Germinação de Stevia rebaudiana Bert

A U R E A M A R I A R A N D r ' " G E R M I N A Ç Ã O DE S T E V I A R E B A U D I A N A B E R T . " ' I * • • T e s e de M e s t r a d o a p r e s e n t a d a ao I n s t i t u t o de B i o l o g i a - D e p a r t a ­ m e n t o de F i s i o l o g i a V e g e t a l - da U n i v e r s i d a d e E s t a d u a l dè C a m p i n a s O r i e n t a d o r : Gil M. F e l i p p e - 1 9 8 0 P r©ibídô.

A G R A D E C I M E N T O S A o Dr. Gil M a r t i n s F e l i p p e p e l a s ua d e d i c a d a o r i e n t a ç ã o , i n c e n t i v o e a m i z a d e . A F u n d a ç ã o de A m p a r o ã P e s q u i s a do E s t a d o de S ã o P a u i o p e l o a p o i o f i n a n c e i r o , qu e t o r n o u p o s s í v e l a r e a l i z a ç ã o d e s t e t r a b a l h o . * A o s p r o f e s s o r e s , f u n c i o n á r i o s e e s t a g i á r i o s d o D e p a r t a m e n t o de F i s i o l o g i a V e g e t a l da U n i v e r s i d a d e E s t a d u a l de • a s C a m p i n a s , b e m c o m o as Dr . T h e r e z i n h a S. M e l h e m e Son.iaf>,M. C* D i e t r i c h do i n s t i t u t o de B o t â n i c a de S ã o P a u l o , p e l o a p o i o e £ m i z a d e .

 J a c i n t a de F a t i m a P r a d a L o u r e n ç o pel o seu cuj_ d a d o na d a t i l o g r a f i a d e s t e t r a b a l h o , e x e c u t a d o na S e ç ã o de Fi- t o e c o l o g i a d o i n s t i t u t o de B o t â n i c a , a q u e m e s t e n d o m e u s a g r a ­ d e c i m e n t o s .

Í N D I C E I N T R O D U Ç Ã O ... . ... .. . ... ... . . 1 M A T E R I A L E M É T O D O S ... ... •••••• *9 M A T E R I A L ... ... ... •.••••• M É T O D O S ... ... 19 A . G e rm i na ç i o ... . 9 B. C l a r i f i c a ç ã o de a q u ê n i o s de S t e v i a ... . 27 C. E f e i t o d o e s t e v i o s í d e o em g e r m i n a ç ã o ... D. E x t r a ç ã o de s u b s t â n c i a s e n d ó g e n a s ... . '29 1. S e p a r a ç ã o dos a q u ê n i o s ... -29 2. M é t o d o de e x t r a ç ã o ... ... . |4> 3. B i o e n s a i o u t i l i z a d o . . . . ... . k. R e v e l a ç ã o de s u b s t â n c i a s e n d ó g e n a s por méitod.of q u í m i c o s ... ... ... . 32 E. A n á l i s e e s t a t i s t i c a ... ... . 35 R E S U L T A D O S ... ... . 36 A. G e r m i n a ç ã o ... . 36 1 . E f e i t o de l u z ... ... . 36 1.1. G e r m i n a ç ã o em luz b r a n c a c o n s t a n t e e r o c o n s t a n t e ... ... . . 36 1.2. E f e i t o de l u z es de d i f e r e n t e s c o m p r I m ^ n T tos de o n d a ... ... . 37 1.3. E f e i t o de c h o q u e s de v e r m e l h o ... ... 38

1.3*1 • C h o q u e s l o n g o s de v e r m e l h o em a q u ê n i o s sem p r é v i a e m b e b i ç ã o no e s c u ­ ro c o n s t a n t e ... . . 38 I . 3 .2 . C h o q u e s c u r t o s de v e r m e l h o após 48 h o r a s de e m b e b i ç i o no e s c u r o ... ... 38 1 .3-3* R e v e r s ã o v e r m e l h o - v e r m e l h o e x t r e m o . . . . 38 1 .3*4. R e v e r s ã o v e r m e l h o e x t r e m o - l u z b r a | c a ... ... ... ... 39 1 * 3 . 5 . R e v e r s ã o de v e r m e l h o p e l o a z u l . . . 39 2* E f e i t o de t e m p e r a t u r a . . . . ... ... 40 2.1. E f e i t o de t e m p e r a t u r a c o n s t a n t e na g e r m i ­ n a ç ã o . ... ... ...40 2.2. E f e i t o de t e m p e r a t u r a s a l t e r n a d a s na g e r ­ m i n a ç ã o no e s c u r o c o n s t a n t e ... . * 41 2.3* C h o q u e de t e m p e r a t u r a b a i x a ... . ; w 41 2.4. C h o q u e de t e m p e r a t u r a a l t a ... . . 1 . i . . i 42 3. E f e i t o de s u b s t â n c i a s r e g u l a d o r a s d e cresciínen to na g e r m i n a ç ã o . . . ... ... ... ..43 3 .1 * E f e i t o de á c i d o g i b e r é l i c o ( G A ^ ) . . . ... ..43 3 - 2 . E f e i t o de 6 b e nz il a d e n i n a ( 6 B A ) ... ..43 3 . 3 . E f e i t o d e á c i d o i n d o 1~ 3 - a c é t i c o ( A I A ) ... ..44 3 . 4. E f e i t o de á c i d o 2 - c 1 o r o e t i 1f o s f ô n i c o ( E t r e l ) ...44 3 . 5. E f e i t o de á c i d o a b s c f s i c o ( A B A ) ... ..44 B. O b s e r v a ç ã o de a q u ê n i o s c l a r i f i c a d o s ... ..45 C. E f e i t o de e s t e v i o s f d e o em g e r m i n a ç ã o ... ..45 D. D e t e c ç ã o de e s t e v i o s f d e o ... ... ..46 E. S u b s t â n c i a s r e g u l a d o r a s de c r e s c i m e n t o ... ..47

1. D e t e c ç ã o por t e s t e s de c r e s c i m e n t o . . . ... .. 47 2. R e v e l a ç ã o por m é t o d o s q u í m i c o s ... .. 47 D I S C U S S Ã O ... ... ... ... 54 R E S U M O ... ... ... .. 70 S U M M A R Y ... ... ... ... . ... .. 72 B I B L I O G R A F I A . ... ... ... .. 74

I N T R O D U Ç Ã O O p r o c e s s o de g e r m i n a ç ã o de s e m e n t e s de p l a n t a s s u p e r i o r e s e n v o l v e uma s é r i e de e t a p a s q u e i n d u z e m uma s e m e n t e q u i e s c e n t e , c o m um b a i x o c o n t e ú d o de á g u a a a p r e s e n t a r um a u ­ m e n t o ger a l da a t i v i d a d e m e t a b ó l i c a e i n i c i a r o d e s e n v o l v i m e n ­ to de uma p l ã n t u l a , a p a r t i r do e m b r i ã o . 0 m o m e n t o e x a t o no qual a g e r m i n a ç ã o t e r m i n a e o c r e s c i m e n t o c o m e ç a ê e x t r e m a m e n ­ te d i f í c i l de ser d e f i n i d o . G e r a l m e n t e , a g e r m i n a ç ã o ê i d e n t i ­ f i c a d a pela p r o t u s ã o de a l g u m a p a r t e do e m b r i ã o a t r a v é s da cas_ ca da s e m e n t e , o q u e é r e s u l t a d o do c r e s c i m e n t o . Em m u i t a s s e ­ m e n t e s , o b s e r v a - s e i n i c i a l m e n t e a p r o t u s ã o da r a d í c u l a ( B R O WN , 1 972). Em c e r t o s c a s o s , u ma s e m e n t e v i á v e l p o d e nã o g e r m i n a r . Os f a t o r e s que r e g u l a m o p r o c e s s o de g e r m i n a ç ã o são c h a m a d o s de a g e n t e s de g e r m i n a ç ã o . U ma s e m e n t e e s t á q u i e s c e n t e q u a n d o n ã o sã o f o r n e c i d o s a ela os a g e n t e s n e c e s s á r i o s pa r a q u e se d e s e n c a d e i e m os p r o c e s s o s m e t a b ó l i c o s q u e c u l m i n a m com a g e r m i n a ç ã o . Uma s e m e n t e q u i e s c e n t e g e r m i n a r á q u a n d o s u b m e t i ­ da a c o n d i ç õ e s f a v o r á v e i s de u m i d a d e , t e m p e r a t u r a e aera çã o ,f a ^ t o r e s e s s e s c h a m a d o s de a g e n t e s n ã o e s p e c í f i c o s . U ma s e m e n t e d o r m e n t e r e q u e r e s t í m u l o s a m b i e n t a i s e s p e c í f i c o s , ne m s e m p r e c o n s t a n t e s , m a s q u e d e t e r m i n a m sua g e r m i n a ç ã o . Os m e c a n i s m o s j_ n i b i t ó r i o s m a i s c o m u n s na d o r m ê n c i a de s e m e n t e s i n c l u e m a i m ­ p e r m e a b i l i d a d e da c a s c a , p e r í o d o s de a m a d u r e c i m e n t o e fotoblas_ t i s m o ( s e n s i b i l i d a d e ã luz). A luz v e r m e l h a q u e b r a a d o r m ê n c i a de s e m e n t e s f o t o b 1á s t i c a s p o r q u e induz n í v e i s a d e q u a d o s de f

