AVALIAÇÃO DA FOTOBIOMODULAÇÃO LASER NO REPARO DE FERIDAS CUTÂNEAS EM DORSO DE RATOS INFECTADAS PELO Staphylococcus aureus

AVALIAÇÃO DA FOTOBIOMODULAÇÃO LASER NO

REPARO DE FERIDAS CUTÂNEAS EM DORSO DE

RATOS INFECTADAS PELO Staphylococcus aureus

PROGRAMA INTEGRADO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA Área de Concentração: Laser em Odontologia

SALVADOR

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NICOLE RIBEIRO DA SILVA SANTOS

AVALIAÇÃO DA FOTOBIOMODULAÇÃO LASER

NO REPARO DE FERIDAS CUTÂNEAS EM DORSO

DE RATOS INFECTADAS PELO Staphylococcus

aureus

Tese apresentada ao Programa Integrado de Pós-Graduação em

Odontologia da Universidade

Federal da Paraíba e Universidade Federal da Bahia em cumprimento às exigências para obtenção do título de Doutor em Odontologia. Área de concentração: Laser em Odontologia.

Orientador: Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro

Co-Orientador: Prof. Dr. João Batista de Macedo Sobrinho

Salvador 2008

AVALIAÇÃO DA FOTOBIOMODULAÇÃO LASER

NO REPARO DE FERIDAS CUTÂNEAS EM DORSO

DE RATOS INFECTADAS PELO Staphylococcus

aureus

SALVADOR, 17 / 12 / 2008

BANCA EXAMINADORA:

__________________________________________________ Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro – Orientador - UFBA __________________________________________________ Prof. Dr. João B. de M. Sobrinho – Co-Orientador - IAPPEM __________________________________________________ Profª. Drª. Viviane A. Sarmento – Membro – UFBA

__________________________________________________ Prof. Dr. Manoel Damião Souza Neto – Membro – USP

__________________________________________________ Profª. Drª. Marleny E. M. Gerbi – Membro - UPE

Dedico aos meus pais, Clóves Nicolau Santos e

Eloísa Ribeiro da Silva Santos, pelo amor, dedicação

e principalmente, por serem exemplos de garra e coragem para toda a família. Obrigada por sempre acreditarem em mim e continuarem sonhando comigo.

À Alexandre Saback Gallas e Souza, que além de estar sempre ao meu lado, principalmente nos momentos mais difíceis, me fez muito feliz nesses quatro anos de convivência. Seu amor, carinho, respeito e dedicação, com certeza, fez com que meus dias ficassem muito mais coloridos.

Ao Prof. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro, meu Orientador, exemplo de garra e sucesso, sempre acessível e principalmente, sempre acreditando em mim e no meu crescimento profissional.

Ao meu cunhado João Batista de Macêdo Sobrinho, que sempre me ajudou e me incentivou, por toda a colaboração nesse trabalho

Às minhas irmãs Candice de Macêdo e Túlia Ribeiro, exemplos de generosidade, que sempre estiveram por perto me ajudando em todos os momentos.

A Artur Nicollau Macedo, meu sobrinho querido, que deu um novo sentido à minha vida e que transforma todos os meus dias numa grande festa.

A Deus, por guiar todos os meus passos e por estar sempre por perto em todos os momentos.

Ao Prof. Jean Nunes, pelo auxílio e por estar à disposição em todos os momentos.

À Profª. Cristina Cangussu, pela sua amizade e carinho, e por ser essa pessoa tão especial tanto profissionalmente, quanto pessoalmente.

À Profª. Aparecida Marques, por todas as oportunidades oferecidas e conhecimentos passados nestes dois anos de curso.

À Profª. Luciana Ramalho, pela disponibilidade e ajuda em todos os momentos.

A todos os professores do curso, em especial ao Prof. Ricardo da UFPB, que colaboraram na construção dos conhecimentos necessários para a realização desse sonho.

À amiga Priscila Oliveira Chagas, que sempre esteve ao meu lado, me ajudando e apoiando em todos os momentos.

À amiga Carolina Carvalho, que também esteve presente em todos os momentos, bons ou ruins, quando aprendemos várias lições e tornamos a nossa amizade ainda mais intensa.

A todos os estagiários do Centro de Laser, em especial à João Reis

e Nara, que sempre estiveram à disposição.

Aos meus colegas do doutorado Cristina Nascimento, Márcio

Lisboa, Márcio Marchionni, Ana Paula Cavalcanti, Sabrina Kívia, Fernando Habib e Lívia Prates, que me ajudaram e me apoiaram nessa dupla jornada.

Aos alunos do Grupo de Laser da FOUFBA, pela grande disponibilidade e ajuda durante a produção desse trabalho.

À Lurdes Maria, pelo seu valioso trabalho no laboratório de Patologia, sempre com muita simpatia e profissionalismo.

Ao amigo Alberto, que apesar de pouco tempo, já se tornou uma pessoa especial em minha vida.

A toda equipe da Disciplina Cirurgia II que me acolheu muito bem ao longo desses quatro anos.

Aos novos colegas do doutorado: Maíra Costalino, Suzana

Sampaio, Juliana Monteiro, Fábio Colombo, Rosário Freire e Edival Barreto.

A todos os funcionários do Biotério Central da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (UFBA), sempre presentes no dia-a-dia desse curso.

Aos funcionários do Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismos do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA.

A todos os pacientes, que nos ajudaram nessa longa jornada e possibilitam o aprendizado de todos nós.

À Faculdade de Odontologia da UFBA (FOUFBA) e todos os seus funcionários pelo apoio e colaboração.

LISTA DE FIGURAS LISTA DE QUADROS

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS RESUMO

ABSTRACT

1) INTRODUÇÃO...23

2) REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Cicatrização de feridas cutâneas...26

2.2 Infecção por Staphylococcus aureus...30

2.3 Laser...32

2.4 Fotobiomodulação a laser e Cicatrização...33

3) PROPOSIÇÃO...38

4) MATERIAIS E MÉTODO 4.1 Comitê de Bioética...39

4.2 Modelo Animal...39

4.3 Confecção da ferida cirúrgica...40

4.4 Bactéria e Caracterização...40

4.5 Ativação da cultura de bactérias...41

4.6 Infecção da ferida...42

4.7 Tratamento (Fotobiomodulação Laser)...42

4.8 Morte Animal, processamento e análise histológica ...46

4.10 Análise Estatística...48

5) RESULTADOS 5.1 Avaliação Histológica sob Microscopia de Luz...49

5.2 Comparação entre os grupos, com relação aos critérios histológicos analisados...72

6) DISCUSSÃO...78

7) CONCLUSÃO...83

8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...84 ANEXO

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: ... (pág.46)

Fotomicrografia do Grupo I (Controle – 07 dias). Observa-se pavimentação epitelial em formação e intenso infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos (L) (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 2: ... (pág.46)

Fotomicrografia do Grupo I (Controle – 07 dias). Observa-se intenso infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos, além de vasos congestos (V) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 3: ... (pág.46)

Fotomicrografia do Grupo I (Controle – 07 dias). Observa-se deposição de fibras colágenas imaturas e desorganizadas e presença de novos vasos sanguíneos (V) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 4: ... (pág.47)

Fotomicrografia do Grupo II (Controle – 14 dias). Observa-se pavimentação epitelial em (E) e infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos (L) (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008. Figura 5: ...

