BoNT-L-PEPTIDE
BOTOX
“LIKE”
As toxinas e venenos que tem um efeito negativo em humanos são produzidos por uma grande variedade de animais, plantas e microorganismos. Provavelmente os organismos sintetizam toxinas para adquirir alimentos, sistemas de defesa próprios contra a depredação e como ajuda para combater potenciais hospedes indesejáveis. Quando os organismos eucariotes apareceram na terra, as toxinas microbianas haviam desenvolvido uma gama de fatores de virulência capazes de provocar enfermidades e promover colonizações e patogêneses.
A espécie humana tem utilizado desde esse tempo venenos e toxinas para seu benefício. Muitas vezes as toxinas e venenos são utilizados para fins benéficos, como eliminação de sintomas de certas enfermidades e para conhecer o funcionamento fisiológico do organismo.
A descoberta da caracterização de proteínas tóxicas também tem contribuído para o desenvolvimento de anti-toxinas e vacinas. O gênero Clostridium produz mais proteínas tóxicas que qualquer outro e como exemplo clássico temos a toxina botulínica tipo A em diversos tratamentos incluindo as aplicações cosméticas.
O estilo de vida atual está ligado a uma demanda crescente na estética dermatológica. Existe um desejo em combater os efeitos visíveis do envelhecimento desde muito cedo, e um dos efeitos mais notáveis do envelhecimento é o aparecimento de rugas.
Em vista disto, a INFINITEC Activos, introduziu um peptídeo biomimético sintético e sofisticado, o BoNT-L-peptide, com efeito similar a toxina botulínica tipo A para diminuição das rugas de expressão faciais provocadas pela contração dos músculos durante a fala ou qualquer expressão facial.
O BoNT-L-peptide atua nos mecanismos fisiológicos da pele com uma especificidade elevada atuando sobre os neurotransmissores. Esse peptídeo biomimético não é uma completa seqüência de aminoácidos, tratando–se de um modelo menor porém mais ativo.
RUGAS
Um dos sinais do envelhecimento é a aparição de rugas na face. Isto pode ocorrer de forma natural e devido a certas mudanças bioquímicas, histológicas e fisiológicas que vem aumentando pela exposição ambiental.
Existem outros fatores secundários que podem gerar rugas. Entre eles existe a presença constante da gravidade, pressões constantes e freqüentes na face (exemplo quando dormimos), e movimentos faciais repetitivos causados por contrações dos músculos durante a expressão facial.
Os movimentos dos músculos miméticos da expressão facial podem contribuir para manifestação de emoções intimas das pessoas, portanto, as rugas não são frutos de
estresse ambiental, o envelhecimento e a persistência de forças gravitacionais, também podem estar relacionadas a expressividade e emoções internas.
Clostridium: Uma fonte rica de Toxinas
Dentro das bactérias, o gênero Clostridium gera mais toxinas protéicas do que qualquer outro. As toxinas de Clostridium são proteínas biológicas ativas que são antígenos da natureza e que podem ser neutralizados em animais com suas antitoxinas. Clostridium é um grupo diverso de bactérias caracterizadas por terem uma estrutura de parede celular gram-positiva, formação de endósporos e um metabolismo fermentativo.
O gênero Clostridium atualmente compreende uma coleção de mais de 100 espécies, e este gênero está claramente carente de uma reavaliação taxonômica.
O Clostridium neuroparalizante, C. Botulinum, causa enfermidades espasmódicas e paralisia muscular. O botulismo é uma enfermidade neuroparalítica rara que pode paralisar todos os músculos esqueléticos do corpo. A enfermidade pode ter uma larga duração de meses e até anos em casos severos.
Botulinum NT (BoNT) é conhecidamente a toxina mais potente. A potencia extraordinária de BoNT deriva de sua remarcável neuroespecificidade e por sua
capacidade catalítica a doses extremamente baixas em substratos neuronais envoltos nas exocitoses.
Porém de todas as formas, as toxinas de Clostridium tem propriedades para serem utilizadas como agentes terapêuticos e no tratamento de enfermidades humanas. Esporas de Clostridium e células vegetativas têm sido também investigadas como veículos de liberação de agentes quimioterapêuticos no tratamento de alguns tipos de câncer.
O grande êxito das toxinas de Clostridium na utilização da toxina botulínica tipo A como agente terapêutico, utilizada para tratar e acelerar a recuperação de desordens musculares involuntárias em humanos.