i-2 t o c r o m o na f o r m a Fve, f i t o c r o m o v e r m e l h o e x t r e m o (JANN e A M E N , 19 77 ) . 0 f o t o b 1 a s t i s m o de s e m e n t e s já h a v i a s i d o v e r i ­ f i c a d o hl m u i t o te m po , e m b o r a suas b a s e s f i s i o l ó g i c a s f o s s e m d e s c o n h e c i d a s . Em 1860 , C a s p a r y (SMITH, 1975) o b s e r v a r a q ue s^e m e n t e s de Bull-iavda aquat-ica n ã o g e r m i n a v a m na a u s ê n c i a de luz. A i n d a no f i m do s é c u l o X I X e i n T c i o d o s é c u l o XX h a v i a e v i d ê n c i a s de q u e a luz b r a n c a a f e t a v a a g e r m i n a ç ã o de d o i s m o d o s : e s t i m u l a n d o a g e r m i n a ç ã o de c e r t a s s e m e n t e s e j_ n i b i n d o a de o u t r a s . 0 f a t o da luz b r a n c a a f e t a r a g e r m i n a ç ã o de s e m e n t e s levou a d i v e r s o s e x p e r i m e n t o s , u s a n d o - s e d i f e r e n ­ tes e s p e c t r o s l u m i n o s o s . C o m p r i m e n t o s de o n d a a b a i x o de 290 nm i n i b i a m a g e r m i n a ç ã o de t o d a s as s e m e n t e s t e s t a d a s . C o m p r i m e n ­ tos de o n d a e n t r e 290 nm a 400 nm não a p r e s e n t a v a m e f e i t o s nf- t i d o s s o b r e a g e r m i n a ç ã o . E n t r e 560 nm e 700 nm e e s p e c i a l m e n ­ te luz v e r m e l h a , o b s e r v o u - s e p r o m o ç ã o da g e r m i n a ç ã o ( M A Y E R e P O L J A K O F F - M A Y B E R , 1975). S ã o c h a m a d a s s e m e n t e s f o t o b 1ã s t i c a s p o s i t i v a s as q u e g e r m i n a m na p r e s e n ç a de luz e f o t o b 1 á s t i c a s n e g a t i v a s as q u e g e r m i n a m na a u s ê n c i a de luz. F L I N T e M C A L L I S T E R (1935, 1937) u s a n d o s e m e n t e s f o t o b 1 á s t i c a s p o s i t i v a s de a l f a c e , c o n s t a t a r a m q u e a p r o m o ç ã o de g e r m i n a ç ã o o c o r r i a em luz v e r m e l h a c om um p i c o a 670 nm e q u e a i n i b i ç ã o m á x i m a o c o r r i a no v e r m e l h o e x t r e m o c om um p i c o a 7 6 0 nm . W A R E I N G e B L A C K ( 1957, 1958) e E V E N A R I , N E U M A N e S T E f N (1957) m o s t r a r a m q u e a luz azul p o d e r i a i n i b i r a germ_i_ n a ç ã o , m a s sob c e r t a s c o n d i ç õ e s a luz azul p o d e r i a t a m b é m e s t i

-3 mu 1 ar . B O R T H W I C K e_t _a]_ (1 952) m o s t r a r a m q u e s e m e n t e s de a l f a c e c u j a g e r m i n a ç ã o h a v i a s i d o e s t i m u l a d a pe l a luz v e r m e lha p o d e r i a m ser i n i b i d a s pe l a s u b s e q u e n t e i l u m i n a ç ã o c o m v e r ­ m e l h o e x t r e m o . 0 f i t o c r o m o , p i g m e n t o r e s p o n s á v e l p e l a s r e s p o s ­ tas f o t o b 1 á s t i c a s em s e m e n t e s ,e x i s t e em d u a s f o r m a s f o t o c o n v e r s í v e i s : f i t o c r o m o v e r m e l h o (Fv) e f i t o c r o m o v e r m e l h o e x t r e m o (Fve) . A f o r m a a t i v a é o Fve, ou se ja, q u a n d o s e m e n t e s são e m ­ b e b i d a s s ob luz v e r m e l h a , a 660 nm, o f i t o c r o m o q u e se a c h a v a na f o r m a i n a t i v a Fv se c o n v e r t e p a ra a f o r m a a t i v a Fve d e t e r m i n a n d o a g e r m i n a ç ã o . S o b a ç ã o do v e r m e l h o e x t r e m o (730 nm) o fi t o c r o m o q u e e s t a v a na f o r m a a t i v a F ve se c o n v e r t e ã f o r m a i n a ­ t iv a Fv . A a l t e r n â n c i a de e x p o s i ç ã o â luz v e r m e l h a ou ao v e r m e l h o e x t r e m o vai i n d u z i r p r o m o ç ã o ou i n i b i ç ã o da g e r m i n a ­ ç ã o s e n d o q u e a r e s p o s t a final é d e t e r m i n a d a p e l a ú l t i m a e x p o ­ s i ç ã o ou s e j a , luz v e r m e l h a na ú l t i m a e x p o s i ç ã o p r o m o v e a g e r ­ m i n a ç ã o e v e r m e l h o e x t r e m o inibe. Na v e r d a d e , p a ra se a f i r m a r q u e d e t e r m i n a d o f e n ô m e n o e s t á sob a a ç ã o do f i t o c r o m o , é precj_ so m o s t r a r a r e v e r s ã o v e r m e 1 h o - v e r m e 1ho e x t r e m o . V á ­ rios a u t o r e s m o s t r a r a m e s s a s r e s p o s t a s em s e m e n t e s d e v á r i a s e s p é c i e s c o m o t o m a t e e p e p i n o ( Y A N I V, M A N C I N E L L I e S M I T H , 1967), R u m e x o b t u s i f o t i u s ( I S I K A W A e FUJ I I , 1961; V I C E N T E , EN- G E L H A R D T e S I L B E R S C H M I DT , 1962) e C u o u m i s a n g u v i a ( N O R O N H A , VJ_ C E N T E e S I L B E R S C H M I D T , 1971; N O R O N H A , V I C E N T E e F E L I P P E , 1978). S e m e n t e s f o t o b 1á s t i c a s p o s i t i v a s q u a n d o s ec a s , a p r e s e n t a m um c e r t o nível de f i t o c r o m o na f o r m a F v . Fv n ã o p o ­

4

de ser r e v e r t i d o a Fve na s e m e n t e d e s i d r a t a d a e por e s s e m o t i ­ v o é n e c e s s á r i o um p e r í o d o de e m b e b i ç i o q u e t o r n e a s e m e n t e

p o A C U _Qj jJL ou (JX M Â As

m a i s s e n s í v e l a luz, ou s e ja, o&oi r ie a r e v e r s ã o de Fv a Fve ( K E N D R I C K , 1 976). Há a l g u m a s e v i d ê n c i a s p a r a a s í n t e s e de f i t o c r o m o em s e m e n t e s . Em A m a r a n t h u s , K E N D R I C K e F R A N K L A N D (1968) o b s e r v a r a m d u a s f a s e s no a u m e n t o do f i t o c r o m o em s e m e n t e s e m b e b i d a s a 25°C. A p r i m e i r a o c o r r e e n t r e a o i t a v a e a d é c i m a hora e ê s e g u i d a de u ma f a s e de l a t ê n c i a a p ó s a qual o c o r r e um g r a n d e a u m e n t o no nível de f i t o c r o m o , c u l m i n a n d o c om a germina_ ção. A p r i m e i r a f a s e é u ma f a s e de r e i d r a t a ç ã o do f i t o c r o m o já e x i s t e n t e e a s e g u n d a f a s e é d e v i d o 'à s í n t e s e de f i t o c r o m o . S t e v i a r e b a u d i a n a B e r t o n i é uma c o m p o s t a o r i g i n £ ria do N o r d e s t e d o P a r a g u a i ( B E R T O N I , 1899; B E R T O N I , 1 918). No B r a s i l , e s s a p l a n t a foi e n c o n t r a d a no a t ual E s t a d o do M a t o G r o s s o do Sul, em P o n t a P o rã , na d i v i s a c o m o P a r a g u a i ( S C H M E - L I NG, 1967). S u a s f o l h a s p o s s u e m s a b o r m a r c a d a m e n t e d o c e , fa_ to e s s e já há m u i t o c o n h e c i d o p e l o s i n d í g e n a s d o P a r a g u a i , q u e a c h a m a m , em g u a r a n i , de c a - á - j h e l ou c á - i - y u p i ( T H O M A S , 1937) ou de k a a - h e ( F L E T C H E R , 1955), que qu e r d i z e r e r v a d o c e . E s s es i n d í g e n a s u t i l i z a m f o l h a s s e c a s e s e g m e n t o s de c a u l e de S t e v i a p a r a a d o ç a r b e b i d a s ( B E R T O N I , 1899; T H O M A S , 1937; F L E T C H E R , 1955; B R U C H E R , 1 97 4 ). M u l h e r e s i n d í g e n a s t a m b é m u t i l i z a m i n f u ­ s õe s de f o l h a s d e s s a p l a n t a p a r a f i n s a n t i c o n c e p c i o n a i s ( P L A ­ NAS e KUC , 1 968; B R U C H E R , 1974; A K A S H I e Y O K O Y A M A , 1 975). Em 1900, R E B A U D I r e f e r i u - s e à e x i s t ê n c i a de uma s u b s t â n c i a d o c e , e x t r a í d a das f o l h a s de S t e v i a , q ue d e c l a r o u ser um g l u c o s í d e o , a g l i c i r r i z i n a ( B E R T O N I , 1918; B R I D E L e

LA-5 V I E I L L E , 1 931a, b; B R U C H E R , 1971). I n i c i a l m e n t e , B e r t o n i c l a s s i f i c o u a p l a n t a c o m o E u p a t o r i u m r e b a u d i a n u m ( B R I D E L e L A V I E 1 L L E , 1 931a, c, d; R0BIN_ SON, 1930). Na E u r o p a , a p l a n t a foi m e n c i o n a d a pe l a p r i m e i ­ ra v e z no K e w B u l l e t i n ( G O S L I N G , 1901). E x a m i n a n d o o m a t e r i a l f o r n e c i d o por G o s l i n g , os c i e n t i s t a s de Kew, b a s e a n d o - s e nas c a r a c t e r í s t i c a s f l o r a i s da p l a n t a , a c r e d i t a r a m que ela f o s s e u_ ma S t e v i a e nã o um E u p a t o r i u m . Em 1 905 , ao p u b l i c a r u m a tradu_ ç ã o dos t r a b a l h o s de R e b a u d i , B e r t o n i t r a n s f e r i u a p l a n t a do g ê n e r o E u p a t o r i u m p a r a o g ê n e r o S t e v i a ( F E L I P P E , 1 9 7 7 a ) . 0 e s t e v i o s í d e o , um g l u c o s í d e o 300 v e z e s m a i s d £ ce que a s a c a r o s e ê a s u b s t â n c i a e n c o n t r a d a em S t e v i a reba.udia_ na, q u e lhe c o n f e r e o s a b o r d o c e ( B R I D E L e L A V I E I L L E , 19 3 1a , b , c , d) . P e l o f a t o das f o l h a s de S t e v i a r e b a u d i a n a a p r e ­ s e n t a r e m g r a n d e s q u a n t i d a d e s de e s t e v i o s í d e o , c e r c a de 7 por c e n t o d o p e s o s e c o d as m e s m a s ( B R I D E L e L A V I E I L L E , 1 9 3 1 a ) , e s s a p l a n t a p a s s o u a ter g r a n d e i n t e r e s s e e c o n ô m i c o i v i s t o que o e s ­ t e v i o s í d e o p o d e r á ser u t i l i z a d o c o m o a d o ç a n t e d e s p r o v i d o de va lor c a l ó r i c o ( P O M A R E T e L A V I E I L L E , 1 931). Uma v e z q u e os ci- c l a m a t o s f o r a m p r o i b i d o s e a s a c a r i n a p o d e r á ser r e t i r a d a do m e r c a d o ( C O H EN , 1978) m a i s u m a vez o e s t e v i o s í d e o t o r n a - s e uma o p ç ã o na s u b s t i t u i ç ã o d e s s e s a d o ç a n t e s s i n t é t i c o s . C o m o o e s t e v i o s í d e o p o s s u i p o d e r a d o ç a n t e e x t r e m a m e n t e a l t o e n ã o é f e r m e n t á v e l p e l o o r g a n i s m o h u m a n o ( B E R T O - Nl, 1918; T H O M A S , 1937; P O M A R E T e L A V I E I L L E , 193Í) isso o t o r ­ na v a n t a j o s o c o m r e l a ç ã o ao a ç ú c a r c o m u m e a os a d o ç a n t e s s i n t £

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t i c o s . E um a d o ç a n t e em p o t e n c i a l pa r a as i n d u s t r i a s de a l i m e n tos .