(pág.47)

Fotomicrografia do Grupo II (Controle – 14 dias). Observa-se células típicas de uma inflamação crônica e vasos congestos (V) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 6: ... (pág.47)

Fotomicrografia do Grupo II (Controle – 14 dias). Observa-se intensa formação de fibras colágenas (F) num estágio mais avançado de maturação (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 7: ... (pág.48)

Fotomicrografia do Grupo III (Vermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se um epitélio estratificado pavimentoso (E), sem anexos cutâneos (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 8: ... (pág.48)

Fotomicrografia do Grupo III ((Vermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se leve infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos (L) e hiperemia moderada (H) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 9: ... (pág.48)

Fotomicrografia do Grupo I (Vermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se matriz colágena de forma moderada e fibras organizadas (F) (aumento aproximado, Picro x 100) UFPB-UFBA, 2008.

Figura 10: ... (pág.49)

Fotomicrografia do Grupo IV (Vermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se pavimentação epitelial em formação, sem fâneros cutâneos (E) (aumento aproximado, HXE

x 40), UFPB-UFBA, 2008. Figura 11: ...

(pág.49)

Fotomicrografia do Grupo IV ((Vermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se intenso infiltrado inflamatório tipicamente linfocitário (L) e novos vasos (V) (aumento aproximado, HXE x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 12: ... (pág.49)

Fotomicrografia do Grupo IV (Vermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se proliferação fibroblástica com moderada formação de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 13: ... (pág.50)

Fotomicrografia do Grupo V (Vermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se tecido de granulação revestido por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado (E), sem fâneros cutâneos (aumento aproximado, HXE x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 14: ... (pág.50)

Fotomicrografia do Grupo V (Vermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se infiltrado inflamatório leve, tipicamente linfocitário (L) e neoangiogênese (V) (aumento aproximado, HXE x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 15: ... (pág.50)

Fotomicrografia do Grupo V (Vermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se proliferação fibroblástica (F) com moderada formação de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 16: ... (pág.51)

Fotomicrografia do Grupo VI (Vermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se reepitelização (E) e um grande número de novos vasos sanguíneos (V). (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 17: ... (pág.51)

Fotomicrografia do Grupo V (Vermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se células inflamatórias tipicamente linfocitárias (L) e vasos congestos (VC). (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 18: ... (pág.51)

Fotomicrografia do Grupo VI (Vermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se matriz colágena em formação com presença de fibras desorganizadas (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 19: ... (pág.52)

Fotomicrografia do Grupo VII (Vermelho 30J/cm2 - 14 dias). Observa-se úlcera revestida por epitélio estratificado pavimentoso queratinizado (E), sem anexos cutâneos (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 20: ... (pág.52)

Fotomicrografia do Grupo VII (Vermelho 30J/cm2 – 14 dias). Observa-se infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos (L) além de fibroblastos. (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008. Figura 21: ...

(pág.52)

Fotomicrografia do Grupo VII (Vermelho 30J/cm2 – 14 dias). Observa-se moderada formação de matriz colágena (C) e fibras ainda em processo de maturação. (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

intenso infiltrado inflamatório. (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 23: ... (pág.53)

Fotomicrografia do Grupo VIII (Vermelho 30J/cm2– 07 dias). Observa-se intenso infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos (L), fibroblastos (F) e vasos congestos(V) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 24: ... (pág.53)

Fotomicrografia do Grupo VIII (Vermelho 30J/cm2– 07 dias). Observa-se formação de moderada matriz colágena (C) com fibras desorganizadas (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 25: ... (pág.54)

Fotomicrografia do Grupo IX (Infravermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se completa pavimentação epitelial (E), com ortoqueratinização, sem anexos cutâneos, recobrindo um vasto tecido de granulação. (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 26: ... (pág.54)

Fotomicrografia do Grupo IX (Infravermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se moderado infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos (L) e inúmeros fibroblastos (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 27: ... (pág.54)

Fotomicrografia do Grupo IX (Infravermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se formação de uma intensa matriz colágena (C) e a organização de suas fibras (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 28: ... (pág.55)

Fotomicrografia do Grupo X (Infravermelho 10J/cm2 – 07 dias) Observa-se o epitélio estratificado pavimentoso em formação, recobrindo um tecido de granulação. (aumento aproximado H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 29: ... (pág.55)

Fotomicrografia do Grupo X (Infravermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se um tecido de granulação tipicamente crônico formado por fibroblastos jovens (F) e linfócitos (L). (aumento aproximado H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 30: ... (pág.55)

Fotomicrografia do Grupo X (Infravermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se leve formação colágeno e fibras (F) ainda desorganizadas. (aumento aproximado Picro x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 31: ... (pág.56)

Fotomicrografia do Grupo XI (Infravermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se um tecido de grnulação revestido por epitélio estratificado pavimentoso (E), sem anexos cutâneos. (aumento aproximado H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 32: ... (pág.56)

Fotomicrografia do Grupo XI (Infravermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se moderado infiltrado inflamatório com predominância de linfócitos e formação de novos vasos (V) (aumento aproximado H/E x 100).

UFPB-UFBA, 2008. Figura 33: ...

(pág.56)

Fotomicrografia do Grupo XI (Infravermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se intensa formação de matriz colágena (C) e novos vasos sangúineos (aumento aproximado Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 34: ... (pág.57)

Fotomicrografia do Grupo XII (Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias) apresentando uma pavimentação epitelial (E) em formação, sem anexos cutâneos, recobrindo um extenso tecido de granulação (aumento aproximado H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 35: ... (pág.57)

Fotomicrografia do Grupo XII (Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se um intenso infiltrado inflamatório crônico, além de novos vasos sanguíneos (V) (aumento aproximado, H/E x 100). UFPB-UFBA, 2008. Figura 36: ...

(pág.57)

Fotomicrografia do Grupo XII (Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se formação de matriz colágena (C) com fibras num estágio mais avançado de organização (aumento aproximado, Picro x 100) UFPB-UFBA, 2008. Figura 37: ...

(pág.58)

Fotomicrografia do Grupo XIII (Infravermelho 30J/cm2 – 14 dias). Observa-se um epitélio estratificado pavimentoso (E) em formação, recobrindo o tecido de granulação. (aumento aproximado, H/E x 40). UFPB-UFBA, 2008.

Figura 38: ... (pág.58)

Figura 38 - Fotomicrografia do Grupo XIII (Infravermelho 30J – 14 dias). Observa-se um moderado infiltrado inflamatório tipicamente crônico com a presença de vasos (V) (aumento aproximado H/E x 100). UFPB-UFBA, 2008.

Figura 39: ... (pág.58)

Fotomicrografia do Grupo XIII (Infravermelho 30J/cm2 – 14 dias). Observa-se intensa matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100). UFPB-UFBA, 2008.

Figura 40: ... (pág.59)

Fotomicrografia do Grupo XIV (Infravermelho 30J/cm2 – 07 dias). Observa-se epitélio estratificado pavimentoso ortoqueratinizado (E), sem anexos cutâneos, recobrindo intenso infiltrado inflamatório (aumento aproximado, H/E x 40). UFPB-UFBA, 2008. Figura 41: ...

(pág.59)

Figura 41 - Fotomicrografia do Grupo XIV (Infravermelho 30J – 07 dias). Observa-se infiltrado inflamatório com a presença de inúmeros vasos (V) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008. Figura 42: ...