BoNT, agente terapêutico
Em particular a toxina botulínica (BoNT), a substância biológica mais venenosa conhecida, é utilizada no tratamento de uma grande variedade de desordens neuromusculares caracterizadas por contrações involuntárias dos músculos.
Desde a aprovação da toxina botulínica tipo A pelo FDA (Food and Drug Administration) em dezembro de 1989 para tratamento de 3 desordens (estrabismo, blefarospasma e espasmo hemifacial), e o números de indicações a que pode aplicar-se não para de crescer, incluindo numerosas distonías, aplicações cosméticas, migrâneas (dores de cabeça) entre outras.
Sua principal aplicação terapêutica é devido a especificidade e potência em inibir a atividade de contração muscular involuntária.
Complexo SNARE, mecanismo de ação
A exocitose Ca2+ dependente é um processo muito regulado nas células endócrinas e neuronais. Os componentes musculares e os eventos envolvidos na cascata exocitósica emergem graças à convergência de fatores genéticos, bioquímicos, farmacológicos e biofísicos.
A informação recebida nos últimos anos permitiu a formação de um modelo de receptores SNAP (SNARE) para descrever as etapas finais da cascata segregante. A hipótese SNARE distingue estados diferentes no processo conhecido como acoplamento e fusão.
O Acoplamento de vesículas, é o processo pelo qual as vesículas carregadas são dirigidas para a membrana plasmática na zona ativa, mas elas não são próprias para a fusão com a membrana desencadeada pela ação do Ca2+. Bioquimicamente, a junção se associa a formação do complexo ternário 7S, onde está envolvida a proteína da membrana vesicular, conhecida como sinaptobrevina, também chamada VAMP (vesicle-associated membrane protein), que é a vesícula SNARE; e das proteínas de membrana plasmáticas, SNAP-25 e sintaxina, que compreendem o complexo SNARE. Depois do acoplamento, as vesículas são ativadas mediante um passo ATP-dependente conhecido como primimg.. Este se inicia com a união de proteínas solúveis NSF (N-ethylmaleimide-sensitive factor, e ATPase) e SNAPs (proteínas solúveis NSF, as quais não estão relacionadas com SNAP 25) aos receptores SNAP. As vesículas respondem a um incremento de gradiente de Ca2+ que induz a fusão com a membrana. A identificação de um passo limitante ATP dependente no final do processo, respalda a hipótese SNARE.
Como resume a figura, podemos observar uma rota simplificada do complexo SNARE. As proteínas SNARE sinaptobrevina/VAMP, SNAP-25 e sintaxina formam um complexo com a ATPase NSF. O complexo SNARE está envolvido no transito das vesículas sinápticas que contém neurotransmissores da membrana pré-sináptica, onde se produz a fusão e exocitose dos neurotransmissores.
BoNT, mecanismo de ação
BoNT são proteínas de aproximadamente 150kDa, que aparecem de forma natural como componentes de toxinas complexas.
O diagrama ao lado descreve a neurotoxina botulínica (BoNT/A). A cadeia simples de BoNT é ativada mediante uma protease que forma uma dupla cadeia ativada, consiste em uma cadeia pesada (H - High) e outra leve (L –low) unidas por uma ponte dissulfúrica. A cadeia H pode dividir-se em dois fragmentos, N-terminal (Hn) e C-terminal (Hc). Os números indicam os aminoácidos da cadeia peptídica simples.
BoNT inibe as vesículas de acoplamento. Depois de sua internalização no citosol, BoNT rompe especificamente as proteínas neuronais que intervem no trafico vesicular e na liberação de neurotransmissores. BoNT compreende um grupo único de proteases de Zn que reconhecem motivos estruturais dos substratos neuronais do complexo SNARE.
Problemas com a terapia BoNT
As primeiras complicações observadas com as terapias com toxinas botulínicas são: • Formação de anticorpos e anulação de resposta a toxina tipo A.
• Escassez de sorotipos botulínicos alternativos com a potência e duração de ação do tipo A.
• Difusão da toxina a músculos vizinhos. Uma das complicações mais significativas e freqüentes é a ptose das pálpebras com a injeção de BoNT em músculos próximos. A toxina injetada migra através do septo orbital, onde paralisa a pálpebra superior. • Falta de consistência e atividade específica baixa em
certas preparações que contém a toxina.
• Em certas alterações crônicas podem necessitar de repetidas aplicações.
• Efeitos secundários como edema local, eritema, dor de cabeça e náuseas.