0 i n t e r e s s e i n d u s t r i a l p e l o e s t e v i o s í d e o ê o fa tor q u e t em e s t i m u l a d o o c u l t i v o de S t e v i a r e b a u d i a n a no J a ­ pão, C o r é i a do Sul e m e s m o em a l g u m a s r e g i õ e s do B rasil ( F E L I £ P E > 19 7 7b ; F E L I P P E , 1978) . No J a p ã o f o r a m r e a l i z a d a s v i r i a s p e s q u i s a s o n d e o e s t e v i o s f d e o foi m i n i s t r a d o a r a t o s e foi m o s t r a d o q u e e s s e g l u c o s f d e o n ão é t ó x i c o e não a p r e s e n t a p r o p r i e d a d e s a n t i c o n ­ c e p c i o n a i s (AKASHI e Y O K O Y A M A , 1 97 5a , b; KATO, 1975). A s s i m , n e s s e p a fs já hã p r o d u ç ã o c o m e r c i a l p el a T o y o M e n k a L a r i s h a Co. ( P A R K E R , 1978) e há v á r i o s t r a b a l h o s q u e e s p e c u l a m s o b r e a p o s s í v e l u t i 1 i z a ç ã o i n d u s t r i a 1 c o m o s u b s t i t u t o do a ç ú c a r e sa-JL, c a r i n a (ISI M A, 1976; F E L I P P E , 1977c; P A R K E R , 1978). E S T U D O S B I O Q U Í M I C O S EM S T E V I A R E B A U D I A N A Os e s t u d o s b i o q u í m i c o s em S t e v i a r e b a u d i a n a t i ­ v e r a m i n í c i o c o m R e b a u d i , em 1900, q u a n d o e s t e m e n c i o n a um g l £ c o s í d e o , nas f o l h a s de S t e v i a , q u e c h a m o u de g l i c i r r i z i n a (BER^ T O N I , 1918; B R I D E L e L A V I E I L L E , 1 931a, b; B R U C H E R , 1 9 7 M -Em 1908, R A S E N A C K c r i s t a l i z o u uma s u b s t â n c i a de s a b o r d o c e, das f o l h a s de S t e v i a . Essa s u b s t â n c i a era s o l úv e l em á g u a , á l c o o l e t í l i c o e d i f i c i l m e n t e s o l ú v e l em a c e t o n a ou á 1 c o o 1 m e t í 1 i c o .

D I E T E R I C H (1909) i s ol o u d u a s s u b s t i n c i a s d o c e s de f o l h a s e c a u l e s de S t e v i a r e b a u d i a n a , q u e c h a m o u de e u p a t o - r in e e r e b a u d i n e . E u p a t o r i n e era 150 v e z e s m a i s d o c e q u e a

sa-7 c a r o s e e s o l ú v e l em e t a n o l , e n q u a n t o q ue r e b a u d i n e era 180 v e ­ zes m a i s d o c e q u e a s a c a r o s e e i n s o l úv e l em e t a n o l . A r e s o l u ç ã o do p r o b l e m a a r e s p e i t o da s u b s t â n ­ c ia d o c e p r e s e n t e em S t e v i a v e b a u d i a n a c o u b e , e n t r e t a n t o , a B R I D E L e L A V I E I L L E (1931a) q u e c o n s e g u i r a m c r i s t a l i z a r o e s t e - v i o s í d e o por m e i o de e x t r a ç ã o a 1coól i c a - a q u o s a de f o l h a s . Eles o b t i v e r a m 60 a 65 g d e s s e g l u c o s í d e ó por Kg de f o l h a s s e c a s de S t e v i a , q u e c o r r e s p o n d e m a 7 por c e n t o do p e s o s e c o d as m e s ­ mas., V e r i f i c a r a m q u e e s s a s u b s t â n c i a t i n h a s a b o r d o c e q u a n d o em p e q u e n a s d o s e s , ma s q u e se t o r n a v a a m a r g o q u a n d o em g r a n d e s d o s e s . 0 p o n t o de f u s ã o d e s s a s u b s t â n c i a foi e s t a b e l e c i d o e n ­ tre 2 3 8 - 2 3 3 ° C . Essa s u b s t â n c i a era s o l ú v e l em e t a n o l , m e t a n o l e á g u a , p o r é m i n s o l ú v e l em é t e r de p e t r ó l e o e c l o r o f ó r m i o . Es- t e v i o s í d e o era a s u b s t â n c i a q u e D I E T E R I C H (1 909) c h a m a v a de ej£ p a t o r i n e e r e b a u d i n e era c o n s t i t u í d a de u ma m i s t u r a de e s t e v io s í d e o e s u b s t â n c i a s o r g â n i c a s e i n o r g â n i c a s . * Por m e i o de h i d r ó l i s e c o m á c i d o s u l f ú r i c o 5 por c e n t o a 100°C, d u r a n t e tres h o r a s , B R I D E L e L A V I E I L L E (1931a, e) o b t i v e r a m uma f r a ç ã o g l u c o s í d i c a e o u t r a nã o g l u c o s í d i c a . A aglucona ê o i s o s t e v i o l . A f r a ç ã o g l u c o s í d i c a a p r e s e n t a a p e n a s D - g l i c o s e . 4 0 , 3 8 por c e n t o con s t i tu i m - s e de f r a ç ã o não glucídj_ ca e 6 7 , 0 8 por c e n t o de g l u c í d i c a . A h i d r ó l i s e de e s t e v i o s í d e o é p o s s í v e l t a m b é m por via e n z i m ã t i c a u t i l i z a n d o - s e s u c o de he- p a t o p â n c r e a s de H e l i x p o m a t i a , o q u e foi v e r i f i c a d o p e l o s m e s ­ m o s a u t o r e s . E n t r e t a n t o , a h i d r ó l i s e e n z i m á t i c a a p r e s e n t o u uma d i f e r e n ç a q u a n d o c o m p a r a d a â h i d r ó l i s e á c i d a . Na p r i m e i r a , o b - t e v e - s e uma f r a ç ã o n ão g l u c í d i c a d e n o m i n a d a de e s t e v i o l e uma f r a ç ã o g l u c í d i c a . Na s e g u n d a , a f r a ç ã o n ão g l u c í d i c a foi d e n o

-8 m i n a d a de i s o s t e v i o l (B RI DEL e L A V I E I L L E , 1 931c; W O O D et al, 19 55 ) , uma v e z q ue e s s e t r a t a m e n t o p r o v o c o u u ma i s o m e r i z a ç ã o do e s t e v i o l a i s o s t e v i o l . Os a u t o r e s d e f i n i r a m a f ó r m u l a do es teviol c o m o s e n d o ^ 2 0 ^30^3 8 a e s t e v i o s í d e o c o m o s e n d o ^ 3 8 ^ 6 0 ^ 1 8 * ^ m o l é c u l a do e s t e v i o s í d e o s e r i a c o n s t i t u í d a por u- ma m o l é c u l a de e s t e v i o l l i g a d a a tres m o l é c u l a s de g l u c o s e . Em I9 3 I, a m o r t e p r e m a t u r a de Bridei pôs fim à f a s e inicial de p e s q u i s a s b i o q u í m i c a s s o b r e o e s t e v i o s í d e o , que s o m e n t e f o r a m r e t o m a d a s na d é c a d a de 1 950 p e l o " N a t i o n a l lnstj_ t ut e of A r t h r i t i s a nd M e t a b o l i c D i s e a s e s " , em B e t h e s d a , M a r y l a n d . Na é p o c a , i n t e r e s s e s m é d i c o s a r e s p e i t o de s u b s t â n ­ c i a s a n t i a r t r í t i c a s i n c l u i r a m e s t u d o s em S i e v i a r e b a u â i a n a ,com o i n t u i t o de um a p o s s í v e l a p l i c a ç ã o de s u b s t â n c i a s e x t r a í v e i s d e s s a p l a n t a pa r a f in s t e r a p ê u t i c o s ( F L E T C H E R , 1955). Dos estu dos l i d e r a d o s por F l e t c h e r , c o n c l u i u - s e q u e o e s t e v i o s í d e o não a p r e s e n t a v a p r o p r i e d a d e s a n t i a r t r í t i c a s , m a s a v a n ç a ram os c o ­ n h e c i m e n t o s a r e s p e i t o da e s t r u t u r a q u í m i c a da s u b s t â n c i a (AN(5 N I M O , 1956). A p e n a s em 1 9 6 3 , a e s t r u t u r a q u í m i c a do e s t e v i o ­ s í d e o p o d e ser c o m p l e t a m e n t e e l u c i d a d a . F i c o u c o n s t a t a d o qu e o e s t e v i o l , a g l u c o n a do e s t e v i o s í d e o , é um d i t e r p e n o t e t r a c í c l i - co á c i d o ( M O S E T T I G e NESS , 1955; W O O D e_t a_l_, 1955; W O O D e F L E T C H E R, 1956; V I S e F L E T C H E R , 1956; D J E R A S S I , R I N I K E R e R I N I K E R ,

1956; , DOLDER. e_t aj_. , 1960; D J E R A S S I et al_, 1961; A R Y A , 1962; W A T E R S , B E C K E R e M O S E T T I G , 1962; M O S E T T I G et al_, 1 963 ).

