Nanopartículas sintetizadas por método verde, contendo prata e fucana, induzem morte de células de adenocarcinoma renal humano (786-0)

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. NANOPARTÍCULAS SINTETIZADAS POR MÉTODO VERDE, CONTENDO PRATA E FUCANA, INDUZEM MORTE DE CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA RENAL HUMANO (786-0). MÔNICA DE OLIVEIRA ROCHA AMORIM. NATAL/RN 2016.

(2) MÔNICA DE OLIVEIRA ROCHA AMORIM. NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM FUCANA SINTETIZADAS POR MÉTODO VERDE INDUZEM MORTE DE CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA RENAL HUMANO (786-0). Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha. NATAL/RN 2016.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Amorim, Mônica de Oliveira Rocha. Nanopartículas sintetizadas por método verde, contendo prata e fucana, induzem morte de células de adenocarcinoma renal humano (786-0) / Mônica de Oliveira Rocha Amorim. - Natal, 2016. 71f.: il. Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte 1. Fucanas - Dissertação. 2. Nanopartículas - Dissertação. 3. adenocarcinoma renal - Dissertação. 4. Spatoglossumschröederi Dissertação. I. Rocha, Hugo Alexandre de O. II. Título. RN/UF/BS-CCS. CDU 582.272. ii.

(4) MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde:. Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. iii.

(5) MÔNICA DE OLIVEIRA ROCHA AMORIM. NANOPARTÍCULAS SINTETIZADAS POR MÉTODO VERDE, CONTENDO PRATA E FUCANA, INDUZEM MORTE DE CÉLULAS DE ADENOCARCINOMA RENAL HUMANO (786-0). Aprovada em: 30 / 09 / 2016. Banca Examinadora:. Presidente da Banca: Prof. Dr. Hugo Alexandre de O. Rocha (UFRN). Membros da Banca Profa. Vanessa De Paula Soares Rachetti - Membro Titular – UFRN Profa. Luciana Nunes Menolli Lanza - Membro Externo – UnP. iv.

(6) Dedico esta obra. A Deus. Senhor de todas as coisas, mestre da nossa existência.. Aos meus filhos. Nunca me senti preparada para ser mãe. Porém, não sei o que seria de mim sem vocês. Vocês são o melhor de mim.. Aos meus pais Presentes em todos os momentos da minha vida, interferindo sempre! Com certeza essa conquista é devida a vocês. Aos meus irmãos. Sempre comigo todas as horas. Amamdo-me, Protegendo-me, Exemplando-me. O que seria de mim sem vocês! Meus amigos, meus mestres. A vocês o meu amor incondicional.. A Hugo Rocha, Exemplo de amor pela profissão, pelo ensino, pela ciência. Obrigada pela paciência, por estar ao meu lado na conclusão desse trabalho e por confiar em minha capacidade.. v.

(7) Agradecimentos especiais Ao meu marido. Rafael, obrigada por dividir a sua vida comigo. À minha família, escolhida por Deus para me ajudar a me tornar uma pessoa melhor; À UFRN, à Pós-graduação em Ciências da Saúde e ao Departamento de Bioquímica pela oportunidade de concluir esse curso de Pós-graduação, assim como as agências Financiadoras CAPES e CNPq. A todos os professores do CCS (UFRN), aos coordenadores do programa de pósgraduação (PPGCSa) e às secretárias do programa. Aos membros da banca de qualificação: Drº RaniereFegundes e Drº Ivan lopes, que disponibilizaram-se a me avaliar e contribuíram com valiosas sugestões para melhorar a minha pesquisa. A Jailma Almeida, um anjo bom que Deus colocou em minha vida. Esse trabalho não teria se concretizado sem a sua ajuda. Tenho certeza que você descontou muitos pecados comigo kkk. MEU MUITO OBRIGADA! A Larisse, minha filha postiça. Pelas longas tardes de centrifugação e posteriormente de ativação da coluna e extração de fucana sempre regadas a muito bom humor e confidências. A Talita Brito, Rainha do Paraguai, pelas tardes agradáveis juntas, necessárias para o crescimento. Agradeço muito ao BIOPOL, uma verdadeira família que me acolheu de braços abertos e me proporcionou momentos únicos. Jailma, Day, Larisse, Mariana, Talita, Pablo, Raynara, Jéssika, Marília, Joana, Gabriel, Moacir, Raniere, Ivan, Leonardo Nobre (Leo), Almino, Letícia, Arthur, Vinicius, Max, Rony, Maíra (tia mainha), Monique, Samantha, Eder, Danielle, Carol, Cinthia Telles, Leandro, Cinthia, Profa. Fabiana, Karoline Rachel, Ana Karina, Yara, Lucas, Carla,Cauê, Ruth e Rafael, Diego (Popó). Espero não ter esquecido ninguém! Todos vocês são essenciais nessa trajetória Agradeço aos meus sogros: René e Vilma pela torcida e orações. Agardeço aos funcionários do DBQ, em especial Sr. Rogério Agradeço a D. Ângela e Jonas pelas tardes descontraidas Agardeço à minhas amigas Vivian Olinto e Camila Priscila, que compartilharam muitos momentos comigo, felizes, tristes, todos necessários para a nossa evolução. Meu muito obrigada a vocês pela torcida. Por fim, obrigada atodos que contribuíram de forma direta ou indireta para a realização desse trabalho.. vi.

(8) "Embora. ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim.”. (Chico Chavier). vii.

(9) RESUMO O estado do Rio Grande do Norte possui uma grande diversidade de espécies de macroalgas marinhas fornecedores de compostos com grande potencial farmacológico e biotecnológico. Dentre eles destacam-se os polissacarídeos sulfatados. Polissacarídeos que contémL-fucose sulfatada são muitas vezes denominados de fucanas. A alga marrom Spatoglossumschröederi sintetiza três fucanas e aquela que é obtida em maior quantidadefoi denominada de fucana A. A produção de nanopartículas de prata contendo biopolímeros naturais tem sido apontada como uma excelente alternativa para potencializar ou fornecer novas aplicabilidades. aos. mesmos,. pois. estes. apresentam. propriedades. farmacológicas que podem ser potencializadas se aliadas à nanotecnologia. A fucana A não se mostroucitotóxica para diferentes linhagens de células normais, nem tampouco é tóxico para ratos quando administrado em altas doses. Ademais, apresentou baixa toxicidade para células tumorais. Com intuito de potencializar a. toxicidade da fucana Afrente às linhagens tumorais,. nanopartículas de prata contendo este polissacarídeo foram sintetizadas por um método verde (pouco agressivo ao meio ambiente). Estas nanopartículas apresentaram um tamanho médio de 210 nm e formato arredondado, bem como,uma carga superficial negativa e foram estáveis por quatorze meses. Quando incubadas com células, estas nanopartículas não apresentaram citotoxicidade para diferentes linhagens de células normais, mas diminuíram a viabilidade de várias linhagens de células tumorais (786-0, HepG2, Siha), principalmente células de adenocarcinoma de renal 786-0. Análises por fluorescência e de citometria de fluxo sugerem que as nanopartículas induzem necrose nas células 786-0. Por outro lado, as nanoparticulas não foram toxicas para células renais normais (HEK, VERO, MDCK). Os dados aqui mostrados levam a conclusão de que as nanopartículas com fucana A são promissores agentes para combate de adenocarcinoma renal. Keywords:. Fucanas,. nanopartículas;. Spatoglossumschröederi;. viii. adenocarcinoma. renal;.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AgNPs. Nanopartículas de prata. 0. Graus Celsius. kDa. kilodalton. F0.5. Fração precipitada com 0,5 volumes de acetona. F0.6. Fração precipitada com 0,6 volumes de acetona. F 0.7. Fração precipitada com 0.7 volumes de acetona. F 0.9. Fração precipitada com 0.7 volumes de acetona. F 1.1,. Fração precipitada com 1.1 volumes de acetona. F 1.3. Fração precipitada com 1.3 volumes de acetona. F.2.0. Fração precipitada com 2.0 volumes de acetona. g. Grama. h. horas. M. Molar. Mg. Miligrama. Min.. Minutos. mL. Mililitros. Mm. Milímetros. nM. Nanômetros. NaCl. Cloreto de sódio. PA. Para análise. 786-0. Célula de adenocarcinoma renal humano. HEK. Célula de renais de embrião humano. HepG2. Célula de carcinoma hepático humano. MDCK. Célula renal de cachorro. Siha. Célula de carcinoma cervical uterino humano. Vero. Célula renal de macaco. C. ix.