Tem-se observado que peptídeos sintéticos que mimetizam a seqüência de aminoácidos de segmentos da sinaptotagmina, SNAP, sinaptobrevina e SNAP-25 são inibidores da neurosecreção.
O BoNT-L-peptide mimetiza a seqüência de aminoácidos do domínio C-terminal de SNAP-25, bloqueando sua atividade. BoNT-L-peptide tem seu efeito terapêutico
atuando seletivamente nas terminações nervosas motoras colinérgicas, inibindo a liberação de neurotransmissor acetilcolina e da intersecção neuromuscular.
BoNT-L-peptide bloqueia a transmissão do impulso neuromuscular em 4 etapas: 1) Etapa de união
O produto se une ao receptor de membrana celular e de neurônio motor pré-sináptica. O primeiro passo em sua união ao receptor colinérgico da membrana celular no extremo pré-sináptico de um nervo motor. O domínio de união é seletivo para terminações nervosas motoras colinérgicas.
2) Terminação axônica
Posteriormente, BoNT-L-peptide é introduzido na terminação axônica. A internalização é um processo endocitótico mediado pelo receptor dependente da energia, no qual o plasma da membrana da célula nervosa invagina ao redor do complexo L-peptide-receptor, formando uma vesícula que contém todo BoNT-L-peptide dentro do terminal do nervo.
3) Translocação
BoNT-L-peptide é liberado através da membrana endossomial da vesícula endocitótica ao citoplasma da terminação nervosa.
4) Etapa bloqueadora
BoNT-L-peptide é responsável pelo bloqueio de transmissão de um impulso nervoso. Inibe a liberação da acetilcolina atuando como uma endopeptidase Zn-dependente, desativando componentes específicos do mecanismo neuroexocitócico. Isto se consegue com a ancoragem de BoNT-L-peptide na proteína sináptica associada (SNAP-25), proteína citoplasmática necessária para acoplamento das vesículas de acetilcolina da parte mais interna da membrana plasmática da terminação nervosa. A proteólise específica de SNAP-25 por BoNT-L-peptide previne a fusão das vesículas de acetilcolina e sua liberação na fenda sináptica, impedindo a terminação nervosa de estimular a contração do músculo. BoNT-L-peptide não afeta nem a síntese nem o armazenamento de acetilcolina, nem a condução de sinais elétricos através da fibra nervosa.
BoNT-L-peptide, áreas a ser tratadas
Como foi citado, há diferentes aplicações para BoNT-L-peptide. De todas as formas focando na aplicação cosmética de BoNT-L-peptide, as áreas a serem tratadas são a testa, área periorbital lateral e área entre as sobrancelhas. Também pode ser utilizado para reduzir a intensidade das rugas do queixo e as rugas do lábio superior, pregas nasais e a zona do pescoço.
• Área entre as sobrancelhas: existem diversos músculos que são responsáveis pelas linhas que se formam entre as sobrancelhas. Essas linhas podem ser tratadas com BoNT-L-peptide.
• Região da testa: as contrações provocam levantamento da testa e aparição de rugas.
• Pregas periorbitais: linhas próximas aos olhos, “pés de galinha” que podem aparecer desde idades mais jovens até idades mais avançadas.
• Linhas nasais: causadas pelas contrações do músculo nasal. • Pregas no queixo: aparecem em casos de hiperatividade
muscular.
• Rugas no lábio superior: estas pequenas linhas radiais são devido a tração muscular.
• Pregas no pescoço: aproximadamente aos 50 anos de idade, dependendo da predisposição genética, segundo a elasticidade e grau de perda de tecido adiposo subcutâneo aparecem pregas nesta área. As linhas verticais são mais proeminentes e seguem da mandíbula em direção a clavícula. BoNT-L-peptide, vantagens sobre a terapia com toxina botulínica
• Custo baixo comparado com a terapia Botox® • Alta efetividade,
• Satisfação cosmética, • Tratamento não invasivo,
• Ausência de efeitos secundários,
• Terapia de escolha para indivíduos que apresentam alergia a toxina botulínica, • Indolor,
• Indicado em associação à terapia com Botox® como tratamento contínuo. BoNT-L-peptide, aplicações cosméticas
Diminuição de rugas de expressão.
BoNT-L-peptide, concentração de uso
BoNT-L-peptide, eficácia
1) Inibição da formação de complexos SNARE Objetivo:
Determinação da inibição da formação de complexos SNARE para comparação de efeito “Botox like” do produto BoNT-L-peptide.