Q u a n t o â l i g a ç ã o das u n i d a d e s de g l u c o s e ã aglu_ c o n a de e s t e v i o s í d e o , v e r i f i c o u - s e qu e d u a s u n i d a d e s l i g a m - s e e n t r e si, p or l i g a ç ã o t i p o C2, rara na n a t u r e z a , e ao o x i g ê

-9 n i o da a g l u c o n a , p e l o c a r b o n o 1 de uma d a s u n i d a d e s de g l u c o se. A t e r c e i r a u n i d a d e de g l u c o s e l i g a - s e p e l o c a r b o n o 1 ao g r u p o c a r b o x í l i c o da a g l u c o n a . A S t e v i a r e b a u d i a n a a p r e s e n t a o u t r o s g l u c o s í - d e o s de e s t e v i o l : e s t e v i o 1b i o s f d e o , r e b a u d i o s f d e o A (2 por cen to do p e s o seco) r e b a u d i o s í d e o B (0,07 por c e n t o do p e s o seco) e d u l c o s f d e o A e B, 30 v e z e s m a i s d o c e q u e a s a c a r o s e ( S A K A M O - T0 1 1 £ l - » 19 75 ; K O H D A e_t aj_. , 1976; Y A M A S A K I et_ aj_. , 1976; KO B A Y A S H I e_t a_l_. , 1 9 77). 0 q u e d i f e r e e s s e s g l u c o s í d e o s do e s t e ­ v i o s í d e o são as l i g a ç õ e s dos a ç ú c a r e s ao e s t e v i o l e a n a t u r e z a q u í m i c a dos a ç ú c a r e s q u e se l i g a m i a g l u c o n a . P R O P R I E D A D E S B I O L Ó G I C A S DO E S T E V I O S Í D E O Em 1915, K O B E R T a t r i b u i u p r o p r i e d a d e s h e m o l f t i - cas ao e s t e v i o s í d e o a p l i c a d o a g l ó b u l o s s a n g u í n e o s h u m a n e s . En_ t r e t a n t o , e s s a s p r o p r i e d a d e s f o r a m d e s a c r e d i t a d a s por P O M A R E T e L A V I E I L L E (1931) qu e a c r e d i t a v a m que tal e f e i t o f o s s e c a u s a ­ do por i m p u r e z a s p r e s e n t e s no e s t e v i o s í d e o , o q u e e v i d e n c i a v a a e x i s t ê n c i a de o u t r a s s u b s t â n c i a s nas f o l h a s d e S t e v i a , que s e r i a m r e s p o n s á v e i s p e l o p o d e r de h e m ó l i s e . A t o x i c i d a d e do e s t e v i o s í d e o f o i ,v e r i f i c a d a tam bém por e s s e s a u t o r e s q u e m i n i s t r a r a m d o s e s d e e s t e v i o s í d e o a c o b a i a s , c o e l h o s e g a l i n h a s . Em n e n h u m d e s s e s a n i m a i s , o e s t e ­ v i o s í d e o c a u s o u d i s t ú r b i o s o r g â n i c o s , c o n s t a t a n d o - s e a u s ê n c i a d e t o x i c i d a d e . E s s e s m e s m o s a u t o r e s a l e g a m q u e um h o m e m de 60 q u i l o s p o d e i n g e r i r sem p r o b l e m a s 144 g de e s t e v i o s í d e o em 48 h o r a s . E s s a s e v i d ê n c i a s i n d i c a m q u e o e s t e v i o s í d e o p o d e r á ser

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u t i l i z a d o p or p e s s o a s p o r t a d o r a s de d i a b e t e s s a c a r i n o , u ma v e z q u e o p o d e r h i pog 1 i cem i a n t e de S t e v i a r e b a u d i a n a t em s i d o verj_ f i c a d o em c a ê s e c o e l h o s ( S H M E L I N G , 1967; S C H M E L I N G , C A R V A L H O ✓ e ES PI N O S A , 1976). P O M A R E T e L A V I E I L L E ( 1 9 3 1) , já h a v i a m m o s ­ t r a d o q u e o e s t e v i o s T d e o i n g e r i d o não era h i d r o l i s a d o no o r g a ­ n i s m o , s e n d o e l i m i n a d o c o m o tal e d e s s a f o r m a nã o tem v a l o r e- n e r g é t i c o . A K A S H I e Y O K O Y A M A ( 1 975) m o s t r a r a m c e r t a toxicj_ d a d e c a u s a d a p e l o e.s tev i os fd e o . E s s e s a u t o r e s m i n i s t r a r a m a r £ tos, e x t r a t o s de f o l h a s de S t e v i a , por s o n d a e s t o m a c a l . Os an_i_ m a i s a p r e s e n t a r a m s i n t o m a s de p a r a l i s i a , s e g u i d o s de m o r t e , a- pós d u a s h o r a s . Q u a n d o , p o r é m , se a p l i c o u e s t e v i o s í d e o pur o, os a n i m a i s a p r e s e n t a r a m c e r t a d i f i c u l d a d e em se l o c o m o v e r , m a s se r e c u p e r a r a m . 0 pó de f o l h a s de S t e v i a p o d e r i a a p r e s e n t a r e- f e i t o s d e l e t é r i o s ao o r g a n i s m o h u m a n o ( F E L I P P E , 1 9 7 7 a) . I n f u s ã o de f o l h a s de S t e v i a é u s a d a p e l a s mulhe_ res i n d f g e n a s do P a r a g u a i , c o m o a n t i c o n c e p c i o n a l ( P L A N A S ,e KUC , 1968 ; B R U C H E R , 197**; A K A S H I e Y O K O Y A M A , 1975). N os t r a b a l h o s r e a l i z a d o s por P L A N A S e KllC (1968) o b s e r v a - s e q u e o chã de f o l h a s de S t e v i a , tal qual é u- s a d o p e l a s m u l h e r e s i n d í g e n a s do P a r a g u a i , r e d u z i u em 80 por c e n t o a f e r t i l i d a d e de ra t a s . Nã o se o b s e r v o u e f e i t o s s e c u n d á ­ rios nas r a t a s e d e s c e n d e n t e s . Os a u t o r e s a c r e d i t a m q u e n ão é o e s t e v i o s f d e o , a s u b s t â n c i a a n t i c o n c e p c i o n a l , m a s sim o u t r a s u b s t â n c i a p r e s e n t e nas f o l h a s de S t e v i a .

P R O P R I E D A D E S B I O L Ó G I C A S DO E S T E V I O L O e s t e v i o l , a g l u c o n a do e s t e v i o s í d e o , ê um d i - t e r p e n o t e t r a c í c l i c o m u i t o s e m e l h a n t e ãs g i b e r e l i n a s , de m o d o q u e p o d e r i a a t u a r c o m o as m e s m a s ( F E L I P P E , 1 9 7 7 a ) . 0 e s t e v i o l e s t i m u l o u o c r e s c i m e n t o de m u t a n t e s de m i l h o a n ã o d- 5 ( R U D D A T , L A N G e M O S E T T I G , 1963; N I T S C H e N I T S C H , 1965) an-1 ( K A T S U M I e £ a l ., 1964) q u e ê p r o m o v i d o e s p e c i f i c a m e n t e por g i b e r e l i n a s . A - p r e s e n t o u o m e s m o e f e i t o das g i b e r e l i n a s p r o m o v e n d o a s í n t e s e da a 1f a - a m i 1 ase , p r o v o c a n d o a h i d r ó l i s e do e n d o s p e r m a de c e v a ­ da ( O G A W A , 1 975) . V Â L I O e R O C H A (1976) m o s t r a r a m q u e o e s t e v i o l £ tua c o m o á c i d o g i b e r é l i c o p r o m o v e n d o o a l o n g a m e n t o do hipocôt_[_ lo de p e p i n o e c r e s c i m e n t o de f e i j ã o e e r v i l h a . E n t r e t a n t o , o e s t e v i o l n ã o t e v e e f e i t o em t e s t e s de a l o n g a m e n t o de m u t a n t e s d-1 e d - 2 de Z e a m a y s , s e n s í v e i s a g i b e r e l i n a s , bem c o m o em p l â n t u l a s de a r r o z , h i p o c ó t i l o de p e p i n o , e r v i l h a a n ã e plântu_ la de i p o m ê i a (K A T S U M I e_t a_l_. , 1 9 6 4 ) . 0 e s t e v i o l nã o t e v e e f e i t o em i n d u z i r o e s c a p o f l o r a l e a f l o r a ç ã o em K a t o n c h ò e g a s t o n i s - b o n n i e r i , pa r tenocar_

pia e a l o n g a m e n t o de c a u l e em S t e v i a rebaud-Cana ( V Ã L I O e ROCHA,

1 976). Q u a n t o ã f o r m a q u í m i c a , o e s t e v i o l é m u i t o s e m e l h a n t e ao c a u r e n o , um dos i n t e r m e d i á r i o s da b i o s s í n t e s e de g i ­ b e r e l i n a s . P a r a q u e os c o m p o s t o s d e r i v a d o s do c a u r e n o a t u e m b i o l o g i c a m e n t e c o m o g i b e r e l i n a s ê i m p r e s c i n d í v e l a l i g a ç ã o etj_ l ê n i c a e x o c í c l i c a ( C H 2 ) do s i s t e m a de q u a t r o a n é i s d e s s e s d i ter_ p e n ó i d e s . Se h o u v e r s u b s t i t u i ç ã o d e s s e g r u p o por o u t r o , no

a-nel D, o c o m p o s t o t o r n a - s e b i o l o g i c a m e n t e i n a t i v o ( KA TSUMI et ai., 1964). 0 i s o s t e v i o l , p r o v a v e l m e n t e , por n ã o a p r e s e n t a r es se t i p o de l i g a ç ã o e t i l ê n i c a C 16 - C 17 , no anel D^é b i o l o g i c £ m e n t e i n a t i v o ( R U D D A T et al., 1963). D e v i d o â s e m e l h a n ç a e s t r u t u r a l e n t r e c a u r e n o e e s t e v i o l , s u g e r i u - s e q u e e s t e p u d e s s e ser c o n v e r t i d o em g i b e r £ lina s q u a n d o a p l i c a d o a m u t a n t e s d-5 e an-1 de m i l h o ( KA TSUMI et al., 1964). Ê n f a s e foi d a d a q u a n t o a e s s e a s p e c t o . C o n s e