(11) LISTA DE FIGURAS. Figura 1.. Estrutura proposta por Leite e colaboradores (1998)para a fucana A da alga S. schröederi................................................................................................14. Figura 2. Figura esquemática do procedimento de extraçãodos polissacarídeos de algas..................................................................................................................22. x.

(12) SUMÁRIO RESUMO................................................................................................................................... ix LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS..................................................................................... x LISTA DE FIGURAS.................................................................................................................. xi 1. INTRODUÇÃO....................................................................................................................... 1.1. POLISSACARÍDEOS DE ORGANISMOS MARINHOS……………………………... 1.2. FUCANAS.................................................……………………………………………. 1.3. NANOTECNOLOGIA...........................................……………………………………. 1.3.1 Nanopartículas............................................................................................. 1.3.2 Nanopartículas de prata............................................................................... 1.3.4 Síntese Verde de Nanopartículas de Prata.................................................. 1.3.4 Nanopartículas de Prata com Polissacarídeos.............................................. 1.4. CARCINOMA DE CÉLULAS RENAIS...…………………………………………….... 12 12 12 14 14 15 15 16 16. 2. JUSTIFICATIVA.................................................................................................................... 18 3. OBJETIVOS........................................................................................................................... 19 3.1. OBJETIVO GERAL................................................................................................. 19 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................. 19 4. MÉTODOS............................................................................................................................. 4.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS..................................................................................... 4.1.1. Algas...................................................................................................... 4.2. OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS..................................... 4.2.1. Delipidação............................................................................................ 4.2.2 Proteólise.............................................................................................. 4.2.3. Fracionamento com volumes crescentes de Acetona..................... 4.2.4. Cromatografia em coluna de troca iônica.......................................... 4.2.5 Eletroforese em gel de Agarose........................................................... 20 20 20 20 20 20 21 22 23. 4.3. ANÁLISES QUÍMICAS........................................................................................... 4.3.1. Quantificação de açúcar e proteínas.................................................. 4.3.2. Quantificação de sulfato……………………………………................... 4.3.4. Compostos fenólicos............................................……....................... 4.4ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................................... 23 23 23 24 24. 5. ARTIGO PRODUZIDO......................................................................................................... 5.1. ARTIGO 1 .............................................................................................................. 25 25. 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E SUGESTÕES....................................................................... 56. 7. REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 57. 8. ANEXOS................................................................................................................................ 63 8.1. NORMAS DA REVISTA PARA SUBMISSÃO............................................... 64. xi.

(13) 12. INTRODUÇÃO 1.1. POLISSACARÍDEOS DE ORGANISMOS MARINHOS As macroalgas marinhas são um grupo de seres vivos aquáticos e autotróficos que são divididas em algas vermelhas (Rhodophyta), pardas (Phaeophyta) e. verdes (Chlorophyta) [1].. As mesmas apresentam. importância, tanto sob o ponto de vista econômico, como ambiental e social, pois podem realizar a manutenção do equilíbrio biológico nos ambientes aquáticos, ser utilizadas pela humanidade como fonte de alimentos [2] por serem ricas em nutrientes como polissacarídeos [3]. Nesses organismos, os polissacarídeos estão localizados em sua parede celular formando uma matriz mucilaginosa que parece estar relacionada à proteção contra desidratação em períodos de maré baixa. A natureza mucilaginosa desses compostos também parece contribuir para tornar a alga flexível o bastante para crescer em ambiente líquido e também rígida o suficiente para permanecer estendida e assim melhor captar a luz e os nutrientes [4]. Os tipos de polissacarídeos presentes em cada macroalga marinha dependem do grupo a que elas pertencem. As algas verdes apresentam polissacarídeos sulfatados mais diversificados, sendo ricos em galactose, manose,. xilose. dentre. outros.. Das. algas. vermelhas. são. obtidas. principalmente as agaranas e as carragenanas, já as algas marrons sintetizam as fucanas[5]. 1.2. FUCANAS As fucanas tem como açúcar representativo α-L-fucose sulfatada [6,7]. Devido à existência de homo e heterofucanas a IUPAC recomenda que o termo fucana seja utilizado para definir uma molécula que contém mais de 90% de fucose, já àqueles polímeros que contém menos de 90% de fucose podem ser denominados de Fucoidan [8]. Além das algas marrons, as fucanas também foram encontradas na camada gelatinosa que cobre os ovos de.

(14) 13. ouriços do mar e também na matriz extracelular do tecido muscular de pepinos do mar [9]. Estes polissacarídeos foram primeiramente isolados de algas marinhas no início do século XX [10]. A fucana mais estudada e comumente utilizada é o Fucoidan de Fucus vesiculosus, a qual é comercializada há décadas e teve sua estrutura caracterizada inicialmente por Percival e Ross [11], porém esta foi reavaliada por Patankar e col. [12]. Fucanas encontram-se presentes em todas as algas pardas até agora estudadas. Por outro lado, não são encontradas nos demais grupos de algas marinhas como algas verdes e vermelhas [10]. O grupo em que se insere esta dissertação, vem trabalhando com a alga parda Spatoglossum schröederi e demonstrou que esta alga sintetiza três diferentes tipos de fucanas que foram denominadas de fucana A [6], fucana B [7] e fucana C [8]. Com relação ao rendimento, a fucana A corresponde a 80% das fucanas sintetizadas por essa alga[6]. A fucana A é uma molécula de 21 kDa, composta por um esqueleto de ácido glucurônico unidos por ligações β(1-3), com ramificações em C-4 formadas por trissacarídeos de fucose unidos por ligações α(1-3). A maioria dos resíduos de fucose geralmente é substituída em C-4 com grupamentos sulfato, e algumas ainda são substituídas em C-2 por dissacarídeos de xilose unidos por ligações β(1-4). 50% das xiloses são sulfatadas. A estrutura proposta para a fucana A está representada na figura 1. Essa fucana A apresenta uma baixa atividade anticoagulante, entretanto possui efeito antitrombótico in vivo [13]. Foi proposto que esta atividade estava relacionada com a capacidade desta fucana em estimular células endoteliais a sintetizarem heparam sulfato [14]. Além disso, foi demonstrado que essa fucana não apresenta potencial genotóxico ou mutagênico [7]..

(15) 14. Figura 1. Estrutura proposta por Leite e colaboradores (1998) [14] para a fucana A da alga S. schröederi.. 1.3. NANOTECNOLOGIA O termo nanotecnologia foi empregado pela primeira vez pelo engenheiro japonês Norio Taniguchi em 1974 e possuía como definição a habilidade de alguns materiais em produzir estruturas estáveis em escala de nanômetros. Atualmente existem inúmeras definições para a nanotecnologia, entretanto todas remetem a capacidade de criar, explorar e manipular materiais em nanômetros (bilionésimos de metro) [15]. Dentre os fins mais nobres almejados pela nanotecnologia estão as aplicações médicas e biomédicas. Dispositivos biomédicos vêm sendo aprimorados a cada dia, tornando possíveis alguns tratamentos e melhorando métodos existentes [16]. Entre as muitas aplicações possíveis de polímeros na área médica, pode-se citar especialmente a liberação controlada de fármacos, dada a grande contribuição que estes sistemas podem trazer para aumentar a eficiência dos sistemas de medicação e reduzir efeitos colaterais adversos [17].. 1.3.1. NANOPARTÍCULAS As nanopartículas (NPs) são vistas como os blocos de construção fundamentais da nanotecnologia. Elas são o ponto de partida para a preparação de vários materiais e dispositivos nanoestruturados. A sua síntese é um processo vital para a eficiência cada vez maior dos estudos que integram.

