PROTOCOLO CITOMETRO DE FLUXO

PROTOCOLO

CITOMETRO DE FLUXO

Prof. Enrique R. Argañaraz

Lab Virologia Molecular

Faculdade de Ciências da Saúde

Universidade de Brasília

FLUXOGRAMA

I. Iniciar Sistema

1. Ligar o aparelho na seguinte ordem: Ligar o aparelho na seguinte

ordem:

 Ligar estabilizador.

 Ligar o Citômetro de Fluxo.

 Ligar o Computador; deixar 5’ a 10’ (para atingir máxima potência)

2. Checagem de Reservatórios

 Vasilhame de Descarte gaveta esquerda (descartar o liquido e acrescentar 50-100 ml hipoclorito concentrado)

- Observar se está em Standby (Só assim o equipamento está pronto para uso).  Vasilhame FACS FLOW

Verificar pressão ( puxar alavanca em direção ao operador) 1. Apertar bem a tampa

2. Encaixe do tubo

Nota: Não esquecer de desligar a pressão ante de abrir o vasilhame  Apertar RUN e HIGH

Objetivo: para que o sistema se complete com o FACS flow novo.

Nota: monitorar ate ausência de bolhas na mangueira (tirar a mangueira do filtro e tirar as bolhas)

 Se as bolhas não desaparecerem, apertar HIGH e PRIME esperar voltar a

Stanby.

Objetivo: tirar bolhas e a solução velha.

3. Abrir o programa Cell Quest Pro.

 Fechar a folha em branco Untitle (Don’t Save).

 Abrir a planilha, “pode estar pronta” :

FileOpen Document Abrir a Planilha de Aquisição Open. FileDocument Size Criar uma Folha.

4. Conectar o computador ao aparelho:

AcquireConnect to Cytometer (maçã + B) – Ao conectar, a janela do Browser aparece automaticamente (Parameter Description).

Iniciar Sistema Controle de Qualidade Ajustar Parâmetros Gravar Dados Analisar Dados Desligar Sistema

Figura 1

Ao conectar o computador ao FACS aparecerá o menu aquisição “Aquisição control”

Figura 2

5.

Número e Tipos de Eventos que serão Adquiridos)

 Clicar em “Aquisição and Storage” aparecerá menu abaixo

Neste menu se podem escolher os critérios para salvar e exibir os eventos.  “Aquisição Gate”: quais eventos serão salvos ou rejeitados, os eventos

podem compor uma dada população (morfologica ou fenotípica)

Nota: em geral se deixa como “All” para ter salvos todos os eventos e excluir apenas na análise

 “Collection Criteria”: se define com que números de eventos a aquisição

será encerrada ( seja de eventos totais ou uma dada população);

 Storage Gate: os eventos que serão salvos se aconselha deixar em “All” ;  Resolution: selecionar o valor “256”;

 “Parameters saved”: quais parâmetros serão salvos. Devem ser

selecionados FSC, SSC ( morfologia, tamanho) e as fluorescências

Figura 4

6.

Identificação das Amostras ( nome e destino dos arquivos)

 Ao conectar o citômetro aparecera automaticamente o menu abaixo

Folder: em que pasta serão gravados os dados, ex iniciais do operador. “custom prefix”mudar para simple ID File name prefix: nome do experimento

File name suffix: se mantido enumerará de forma

crescente

Figura 6

Ainda no “parametr description” se repete no item Sample ID: o nome do tubo ex. Mock;

 Se deve colocar dos eixos dos gráficos: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2;

P5-FL3. Pode-se ainda se escolher outros eixos ex anti-CD3 FITC ao invez

de FL1, como nome do eixo P1.

Nota: é possível só se existe um tipo de Ac conjugado a FITC. Fechar, não tem ok

7. Abrir as 4 janelas (maça 1,2,3,4) ou Cytometer abrir as seguintes

janelas:

i. Detectors/Amp (maçã + 1) (mudar para log FL1,2 e3)

ii. Threshold (maçã + 2).

iii. Compensation (maçã + 3).

iv. Status (maçã + 4)

v. Instrument Settings  Open  Procurar uma Compensação (Feita com as Beads ou CD3-CD4-CD8) SetDone.

 Detectors/ Amp:

FSC e SSC devem ser mantidos em Linear e as fluorescências em Log; Pode-se ligar o seh]gundo laser “four color” (635 nm-vermelho)

 Compensation usado se houver 2 ou mais marcações

 Threshold: usado para “tirar debris”

8. Na pagina principal abrir Plot

Figura 8

 Em “Plot Source”: selecionar “Axquisition” e em seguida parecerão “X e Y

parameters” que foram previamente selecionados “parameters saved”;

 Escolher os eixos desejados: ex para 3 fluorescencias FSC x SSC; FL1 x FL2, FL1 x FL3 e FL2 x FL3.

 Pode-se escolher “No Gate” ou apenas os eventos que interessam, selecionando uma região de interesse.

Nota: Mesmo que selecione um gate todos os eventos estarão sendo salvos como determinado em “Aquisição & Store”

 Para abrir “Histogramas” selcioanr plots e depois “Histogram”

 Neste ponto poderá ser adquiridas as amostras controles para ajustar os parâmetros. Sempre com o item “Setup” selecionado Figura 2

0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 10 00 0 2 0 0 4 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 Linfócito s Monócit os Neutró filos

II. Ajuste de Parâmetros ( Settings)

A. Ajuste de morfologia

- Passar a amostra Mock e no plot de Foward / Side- Sacatter;

- Mexer no Detector / Amp para distribuir a população e distinguir as diferentes populações, vide exemplo

Figura 9

- Em A a voltagem SSc esta muito alta e B a de FSC esta alta, permitindo a aquisição de “debris” o que diminuirá os eventos plauciveis de serem analizados.