-1 4

g u i u - s e a i n c o r p o r a ç a o de D L - M e v a 1 o na to de s o d i o 2- C em e s ­ t eviol ( H A N S O N e W H I T E , 1 968). T a m b é m foi m o s t r a d o que c a u r e n o

( B E N N E T , L I E B E R e H E F T M A N N , 1967; H A N S O N e W H I T E , 1968) e á c i ­ do c a u r e n ó i c o ( H A N S O N e W H I T E , 1968) p o d e m a g i r c o m o p r e c u r s o ­ res de e s t e v i o l em S t e v i a . A s í n t e s e de e s t e v i o l ê i m p e d i d a pe_ lo A M O - 1 6 1 8 ( c l o r e t o de 4 - h i d r o x i - 5 - i s o p r o p i 1 - 2 - m e t i 1 - f e n i 1 - t r i m e t i 1- a m o n i o - c a r b o x i 1 a to de 1 - p i p e r i d i n a ), um i n i b i d o r da b i o s s í n t e s e de g i b e r e l i n a s q u e a t u a i m p e d i n d o a c i c l i z a ç ã o do g e r a n i 1g e r a n i 1 p i r o f o s f a to . ( G G P P ) e, p o r t a n t o , a f o r m a ç ã o do c a u r e n o ( D E N N I S , U P P E R e W E S T , 1965; B A R N E S , L I G H T e L A N G , 1 969). 0 CCC ( c l o r e t o de 2 -c 1 o roe t i 1 - 1 r i m e t i 1- a m ô n i o) c a u s o u f e i t o s e m e l h a n t e ; e s s a s u b s t â n c i a i m p e d e a t r a n s f o r m a ç ã o de t r a n s g e r a n i 1g e r a n i 1 p i r o f o s f a t o a c o p a l i l p i r o f o s f a t o ( S C H E C H - T E R e W È S T , 1969) e p o r t a n t o , i m p e d e a s í n t e s e de c a u r e n o . R O C H A (1975) m o s t r o u uma d i m i n u i ç ã o dc c o n t e ú d o de e s t e v i o l em á p i c e s de p l a n t a s de S t e v i a v e b a u d i a n a t r a t a d a s c o m C C C . R U D D A T et al (1968), t r a t a r a m m u t a n t e s de m i l h o d-5 e d-1 co m e s t e v i o l e o b s e r v a r a m um a u m e n t o de g i b e r e l i n a s e n d ô g e n a s n e s t a s p l a n t a s . E s s e s r e s u l t a d o s são m a i s uma e v i d ê n c i a de q u e o e s t e v i o l é c o n v e r t i d o em s u b s t â n c i a de a t i v i d a d e g i b

13 r e 1 f n i ca . E s t u d o u - s e a v i a b i o s s i n t é t i c a do e s t e v i o l , a-14 p l i c a n d o - s e a f o l h a s de S t e v z a , p r e c u r s o r e s m a r c a d o s c om C 1 4 - ~ 11» 1 4 -( a c e t a t o 2- C, a c i d o m e v a l o n i c o - 2 - C, c a u r e n o - 1 7 - C, a c i d o O c a u r e n õ i c o - 7 " H) e f i c o u e s t a b e l e c i d o q u e n e s s a p l a n t a , a b i o s_ s í n t e s e do e s t e v i o l o c o r r e a p a r t i r do a c e t a t o , á c i d o mevalônj_ co, c a u r e n o e á c i d o c a u r e n ó i c o , ou seja, por m e i o do m e s m o c a ­ m i n h o b i o s s i n t é t i c o das g i b e r e l i n a s ( R U D D A T et a l . , 1965; BEN- N E T et a l. , 1967; H A N S O N e W H I T E , 1968). Os e s t u d o s p a r a e l u c i d a r a via b i o s s i n t é t i c a do e s t e v i o l têm s i d o c o n d u z i d o s t a m b é m em l i n h a g e n s de f u n g o s . A l i n h a g e m BI - 4 la de G i b b e r e l l a f u j i k u r o i a- p r e s e n t a um b l o q u e i o m e t a b ó l i c o e n t r e c a u r e n o l e á c i d o c a u r e ­ n ó i c o , b l o q u e i o e s s e qu e p o d e ser s u p e r a d o f o r n e c e n d o - s e e s t e ­ viol q u e é m e t a b o l i z a d o a GAj , GA^ g, G A ^ , G A ^ q e 1 3 ^ h i d r o x i G A j 2 > que a p a r e c e m t a m b é m em p l a n t a s s u p e r i o r e s ( B E A R D E R et al., 1975; B E A R D E R et al., 1976; H E D D E N et a l ., 1978). O b s e r - v a - s e q u e em f u n g o s , o e s t e v i o l é c o n v e r t i d o a s u b s t â n c i a s que a p r e s e n t a m a t i v i d a d e g i b e r e 1 T n i c a . Em S t e v i a r e b a u d i a n a , e n t r e t a n t o , o e s t e v i o l nã o a t u a c o m o g i b e r e l i n a , p o d e n d o a t é i n i b i r o c r e s c i m e n t o des_ sa p l a n t a c o m o foi v e r i f i c a d o por V A L I 0 e R O C H A (1976). H E D D E N et al (1978) s u g e r e m que, uma v e z q u e o a p a r e c i m e n t o de e s t e v i o l p a r e c e e s t a r r e s t r i t o a Stevi-a r e b a u - ã i a n a , é p o s s í v e l q u e n e s s a p l a n t a , a sua s í n t e s e s ej a a p e n a s um c a m i n h o a l t e r n a t i v o p a r a a s í n t e s e de g i b e r e l i n a s ou um r a ­ m o t e r m i n a l , sem ter r e l a ç ã o com a p o s t e r i o r b i o s s í n t e s e de gj_

14 E S T U D O S F I S I O L Õ G I C O S EM S T E V I A R E B A U D I A N A M u i t o já se fez a r e s p e i t o da b i o q u í m i c a do es- t e v i o s f d e o e do e s t e v i o l , bem c o m o a r e s p e i t o das p r o p r i e d a d e s b i o l ó g i c a s dos m e s m o s . Do p o n t o de v i s t a f i s i o l ó g i c o , as p e s q u i s a s c o ­ m e ç a r a m a se d e s e n v o l v e r a p a r t i r da d é c a d a de 1970. A n t e s , p o u c o se s a b i a a r e s p e i t o da f i s i o l o g i a de S t e v i a r e b a u d i a n a . E s t u d o s a r e s p e i t o da f l o r a ç ã o de S t e v i a r e b a u ­ d i a n a f o r a m f e i t o s por V Ã L I 0 e R O C H A (1977) c o m p l a n t a s t r a z i ­ das do P a r a g u a i , c u l t i v a d a s no I n s t i t u t o de B o t â n i c a do E s t a d o de S ão P a u l o , na d é c a d a de 1960. Se u s r e s u l t a d o s m o s t r a r a m q ue é pl7a n ta de d i a s c u r t o s p a r a a f l o r a ç ã o , com f o t o p e r í o d o crftj_ co e n t r e 13 e 14 h o r a s (V Â LI O e R O C H A , 1977). Z A I D A N , D I E T R I C H e F E L I P P E (1 980) t r a b a l h a n d o c o m p l a n t a s de S t e v i a r e c é m i n t r o d u z i d a s do P a r a g u a i , o b s e r v a ­ ram q u e e s s a s p l a n t a s p o d e r i a m ser a g r u p a d a s em t r es g r u p o s d i s t i n t o s q u a n t o ao seu c o m p o r t a m e n t o ã v a r i a ç ã o f o t o p er i ód j _ ca: g r u p o A - f l o r a ç ã o o c o r r e a p e n a s em f o t o p e r í o d o s de 8, 10 ou 12 h o r a s ; g r u p o B - f l o r a ç ã o o c o r r e a p e n a s em f o t o p e r í o d o s de 10 ou 12 h o r a s ; g r u p o C - f l o r a ç ã o o c o r r e em f o t o p e r í o d o s de 8, 10, 12 e 14 h o r a s . A p l a n t a e s t á m a d u r a p ar a a i n d u ç ã o fl o r a l a p a r t i r do e s t a g i o de q u a t r o p a r e s de f o l h a s ( VÂ L I O e R O C H A , 1 9 7 7 ) . CCC i n ib i u o c r e s c i m e n t o de p l a n t a s de S t e v i a r e b a u d i a ­ n a, c r e s c i m e n t o e s s e a c e l e r a d o por G A ^ , q u e t a m b é m r e v e r t e u o e f e i t o i n i b i d o r do CCC. 0 e s t e v i o l e x ó g e n o i n ib iu o c r e s c i m e n ­ to d e p l a n t a s de S t e v i a r e b a u d i a n a ( V A L I O e R O C H A , 1976) . 0