(pág.59)

Fotomicrografia do Grupo XIV (Infravermelho 30J/cm2 – 07 dias). Observa-se intensa angiogênese (V) de leve a moderada produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 43: ... (pág.60)

Fotomicrografia do Grupo XV (Vermelho +Infravermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se epitélio pavimentoso estratificado (E) recobrindo tecido de granulação (aumento aproximado, H/E x 40),

UFPB-(pág.60) +Infravermelho 10J/cm – 14 dias). Observa-se intensa angiogênese (A) e leve produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 45: ... (pág.60)

Fotomicrografia do Grupo XV (Vermelho +Infravermelho 10J/cm2 – 14 dias). Observa-se intensa angiogênese (A) e leve produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 46: ... (pág.61)

Fotomicrografia do Grupo XVI (Vermelho +Infravermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se epitélio pavimentoso estratificado ortoqueratinizado (E) recobrindo tecido de granulação com células típicas de inflamação crônica (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 47: ... (pág.61)

Fotomicrografia do Grupo XVI (Vermelho +Infravermelho 10J/cm2 – 07 dias)). Observa-se tecido de granulação com infiltrado inflamatório intenso repleto de linfócitos (L) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 48: ... (pág.61)

Fotomicrografia do Grupo XVI (Vermelho +Infravermelho 10J/cm2 – 07 dias). Observa-se intensa angiogênese (A) e produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 49: ... (pág.62)

Fotomicrografia do Grupo XVII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se epitélio pavimentoso estratificado ortoqueratinizado (E) recobrindo tecido de granulação com células típicas de inflamação crônica (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 50: ... (pág.62)

Fotomicrografia do Grupo XVII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 14 dias)). Observa-se tecido de granulação com infiltrado inflamatório leve e a presença de novos vasos sanguíneos (V) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 51: ... (pág.62)

Fotomicrografia do Grupo XVII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 14 dias). Observa-se de intensa produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 52: ... (pág.63)

Fotomicrografia do Grupo XVIII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se epitélio pavimentoso estratificado ortoqueratinizado (E) recobrindo tecido de granulação com células típicas de inflamação crônica (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 53: ... Fotomicrografia do Grupo XVIII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se tecido

(pág.63) de granulação com infiltrado inflamatório intenso tipicamente crônico e novos vasos (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 54: ... (pág.63)

Fotomicrografia do Grupo XVIII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se intensa angiogênese (A) e produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 55: ... (pág.64)

Fotomicrografia do Grupo XIX (Vermelho +Infravermelho 30J/cm2 – 14 dias). Observa-se epitélio pavimentoso estratificado ortoqueratinizado (E) recobrindo um vasto tecido de granulação (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 56: ... (pág.64)

Fotomicrografia do Grupo XIX (Vermelho +Infravermelho 30J/cm2 – 14 dias). Observa-se tecido de granulação com infiltrado inflamatório leve, tipicamente crônico e inúmeros novos vasos (V) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008. Figura 57: ...

(pág.64)

Fotomicrografia do Grupo XVIII (Vermelho +Infravermelho 20J/cm2 – 07 dias). Observa-se intensa angiogênese (A) e produção de matriz colágena (C) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 58: ... (pág.65)

Fotomicrografia do Grupo XX (Vermelho +Infravermelho 30J/cm2 – 07 dias). Observa-se epitélio pavimentoso estratificado ortoqueratinizado (E) recobrindo um vasto tecido de granulação (aumento aproximado, H/E x 40), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 59: ... (pág.65)

Fotomicrografia do Grupo XX (Vermelho +Infravermelho 30J/cm2 – 07 dias). Observa-se intenso infiltrado inflamatório com inúmeros linfócitos (L), além de hiperemia e edema(E) (aumento aproximado, H/E x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 60: ... (pág.65)

Fotomicrografia do Grupo XX (Vermelho +Infravermelho 30J – 07 dias). Observa-se intensa produção de matriz colágena (C) e suas fibras mais organizadas (F) (aumento aproximado, Picro x 100), UFPB-UFBA, 2008.

Figura 61:... (pag.66).

Resultados Histológicos: HIPEREMIA - 07 dias (UFPB-UFBA, 2008).

Figura 62:... (pág.67).

Resultados Histológicos: EXSUDATO FIBRINOSO - 07 dias (UFPB-UFBA, 2008).

Figura 63:... (pág.68).

Resultados Histológicos: EDEMA - 07 dias (UFPB-UFBA, 2008).

Figura 64:... (pág.68).

Resultados Histológicos: EDEMA - 14 dias (UFPB-UFBA, 2008).

Figura 66:... (pág.70).

Resultados Histológicos: INFILTRADO

INFLAMATÓRIO14 dias (UFPB-UFBA, 2008). Figura 67:...

(pág.71).

Resultados Histológicos: COLAGENIZAÇÃO 14 dias (UFPB-UFBA, 2008) (pag.71).

Figura 68:... (pág.71).

Resultados Histológicos: COLAGENIZAÇÃO 14 dias (UFPB-UFBA, 2008).

LISTA DE QUADROS

Critérios Histológicos da Cicatrização (SOARES, 2006).

ATP: ... Adenosina-trifosfato cm: ... Centímetro

cm2: ... Centímetro quadrado

CW: ... Continous Wave = Emissão contínua FBML ... Fotobiomodulação à Laser

Fig.: ... Figura

FCF: ... Fator de Crescimento Fibroblástico

FGF: ... Fibroblast Growth Factor = Fator de crescimento de Fibroblastos

g: ... Grama

GaAs Gallium-Arsenide= Arseneto de Gálio

GaAlAs: ... Gallium-Aluminium-Arsenide = Arseneto de Gálio e Alumínio

H/E: ... Hematoxilina e Eosina Hs: ... Horas

Hz: ... Hertz

J: ……… Joule

J/cm2: ……… Joule por centímetro quadrado K+: ... Íon Potasio

LILT: ... Low Intensity Laser Treatment MEC ... Matriz Extracelular

mg/mL: ... Miligrama por mililitro min: ... Minuto

mL: ... Mililitro mW: ... MiliWatts

mW/cm2: ... MiliWatts por centímetro quadrado Na+: ... Íon Sódio

nm: ... Nanômetro

pH: ... Potencial hidrogeniônico Picro: ... Picrosírius

rpm: ... Rotações por minuto S: ... Segundo

UFBA: ... Universidade Federal da Bahia UFC: ... Unidade formadora de colônia

UFC/mL: ... Unidade formadora de colônia por mililitro

UFPB Universidade Federal da Paraíba

W: ... Watts

: ... Marca registrada °C: ... Graus Celsius nº: ... Número

µg: ... Micrograma

µg/mL: ... Micrograma por mililitro µl: ... Microlitro

µm: ... Micrometro

λ: ... Comprimento de onda %: ... Percentual

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi avaliar, através das análises histológicas, a fotobiomodulação Laser no processo de cicatrização de feridas cutâneas em dorso de ratos infectadas por Staphylococcus aureus. Foram utilizados sessenta ratos (Wistar), sendo realizada no dorso de cada animal uma ferida excisional de 1cm2 que 4hs depois foi inoculada com