(16) 15. a nanociência [18]. Podem ser conceituadas como colóides sólidos, estáveis, que possuem tamanho variando entre 10 a 1000 nm.[19] Por apresentarem grande prospecção de estudo e por possuírem facilidade de preparo e manipulação, maior área superficial e elevada reatividade, as nanopartículas atraíram a atenção de pesquisadores, governo e indústria. Adicionalmente, as nanopartículas podem ser formadas com uma grande variedade de materiais de núcleos de metal, com capacidade condutora ou semicondutores atribuindo a elas propriedades magnéticas ou de fluorescência [20].. 1.3.2. NANOPARTÍCULAS DE PRATA A prata, é um mineral que possui uma ação antisséptica conhecida desde os primórdios da civilização. Estudos na área da medicina têm demonstrado que a prata é eficiente contra mais de 650 organismos patogênicos, possuindo um amplo espectro de atuação. Sua utilização na forma de nanopartículas potencializa esta propriedade, permitindo sua utilização em uma ampla gama de aplicações [21,22]. As Nanopartículas de prata - AgNPs, possuem propriedades biológicas importantíssimas, alguns exemplos são as atividades antiviral [23,24], antifúngica [25], anti-inflamatória [26] e bactericida. [27] A eficácia desses nanocompostos na área médica também vem sendo confirmada na forma curativa, devido a capacidade de reduzir infecções bacterianas associadas a feridas de queimaduras e como agente cicatrizante [28]. Além disso, com relação à toxicidade para as células animais, as nanopartículas de prata são as que apresentam o menor índice [29]. 1.3.3. SÍNTESE VERDE DE NANOPARTÍCULAS DE PRATA A abordagem verde de síntese de nanopartículas concentra-se na utilização de materiais de baixo custo, eficazes, biocompatíveis e que causem poucos danos ao meio ambiente, originando nanopartículas estáveis para aplicação terapêutica [30]..

(17) 16. A síntese “completamente verde” consiste na utilização apenas de água, como solvente, e moléculas, como polissacarídeos, como redutores e/ou estabilizantes da prata e da nanopartícula formada, respectivamente [31].. 1.3.4. NANOPARTÍCULAS DE PRATA COM POLISSACARÍDEOS Atualmente, há uma busca por potencializar as atividades de moléculas,. inclusive. polissacarídeos.. É. sabido. que. os. sistemas. nanoestruturados retardam a liberação do princípio ativo, proporcionando melhor adesão do paciente à terapêutica proposta, otimização da dose total do princípio ativo e aumento na eficiência do tratamento [17]. A síntese de nanopartículas constituídas de polissacarídeos pode ocorrer por diversos métodos [32,33,34]. Porém, em muitos desses estudos utiliza-se substâncias tóxicas aos seres humanos, a outros seres vivos e ao meio ambiente ou utilizam-se procedimentos muito complexos [35]. Tendo conhecimento deste fato, preconiza-se o uso de moléculas de boa biocompatibilidade e biodegradabilidade para a formação de nanopartículas, com intuito de diminuir a toxicidade, não só das mesmas, como também daquelas advindas das etapas de sua manipulação e, por conseguinte, simplificar o processo de síntese [36,37]. Os polissacarídeos atendem a estas expectativas, pois são moléculas de. baixa. toxidade. e. ótima. biocompatibilidade. [38,39].. Ademais,. nanopartículas sintetizadas com polissacarídeos tendem a agregar-se bem menos do que nanopartículas feitas com outros materiais [40]. Fazendo com que as nanopartículas contendo polissacarídeos sejam menos citotóxicas [41].. 1.4. CARCINOMA DE CÉLULAS RENAIS O termo Carcinoma de célula Renal (CCR) designa as neoplasias parenquimatosas renais de origem epitelial com potencial maligno que representam em média 90% de todas as neoplasias que ocorre no rim de.

(18) 17. pessoas adultas [42,43,44]. É uma doença agressiva, considerada a mais letal dentre as neoplasias urológicas [45]. A abordagem terapêutica para o CCR é guiada pela probabilidade de cura, que está diretamente relacionada com o estágio ou grau de disseminação celular. O futuro da terapia no CCR caminha no sentido da individualização do perfil molecular de cada paciente e da escolha de terapias específicas individuais [46] Neste sentido, nanopartículas de polissacarídeos, inclusive polissacarídeos sulfatados, se tornam promissores agentes terapêuticos, pois apresentam atividade antitumoral inerente, portanto, diferente de outras nanopartículas, não precisam ter em suas estruturas outros agentes anticancerígenos, o que geralmente encarece o valor comercial das nanopartículas. Além disso, devido à enorme variabilidade estrutural dos polissacarídeos, nanopartículas feitas com polissacarídeos diferentes podem ter alvos celulares diferentes, e, portanto, serem usadas contra diferentes tipos de câncer. O que incentiva o desenvolvimento de nanopartículas com novos polissacarídeos..

(19) 18. 2. JUSTIFICATIVA. O grupo de pesquisa do Laboratório Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), do Departamento de Bioquímica, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), vem estudando desde a década de noventa, polissacarídeos sulfatados com potenciais farmacológicos, principalmente de macroalgas marinhas da costa potiguar. Durante este período foi demonstrado que a alga marrom Spatoglossum schröederi sintetiza três diferentes fucanas, sendo aquela denominada de fucana A, a que se obtém em maior quantidade. Esta fucana, quando administrada em altas doses (500 a 2000 µg/mL), apresentou atividade citotóxica para células tumorais, em especial células de adenocarcinoma renal humano (786-0). O que levou a busca de alternativas para potencializar esta atividade. Em estudo paralelo, componentes do BIOPOL demonstraram que a formação de nanopartículas de prata contendo polissacarídeos sulfatados de algas potencializava a ação desses últimos. Nanopartículas de prata vem sendo apontadas em diferentes trabalhos como agentes possíveis de serem utilizados em diversas áreas, desde a saúde à indústria têxtil. Ademais, a incidência do câncer renal tem aumentado cerca de 2% ao ano no Brasil e quando o câncer renal já produziu metástases, seu prognóstico é ruim, pois ele não pode ser curado pela radioterapia, pelas drogas antineoplásicas tradicionais (quimioterapia) ou por hormônios. Neste contexto, surgiu a necessidade de produzir nanopartículas de prata contendo fucana A afim de verificar a potencialização de suas propriedades..

(20) 19. 3. OBJETIVOS. 3.1. GERAL Sintetizar nanopartículas de prata contendo fucana A que ajam como agente indutores de morte de células de adenocarcinoma renal humano (7860).. 3.2. ESPECÍFICOS •. Extrair e purificar a fucana A da alga marinha S. schröederi;. •. Confirmar a identidade da fucana A obtida;. •. Sintetizar nanopartículas de prata utilizando a fucana A. •. Caracterizar a nanopartícula de fucana A físico-quimicamente;. •. Identificar a atividade citotóxica, frente as linhagens celulares 786-0, HEK, VERO e MDCK, das nanopartículas de prata contento fucana A;. •. Avaliar a capacidade das nanopartículas de prata contento fucana A em induzir apoptose ou necrose em células tumorais;.

(21) 20. 4. MÉTODOS Serão descritos a seguir apenas os métodos que necessitam de um maior detalhamento para compreensão, já que os demais métodos encontram-se claramente descritos no capítulo 5, que se refere ao artigo publicado. 4.1 MATERIAIS BIOLÓGICOS 4.1.1 Algas A alga marinha marrom Spatoglossum schröederi foi coletada na Praia de Búzios, município de Nísia Floresta (litoral sul do Rio Grande do Norte), durante os períodos de marés baixas entre 0,0 a 0,2 metros a uma temperatura situada entre 28-30°C. Após ser coletada, a alga foi trazida ao laboratório, onde foi lavada e retirada as epífitas e inclusões calcárias encrostadas na mesma. Em seguida a alga foi seca em estufa a 45ºC, triturada e guardada em recipiente apropriado.. 4.2. OBTENÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS SULFATADOS 4.2.1 Delipidação As algas trituradas passaram por um processo de despigmentação e delipidação como descrito por Farias (1992) [47]. Para tal, dois volumes de etanol PA foram adicionados a diferentes Beckers contendo as algas trituradas. Estes materiais ficaram em contato com o álcool durante 24h, à temperatura ambiente. A cada saturação do etanol, identificada visualmente, realizou-se a renovação do solvente. Após a sexta troca do álcool, os pós foram separados do mesmo por processo de filtração e secos a temperatura ambiente em exposição a luz solar. Obtendo-se assim pós de algas delipidados.. 4.2.2. Proteólise O pó delipidado foi imerso em solução salina contendo NaCl 0,25 M, com pH ajustado para 8,0 e submetido à digestão proteolítica por meio de uma.