15 c o n t e ú d o de e s t e v i o s í d e o em f o l h a s foi r e d u z i d o por t r a t a m e n t o c o m CCC (RO C HA , 1975). Em á p i c e s , R O C H A (1975) e n c o n t r o u uma s u b s t â n c i a c o m a t i v i d a d e g i b e r e l í n i c a , c u j o nível foi r e d u z i d o p or t r a t a m e n t o c o m CCC. GA^ i n d u z i u p a r t e n o c a r p i a , e n q u a n t o q u e CCC e e s t e v i o l f o r a m i n e f e t i v o s ( V Á L !0 e R O C H A , 1 976). M E T I V I E R e V I A N A (1979a) r e a l i z a r a m uma s é r i e jujLtdjoé de t ra fa a 1feos a r e s p e i t o do c o n t e ú d o de e s t e v i o s f d e o , a ç ú c a r e s t o t a i s e p r o t e f n a , em f o l h a s de S t e v i a , s u b m e t i d a a d o i s f o t o - p e r f o d o s d i f e r e n t e s . C o n d i ç õ e s de d i a s l o n g o s a u m e n t a m o c o m p r i m e n t o do e n t r e n ó , a á r e a f o l i a r e o pe s o s ec o e r e d u z e m o i n t e r v a l o e n t r e o a p a r e c i m e n t o dos s u c e s s i v o s p a r e s f o l i a r e s em r e l a ç ã o a c o n d i ç õ e s de d i a s c u r t o s . Em c o n d i ç õ e s de d i a s l o n g o s , o con t e ú d o de a ç ú c a r e s s o l ú v e i s t o t a i s e p r o t e í n a s a u m e n t o u , em t e £ m o s r e l a t i v o s e a b s o l u t o s , bem c o m o a s í n t e s e d e e s t e v i o l , què a u m e n t o u em bS por c e n t o ( M E T I V I E R e V I A N A , 1 9 7 9 a ) . U s a n d o m é t o d o s d i f e r e n t e s de e x t r a ç ã o e d o s a g e m de e s t e v i o s í d e o , t a n t o M E T I V I E R e V I A N A (1979 a , b) c o m o Z A I D A N

e_t a_l_ (198o) m o s t r a r a m q u e d i a s l o n g o s a u m e n t a m o c o n t e ú d o de e s t e v i o s í d e o . O b s e r v o u - s e q ue o p e s o s e c o da f o l h a e os n í ­ v e i s de a ç ú c a r e s s o l ú v e i s e p r o t e í n a s m o s t r a m um d e s e n v o l v imeji to em d u a s f a s e s , d u r a n t e o c r e s c i m e n t o da f o l h a , em Stev-La ve_ b a u d i a n a . 0 g r a n d e a u m e n t o inicial no t a m a n h o da f o l h a foi d e ­ v i d o , p r i n c i p a l m e n t e , ao a u m e n t o de á g u a . 0 a u m e n t o no c o n t e ú ­ do de p r o t e í n a a b s o l u t a foi i n i c i a l m e n t e l en t o, m a s r á p i d o na s e g u n d a fas e, c o n c o m i t a n t e m e n t e ao a u m e n t o em p e s o s e c o e no c o n t e ú d o de a ç ú c a r s o l ú v e l . Em t e r m o s r e l a t i v o s , e n t r e t a n t o , a

c o n c e n t r a ç ã o de a ç ú c a r e s l i v r e s d i m i n u i u , c o n f o r m e a f o l h a c r e s c e u . Os r e s u l t a d o s i n d i c a m que a s í n t e s e de p r o t e í n a s nas f o l h a s , p r o v a v e l m e n t e seja d e p e n d e n t e de um s u p r i m e n t o de c a r ­ b o n o p r o v e n i e n t e da f o t o s s í n t e s e ( V I A N A e M E T I V 1 E R , 1979). Z A I D A N e_t aj_ (19 8 o) o b s e r v a r a m q u e o e s t e v i o s í - d e o o c o r r e a p e n a s nas p o r ç õ e s a é r e a s de p l a n t a s de S t e v i a e e ^ tá a u s e n t e no s i s t e m a r a d i c u l a r . J i m e n e z em 1917 (J_n_ A N Ô N I M O , 1 920) d i z i a qu e em ge ral os f r u t o s de S t e v i a e r a m e s t é r e i s . F L E T C H E R (1955) r e a d ­ m i t i u e s s a a f i r m a ç ã o , o q u e foi n o v a m e n t e c o n f i r m a d o em 1956 ( A N Ô N I M O ) . Os p r i m e i r o s e s t u d o s a r e s p e i t o da g e r m i n a ç ã o de S t e v i a r e b a u d i a n a f o r a m f e i t o s p o r F E L I P P E e_t £_1_ (1971) e F E L I P P E e L U C A S (197 1 )- S t e v i a r e b a u d i a n a a p r e s e n t a dois^ ti p o s de f r u t o s n i t i d a m e n t e d i s t i n g u í v e i s a o l h o nu: f r ü t o s e s c u r o s e f r u t o s c l a r o s . Os f r u t o s c l a r o s t s ão e s t é r e i s . A p e n a s 40 por 2^rrtín^QAJ<yrr^

c e n t o dos f r u t o s e s c u r o s s-ão-j-f-ér-t-e i s-. g e rm-i-R=ã=a=d=o a 25 C em luz c o n s t a n t e ( F E L I P P E e_t aj_. , 1 971). U t i l i z a n d o o t e s t e do t e t r a - z õ l i o , F E L I P P E e L U C A S (1971) m o s t r a r a m q u e c e r c a de 50 por c e n t o dos f r u t o s e s c u r o s de S t e v i a e r a m f é r t e i s , s e n d o q u e e s ­ ses r e s u l t a d o s e r a m c o m p a t í v e i s c o m os t e s t e s de g e r m i n a ç ã o em luz c o n s t a n t e . V e r i f i c o u - s e , t a m b é m , q ue os f r u t o s d e S t e v i a ram v i á v e i s s o m e n t e a t é o o i t a v o m ê s a p ô s a c o l e t a ( F E L I P P E e L U C A S , 1 9 71 ) . R O C H A (1975) m o s t r o u q u e a p o r c e n t a g e m de f r u t o s c l a r o s p r o d u z i d o s p e l a s p l a n t a s p o r e l a e s t u d a d a s foi de 78 por c e n t o . M O N T E I R O (I9 8 O) m o s t r o u que em S t e v i a r e b a u d i a ­ n a a p o l i n i z a ç ã o é c r u z a d a e tres t i p o s de a q u ê n i o s p o d e m ser

17 f o r m a d o s : a) a q u ê n i o c l a r o e s t é r i l : não o c o r r e a p o l i n i z a ç ã o , n ã o hã p o r t a n t o e m b r i ã o ; b) a q u ê n i o e s c u r o f é r t i l : em q u e ela o c o r r e e hã f e c u n d a ç ã o da o o s f e r a , h a v e n d o a f o r m a ç ã o de um em b r i ã o n o r m a l ; c) a q u ê n i o e s c u r o e s t é r i l : o c o r r e a p o l i n i z a ç ã o , hã o d e s e n v o l v i m e n t o do t u b o p o l f n i c o , p o r é m e s t e tem seu cr e s c i m e n t o i n t e r r o m p i d o a n t e s de a t i n g i r a o o s f e r a ( p o s s i v e l m e n t e por u ma i n c o m p a t i b i l i d a d e e s p o r o f í t i c a ); a p a r e d e do a q u ê n i o ( p e r i c a r p o ) f i c a c om a c o r e s c u r a , m a s o a q u ê n i o nã o p o s s u i em b r i ã o . F E L I P P E e_t a_l_. (1971) c o n s t a t a r a m q u e a g e r m i n a ç ã o era m a i o r em luz c o n s t a n t e e se c o m p l e t a v a a o r e d o r do d é c i m o q u a £ to dia, e n q u a n t o q u e no e s c u r o , a p o r c e n t a g e m de g e r m i n a ç ã o e- ra b a s t a n t e b a i x a . Os f r u t o s de S t e v i a , são p o r t a n t o , fotoblãs_ t i c o s p o s i t i v o s ( F E L I P P E , 1 9 7 7 a ) . V e r i f i c o u - s e qu e h a v i a c e r t a v a r i a ç ã o na p o r c e n t a g e m de g e r m i n a ç ã o em luz c o n s t a n t e , q u e es t av a na f a i x a dos 30 a 60 por c e n t o ( F E L I P P E e_t a_l_. , 197*1) . A 1 - g u m a s p l â n t u l a s g e r m i n a d a s em p l a c a s d e P e t r i a p r e s e n t a r a m ra- d í c u l a s a t r o f i a d a s . Isto p o d e r i a o c o r r e r d e v i d o a um i n i b i d o r p r e s e n t e nos f r u t o s c o n s i d e r a d o s f é r t e i s . A f i m de v e r i f i c a r a v a l i d a d e d e s s a h i p ó t e s e ^ F E L I P P E <it_ aj_. (1971) f i z e r a m b i o t e s - tes c o m e x t r a t o s de fio-1 fcra-s c o n s i d e r a d o s f é r t e i s e v e r i f i c a r a m q u e h a v i a um i n i b i d o r de c r e s c i m e n t o de r a d í c u l a de a l f a c e nas r e g i õ e s e n t r e os R^s 0^80 e 0 , 9 0 no s i s t e m a de s o l v e n t e s por e^ les u t i l i z a d o s . E s s e i n i b i d o r p o d e r i a ser o r e s p o n s á v e l p e l o a_ p a r e c i m e n t o de p l â n t u l a s de S t e v i a , c o m r a d í c u l a a t r o f i a d a . A- v e n t o u - s e a h i p ó t e s e de q u e o i n i b i d o r do c r e s c i m e n t o de r a d í ­ c u l a p u d e s s e ser o e s t e v i o s í d e o ( F E L I P P E e L U C A S , 1971)• D oi s são os o b j e t i v o s p r i n c i p a i s d e s t e t r a b a ­ lho: a) v e r i f i c a r em d e t a l h e a g e r m i n a ç ã o de S t e v i a , e s t u d a n d o

18 q u a i s os f a t ò r e s q u e a a f e t a m , de m o d o a se e s t a b e l e c e r as con d i ç õ e s ó t i m a s pa r a a g e r m i n a ç ã o ; b) v e r i f i c a r se os a q u ê n i o s ( c l a r o s e e s c u r o s ) p o s s u e m e s t e v i o s í d e o c o m o t a m b é m d a r uma i- d é i a de q u a i s s u b s t â n c i a s de c r e s c i m e n t o e x i s t e m n e s s e s a q u ê ­ ni os.

19 M A T E R I A L E M É T O D O S M A T E R I A L A q u ê n i o s de S t e v i a vebaud-tana B e r t . f o r a m o b t i ­ dos a p a r t i r de p l a n t a s c u l t i v a d a s na U n i v e r s i d a d e E s t a d u a l de C a m p i n a s ou f o r n e c i d o s p e l o I n s t i t u t o de B o t â n i c a da S e c r e t a ­ ria de A g r i c u l t u r a do E s t a d o de Sã o P a u l o . As a m o s t r a s e r a m u- t i l i z a d a s at é seis m e s e s de ida de (c&ni 9x=ce^5=o :d~e u in ~e.y p~e r hn-er^

g é ^ ^ r n a ç ã o )

.

Os a q u ê n i o s de S t e v i a rebaud-Cana p o d e m ser sepa_ r a d o s em c l a r o s e e s c u r o s a o l h o nu. A q u ê n i o s c l a r o s nã o p o s ­ s u e m e m b r i ã o e são, p o r t a n t o , e s t é r e i s . Só há g e r m i n a ç ã o de a- q u ê n i o s e s c u r o s ( F E L I P P E e_t_ aj_. 1971) . Os a q u ê n i o s e s c u r o s f o ­ ram s e p a r a d o s um a um, s e n d o l e v e m e n t e p r e s s i o n a d o s com uma p i n ç a . E r a m s e l e c i o n a d o s a p e n a s os m a i s r i j o s e c o n s i s t e n t e s .