Staphylococcus aureus. Após 48hs da infecção, os animais foram distribuidos

em 4 grupos: grupo Controle; grupo Laser λ680nm; grupo Laser λ790nm; grupo Laser λ680nm + λ790nm, que por sua vez, foram subdivididos em dois períodos de sacrifício animal (7 e 14 dias), além de três densidades de energia distintas (10, 20 e 30J/cm2) totalizando, ao final, 20 subgrupos com 3 animais cada. Na fotobiomodulação laser, as feridas eram irradiadas, a cada 48H, nas suas extremidades (4 pontos), com os valores das densidades de energia divididos de acordo com esses pontos. As potências do aparelho variavam de acordo com o comprimento de onda: 30mW para o vermelho e 40mW para o infravermelho. As ponteiras foram devidamente protegidas e entravam em contato diretamente com a ferida, sempre numa posição perpendicular em relação à ferida, com spot de aproximadamente, 3mm cada uma. Após a fotobiomodulação laser e o sacrifício dos animais, foram realizadas biópsias excisionais nas feridas, para processamento e confecção das lâminas, coradas com H/E e Picrossírius e análise sob microscopia de luz. Os seguintes critérios foram analisados: edema, neovascularização, pavimentação epitelial, proloiferação fibroblástica, infiltrado inflamatório e colagenização. Uma análise semi-quantitativa foi realizada e os testes de Kruska-Wallis e de Fisher foram utilizados. Dessa forma, foi observado que os animais dos grupos tratados com laser apresentaram um tempo de cicatrização mais rápido, com uma maior deposição de fibras colágenas e maior quantidade de vasos sanguíneos. E segundo os resultados encontrados, os grupos com valores de densidade de energia mais altos (20 e 30J/cm2) e tratados com os dois comprimentos de ondas distintos apresentaram um reparo mais efetivo e com uma produção de colágeno maior.

Palavras-chave: Fotobiomodulação Laser, infecção, Staphylococcus aureus, Reparo.

ABSTRACT

The Laser photobiomodulation acts directly in the healing process through the increase of the cellular proliferation, synthesis of substances and liberation of growth factors.T he infection is a constant fight between the mechanism of defence of the organism and the concentration and virulence pf the microorganism. This work has as objective evaluates through a histological study the action of the laser in cutaneous wounds infected by Staphylococus aureus. Sixty mice will be used (Wistar), being accomplished in the back of each animal a wound of 1cm2, the animals will be divided in four groups: group control, group laser λ680nm; group Laser λ790nm; group Laser λ680nm + λ790nm (7 and 14 days; 10, 20 and 30J/cm2 .After the treatment, the animals will be sacrificed and submitted to biopsies excisionais of the wounds, for making of the sheets and histological analyses in coloration HE, Picrosírius. The histological results, in general, showed a better healing in the laser groups, in comparison to the controls groups. The results showed higher deposition of collagen fibers, larger amounts of granulation tissue, better inflammatory reaction and revascularization on laser-treated subjects. It is concluded that lasertehrapy resulted in a better repair in the groups with 20 e 30J/cm2 and 680 and λ790nm laser light.

Word-key: Laser Photobiomodulation, infection, Staphylococcus

1. INTRODUÇÃO

A pele é o maior órgão do corpo humano; é constituída pela epiderme (camada mais externa, epitélio) e pela derme (camada mais interna, conjuntivo); e atua como uma barreira mecânica a lesões e à contaminação. Qualquer solução de sua continuidade representa uma ferida. A restauração de sua estrutura se dá por cicatrização ou reparo (GOGIA, 2003; NASCIMENTO et

al., 2004).

Alguns fatores (locais e/ou sistêmicos) tais quais: a deficiência nutricional como carência protéica e de vitamina C (que interferem na formação do colágeno); a Diabetes Mellitus (microangipatia); hormônios, como os glicocorticóides, têm ação antiinflamatória e inibem a produção de colágeno. Estes interferem nos processos de cicatrização. Localmente, a infecção é a mais importante causa de retardo na cicatrização. Outros fatores podem também retardar a cicatrização (movimentação precoce dos tecidos, corpos estranhos, tamanho e localização da ferida, e a vascularização local (COTRAN

et al. 2000, PINHEIRO et al., 2006).

Os microrganismos que são normalmente encontrados em vários locais do organismo sem, contudo causar a sua invasão (geralmente inofensivos ao hospedeiro) e são conhecidos como “flora normal” ou microbiota indígena e contribuem para o desenvolvimento do sistema imune, podendo dificultar a colonização por microrganismos patogênicos. Inofensivos em seus locais habituais, eles podem produzir doença se penetrarem em outras áreas, sendo considerados oportunistas. Podem também, após um desequilíbrio da

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microbiota indígena, favorecer a ação de bactérias potencialmente patogênicas (RIBEIRO et al., 2003).

A infecção cirúrgica é uma possibilidade sempre presente após qualquer intervenção e sua ocorrência é multifatorial. A exata conceituação e a avaliação rigorosa de sua incidência são fundamentais para que possam ser identificados eventuais desvios das normas ou a eficácia de medidas adotadas para preveni-las. A infecção é a complicação mais comum na cicatrização das feridas, e resulta em uma resposta vascular e celular dos tecidos (OLIVEIRA et al., 2003; RIBEIRO et al., 2003).

A reparação dos tecidos infectados ocorre apenas após destruição dos microrganismos e a remoção do tecido necrótico. Outro problema resultante da infecção é o fato das fibras colágenas terem uma destruição aumentada, possivelmente pela ação de enzimas lisossômicas presentes nos leucócitos. Adicionalmente, os fibroblastos competem localmente com outras células e microrganismos por Oxigênio e outros nutrientes na ferida, o que resulta na diminuição de seu metabolismo e, conseqüentemente, na redução da síntese do colágeno. Os principais agentes etiológicos da infecção de uma ferida cirúrgica na pele e na nasofaringe são o Staphylococcus aureus e o

Streptococcus pyogenes (OLIVEIRA et al., 2003).

Diversas terapêuticas têem sido propostas como eficazes na melhora da cicatrização, dentre elas o uso de diversas fontes de luz, dentre elas a luz Laser. Diversos trabalhos têem mostrado que o uso de protocolos adequados é eficaz em promover uma melhor resposta tecidual frente a diversos agentes traumáticos ou a condições locais e sistêmicas (MENDEZ et al., 2003; AL-WATBAN et al., 2004; NASCIMENTO et al., 2004)

A luz laser tem um efeito fotobiológico que promove aceleração dos eventos do processo de cicatrização tecidual. Atuam em nível celular, através da interação fotoquímica, podendo promover o aumento do metabolismo celular, e consequentemente, induzir diferentes efeitos, como o analgésico, antiiflamatório e reparo (VINKI et al., 2003; NASCIMENTO et al., 2004; BOURGUIGNON-FILHO et al., 2005; HERASCU et al., 2005).

Este trabalho tem como objetivo avaliar, histologicamente, a ação da fotobiomodulação laser na cicatrização de feridas cutâneas infectadas com

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2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Reparo de Feridas Cutâneas

No processo de reparação tecidual, a regeneração e a cicatrização devem ser consideradas como eventos distintos, que agem em conjunto a fim de manter a estrutura anatômica e a função da região afetada. Este fenômeno envolve vários fatores e o desequilíbrio ou a ausência de compostos (mediadores solúveis, elementos figurados do sangue, matriz extracelular e células parenquimatosas), principalmente os envolvidos na formação do colágeno, compromete o resultado final da cicatrização (AZEVEDO et al., 2004; BLANES et al., 2004; NASCIMENTO et al., 2004).