- A voltagem de FSC deve ser mantida em E00 e como em B tem muito debris o valor de FSc deve ser diminuído ou mesmo para SSC, até ficarem satisfatórios como figura abaixo

.

Figura 10

Passos da otimização

Amostras para otimização

A. Ajustar as voltagens de FSC e SSC. B. Ajustar threshold.

C. Seleção de população de interesse “gate”. D. Ajustar as voltagens dos PMT.

Controle Não Marcado

E. Compensação.

Controle com FITC Controle com PE Controle com PerCP

FSC-H

0

20

0

40

0

60

0

80

0

10

00

DEBRIS

B. Ajustar o Threshold -Exclusão do Debris Existem duas formas de excluir o debris: a) Baixar a voltagem do FSC

b) Aumentando o Threshold, até que o debris deixe de ser visualizada

Figura 11

Fazer “gate” na população de interesse e ajustar as voltagens dos PMT. Objetivo: evitar falso positivo e falso negativo – células não marcadas como controle

SSC-H

Em qual parâmetro usa-se o treshold?

E. Compensação- Vazamento

Muitas fluorescências apresentam superposição-vazamento para outros canais, pelo que tem que ser realizada a compensação

Sobreposição de Espectros

a) Passar os controles (+) para cada fluorescência e compensar, ou seja aumentar as

diferencias entre as fluorescencias para tirar o vazamentoi-sobreposição das fluorescencias.

 Compensação do FITC ( +FITC/-PEC)

Sem ajuste

Com ajuste

Relative Intensity 500n m 550n m 600n m 650n m 700n m Wavelength (nm) FITC 530/3 0 PE 585/42 Aumente o valor 0.0 PERCP 670nm

 Compensação PEC (- FITC/+ PEC)

 Compensação (-FITC / - PEC)

Ajustar as populações para que a população fique no quadrante duplo negativo.

Salvar

Aquire ---- Adquisição store: - definir R1 e o número de eventos Parâmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo

passar os controles novamente clicando no settting para que grave

Onde os valores de parâmetros ficam armazenados?

II. Aquisição das Amostras

c) Salvar Aquire ---- Adquisição store: - definir R1 e o número de eventosParâmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo

Sem ajuste

Com ajuste

Relative Intensity Aumente o valor 1.2 Wavelength (nm) PE 585/42 PERCP _670nm FITC 530/3 0 PE-Cy7 780/60

Apêndice

I. Calibração automática por beads - FACS comp.

1. Preparar os seguintes tubos

a) 1 ml de FACS Flow + 1 gota de beads não marcados b) 3 ml de FACS Flow + 1 gota de cada fluorescência 2. Abrir o FACS Comp

a) defenir o tipode célula: se é lavada ou não b) Códigos: colocar os códigos de cada beads c) Se vai se gravar ou não

II. Para puxar uma calibração anterior

a) Uma calibração anterior

Abrir Citometer---- Instrument setting---Open----Puxar a calibração anterior b) Calibração do FACS Comp

Abrir FACS station---BD files---- Instrument setting----Calibration files--- ---- Open--- set----Done

III. Imprimir relatório

Abrir FACS station---BD files ---FACS comp files--- Pasta do dia---- cliques

OBSERVAÇOES IMPORTANTES

Lavar periodicamente com detergente neutro, deixando ele secar e recolocando na grade do filtro, sempre lembrando com a proteção metálica para baixo.

 Limpeza do tanque de isoton

Para a retirada da sonda tomar cuidado para não rodar toda a sonda, rodar somente a parte branca que envolve a sonda, pois pode levar a quebrar o fio que leva a informação para o aparelho se o isoton esta cheio ou vazio

 Nível dos tanques

A importância de verificar o nível dos tanques: se o isoton estiver abaixo do nível mínimo a coluna de ar será maior que a de líquido, levando a adquirir muito ar podendo prejudicar as amostras.

 Enchendo o tanque de isoton

No momento em que for encher o tanque de isoton tomar cuidado com a limpeza do funil e do Becker, que poderá a levar a cair partículas de sujeira que

acarretara no mal uso do citômetro podendo levar ate o entupimento do aparelho.

 Tanque de waste

O tanque de waste quando estive cheio descartar na pia, e depois colocar 100ml de hipoclorito concentrado e levar de volta ao citômetro.

 Kit básico

É importante ter um kit básico na sala de citometria, que é composto por um esguicho de água bi destilada,de hipoclorito a 1% e outro de isoton, com uma observação importante, o hipoclorito não pode ficar em um frasco transparente por que só ira durar 1 dia e a água tem que ser trocada diariamente por que pode criar alga.

 Entupimento do citômetro

Caso ocorra o entupimento do citômetro, temos 3 procedimentos que poderíamos fazer para resolver.

O 1ª é dando o prime no próprio aparelho com a água no SIP, este procedimento ira provocar uma pressão para o lado de fora do SIP tentando limpar o sugador.

2ª passo é usando uma seringa com um cano de plástico que ira ligar ao SIP que através da pressão exercida que será maior que a do prime para o desentupimento do SIP.

3ª passo utilizando um fio muito fino que colocaremos dentro do SIP e empurrando de um lado e puxando do outro para desobstruir o SIP.