Os a q u ê n i o s s e l e c i o n a d o s p ar a os e x p e r i m e n t o s f o r a m e s t e r i l i z a d o s de a c o r d o com as s e g u i n t e s e t a p a s :

20 - l a v a g e m r á p i d a em s o l u ç ã o de d e t e r g e n t e . - l a v a g e m em á g u a c o r r e n t e . - i m e r s ã o em s o l u ç ã o de h i p o c l o r i d o de s ó d i o h % , d u r a n t e 30 mi nu t o s . - l a v a g e m e m á g u a d e s t i l a d a c o r r e n t e d u r a n t e 5 m i n u t o s , - i m e r s ã o em á g u a d e s t i l a d a d u r a n t e 60 m i n u t o s . - s e c a g e m em papel de f i l t r o . P ar a c a d a t r a t a m e n t o , s e m p r e se u t i l i z a r a m d u as p l a c a s de P e t r i , de 9 cm de d i i m e t r o , c o m 50 a q u ê n i o s por p l a ­ ca. As p l a c a s e r a m r e v e s t i d a s c o m u m a f o l h a de papel de f i l t r o q u a l i t a t i v o ( K labin) e e s t e r i l i z a d a s a 100°C d u r a n t e 60 m i n u ­ tos. Os a q u ê n i o s f o r a m e m b e b i d o s c om 5 ml de á g u a d e s t i l a d a ou da s o l u ç ã o a ser t e s t a d a . Os e x p e r i m e n t o s de g e r m i n a ç ã o f o r a m r e a l i z a d o s em c â m a r a de c r e s c i m e n t o " F o r m a S c i e n t i f i c " , c o m t e m p e r a t u r a c o n t r o l a d a de 25°C, a não ser q u a n d o o e f e i t o d e t e m p e r a t u r a js ra t e s t a d o . Na g e r m i n a ç ã o em luz b r a n c a c o n s t a n t e e r a m u t i ­ l i z a d a s d u a s l â m p a d a s f l u o r e s c e n t e s d e 15 W e i n t e n s i d a d e de 2 3 , 6 y W / c m .nm. Os e x p e r i m e n t o s de e s c u r o c o n s t a n t e f o r a m real_i_ z a d o s c o l o c a n d o - s e as p l a c a s de Petri d e n t r o de tres s a c o s p l á s t i c o s p r e t o s . P r e v i a m e n t e foi t e s t a d a a g e r m i n a ç ã o no escu_ ro c o n s t a n t e d e n t r o dos s a c o s p r e t o s e sem os s a c o s p r e t o s , n a s c â m a r a s . N ã o h o u v e d i f e r e n ç a na g e r m i n a ç ã o e n t r e e s s e s d o i s tra_ t a m e n t o s . T e s t e s de g e r m i n a ç ã o s ob luz b r a n c a c o n s t a n t e e e s c u r o c o n s t a n t e f o r a m r e a l i z a d o s c o m o c o n t r o l e p a r a a m a i o r i a dos e x p e r i m e n t o s .

21 G e r a l m e n t e f i z e r a m - s e tres a q u a t r o c o n t a g e n s de g e r m i n a ç ã o , a c a d a d o i s ou tr es d ia s . 0 e f e i t o de luzes m o n o c r o m á t i c a s t a m b é m foi v e ­ r i f i c a d o . CFjyft - ^ 0 Os c o m p r i m e n t o s de o n d a d e s e j a d o s f o r a m o b t i d o s a p a r t i r de l i m p a d a s f l u o r e s c e n t e s e i n c a n d e s c e n t e s e f i l t r o s f e i t o s de papel c e l o f a n e c o l o r i d o , a j u s t a n d o - s e a i n t e n s i d a d e 2 a o r e d o r de 1,2 y W / c m .n m , por m e i o de um e s p e c t r o - r a d i o m e t r o ISCO, m o d e l o SR ( F i g u r a 1).

A luz a z u l , com p i c o a 450 nm , foi o b t i d a com uma l â m p a d a f l u o r e s c e n t e azul ( W e s t i n g h o u s e ) de 15 W e f i l t r o f o r m a d o por uma f o l h a de papel c e l o f a n e az u l . A luz v e r d e , com p i c o a 525 nm foi c o n s e g u i d a com lâ m p a d a f l u o r e s c e n t e v e r d e ( Ge n er al E l e t r i c ) de 20 W e f i l t r o f o r m a d o por u m a f o l h a de pa_ pel c e l o f a n e v e r d e . Luz v e r m e l h a , com p i c o a 6 50 nm foi o b t i d a a p a r t i r de u m a l i m p a d a v e r m e l h a ( W e s t i n g h o u s e ) de 15 W. 0 v er m e l h o e x t r e m o , com p i c o a 730 nm foi o b t i d o a p a r t i r de uma l i m p a d a i n c a n d e s c e n t e de 25 W (G e n e r a l E l e t r i c ) e f i l t r o f o r m a d o por d u a s f o l h a s de papel c e l o f a n e v e r m e l h o e tres f o l h a s de p apel c e l o f a n e a z u l . As c o n t a g e n s d o s e x p e r i m e n t o s m a n t i d o s em e s c u r o c o n s t a n t e , ou sob os d i f e r e n t e s c o m p r i m e n t o s de o n d a fc> ram f e i t a s sob luz v e r d e de s e g u r a n ç a , c u j o e s p e c t r o a p r e s e n t a

2

um p i c o a 525 nm e i n t e n s i d a d e de 0 , 0 2 y W / c m .nm ( F i g u r a 1). 0 e f e i t o de c h o q u e s de v e r m e l h o (de c u r t a ou l o n g a d u r a ç i o ) t a m b é m foi e s t u d a d o .

Em um d e t e r m i n a d o e x p e r i m e n t o , os a q u ê n i o s f o ­ ram e m b e b i d o s por 72 h o r a s sob luz v e r m e l h a e a s e g u i r f o r a m t r a n s f e r i d o s p ar a o e s c u r o c o n s t a n t e .

F i g u r a 1 E s p e c t r o s l u m i n o s o s u t i l i z a d o s nos e x p e r i m e n t o s de g e r m i n a ç ã o . O Luz a z u 1 0 Luz v e r d e O Luz v e r m e l h a Ê* V e r m e l h o e x t r e m o A Luz v e r d e de s e g u r a n ç a

22 Em o u t r o s e x p e r i m e n t o s , os a q u ê n i o s e m b e b i d o s no e s c u r o c o n s t a n t e por 24 e 48 h o r a s r e c e b e r a m c h o q u e s de ver m e l h o c om d u r a ç ã o de 24 h o r a s ( c h o q u e s l o n g o s ) . A p ô s os c h o ­ q u e s , os a q u ê n i o s r e t o r n a r a m ao e s c u r o , o n d e p e r m a n e c e r a m a té o final do e x p e r i m e n t o . A q u ê n i o s e m b e b i d o s t a m b é m por 48 h o r a s no e s c u ­ ro c o n s t a n t e e r a m t r a n s f e r i d o s pa r a c â m a r a i l u m i n a d a por l â m p £ da v e r m e l h a , o n d e r e c e b i a m c h o q u e s de 60, 180 e 3 00 m i n u t o s ( c h o q u e s c u r t o s ) . A p ó s os c h o q u e s , r e t o r n a r a m para o e s c u r o c o n s t a n t e . A r e v e r s ã o do v e r m e l h o p e l o v e r m e l h o e x t r e m o f o i e s t u d a d a . A q u ê n i o s q u e r e c e b i a m c h o q u e s c u r t o s de v e r m e ­ l ho de 60 m i n u t o s (após 48 h o r a s de e m b e b i ç ã o no e s c u r o ) f o ­ ram t r a t a d o s co m c h o q u e s c u r t o s d e v e r m e l h o e x t r e m o , de 60, 180 e 3 00 m i n u t o s de d u r a ç ã o . A p ó s os c h o q u e s de v e r m e l h o e x ­ t r e m o r e t o r n a r a m para o e s c u r o c o n s t a n t e . A q u ê n i o s t a m b é m f o r a m e m b e b i d o s sob v e r m e l h o ex t r e m o , d u r a n t e 72 h o r a s e a s e g u i r t r a n s f e r i d o s p a r a c â m a r a i- l u m i n a d a c om luz b r a n c a , o n d e p e r m a n e c i a m a t é o final d o e x p e - r i m e n t o . Em um o u t r o e x p e r i m e n t o , os a q u ê n i o s f o r a m e m b e b i d o s sob luz b r a n c a d u r a n t e 72 h o r a s e a s e g u i r t r a n s f e r i d o s p a ra c â m a r a i l u m i n a d a c o m v e r m e l h o e x t r e m o , o n d e f i c a r a m a t é o f i ­ nal do e x p e r i m e n t o . A r e v e r s ã o do v e r m e l h o p e l o azul t a m b é m foi v e ­ r i f i c a d a .