Diante de destruições teciduais, que ultrapassam os limites da regeneração, ou perante a destruição de células perenes, a reposição tecidual é feita à custa da proliferação de células menos diferenciadas, como é o caso das pertencentes ao tecido conjuntivo. Dá-se início, então, ao processo de cicatrização. Esta nada mais é que a reposição de tecido por conjuntivo neoformado não especializado (BAYNES et al., 2000, MENDEZ et al., 2003).

O comportamento de cada tipo de célula, o seu desempenho e a contribuição durante as fases de proliferação, migração, síntese de matriz e contração, bem como a presença dos fatores de crescimento e da matriz no leito da lesão, ainda são superficialmente compreendidos. O processo de cicatrização envolve a indução de um processo inflamatório agudo, inicialmente, com estimulação, migração e proliferação de células parenquimatosas e conjuntivas, síntese da matriz extracelular, resultando em

remodelagem do tecido conjuntivo e de componentes parenquimatosos, colagenização e aquisição de resistência da ferida (PUGLIESE et al., 2003; NASCIMENTO et al., 2004).

O reparo das feridas e sua reestruturação constituem um mecanismo complexo, em que vários fatores contribuem para que os diversos tipos de cicatrização, como hipertrofia, atrofia ou normotrofia da área lesionada. Esses processos compreendem as seguintes fases: inflamação, granulação e formação de matriz extracelular (AL-WATBAN et al., 2004; PINHEIRO et al., 2006).

A fase inflamatória inicia-se imediatamente após a lesão, ocorrendo vasoconstrição por cinco a 10 minutos. Essa vasoconstrição inicialmente reflexa propicia o fechamento dos vasos lesados e favorece a hemostasia. Posteriormente as células endoteliais retraem-se e perdem suas conexões, aumentando a permeabilidade vascular e permitindo a passagem de elementos sangüíneos para a ferida como plasma, eritrócitos e leucócitos, através do fenômeno de diapedese. A vasodilatação com extravasamento de elementos para o exterior dos vasos forma um exsudato causando calor, rubor e dor. Sua intensidade correlaciona-se com o tipo e grau de agressão. Juntamente com todas estas alterações, que correspondem à resposta vascular, existe uma resposta celular. São importantes nesta fase os neutrófilos, responsáveis pela digestão de bactérias e tecidos desvitalizados e os monócitos que se transformam em macrófagos e auxiliam na fagocitose. Após o trauma, são liberados mediadores celulares que estimulam a elaboração de substâncias, promovendo o processo inflamatório (histamina, serotonina, bradicinina,

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prostaglandinas, tromboxanos, linfocinas e interleucina) (NASCIMENTO et al., 2004; VILELA, 2006).

Na fase proliferativa ou fibroplástica ocorre a reparação do tecido conjuntivo e do epitélio, formando o tecido de granulação, que é composto por fibroblastos e vasos sangüíneos neoformados. O fibroblasto surge por volta do segundo e terceiro dias após o trauma. O fibrinogênio do exsudato inflamatório transforma-se em fibrina, formando uma rede, onde os fibroblastos depositam-se e passam a multiplicar-depositam-se e a depositam-secretar os componentes protéicos do tecido cicatricial. Concomitante a esta fibroplasia ocorre intensa proliferação vascular. O tecido formado por fibroblastos, substâncias e vasos sangüíneos denomina-se, tecido de granulação, tem aspecto granuloso e avermelhado. O miofibroblasto é uma célula que está presente no tecido de granulação e confere capacidade contrátil facilitando a epitelização (RESENDE et al., 2005). A atividade mitótica do fibroblasto praticamente desaparece em torno do 15º dia, passando a secretar as proteínas presentes no tecido de granulação, produzindo componentes da substância fundamental e o colágeno. A substância fundamental é formada por água, eletrólitos e glicosaminoglicanos têm aspecto semelhante a um gel e está distribuído entre as fibras do tecido conjuntivo. A formação do epitélio é outro fenômeno que ocorre na fase de fibroplasia. A epitelização faz-se, pelo aumento de tamanho, da divisão e da migração das células da camada basal da epiderme por sobre a área de reparação do tecido conjuntivo subjacente (CARVALHO et al., 2003).

Os fibroblastos são a maior fonte de matriz de proteínas que restaura a continuidade do tecido lesado. Dois processos estão envolvidos na fibroplasia: migração e proliferação de fibroblastos e a deposição de Matriz Extracelular

(MEC) por estas células. A permeabilidade vascular dos vasos neoformado neste tecido de granulação também favorece a deposição de proteínas plasmáticas, como fibrinogênio e fibronectina na matriz extracelular, proporcionando estroma para o crescimento de células endoteliais. A migração de fibroblastos para o local da lesão e a sua subseqüente proliferação, é deflagrada por numerosos fatores de crescimento e as denominadas citocinas fibrinogênicas (COTRAN et al., 2001).

O colágeno é uma proteína fibrosa cujo tamanho é 3000Å x 14Å com funções estruturais importantes. Constituem parte importante da matriz extracelular, contribuindo para a preservação da integridade e da forma da maioria dos tecidos biológicos da maioria dos tecidos. As fibras colágenas estão também envolvidas no desenvolvimento embrionário, fenômenos adesivos e de movimentação celular. Há vários isótopos de colágenos conhecidos atualmente, cada um com estrutura própria e finalidade distinta. Os principais tipos de colágeno humano são do I ao IX, cada um em com tecido e função específica. Os tipos de colágeno mais abundante são os tipo I, II, III, são os chamados colágenos intersticiais, dentre estes os colágenos tipo I e III são os envolvidos no processo de reparo de tecidos moles. O colágeno tipo III, também denominado fetal ou embrionário corresponde ao principal componente da reação de granulação em feridas em cicatrização e da camada reticular do tecido conectivo da mucosa oral. Com a progressão da cicatrização, a quantidade de colágeno tipo III diminui e um colágeno mais forte e robusto, o tipo I é depositado (COTRAN et al., 2000).

Inicialmente predomina-se o colágeno tipo III, e após sete a oito dias o colágeno tipo I é predominante. As fibras colágenas são depositadas em

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paralelo aos fibroblastos e estes estão dispostos em ângulos de 90˚ em relação aos capilares. Durante a cicatrização, os neutrófilos, macrófagos, células epiteliais e fibroblastos são capazes de produzir colagenase e todos participam da degradação do colágeno tipo III. A maior parte do colágeno tipo III possui um sítio suscetível a proteases inespecíficas. Mesmo após a remoção do colágeno III, a atividade da colagenase permanece elevada no sítio do ferimento por alguns meses. Após os estágios iniciais da cicatrização, a resistência tênsil é estabelecida, os capilares são reabsorvidos e inicia-se a mobilização do tecido Para tanto é necessário que as fibras e feixes de colágeno sejam re-orientados de acordo com as novas linhas de força e isso ocorre com a remoção do colágeno inicialmente depositado e pela deposição de novas fibras colágenas [ ... ].

2.2. Infecção por Staphylococcus aureus

A infecção, que corresponde a 50% das complicações que podem acometer uma ferida, é o mais problemático fator local que afeta a cicatrização. Ela tem um efeito negativo no metabolismo do colágeno, reduzindo a sua produção e aumentando a sua lise. Além do mais a infecção bacteriana diminui a disponibilidade dos nutrientes necessários à cicatrização (GOGIA, 2003).