(22) 21. mistura de enzimas denominada prozima, durante 18h a uma temperatura de 60ºC. Neste processo, ocorreu a quebra das proteínas contidas nos fragmentos de algas, a liberação e a solubilização dos polissacarídeos na solução salina. A solução de polissacarídeos foi submetida a uma centrifugação à 10.000 x g, durante 15 minutos, a 4º C. Após esta etapa, o sobrenadante passou por um processo de filtração. Ao final, o volume deste sobrenadante foi mensurado e reservado para ser utilizado no fracionamento com volumes crescentes de acetona.. 4.2.3. Fracionamento com volumes crescentes de acetona O volume do sobrenadante (solução rica em polissacarídeos) obtido foi fracionado com volumes crescentes de acetona, obtendo-se as frações polissacarídicas. Os valores de acetona adicionados foram determinados pela turvação da solução, que caracteriza a precipitação de polissacarídeos devido à adição desse solvente polar. Adicionou-se um volume de acetona, sob agitação leve, necessário para que se visualizasse uma turvação da solução, essa solução foi mantida em repouso a 4ºC durante 18h, o precipitado foi coletado por centrifugação a 8.000 x g por 15 minutos a 4ºC e seco a pressão reduzida. Em seguida, esse procedimento foi repetido até que não se visualizasse mais a formação de precipitado. As frações obtidas (frações cetônicas) foram denominadas conforme o volume de acetona no qual foram precipitadas (F0.5, F0.6, F0.7, F0.9, F1.1, F1.3 e F2.0). As etapas da extração dos polissacarídeos estão demonstradas na figura 2..

(23) 22. Figura 2. Figura esquemática do procedimento de extração dos polissacarídeos de algas.. 4.2.4. Cromatografia em coluna de troca iônica A fração cetônica F0,6 foi submetida à complexação com a resina de troca iônica Lewatite (10 mg de material para cada 1,0 mL de resina) e a eluição foi realizada passo a passo utilizando-se molaridades crescentes de NaCl, como descrito por Dietrich e colaboradores [48]. Foram coletadas frações, com volume total de três vezes o volume da resina, para cada molaridade de sal (0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0, e 3.0M), as quais foram separadas pela ausência de positividade para o método de fenol-ácido sulfúrico [49]. O fluxo de coleta foi de 1 mL/min, sendo o volume de eluição igual para todas as molaridades coletadas. As frações eluídas com 1.0 e 1.5M de NaCl foram precipitadas com 2 volumes de metanol PA a 4°C e deixadas em repouso por 18h, sendo posteriormente centrifugadas a 10.000 x g, por 15 minutos e secas a pressão reduzida. Essas duas frações (1.0 e 1.5M) são consideradas como detentoras da fucana A [14, 13]..

(24) 23. 4.2.5. Eletroforese em gel de Agarose A agarose foi preparada na concentração 0,6% em tampão 1,3 diaminopropano acetato (PDA) e colocado sobre lâminas de vidro medindo 7,5 x 7,5cm x 0,1. Cinco microlitros de cada fração na concentração de 10 mg/mL foram aplicados em canaletas abertas no gel e submetidos a corrente contínua de 100V durante uma hora, em cuba resfriada a 4°C. A origem corresponde ao polo negativamente eletrizado do tampão. Após a corrida eletroforética, os compostos foram precipitados com cetavlon 0,1% por no mínimo 2h, a temperatura ambiente. Para revelação das bandas de migração, o gel foi submetido a uma corrente de ar quente contínua para ser desidratado homogeneamente e posteriormente corado com azul de toluidina 0,1%. O excesso de corante é removido por uma solução de ácido acético 1% em etanol 50% (solução descorante). A revelação das bandas polissacarídicas é realizada devido à capacidade do azul de toluidina interagir com o sulfato presente nos polissacarídeos e os compostos ricos em sulfato desenvolverem uma coloração azul-violácea característica [50].. 4.3 ANÁLISES QUÍMICAS 4.3.1. Quantificação de açúcar e proteínas A quantidade de açúcares totais das frações polissacarídicas extraídas foram determinadas pelo método fenol/ácido sulfúrico [28], empregando-se como padrão a fucose, sendo as leituras realizadas a 490 nm. O grau de contaminação proteica foi determinado com o reagente Comassie blue R 250 e a leitura realizada a 595 nm [51].. 4.3.2. Quantificação de sulfato O teor de sulfato total das frações polissacarídicas foi quantificado, após hidrólise ácida (HCl 4 M, 6 horas, 100º C), por turbidimetria pelo método de gelatina-bário [29]. O sulfato de sódio foi empregado como padrão..

(25) 24. 4.3.3. Compostos fenólicos Os compostos fenólicos foram avaliados quantitativamente pelo método colorimétrico de Folin-Ciocalteu, utilizando-se como padrão o ácido gálico, sendo as leituras realizadas a 765 nm [52]. 4.4. ANÁLISES ESTATÍSTICAS Os dados foram expressos em média ± desvio padrão. A análise estatística foi realizada por meio de uma simples variação análises (one-way ANOVA) seguida pelo teste de Tukey-Kramer (P <0,05). As análises estatísticas foram realizadas utilizando a versão GraphPadInStat® Software 4.0 (software GraphPad, San Diego, CA, EUA)..

(26) 25. 5. ARTIGO PRODUZIDO 5.1. Artigo 1 (Aceito) Fucan-coated silver nanoparticles synthesized by a green method induce human renal adenocarcinoma cell death Periódico: International Journal of Biological Macromolecules Fator de impacto: 3.13 ISSN: (Printed version)Print ISSN: 0141-8130 ISSN: (Online version)Electronic ISSN: 1879-0003 Qualis: Medicina II – A2 Indexada: PubMed – indexado por SCIENCEDIRECT. Accepted Manuscript Title: Fucan-coated silver nanoparticles synthesized by a green method induce human renal adenocarcinoma cell death. Author: Monica Oliveira Rocha Amorim Dayanne Lopes Gomes LarisseAraujo Dantas Rony Lucas Silva Viana Samanta Cristina ChiquettiJailma Almeida-Lima Leandro Silva Costa Hugo Alexandre Oliveira Rocha PII: DOI: Reference:. S0141-8130(16)31225-9 http://dx.doi.org/doi:10.1016/j.ijbiomac.2016.08.043 BIOMAC 6424. Toappear in:. International Journal of Biological Macromolecules. Received date: Revised date: Accepted date:. 2-4-2016 11-8-2016 13-8-2016. Please cite thisarticle as: Monica Oliveira Rocha Amorim, Dayanne Lopes Gomes, LarisseAraujo Dantas, Rony Lucas Silva Viana, Samanta Cristina Chiquetti, Jailma Almeida-Lima, Leandro Silva Costa, Hugo Alexandre Oliveira Rocha, Fucancoatedsilvernanoparticlessynthesizedby a greenmethodinducehuman renal adenocarcinomacelldeath, InternationalJournalofBiologicalMacromoleculeshttp://dx.doi.org/10.1016/j.ijbiomac .2016.08.043.

(27) 26. This is a PDF file of an unedited manuscript that has been accepted for publication. As a service to our customers we are providing this early version of the manuscript. The manuscript will undergo copyediting, typesetting, and review of the resulting proof before it is published in its final form. Please note that during the production process errors may be discovered which could affect the content, and all legal disclaimers that apply to the journal pertain..

(28) 27. Fucan-coated silver nanoparticles synthesized by a green method induce human renal adenocarcinomacelldeath Monica Oliveira Rocha Amorim1,2, Dayanne Lopes Gomes1,2, LarisseAraujo Dantas1, Rony Lucas Silva Viana1, Samanta Cristina Chiquetti1, Jailma Almeida-Lima1, Leandro Silva Costa1,3and Hugo Alexandre Oliveira Rocha 1,2,*. 1. Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais (BIOPOL), Departamento de Bioquímica, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte- RN 59078-970, Brazil;. 2. Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), Natal, Rio Grande do Norte - RN 59078-970, Brazil;. 3. Intituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Norte (IFRN), Ceara-Mirim, Rio Grande do Norte – RN, 59580-000, Brazil;. *Correspondingauthor: Hugo Alexandre Oliveira Rocha, Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Biociências Departamento de Bioquímica Laboratório de Biotecnologia de Polímeros Naturais-BIOPOL Av. Salgado Filho S/N Phone-fax: +55(84)32119208 E-mail: hugo@cb.ufrn.br.