A q u ê n i o s que r e c e b i a m c h o q u e s c u r t o s de luz vej^ m e l h a , de 60 m i n u t o s de d u r a ç ã o , a p ó s 48 h o r a s de e m b e b i ç ã o no

23

e s c u r o , f o r a m e x p o s t o s à luz azul por 60 e 180 m i n u t o s e a s e ­ g u i r r e t o r n a r a m para o e s c u r o , o n d e f i c a v a m a t é o final do e x ­ p e r i m e n t o . Em t o d o s os e x p e r i m e n t o s de c h o q u e s de luz, a t r a n s f ê r e n c i a de a q u ê n i o s de u ma c â m a r a pa r a o u t r a , foi f e i t a m a n ­ t e n d o - s e a s a l a t o t a l m e n t e no e s c u r o . No q u e d i z r e s p e i t o ao e f e i t o de t e m p e r a t u r a s , t e s t a r a m - s e t e m p e r a t u r a s c o n s t a n t e s de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 e 40°C com a q u ê n i o s m a n t i d o s em luz b r a n c a c o n s t a n t e e es c u ro c o n s t a n t e . V e r i f i c o u - s e o e f e i t o d a s s e g u i n t e s a l t e r n â n ­ c i a s de t e m p e r a t u r a na g e r m i n a ç ã o de S t e v i a m a n t i d a no e s c u r o : 25 - 0°C, 25 - 5°C, 25 - 10°C, 25 - 1 5°C, 25 - 20°C, 25 - 3 0°C e 25 - 3 5°C. 0 c o n t r o l e das t e m p e r a t u r a s d e n t r o das c â m a r a s , d u r a n t e o d e c o r r e r d e s s e s e x p e r i m e n t o s foi f e i t o por m e i o de um t e r m ô m e t r o d i g i t a l m a r c a D i g i t e c t i p o 581 c. E s s e t e r m ô m e ­ tro a c u s o u u m a a l t e r a ç ã o d i á r i a de ± 1°C p a r a c a d a t e m p e r a t u r a t e s t a d a . E x p e r i m e n t a l m e n t e , v e r i f i c o u - s e o t e m p o de m u d a n ç a de t e m p e r a t u r a a p a r t i r da t e m p e r a t u r a inicial b á s i c a de 25°C. Is^ to foi f e i t o p a r a as c â m a r a s de c r e s c i m e n t o e p l a c a s de Petri f e c h a d a s e f o r r a d a s com papel de f i l t r o u m e d e c i d o , c o l o c a d a s d e n t r o d a s c â m a r a s . P a r a m e d i d a s das t e m p e r a t u r a s d e n t r o da s c â m a ­ ras e das p l a c a s de Pe tri u t i l i z o u - s e o t e r m ô m e t r o d i g i t a l D i g i t e c t i p o 581 c, co m um t e r m o p a r d e n t r o da c â m a r a e o u t r o d e n t r o da p l a c a de P e t r i . A v a r i a ç ã o da t e m p e r a t u r a foi verifj_ c a d a de m i n u t o a m i n u t o ( F E L I P P E , 1978; J O L Y e F E L I P P E , 1 9 79 ), c o n f i r m a n d o os r e s u l t a d o s d e s s e a u t o r e s .

24 A F i g u r a 2 m o s t r a c u r v a s de a l t e r n â n c i a de t e m ­ p e r a t u r a s d e n t r o das c â m a r a s , d e t e r m i n a d a a c a d a m i n u t o . Expli c i t a m e n t e , as c u r v a s de a l t e r n â n c i a de t e m p e r a t u r a s m o s t r a m o p e r f o d o de t e m p o d e c o r r i d o at é qu e a c â m a r a a t i n g i s s e a t e m p e ­ r a t u r a a l t e r n a n t e d e s e j a d a e r e t o r n a s s e à t e m p e r a t u r a i n i c i a l . N e s s a s c â m a r a s , o r e l ó g i o de a l t e r n â n c i a de t e m p e r a t u r a s foi r e g u l a d o p a r a 12 h o r a s de t e m p e r a t u r a b á s i c a e 12 h o r a s de tem p e r a t u r a a l t e r n a n t e , em c i c l o s de 24 h o r a s . A T a b e l a 1 m o s t r a o t e m p o n e c e s s á r i o para a c â m a r a a t i n g i r a t e m p e r a t u r a alter_ n a n t e e r e t o r n a r i t e m p e r a t u r a b á s i c a . A s s i m , por e x e m p l o , no par de a l t e r n â n c i a s 25 - 20°C, a c â m a r a leva 10 m i n u t o s p a r a a_ t i n g i r a t e m p e r a t u r a a l t e r n a n t e e 15 m i n u t o s p a r a r e t o r n a r i t e m p e r a t u r a de 25°C. P e la T a l e l a 1, p o d e - s e v e r i f i c a r q u e na p l a c a , o t e m p o d e c o r r i d o at é a t i n g i r a t e m p e r a t u r a a l t e r n a n t e foi de 18 m i n u t o s . A F i g u r a 3 r e p r e s e n t a c u r v a s de a l t e r n â n c i a de t e m p e r a t u r a d e n t r o das p l a c a s de Petri e x p o s t a s a p e r í o d o s de t e m p e r a t u r a s a l t e r n a n t e s . O b v i a m e n t e , c o m o a m u d a n ç a de t e m p e ­ r a t u r a é g r a d u a 1 ,. n u n c a se o b t e v e um p e r í o d o de 12 h o r a s de ex p o s i ç ã o a c a d a t e m p e r a t u r a a l t e r n a n t e ( T a b e l a 2). A s s i m , p ar a o par a l t e r n a n t e de 25 - 0°C, a p l a c a p e r m a n e c e u d u r a n t e 10 h £ ras e 52 m i n u t o s na t e m p e r a t u r a b á s i c a de 2 5 ° e 10 h o ras e 8 m i n u t o s na t e m p e r a t u r a a l t e r n a n t e . D e n o m i n a - s e c h o q u e de t e m p e r a t u r a ao p e r í o d o c u r t o d e t e m p o , d u r a n t e o qual os a q u ê n i o s p e r m a n e c e r a m a uma t e m p e r a t u r a d i f e r e n t e da t e m p e r a t u r a c o n t r o l e (25°C). Nos e x p e r i m e n t o s c o m c h o q u e s de t e m p e r a t u r a e s t a s f o r a m 0°C e 45°C. P r e v i a m e n t e , r e g u l o u - s e u ma c â m a r a de c r e s c i m e n t o a 0°C e uma

F i g u r a 2. A l t e r n â n c i a de t e m p e r a t u r a nas c â m a r a s . A v a r i a ç ã o de t e m p e r a t u r a foi v e r i f i c a d a a c a d a m i n u t o . T e m p e r a t u r a b á s i c a de 25°C 25 - 3 5°C □ 25 - 3 0°C

o

F I G 2 O m i n u t o s

T e m p e r a t u r a b á s i c a de 25°C . A l t e r n â n c i a r e g u l a d a pa ra 1 2 h o r a s . T a b e l a 1 - A l t e r n â n c i a de t e m p e r a t u r a em um c i c l o de 24 h o r a s . A l t e r n â n c i a de t e m p e r a tu ra °C T e m p o p ar a a t i n g i r a a l t e r n â n c i a d e s e j a d a m i n u t o s T e m p o p ar a r e t o r n a r a 25°C m i n u t o s Den t ro da c â m a r a D e n t r o da p l a c a D e n t r o da c â m a ra D e n t r o da p l a c a 25 - 35 16 35 31 43 25 - 30 1 1 17 17 51 25 - 20 1 0 1 8 15 47 2 5 - 1 5 20 35 19 46 25 - 10 33 62 21 69 2 5 - 5 87 30 76 O 1 LACNl _{61 1 1 2 39 68}

F i g u r a 3. A l t e r n â n c i a de t e m p e r a t u r a d e n t r o de p l a c a s de Petri f e c h a d a s e f o r r a d a s com papel de f i l t r o u m e d e c i d o . A v a r i a ç ã o da t e m p e r a t u r a foi v e r i f i c a d a a c a d a minuto. T e m p e r a t u r a b á s i c a de 25°C. © 25 - 3 5°C □ 25 - 3 0°C

o

30

-I

u

T a b e l a 2 - P e r í o d o em q u e o I n t e r i o r da p l a c a de Petri p e r m a n e c.eu em uma d e t e r m i n a d a t e m p e r a t u r a . A l t e r n â n c i a de T e m p e r a t u r a b á s i c a T e m p e r a t u r a a l t e r n a n t e t e m p e r a t u r a 25°C h o r a s °C h o r a s 25 - 35 10 h . e 17 min. 1 1 h . e 25 min. 25 - 30 1 1 h. e 9 m in . 1 1 h . e 43 min. 25 - 20 1 1 h . e 13 min. 1 1 h . e 42 min. 25 - 1 1 h . e 1 4 m i n . 11 h . e 25 min. 25 - 1 0 10 h

.

25 a kS°C. Os c h o q u e s de t e m p e r a t u r a f o r a m r e a l i z a d o s a- pós d i f e r e n t e s p e r í o d o s de e m b e b i ç i o no e s c u r o c o n s t a n t e : 24, 48 e 7 2 horas. Na F i g u r a 4 o b s e r v a m - s e as c u r v a s de a l t e r a ç ã o da t e m p e r a t u r a , d e n t r o das p l a c a s de P e t r i . Isso foi f e i t o c o ­

loca n d o - s e p 1a ca s de P etri a t é e n t ã o m a n t i d a s a 25°C , d e n t r o d as c â m a r a s jã r e g u l a d a s na t e m p e r a t u r a do c h o q u e . As p l a c a s e^ r a m f o r r a d a s c o m papel de f i l t r o u m e d e c i d o . M e d i u - s e t a m b é m a t e m p e r a t u r a dos a q u ê n i o s por m e i o de t e r m o m e t r i a t e r m o e 1é t r i c a . U t i l i z o u - s e um m u l t f m e t r o , ao qual se c o n e c t a um t e r m o p a r c o m p o s t o por d o i s m e t a i s d i f e ­ r e n t e s , q u e d e s e n v o l v e m d i f e r e n ç a s de p o t e n c i a l e l é t r i c o , q u a £ do as j u n ç õ e s a c h a m - s e em d i f e r e n t e s t e m p e r a t u r a s . 0 m u l t f m e ­ tro m e d e a v o l t a g e m d e s e n v o l v i d a p e l o t e r m o p a r , 0 t e r m o p a r u t i l i z a d o foi o de c o b r e - c o n s t a n t a n . E s s e t e r m o p a r d e s e n v o l v e a s e g u i n t e r e l a ç ã o : a c a d a °C c o r r e s - p o n d e m q u a r e n t a m i c r o v o l t s (yV) de m a n e i r a que: T e m p e r a t u r a m e d i d a = y V lido no a p a r e l h o 40 A t e m p e r a t u r a de r e f e r ê n c i a foi °C. 0 a p a r e l h o u t i l i z a d o nas m e d i d a s da v o l t a g e m d £ s e n v o l v i d a p e l o t e r m o p a r foi um m u l t í m e t r o d i g i t a l ^ m a r c a H e w l e t - P a c k a r d , t i p o 3 4 6 5 B, co m f u n d o de e s c a l a de 20 mV a 100 v - cc e s e n s i b i l i d a d e de 1 y V na m e n o r f a i x a de m e d i ç ã o . A F i g u r a 5 m o s t r a a m u d a n ç a de t e m p e r a t u r a nos a q u ê n i o s . Em um c h o q u e de 45°C, os a q u ê n i o s d e m o r a m 30 mj_