O Staphylococcus aureus é um coco gram-positivo, que é considerado a espécie mais virulenta desta cepa, sendo um patógeno com grande capacidade de produzir abscessos em infecções localizadas ou metastáticas (Kasper et al, 2006). Dos diversos tipos, ele é o mais importante agente patogênico para o

homem. A pele é a via de entrada mais comum, mas é necessário um traumatismo para que se crie uma porta de entrada, pois o microrganismo não pode atravessar a epiderme intacta (COTRAN et al., 1999, RIBEIRO et al., 2003).

Numa ferida cutânea infectada, freqüentemente, é formada por tecido necrosado e exsudato inflamatório constituindo uma escara. Abaixo desta, encontra-se um tecido de granulação inflamatório crônico (OLIVEIRA et al., 2003).

O Staphylococcus aureus é o agente mais freqüente na etiologia das infecções das feridas cirúrgicas, exteriorizando-se habitualmente na primeira semana após a intervenção cirúrgica. A secreção purulenta espessa e sem odor é a sua característica, e o tratamento local, é a maneira mais efetiva de se tratar a ferida (FERRAZ et al., 1997, OLIVEIRA et al., 2003). Ele produz uma série de infecções, que variam desde lesões purulentas e localizadas da pele, até infecções generalizadas e sistêmicas (RIBEIRO et al., 2003).

Num estudo onde se isolaram cepas de Staphylococcus aureus de várias doenças da pele durante um período de três anos, do total, 113 apresentaram sensibilidade à Meticilina e 31 eram resistentes. As doenças da pele que originaram culturas positivas foram dermatite atópica, seguida por úlceras. O Staphylococcus aureus foi a espécie predominante em cerca de 2/3 de todas as diferentes doenças de pele examinadas (HIGAKI et al. 2000),

A infecção geralmente desenvolve-se como processo inflamatório difuso, inicialmente sem supuração, que é caracterizado por edema, eritema e

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dor. O tecido sofre infiltração celular de glóbulos vermelhos, Leucócitos, Histiócitos e Macrófagos. Este processo é seguido de supuração, que é resultante da liquefação dos tecidos e pelo acúmulo de pus no interior do abscesso. Enzimas proteolíticas bacterianas, incluindo as proteinases, colaboram no processo de liquefação tecidual. A Colagenase, enzima do

Staphylococcus aureus, produz a liquefação do colágeno e ajuda na

disseminação da infecção através das barreiras das fascias (CABRAL JÚNIOR; MAGALHÃES, 1993).

2.3 LASER

A luz é uma forma de energia que pode ser representada graficamente por uma linha contínua conhecida como espectro eletromagnético. A unidade de medida realizada em nanômetro é chamada de comprimento de onda e determina a cor. Os vários comprimentos de ondas de energia do laser vão desde ondas curtas, na área ultravioleta, até ondas mais longas, na região do infravermelho ao longo desta linha perpétua. Os comprimentos de ondas laser visível ocupam uma pequena parte deste contínuo. A radiação laser é ionizante, pois não apresenta risco de rompimento do DNA celular pela contínua exposição tissular, sendo sua potência, ou energia de feixe de laser medida em Watts (BRUGNERA e PINHEIRO, 1998; GENOVESE, 2000; LOW e REED, 2001).

A palavra Laser é um acrônimo para Light Amplification by Stimulated

Emission of Radiation, que significa amplificação da luz por emissão estimulada

estimulada foi apresentada por Einstein, e em 1916, o seu importante trabalho

Zur Quantum Theorie der Stralung, proporcionou o desenvolvimento teórico do

laser. Mais tarde, Schawlow e Townes elaboraram os princípios pelos quais os Laseres operam. Em 1964, o prêmio Nobel foi concedido para Townes, Basov e Prokholov, creditando-lhes o desenvolvimento da Teoria das Emissões Espontânea e Estimulada de Radiação (PINHEIRO; FRAME, 1991; BRUGNERA JÚNIOR; PINHEIRO, 1998; PINHEIRO, 1998).

A terapia à Laser é mais uma opção de tratamento que se pode oferecer ao paciente na clínica diária. Observa-se que os clínicos que todas as áreas estão integrando-se cada vez mais a essa nova ferramenta de trabalho [..].

Os parâmetros fundamentais para uma apropriada comparação de dados de um protocolo de irradiação da luz Laser são os seguintes: comprimento de onda, freqüência, potência, diâmetro do raio, tempo de irradiação, densidade de potência, dose e intervalos de tratamento. Em adição a estes parâmetros, o efeito da energia liberada para os tecidos deve levar em consideração a definição de Laser não-ablativo. Para isto, o diâmetro do raio e o tempo de exposição são de importância significante, uma vez que são eles que determinam a densidade de potência e a dose, e desta forma, a resposta das células à luz incidente (SCHINDL et al., 2000).

2.4. Fotobiomodulação a Laser e Cicatrização

A partir das descobertas de Mester, diversos estudos foram realizados e os principais aspectos da cicatrização que são reportadamente afetados são a proliferação de Fibroblastos e Queratinócitos, a síntese do colágeno com um

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maior padrão de produção de matriz extracelular e de estimulação da angiogênese. Enquanto alguns trabalhos relatam um efeito mínimo ou a falta de efeitos após a irradiação com Laser não-ablativo, a maioria demonstra um efeito positivo na atividade celular, com aumento na produção de colágeno e melhoria de cicatrização (CONLAN et al., 1996).

Com o objetivo de investigar o comportamento de feridas cutâneas circulares de 10mm de diâmetro, provocadas na região dorsal de 12 ratos Wistar, outra pesquisa foi idealizada. Os animais foram divididos aleatorimente em dois grupos, um sem tratamento, e outro, submetido à terapia a laser de baixa intensidade. O aparelho de laser utilizado foi o Twin Laser (GaAs), λ870nm, potência de pico de 70mW, potência média de saída de 0,5 a 3,5mW, com fibra óptica. A aplicação foi realizada pelo método de varredura na área central da ferida. O protocolo utilizado foi de 3,8J/cm2 de dosagem, 15mW de potência e tempo de aplicação de 15s, num intervalo de 48H. Após 10 dias do ato cirúrgico foram colhidas amostras das lesões para realização de estudo histológico e histomorfométrico, que evidenciaram um aumento da neovascularização e da proliferação fibroblástica e diminuição da quantidade de infiltrado inflamatório. Os resultados em conjunto sugeriram que a terapia a laser é um método eficaz no processo de modulação da reparação tecidual, contribuindo para uma cicatrização tecidual mais rápida e organizada (ROCHA JÚNIOR et al., 2006).

Num estudo para avaliar a interferência do laser de baixa intensidade sobre as fibras colágenas e elásticas, foram realizados ferimentos cutâneos padronizados no dorso de setenta e dois ratos Wistar. O laser utilizado foi o diodo de Ga-Al-As (Dentoflex-Brazil), λ670nm, CW, 9mW. Em seguida, com

aplicações pontuais do raio laser com diferentes densidades de energia (grupo 2, 4J/cm2 e grupo 3, 8J/cm2) deu-se início à fototerapia. Os animais foram sacrificados com 24, 48 e 72 horas e aos quinto, sétimo e 14º dias. Através da análise histológica, observou-se que nos grupos submetidos à terapia a laser, houve maior redução do edema e infiltrado inflamatório, além disso, uma maior expressão de fibras colágenas e elásticas foi também evidenciada. Em relação à fluência, o grupo de 4J/cm2 apresentou melhores resultados em relação ao de 8J/cm2. Sendo assim concluiu-se que o laser contribuiu para uma maior expressão de fibras colágenas e elásticas na cicatrização (PUGLIESE et al., 2003).