(29) 28. ABSTRACT. Polysaccharides containing sulfated L-fucoseare often calledfucans. The seaweed Spatoglossumschröederi synthesizes three fucans, among which fucan A is the most abundant. This polymer is not cytotoxic against various normal cell lines and is non-toxic to rats when administered at high doses. In addition, it exhibits low toxicity against tumor cells. With the aim of increasing the toxicity of fucan A, silver nanoparticles containing this polysaccharide were synthesized using a green chemistry method. The mean size of these nanoparticles was 210 nm. They exhibited a spherical shape and negative surface charge and were stable for 14 months. When incubated with cells, these nanoparticles did not show any toxic effects against various normal cell lines; however, they decreased the viability of various tumor cells, especially renal adenocarcinoma cells 786-0. Flow cytometry analyses showed that the nanoparticles induced cell death responses of 786-0 cells through necrosis. Assays performed with several renal cell lines (HEK, VERO, MDCK) showed that these nanoparticles only induce death of 786-0 cells. The data obtained herein leads to the conclusion that fucanA nanoparticles are promising agents against renal adenocarcinoma.. Keywords: fucoidan; renal adenocarcinoma; necrosis; Spatoglossum schröederi..

(30) 29. 1. Introduction Brown algae produce a group of sulfated polysaccharides called fucans, which contain sulfated α-L-fucose as the main monosaccharide [1]. Due to the existence of homo- and heterofucans, IUPAC recommends that the term fucanbe used to define a molecule that contains more than 90% of fucose, while polymers with less than 90% of fucose can be called fucoidans [2]. However, the nomenclature of fucans is not yet fully established. A classic example is fucoidan, a homofucan isolated from the seaweed Fucusvesiculosuswhose name derives from the seaweed [3]. Homofucans are alsosynthesized by sea urchins and cucumbers [4]. Many studies have shown that algal fucans have antioxidant, antiproliferative, antitumoral, antiviral, antiangiogenic, anticoagulant, and antiadipogenic properties. A number of excellent reviews published in recent years provide a comprehensive description of the properties of fucans [1,5]. On the other hand, few studies have reported the synthesis of nanoparticles with this type of polysaccharide. Our group has been studying the Spatoglossum schröederi brown seaweed and has shown that it synthesizes three different types of heterofucans, called fucan A [6], fucan B [7], and fucan C [8]. Fucan A corresponds to 80% of fucans synthesized by this seaweed [6]. It is a 21 kDa molecule composed of a core of β(1-3)-linked glucuronic acid units with branches at C-4 of α(1-3)-linked fucosetrisaccharides. The majority of the fucose residues are usually substituted at C-4 with sulfate groups and some residues are substituted at C-2 with β(1-4)-linked xylose disaccharides, of which 50% are, in turn, sulfated. The proposed structure for fucan A is shown in Fig. 1. Fucan A was not found to be genotoxic, mutagenic, or cytotoxic against various normal cell lines [9]. In addition, it did not have a toxic effect on rats when applied at high doses, both in acute.

(31) 30. treatments (seven days) and chronic treatments (90 days) [10]. On the other hand, fucan A was shown to have a toxic effect on various tumor cell lines, although moderate [9].. Fig. 1. Structure of fucan A ofS. schröederiproposed by Leite et al. [6].. Studies have shown that the synthesis of silver nanoparticles with different molecules potentiates the activity of these molecules that are applied in areas such as cosmetics [11], medicine [12], and materials engineering [13]. Therefore, one way of increasing the antiproliferative activity of fucan A is the synthesis of silver nanoparticles with fucan A. In the present study, silver nanoparticles with fucan A from the S. schröederi (C. Agardh) Kützing brown alga were synthesized using a green method, i.e., a method not harmful to the environment. These nanoparticles were subsequently characterized and tested as antiproliferative agents in various tumor and normal cells. 2. Materials and methods 2.1. Materials 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI), MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5diphenyltetrazolium bromide), standard sugars were purchased from Sigma Chemical.

(32) 31 Company, St. Louis, MO, USA. Cell culture medium components (Dulbecco's Modified Eagle Medium-DMEM), trypsin and newborn calf serum (FCS) were obtained from Cultilab (Campinas, Brazil). L-glutamine, sodium bicarbonate, sodium pyruvate and phosphate buffered saline (PBS) were purchased from Invitrogen Corporation (Burlington, ON, USA). All other solvents and chemicals were of analytical grade.. 2.2. Chemical Analysis and Monosaccharide Composition of fucan A Total sugars, sulfate, protein, phenolic compounds and glucuronic acid were determined as previously described [6-9]. The samples were hydrolyzed with 2 M HCl for 2 at 100° C and sugar composition was determined using a LichroCART® 250-4 column (250 mm × 40 mm) packed with Lichrospher® 100 NH2 (5 μm) coupled to a LaChrom Elite® HPLC system from VWR-Hitachi equipped with a refractive index detector (RI detector model L-2490). The sample mass used was 0.2 mg and analysis time was 25 min. The chromatogram was compared to those of sugar references: arabinose, fructose, fucose, galactose, glucose, glucosamine, mannose, and xylose. 2.3 Agarose Gel Electrophoresis Agarose gel electrophoresis of the acidic polysaccharides was performed in 0.6% agarose gel (7.5 cm × 10 cm × 0.2 cm thick) prepared in 0.05 M 1.3-diaminopropane acetate buffer pH 9.0, as previously described [8]. Aliquots of the polysaccharides (about 50 μg) were applied to the gel and subjected to electrophoresis. The gel was fixed with 0.1% cetyltrimethylammonium bromide solution for 2 h, dried, and stained for 15 min with 0.1% toluidine blue in 1% acetic acid in 50% ethanol. The gel was, then, destained with the same solution without the dye. Representative image of three independent experiments is shown. 2.4. Green synthesis of silver nanoparticles with fucan A (NFucA).

(33) 32. The process of green synthesis of NFucA involves reducing agents that convert silver ions into nanoparticles. Initially, the synthesis of NFucAwas performed using a 0.001 M solution of silver nitrate combined with a 10 mg/mL solution of fucan A (in a1:9 ratio). The solutions were mixed in a 250 mL Erlenmeyer flask previously protected from light with aluminum paper. The resulting solution was homogenized by gentle shaking for one hour. The AgNPs were centrifuged at 10,000 x g for 15 min at 25 ºC and the precipitates were collected, freeze-dried, weighed, and stored in conical tubes protected from light. 2.5. Characterization of the nanoparticles 2.5.1. Sample digestion Analytical scales were used to weigh 100 mg of sample in Teflon cups (total 200 mg of sample; 100 mg of each cup), to which 7 mL of 65% nitric acid purified by subboiling distillation (Berghof, Eningen, Germany) and 1 mL of 30% hydrogen peroxide (Merck, Darmstadt, Germany) were added. The digestion cups were subsequently closed and digestion was performed in a microwave digester (Start D, Milestone, Italy) using 6 stages and a power of 1100 W: (1) 5 min at 70 °C; (2) 2 min at 70 °C; (3) 3 min at 120 °C; (4) 2 min at 120 °C; (5) 10 min at 170 °C; (6) 15 min at 170 °C and lastly 30 min of ventilation before the removal of the rotor from the microwave. The digested content was quantitatively made up to 15 mL using deionized water and filtered through a 0.45 µm membrane. The analyses were conducted in duplicate and analytical blanks were performed by conducting the procedure in the absence of sample.. 2.5.2. Determination of silver content of digested sample.