Materiais e Métodos:
Incubação dos fragmentos solúveis de 3 proteínas SNARE (sintaxina 1ª, SNAP-25 e sinaptobrevina/VAMP-2) para permitir a formação de complexos resistentes a SDS. A visualização destes complexos se realiza mediante eletroforese em gel de poliacrilamida. A mescla de proteína é acrescido SNAP-25 marcada radioativamente com “Met” para detecção e quantificação da quantidade de complexos.
A quantidade de proteínas SNARE e de cada via foi a seguinte: • Sinaptobrevina/VAMP-2 = 2µg
• SNAP-25 = 4µg • Sintaxina 1ª = 4,2µg
A esta mescla de proteínas foi adicionado durante 30 minutos os produtos em uma diluição de 1/10 de uma solução padrão de 100mg/ml em água. Foi realizado em duplicata. Finalizado o período de incubação foi adicionado ao tampão amostras para eletroforese e foi deixado correr em gel de acrilamida.
Finalizada a corrida em gel, estes se fixaram e secaram e foram expostos à telas de “Phospholgamer” (Biorad) durante um período de tempo variável (3 a 12h). As imagens foram escaneadas e as bandas foram quantificadas mediante um programa chamado “Quantity-One de Bio-Rad”.
Resultados:
Em resumo podemos indicar que foi encontrado um efeito inibidor de complexos SNARE de 30% a uma concentração de uso de BoNT-L-peptide de 0,8mM
Gráfico 1. Inibição da formação de complexos SNARE
BoNT-L-peptide inibe 30% da formação de complexos SNARE.
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 Controle BoNT-L-Peptide 1 BoNT-L-Peptide 2 BoNT-L-Peptide 3 BoNT-L-Peptide 4 BoNT-L-Peptide 5
2) Micro-relevo da pele humana (replicas de silicone) Objetivo:
Avaliar a capacidade do BoNT-L-peptide à 5% em reduzir as rugas de expressão. Metodologia:
Foi determinado macro-rugosidade em réplicas de silicone obtidas de 15 voluntários correspondentes a zona do contorno dos olhos nos tempos T0 e T28. O tratamento com o produto durou 4 semanas e as avaliações aconteceram antes e depois do tratamento. A medida de rugosidade foi realizada mediante perfilometria com um perfilômetro Plµ.
Resultados:
Pode-se observar uma redução total de 38% das rugas.
Figura: Imagens do voluntário 12 em T0 e T28 respectivamente. 3) Avaliação das fotografias das rugas
Objetivo:
Avaliar a capacidade de BoNT-L-peptide a 5% em reduzir as rugas de expressão. Metodologia:
Avaliação de fotografias da rugas por juizes qualificados e treinados para tal ação, antes e após o tratamento. O critério de avaliação foi a profundidade das rugas. Os juizes são treinados regularmente usando um portifólio de 50 fotografias do contorno dos olhos. A repetição e a variabilidade constituem uma avaliação previa da eficácia por análise visual de um tratamento anti-rugas.
Resultados:
Observam-se fotografias de uma voluntária em T0 e T28 com melhora significativa da expressão das rugas.
Referências Bibliográficas
1. Benedetto, A.V. The cosmetic use of Botulinum neurotoxin type A. Int.J. Derm. 38,641-655 (1999).
2. Lintner,K. Promoting production in the extracellular matrix hout ccompromising barrier. Cutis 2002 Dec;70 (6 Suppl):13-6; discussion 21-3.
3. Stegman, S.J.; Tromovitch, T.A. and Glogau, R.G. The skin of the aging face in cosmteic dermatologic surgery. 2nd edn. Mosby year book, St. Louis MO, pp.5-15 (1990).
4. Tischer, AS. Chromaffin cells as models of endocrine cells and neurons. Ann Ny Acad Sci. .2002, 971:366-70.
5. Becker-Wegerich, P.M., Rauch, L. and Ruzicka T. Botulinum toxin : a successful decollete rejuvenation. Dermatol. Surg. 28, 168-171 (2002).
6. Frankel, A.S. Botox for rejuvenation of the periorbital region. Facial Palst. Surg. 15, 255-262(1999).
7. Hayashi,T, Yamasaki,S., Nauennburg,S., Binz,T. And Niemann, H. Disassembly of the reconstituted synaptic vesicle membrane fusion complex in vitro. Embo J. 14,2317-2325 1994).