Já com o objetivo de avaliar a relação existente entre os diferentes comprimentos de onda e a intensidade utilizada, outra pesquisa foi idealizada analisando o processo cicatricial e a fotobiomodulação a Laser. Nesta, 30 ratos

Wistar, adultos, jovens foram selecionados e submetidos a procedimentos

cirúrgicos e a fotobiomodulação a Laser. Sendo assim, eles foram anestesiados, e uma ferida circular (8 X 1mm) foi criada no dorso de cada animal. Os animais foram divididos em dois grupos, cada um com 15 animais. Os mesmos foram subdivididos em mais três grupos, contendo cinco animais cada. As feridas foram irradiadas com o Laser diodo (Thera Laser®, DMC, São Carlos, SP, Brazil) com comprimentos de onda de λ670nm e λ685nm e dose de 10J/cm2, em dois pontos distintos da borda da ferida. Diferentes intensidades foram testadas: 2, 15 ou 25mW durante sete dias. Em todos os grupos foi observado o processo de reparo. No entanto, o tratamento mais efetivo foi quando houve uma combinação da maior intensidade com o menor

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comprimento de onda, ou menor intensidade e maior comprimento de onda (NASCIMENTO et al., 2004).

Outro estudo teve como objetivo avaliar In Vitro o efeito da laserterapia na proliferação de Fibroblastos de gengiva humana, utilizando laseres diodo de diferentes comprimentos de onda (λ670nm, λ780nm, λ692nm e λ786nm) e potência de energia (10mW, 30mW e 50mW), com uma única densidade de energia (2J/cm2). Como conclusão, foi observado que a FBML promoveu em todos os grupos experimentais um aumento na proliferação de Fibroblastos, sendo que os comprimentos de onda infravermelhos e os tempos de exposição menores apresentaram melhores resultados (ALMEIDA LOPES et al. 2001).

Outra pesquisa com o objetivo de avaliar o efeito dos Laseres de GaAlAs (λ830nm – 35mW, spot 0.60mm) e Índio-Gálio-Alumínio-Fosforo (InGaAlP) (λ685nm – 35mW, spot 0,60mm) com doses de 20 e 50J/cm2, ambos Thera Laser®, DMC, São Carlos, SP, Brazil. Sessenta animais foram divididos em sete grupos e em todos foi realizada uma ferida cutânea circular de 8mm2. Os ratos Wistar foram sacrificados após três, cinco e sete dias do início do tratamento. Análises histológicas dos grupos irradiados utilizando as colorações HE e Picrosírius mostraram aumento na produção e organização do colágeno quando comparados com os grupos controle. A inflamação esteve presente em todos os grupos e em todos os tempos. Os grupos Laseres λ830nm e λ685nm, com densidade de energia de 20J/cm2, apresentaram melhores resultados ao final dos períodos experimentais (MENDEZ et al. 2004).

Apesar do grande número de trabalhos mostrando os efeitos desejáveis da irradiação com Laser, há aqueles com um efeito contrário ou falta de efeito

(ALLENDORF et al., 1997; BRAVERMAN et al., 1989; CAMBIER et al., 1996; HALL et al., 1994; HALLMAN et al., 1988; HUNTER et al., 1984; KREISLER et

al., 2001; LAGAN et al., 2001; SCHLAGER et al., 2000).

Questiona-se os parâmetros usados, tais como comprimento de onda, dose, densidade de potência, tempo de irradiação, além do calendário de dias de aplicação; e complementou destacando que antes de iniciar um trabalho de pesquisa com Laser é preciso considerar a importância desses parâmetros e de como eles podem influenciar os resultados, para evitar controvérsias e conclusões empíricas (WALSH, 1997).

Alguns estudos que não encontraram efeitos da fotobiomodulação a Laser não-ablativo, têm algum problema na metodologia empregada, não levando em conta o efeito sistêmico ou usando feridas contralaterais como controle (SILVA JÚNIOR et al., 2002).

A fotossensibilidade das células à irradiação Laser não é do tipo “tudo ou nada”. Ao contrário, existem diversos graus nos quais as células dos tecidos podem ser menos ou mais sensibilizadas, dependendo do estado fisiológico das mesmas, prévio à irradiação. Sendo assim, não provoca admiração o fato de o Laser não-ablativo exercer um efeito menor ou uma falta de efeito sobre organismos “saudáveis”, que estejam em um estado de equilíbrio fisiológico, podendo o pesquisador desatento encontrar resultados falso-negativos (KARU, 1989; SCHINDL et al. 2000).

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3. PROPOSIÇÃO

3.1 Geral

Avaliar, através da análise histológica, o processo de reparo de feridas cutâneas infectadas por Staphylococcus aureus no dorso de ratos submetidos à fotobiomodulação Laser em diferentes comprimentos de ondas e suas respectivas potências (λ680nm, 30mW e λ790nm, 40mW), associados ou não, e diferentes densidades de energia (10,20 e 30J/cm2).

3.2 Específica

Descrever e comparar, histologicamente, o processo de reparo de feridas cutâneas infectadas por Staphylococcus aureus no dorso de ratos submetidos à fotobiomodulação Laser através da caracterização dos eventos envolvidos: infiltrado inflamatório, hiperemia, edema, exsudato fibrinoso, pavimentação epitelial, deposição colagênica e neoangiogênese.

4. MATERIAIS E MÉTODO

4.1 Comitê de Bioética

O projeto de pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética na Experimentação Animal do Laboratório de experimentação animal da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia (Anexo: 1).

O presente estudo respeitou todos os princípios éticos de experimentação animal, bem como as normas didático-científicas da vivissecção de animais, de acordo com a Lei 6.638, de 08 de maio de 1979 (GOLDIM, 1995).

4.2 Modelo Animal

No presente trabalho foram utilizados 60 ratos Ratthus Norvegicus

Albinus, Rodentia Mammalia, da linhagem Wistar, machos, adultos jovens

obtidos junto ao Biotério Central da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Salvador, Bahia, sendo em seguida transferidos para o Laboratório de Experimentação Animal da FOUFBA. Os animais foram acomodados em gaiolas individuais, mantidos com água e ração

ad libitum, com iluminação artificial (ciclo de 12/12hs claro/ escuro) e a

40

4.3 Confecção da Ferida Cirúrgica

Os animais foram anestesiados com cloridrato de cetamina (Vetset®) 0,06ml/100g e xilazine (Copazine®) 0,03ml/100g, via intra-peritoneal. Tiveram a região dorsal tricotomizada e, em seguida, a área lavada com soro fisiológico e Clorexidina a 2%. Feridas excisionais medindo aproximadamente 1x1cm (marcação feita com auxílio de uma régua e uma caneta), foram criadas no dorso de cada animal, utilizando um cabo de bisturi com lâmina número 15.

4.4 Bactéria e Caracterização

A cepa bacteriana usada nesse trabalho foi a Staphylococcus aureus ATCC 6538, que faz parte da coleção de culturas do Laboratório de Biotecnologia e Ecologia de Microrganismos do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. O microrganismo é recomendado mundialmente para avaliação da susceptibilidade a substâncias e processos antimicrobianos. Para a devida avaliação da sua pureza e identificação foram realizados testes em meios de cultura específicos, com o meio Baird-Parker1; foi feita a verificação de sua morfologia (forma, tamanho e arranjos característicos); foi realizada a caracterização pelo método de Gram; produção de catalase e coagulase; teste de aglutinação em látex2, para observação do fator de aglutinação e a detecção da proteína A; verificação do padrão característico em relação ao coeficiente fenólico e a resistência a vários antibióticos. Sendo que todos os resultados obtidos

1

DifcoTM Baird-Parker Agar Base (ref. 0768) + DifcoTM Egg Yolk Enrichment 50% (ref. 3347) 2

estavam de acordo com o microrganismo, segundo Manual de Bacteriologia Determinativa (HOLT et al., 1994).