(34) 33 Silver content of digested sample (Fucan A or NFucA) was quantified using an inductively coupled plasma emission spectrometer (ICP-OES 5100 VDV, Agilent Technologies, Tokyo, Japan) in axial view, equipped with a radio-frequency source (RF) of 27 MHz, using a simultaneous optical detector, a peristaltic pump, a double passcyclonic spray chamber, a 1.8 mm quartz torch, and a seaspray glass nebulizer. The gas used in the system was plasma liquid argon with a purity of 99.996% (White Martins, SP, Brazil). The ICP OES equipment operated under the following conditions: power of the plasma, 1.5 kW; argon flow, 12.0 L/min; auxiliary argon flow, 1.0 L/min; nebulization flow, 0.70 L/min; number of replicates, 3; stabilization and reading time, 15 s, wavelength, 328.068 nm. The analytical curve for silver was prepared by diluting 1000 mg/L of reference standard solution (Merck, Darmstadt, Germany) into a 2.5 to 100 g/L range (r = 0.9999) in a solution of 5% (v/v) nitric acid prepared from 65% acid distilled in a sub-boiling system (Distill acid, Berghof, Eningen, Germany). Serial dilutions were prepared for sample measurement: i) 0.1 mL/10 mL and ii) 0.2 mL/10 mL.. 2.5.3. Fourier Transformed Infrared (FT-IR) Spectroscopy Analysis The infrared spectra of fucan A and NFucAwere obtained using infrared spectroscopy via Fourier transform (IRAffinity-1 spectrometer, Shimadzu Corp., Kyoto, Japan) equipped with the IRsolution 1.20 software. Samples were mixed completely with the dried potassium bromide powder (KBr) and compressed. The sweep frequency range was 4000–400 cm−1. Representative spectra of three independent experiments are shown.. 2.5.4. Dynamic light scattering (DLS).

(35) 34 NFucA dispersions were prepared in water at 25 °C at a concentration of 1 mg/mL. The effective hydrodynamic diameter and zeta-potential of NFucA was measured by photon correlation spectroscopy using Brookhaven 90 Plus Nanoparticle Size Analyzer (Brookhaven Instruments Corporation, New York, USA). The zeta. potential was obtained by using a disposable capillary cell in automatic mode on the same instrument. Three independent experiments were performed, repeated measurements were performed (3 times) and values reported are average values. For stability experiments, the NFucA (1 mg/mL) was stored at 25 °C for up to 14 months, and measurements were taken every thirty days as described above. 2.5.5. Scanning electron microscopy (SEM) Size of the NFucAwas evaluated by scanning electron microscopy (SEM). 50 µL of the NFucA solution (1 mg/mL) was deposited onto a clean mica surface, allowed to dry at 25 ºC, and then observed in a Shimadzu electron microscope, model SSX550 (Shimadzu Corp., Kyoto, Japan). Representative image of three independent experiments is shown. 2.6. Cell culture and maintenance Human renal adenocarcinoma (786-0) cells (ATCC CRL-1932), murine melanoma (B16F10) cells (ATCC CRL-6475), human renal cells (HEK-293) (ATCC CRL-1573), murine fibroblasts cells (3T3) (ATCC CCL-92), canine kidney cells (MDCK), monkey kidney cells (Vero cells), Chinese hamster ovarian cells (CHO-K1), human uterine cervical carcinoma cells (SiHa) and human liver carcinoma cells (HepG2) were grown as previously described by Almeida-Lima et al. [9].. 2.7. Mitochondrial Reduction of MTT.

(36) 35 The cytotoxicity of fucan A and NFucAwere evaluated following the mitochondrial reduction of the MTT. Briefly, the assay was conducted to investigate the cellular enzyme’s capacity of reducing the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,59diphenyltetrazolium bromide (MTT) to formazan in cells with an active metabolism. The 1x104 cells (786-0; HEK-293; 3T3 or B16F10) were incubated in the presence of Minimum essential Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) (control), DMEM with fucan A (0.01; 0.025; 0.05; 0.1 mg/mL) or DMEM with NFucA (0.01; 0.025; 0.05; 0.1 mg/mL) at 37 °C for 24 h. In another sets of experiments 1x104 cells (MDCK; CHO-K1; HepG2; Vero or SiHa) were incubated with fucan A (0.025 or 0.05 mg/mL) or NFucA (0.025 or 0.05 mg/mL) under the same conditions described above. After, the medium was removed and MTT in DMEM was added. After 4 hours, the medium was aspirated and the formazan crystals were dissolved in ethanol 96%. Absorbance was measured at 570 nm [14].. 2.8. DAPI staining The changes in the nuclear morphology of 786-0 cells following exposure to NFucAwere examined using the DNA-specific fluorochrome DAPI. Cells were plated at a density of 3×104 cells/well in a 24-well plate and after 24 h of incubation, the cells were treated with DMEM (control) or DMEM with NFucA (0.025 mg/mL) for 24 h. Cells were washed with PBS and fixed with 4% paraformaldehyde in PBS for 30 min at room temperature. After washing twice with PBS, cells were maintained in PBS containing 0.1% Triton X-100 at room temperature for 30 min. Fixed cells were washed with PBS and stained with DAPI (1 μg/mL) solution for 30 min at room temperature. Nuclear morphology of necrotic cells with condensed/fragmented nuclei was examined under a fluorescent microscope (Nikon TE-Eclipse 300). Data presented are.

(37) 36 representative of those obtained in at least three independent experiments done in duplicates. 2.9. Annexin V-FITC/PI Double Staining and Analysis by Flow Citometry To evaluate the effects of NFucA particles on cell death, a FITC/Annexin V Apoptosis Kit was used, with Dead Cell Annexin FITC and propidium iodide (PI), for Flow Cytometry (Invitrogen, Catalog no. V13242). Cells were grown in 6-well plates until they reached confluence of 2 × 105 cells/mL and were then stimulated to enter G0 in a medium without serum for 24 h. Next, cells were to exit G0 by adding DMEM supplemented with 10% FCS, in the presence of fucanA (0.1 mg/mL) or NFucA (0.01 mg/mL). A negative control was prepared without the presence of fucan A or NFucA. After 24 h, 786-0 cells were trypsinized, collected and washed with cold PBS. The supernatant was discarded and cells were resuspended in 200 µL of 1× Binding Buffer. Five microlitres of Annexin V-FITC and 1 µL of PI solution (100 µg/mL) was added in 100 µL of cell suspension. Cells were incubated for 15 min at room temperature and kept under light protection. After the incubation period, 400 µL of binding buffer for annexin V 1× was added and cells were analyzed by flow cytometry (flow cytometer FASCANTO II, BD Biosciences), measuring fluorescence emission at 530–575 nm for annexin V and 630/22 nm for PI. A total of 10.000 events were acquired. FlowJo software V ×10.0.7 (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) was used for data analysis as described in Gomes et al. [14]. 2.10. Statistical Analysis All data has been expressed as the average ± standard deviation. Statistical analysis was conducted via a simple variation analyses (one-way ANOVA) followed by the Tukey-Kramer (p < 0,05) test. Statistical analysis were performed using GraphPadInStat® Software version 4.0 (GraphPad software, San Diego, CA, USA)..

(38) 37. 3. Results and Discussion 3.1. Extraction and characterization of fucan A Sulfated polysaccharides were extracted from S. schröederi seaweed (crude extract). Subsequently, the polysaccharides contained in this extract were separated into seven polysaccharide fractions using the method described by Rocha et al. [15]. Briefly, the extract was filtered and the filtrate fractionated by acetone precipitation as follows: 0.5 volume of ice-cold acetone was added to the solution under gentle agitation and maintained at 4° C for 24 h. The precipitate formed was collected by centrifugation (10,000 x g, 20 min), dried under vacuum, dissolved in distilled water, and analyzed. The operation was repeated by adding 0.6, 0.7, 0.9, 1.1, 1.3, and 2.0 volumes of acetone to the supernatant. The fractions were named according to the volume of acetone used as: F0.5v; F0.6v; F0.7v; F0.9v; F1.1v; F1.3v and F2.0v. Agarose gel electrophoresis analysis showed that the F0.6v fraction was rich in fucan A (Fig. 2) and the sulfated polysaccharides in this fraction were therefore separated by ion exchange chromatography into three new fractions (F0.7M; F1.0M; F1.5M). Fraction F1.0M, which contained the fucan A (Fig. 2) as described by Leite et al. [6] was subjected to gel filtration chromatography (Sephadex G-75) and the fractions 60-78 were pooled, dialyzed, freeze-dried, and subjected to agarose gel electrophoresis. As Fig. 2 shows, the electrophoretic mobility of fucan A after gel filtration was similar to that of fucan A obtained after ion exchange chromatography, which indicated that fucan A was purified..

(39) 38. Fig.2. Electrophoresis in 0.05M PDA buffer, pH 9.0, of fucan A obtained from different step of purification.F0.6 – fucan A-rich fraction obtained by acetone precipitation. F1.0 M -Fucan A obtained by ion exchange chromatography. FucA fucan A obtained from gel filtration.. Table 1 shows data obtained from the chemical analysis of the sample. The crude extract was rich in galactose, probably because of the presence of fucans B and C that have galactose as the main monosaccharide [7,15]. The molar ratios of the components of both fraction F1.0M and fucan A obtained after gel filtration were verysimilar to that of fucan A described by Leite et al. [6], which indicated that the fucan under analysis in the present study was indeed fucan A.. 3.2. Synthesis and characterization of silver nanoparticles with fucan A The synthesis of silver nanoparticles with fucan A (NFucA) was monitored by scanning the absorption in the region between 350 and 600 nm, at every 30 minuteinterval, for eight hours. However, one hour into the reaction, the values of optical density stabilized and remained constant until the end of the monitoring period.

(40) 39 (data not shown), which indicated that one hour is sufficient for the production of the silver nanoparticles with fucan A. The 350 – 600 nm wavelength range was used because it had been described as the range at which metal nanoparticles absorb light [16].. Table 1. Chemical composition of samples from different stages of purification of fucan A.. Samples. Total sugar. Crude Ex. F0.6v F1.0M Fuc A* Fuc A**. % 35 ±1.2 43 ±3.2 75 ±1.2 77 ±1.8 nd. Protein %. Phenolic compounds. Molar ratio Fuc. Xyl. GluA. Gal. Sulfate. 3.2 ±1.2 1.2 ±0.8 # # #. % 7.1 ±0.9 0.18 ±0.08 # # nd. 1 1 1 1 1. 0.80 0.60 0.30 0.32 0.33. nd 4.10 0.62 0.60 0.55. 1.80 0.21 # # #. 1.40 1.30 1.50 1.52 1.50. Fuc – fucose; Xyl – xylose; GlucA – glucuronic acid; Gal – galactose; nd – not determined; # - not found in the evaluated conditions. Fuc A* - fucan A obtained after gel filtration. Fuc A** - fucan A described by Leite and contributors [6]. Although the NFucAs had traces of protein and phenolic contaminants (as shown in Table 2), their content was lower than in the original fucan A. Moreover, only 7% of the nanoparticle was composed of silver, which indicated that the structure of the nanoparticle was almost entirely made up of the organic portion. The synthesis of silver nanoparticles containing fucan A was confirmed by infrared spectroscopy. Fig. 3 shows the spectra obtained with fucan A and with NFucA; their overlap clearly shows that the signals in the spectrum of fucanA are also present in the spectrum of NFucA. The exception is the signal at 1381 cm-1, which corresponds to the reduced silver [17]..

(41) 40 Table 2. Characteristics of NFucA.. Chemical composition. Physico-chemical parameters. Samples. Ag (%). Protein (%). Phenolics (%). Size (nm). Zeta Potential (mV). NFucA. 7.0. 0.01. 0.07. 210.44 ± 29.13. -18.82 ± 4.85. Fucan A. 0.0. 0.04. 0.18. #. #. NFucA size (nm) measured during 14 months* Mar. Apr. May. Jun. Jul. Ago. Sep. Oct. Nov. Dez. Jan. Feb. Mar. Apr. 210.4 208.2 215.1 207.5 209.3 203.5 201.4 210.8 208.5 209.1 213.2 220.9 215.4 215.8 # -– not determined. * The standard deviation in all measures was less than 10%.. The mean size of the NFucAwas determined by dynamic light scattering (DLS) and is shown in Table 2. The mean size of the NFucA was 210.44 ± 29.13 nm, which was larger than that reported for silver nanoparticles synthesized with fucoidan and carboxymethyl-curdlan (~ 80 nm) [18].. Fig.3. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) spectra of fucan A and NFucA.. However, the size of the latter was determined by scanning electron microscopy (SEM); in this technique, the particles are dehydratedand their sizes are therefore smaller.

(42) 41 than those observed when DLS is used [19,20]. The mean size of the NFucAs determined by SEM (Fig. 4) was 129 ± 12.24 nm, which is closed to silver nanoparticles synthesized with fucoidan and carboxymethyl-curdlan [18].. Coradeghini et al. [21] reported that very small nanoparticles could be very cytotoxic when compared to larger nanoparticles. Furthermore, large nanoparticles are not easily absorbed by tissues, which hinder their action on the target tissue [22]. Therefore, according to these authors, 20-200 nm nanoparticles are particularly indicated for in vivo applications and in some cases, such as the delivery of drugs to the liver, nanoparticles measuring up to 500 nm can also be used [22]. The size of the NFucAs is within this range and it is therefore expected that they are adequate for invivo applications.. Fig.4. Appearance of NFucA identified by scanning electron microscopy (SEM). The size of the NFucAswas measured by DLS at several intervals for a total period of 14 months. During this time, there was no statistically significant change in the size of the particles (Table 2). With regard to the stability of other polysaccharide.

(43) 42 nanoparticles, the literature reports 25 days for silver nanoparticles with chitosan and fucoidan [23], two months for nanoparticles prepared with fungal exopolysaccharides [24] and six months for silver nanoparticles prepared with sulfated seaweed polysaccharides [25]. Because no article was found describing nanoparticles with polysaccharides that are stable for more than nine months, we believe that NFucAs are the most stable particles described to date. Fig. 4 shows the size and the morphology of the formed NFucAs. They exhibit a spherical shape, a geometry that has been reported for other silver nanoparticles [16,26]. Nanoparticles can be amorphous or they can have different geometric forms, but several nanoparticles prepared with polysaccharides from different sources (plant [13, 27], fungi. [28], bacteria [29], animal [30-32]), including sulfated seaweed polysaccharides based nanoparticles [25], have a spherical shape. It is a positive fact that NFucAs are always sphere-shaped, because spherical nanoparticles are less cytotoxic than non-spherical nanoparticles such as triangular nanoparticles [33]. The zeta potential of NFucA, a measure of the difference between the surface charge of the nanoparticles and that of the solvent, was -18.82 ± 4.85 mV (Table 2). This negative value can be explained by the presence of sulfate groups in fucan A. There are many reports of nanoparticles synthesized with sulfated polysaccharides with negative zeta potential [30-32, 34]. Chauvierre et al. [34], for example, synthesized nanoparticles with several sulfated polysaccharides, such as sulfated heparin and dextran, and reported zeta potential values of approximately – 45 mV. The negative charge of the NFucAs may have been an important factor for their 14-month stability, because in an aqueous system, negative or positive charges added to.

(44) 43 the nanoparticles contribute to the repulsive force between them, thus preventing their aggregation and instability [35].. 3.3. Effect of NFucAs on cultured cells The effect of NFucAs on cells was assessed using two tumor cell lines, 786-0 (human renal adenocarcinoma) and B16F10 (murine melanoma), and normal cell lines HEK 293 cells (human renal cells) and 3T3 cells (murine fibroblasts) were used for comparison with the tumor cells. The data obtained in the experiments are shown in Fig. 5. Reduction of MTT by normal cells (HEK 293 and 3T3) was similar both in the presence of fucan A and in the presence of NFucA, which demonstrates that silver did not provide NFucA particles with toxic properties, at least against these cells. On theother hand, the presence of NFucA significantly decreased the ability of tumor cells to reduce MTT, which indicated that the nanoparticles had cytotoxic activity against these cells. 786-0 cells were the most affected because NFucA at 0.025 mg/mL resulted in a MTT reduction rate of only 20% when compared to that observed with the control (cells not exposed to fucan A or NFuc A). Although the B16F10 cells were also affected, the concentration of NFucA had to be doubled to obtain a 20% MTT reduction rate.. Renal adenocarcinoma (renal cancer) is the third major cause of urogenital tract cancer and corresponds to approximately 2% of cancer cases in adults [36]. The recommended treatment is the surgical removal of the tumor because these tumors are resistant to radiotherapy and chemotherapy [37]. The development of compounds that are toxic against renal adenocarcinoma cells is therefore highly desirable. In addition, the higher susceptibility of renal tumor cells to NFucAs and the non-toxicity of these nanoparticles against normal renal cells led to further investigation of the mechanism of the toxicity of NFucAs on 786-0 cells..

(45) 44. Fig.5. Percentage reduction of MTT by the cells in the presence of Fuc A or NFucA.Letters (a,b) represent the significant difference between concentrations of individual sample by the simple variance analyses (one-way ANOVA) followed by the Tukey– Kramer (p < 0.05) test. Different letters (x,y) indicate a significant difference (p < 0.05) between the same concentrations of different samples.. Fig. 6 shows the nuclei of 786-0 cells stained with DAPI. The nuclei (Fig. 6A) of cells not exposed to NFucAs are sphere-shaped, uniform in size and coloration, and without localized dye intensity. Conversely, the nuclei of cells treated with NFucAs exhibited spots that were more intensely colored than others were which indicated DNA fragmentation and aggregation. In addition, many nuclei exhibited a small size (pyknotic nuclei)..

(46) 45. Fig.6. Nucleus of 786-0 cells stained with DAPI. A–Cells grown in the absence ofNFucA. B – cells cultured in the presence of NFucA. Arrows indicate intensely stained and pyknotic nuclei. The morphology of the nuclei of cells treated with NFucAs and stained with DAPI suggested necrosis. To confirm this result, the cells were incubated with NFucAs and subsequently analyzed by flow cytometry. Fig. 7 summarizes the data obtained; the cells treated with fucan A were not stained with PI or annexin V, which confirmed the data obtained in the MTT assay, i.e., fucan A was not toxic against these cells at thetested concentration. However, the incubation of cells with NFucAs increased the number of cells stained with PI, without affecting the cell annexin V staining pattern of cells. This result suggests that NFucA particles induce cell death (necrosis) in 786-0 tumor cells..

(47) 46. Fig.7. Distribution of 786-0 cells marked with PI (necrosis) and annexin V (apoptosis)after incubation with Fuca or NFucA for 24 hours. This figure is representative of three separate tests made independently.. To investigate whether NFucAs had a toxic effect on other cells of the urogenital tract, the NFucAs were incubated (0.025 and 0.10 mg/mL) with canine kidney cells (MDCK), monkey kidney cells (Vero cells), Chinese hamster ovarian cells (CHO-K1), human uterine cervical carcinoma cells (SiHa), and human liver carcinoma cells (HepG2). Although the latter are tumor cells, they are used as a model to assess the hepatotoxicity of compounds. Only the SiHa cells were affected by the NFucAs, as shown in Fig. 8. However, the cytotoxic effect of the NFucAs on these cells was less pronounced than on the 786-0 cells (Fig. 5). Moreover, the nanoparticles were not toxic against the other two models of kidney cells, which demonstrate that the NFucAs are highly specific for renal adenocarcinoma cells..

(48) 47. Fig.8. NFucA effect on MTT reducing ability of different cells. To the best of our knowledge, this the first paper that describe the synthesis of silver nanoparticle based on fucan, thus, we cannot compare our data to those already published. However, the synthesis of cytotoxic silver nanoparticles based on polysaccharide-rich extract from seaweeds has been previously described by other authors [38]. In this study, the cytotoxicity of silver nanoparticles prepared with fucanrich extract against HepG2, MCF-7, HeLa, and Jurkat cells [38] was similar to that obtained with the NFucAs tested in the present study. Moreover, this extract showed lower cytotoxicity than the its silver nanoparticles. These data indicate that the union of fucans with silver in the form of nanoparticles enhances the cytotoxic action of fucans. 3.4. Effect of silver on cultured 786-0 cells The observation that fucanA alone was not toxic against 786-0 cells led to the investigation of the extent to which the toxicity of the NFucA particles against 786-0 cells was dependent on silver. Table 2 shows that the silver content in the NFucAparticles was 7.0%, i.e., the concentration of silver in 0.025 mg/mL of NFucA was 0.00175 mg/mL. Thus, the 786-0 cells were incubated with silver nitrate at three.

(49) 48 distinct concentrations (0.00175; 0.0250 or 0.050 mg/mL) to determine the toxic effect of the salt on the cells. Fig. 9 shows that silver nitrate was not toxic against 786-0 cells at a concentration of 0.00175 mg/mL. The cells' ability to reduce MTT was less affected by the silver nitrate than by the nanoparticles, even at a concentration of silver nitrate similar to that used in the NFucAs. This result shows that the ability of the NFucAs to induce cell death does not depend on one of their components alone but rather on the combination of the organic and inorganic portions.. Fig.9. Silver and NFucA effect on MTT reduction capacity of the 786-0 cells. *(p<0.05); ** (p<0.001). It has been shown that nanoparticles prepared with fucans induce osteosarcoma cell death largely than fucans alone, taking into account the concentrations used [39]. However, the mechanism of cell death induction has not been explained. A general mode of action has been proposed for the bactericidal action of silver nanoparticles in which the silver nanoparticles act as a reservoir of silver ions and the gradual release of.

(50) 49 these ions inside bacteria causes damage to the membranes, thereby increasing the permeability and leading to death [40]. It is therefore proposed that fucans in the NFucAs facilitate the entry of these nanoparticles in the 786-0 cells. The NFucAs then dissolve inside the cells and the silver is released, thus leading to cell death. The fact that fucans bind to the surface of tumor cells and are subsequently internalized via a mechanism that is still not yet understood [41] and that nanoparticles synthesized with fucans also have this ability tobe internalized, as shown by Lira et al. [42], confirms this hypothesis. Further studies should confirm this hypothesis and shed light on the mechanism of cell death induction by NFucAs. 4. Conclusion The synthesis of stable nanoparticles with silver and fucanA polysaccharide was successful. These nanoparticles exhibited a higher cytotoxicity against tumor cells, especially human renal adenocarcinoma cells (786-0), than against non-tumor cells. We also confirmed that NFucAs induce the necrosis of 786-0 cells but were not toxic against various non-tumor kidney cells.. Acknowledgments The authors wish to thank Conselho Nacional de DesenvolvimentoCientífico eTecnológico-CNPq (National Council for Scientific and Technological Advancement, inloose translation), Coordenacão de AperfeiçoamentoPessoal de Nível SuperiorCAPES (Higher Level Personal Development Coordination, in loose translation) and the Ministerio de Ciência, Tecnologia e Informação (MCTI–the Science and TechnologyMinistry in Brazil), as well, for the financial support. RonyViana, Dayanne Lopes, SamantaChiqueti and Jailma Lima have scholarship from CAPES. Hugo Rocha.

(51) 50 is a CNPq fellowship honored researcher. Monica Amorim had a scholarship from CAPES.. Conflicts of Interest The authors declare no conflict of interest. References [1] M.F. de Jesus Raposo, A.M. de Morais, R.M. de Morais, Marine polysaccharidesfromalgaewithpotentialbiomedicalapplications, Mar Drugs. 13 (2015) 2967–3028. [2] O. Berteau, B. Mulloy, Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide, Glycobiology. 13 (2003) 29R–40R. [3] M.S. Patankar, S. Oehninger, T. Barnett, R.L. Williams, G.F. Clark, A revised structure for fucoidan may explain some of its biological activities, J. Biol. Chem. 268 (1993) 21770–21776.. [4] I.N. Queiroz, X. Wang, J.N. Glushka, G.R. Santos, A.P. Valente, J.H. Prestegard, et al., Impact of sulfation pattern on the conformation and dynamics of sulfated fucan oligosaccharides as revealed by NMR and MD, Glycobiology. 25 (2015) 535–547. [5] G. Jiao, G. Yu, J. Zhang, H.S. Ewart, Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae, Mar Drugs. 9 (2011) 196–223. [6] E.L. Leite, M.G.L. Medeiros, H.A.O. Rocha, G.G.M. Farias, L.F. Silva, S.F. Chavante, et al. Structure of a new fucan from the algae Spatoglossumschröederi, Plant Science. 132 (1998) 215–228..

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