4.5 Ativação da cultura do Staphylococcus aureus

Para a ativação da cultura do Staphylococcus aureus foram realizados os seguintes procedimentos:

1. Ativação da cultura pura de Staphylococcus aureus ATCC 6538 a partir de um meio sólido, que compreendeu na inoculação de uma alçada em um tubo de ensaio contendo 10mL em Caldo Tripticase de Soja3 (TSB) e incubada a 36°C por 24hs. Para obter um inóculo padrão , foi tomada uma alíquota de 10µL da cultura ativada que foi inoculada em um tubo de ensaio contendo 10mL de meio TSB e incubada em estufa a 36°C por 24hs;

2. A cultura foi então submetida às diluições decimais sucessivas em solução tampão fosfato salina (PBS) até 10-5, quando então foi retirada uma alíquota de 10µL da cultura e inoculada em um tubo de ensaio contendo 10mL em TSB de forma a se obter inicialmente (tempo 0), no máximo, cerca de 102 bactérias;

3. O tubo foi incubado sob agitação constante (150rpm, 36°C) por 24hs, que conforme curva de crescimento realizada por MACEDO SOBRINHO (2004), as alíquotas para tratamento continham cerca de 109 UFC de

Staphylococcus aureus.

3

42

4.6 Infecção da Ferida Cirúrgica pelo Staphylococcus aureus

Quatro horas após a cirurgia, para a obtenção do coágulo das feridas, as mesmas foram inoculadas com cultura de Staphylococcus aureus ATCC 6538 visando à obtenção de feridas infectadas (OLIVEIRA et al., 2003), por uma suspensão da cultura de 24 horas de Staphylococcus

aureus, em TSB, que teve 109 UFC/mL, conforme a curva de crescimento

realizada por Macedo Sobrinho (2004), sendo utilizados 200µL para cada animal

4.7 Tratamento (Fotobiomodulação Laser)

Quarenta e oito horas após contaminação das feridas (Oliveira et al., 2003; Macedo Sobrinho, 2004), os animais infectados permaneceram com crosta e foram divididos em grupos com três animais cada (Quadro 1):

SACRIFÍCIO COMPRIMENTO DE ONDA DENSIDADE DE

ENERGIA GRUPO CONTROLE 10J/cm2 20J/cm2 VERMELHO 30J/cm2 10J/cm2 20J/cm2 INFRA-VERMELHO 30J/cm2 10J/cm2 20J/cm2 7/14 DIAS VERMELHO/INFRAVERMELHO 30J/cm2 QUADRO 1: Grupos de estudo

O aparelho de Laser utilizado foi o diodo BioWave (Kondortech, São Carlos, SP). Ele possui duas ponteiras independentes, as quais emitem Laser em dois comprimentos de ondas diferentes: diodo de λ680nm, espectro vermelho, ajustado na potência (P) de 30mW, modo contínuo e a outra ponteira emite laser no espectro infravermelho de λ790nm, com potência de 40mW, modo contínuo e diâmetro do feixe nas ponteiras de 3mm. As irradiações eram feitas num intervalo de 48H, por um mesmo operador. A ponteira era disposta perpendicularmente e em contato direto à ferida e as aplicações eram feitas nas quatro extremidades da ferida. Para tanto, os valores da densidade de eneria eram divididos pelos pontos. O tempo de aplicação era calculado automaticamente pelo aparelho de laser, de acordo com a densidade de energia estipulada.

G

Grruuppoo II:: CCoonnttrroollee ((sseettee ddiiasas)) –– nnããoo ssooffrreerraamm oouuttrrooss pprroocceeddiimmeennttooss;;

Grupo II: Controle ( 14 dias) – não sofreram outros procedimentos;

Grupo III: Laser Vermelho λ680nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (30mW,10J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo IV: Laser Vermelho λ680nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatros pontos ao redor da ferida (30mW,10J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

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Grupo V: Laser Vermelho λ680nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (30mW, 20J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo VI: Laser λ680nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (30mW, 20J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo VII: Laser λ680nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (30mW, 30J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo VIII: Laser λ680nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (30mW, 30J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo IX: Laser Infravermelho λ790nm (14 dias) – os animais foram irradiados em quatros pontos ao redor da ferida (40mW, 10J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo X: Laser Infravermelho λ790nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 10J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XI: Laser Infravermelho λ790nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor ferida (40mW, 20J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XII: Laser Infravermelho λ790nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 20J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XIII: Laser Infravermelho λ790nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 30J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XIV: Laser Infravermelho λ790nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 30J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XV: Laser Infravermelho λ680nm + Infravermelho λ790nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 10J/cm2,emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XVI: Laser Infravermelho λ680nm + Infravermelho λ790nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 10J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XVII: Laser Infravermelho λ680nm + Infravermelho λ790nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 20J/cm2, emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XVIII: Laser Infravermelho λ680nm + Infravermelho λ790nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 20J/cm2,emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

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Grupo XIX: Laser Infravermelho λ680nm + Infravermelho λ790nm (14 dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 30J/cm2,emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

Grupo XX: Laser Infravermelho λ680nm + Infravermelho λ790nm (sete dias) - os animais foram irradiados em quatro pontos ao redor da ferida (40mW, 30J/cm2,emissão contínua, diâmetro do feixe na ponteira de 3mm);

4.8. Morte animal, coleta de amostra e processamento

Os animais foram sacrificados no oitavo e 15° dias após o pe ríodo cirúrgico-infecção, logo em seguida ao procedimento microbiológico, com uma overdose de anestésico geral. A seguir foram realizadas biópsias excisionais nas feridas, com margem de segurança de aproximadamente 0,5cm. Cada peça cirúrgica foi armazenada em um recipiente estéril contendo Formol a 10% e enviado ao Laboratório de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia da UFBA. Os espécimes de tecidos foram processados de acordo com a rotina para inclusão em parafina. Os blocos submetidos à inclusão foram identificados e submetidos à microtomia. Cortes de 5µm foram assim destinados: uma série à técnica de coloração histológica HE e outra à de Picrosírius.

Após a confecção das lâminas foi realizada a leitura das lâminas, através da descrição do aspecto histológico das peças cirúrgicas, levando-se em consideração os processos envolvidos na cicatrização de feridas dos tecidos moles. Os cortes histológicos corados pelas duas técnicas foram

avaliados sob a microscopia de luz através de análise descritiva e semi-quantitativa das características do reparo tecidual.

4.9. Análise Histológica por Microscopia de Luz

Para os critérios de avaliação microscópica analisados a seguir, sendo eles: Edema, Pavimentação epitelial, Proliferação fibroblástica e Neovascularização, foram considerados como ausente, sendo o escore zero (0) ou presente, como sendo o escore um (1). Já para o infiltrado inflamatório, colagenização e hiperemia, foram considerados escores que variam entre zero (0) e três (3), ou seja, de ausente a intenso (Quadro 2).

CRITÉRIOS ANALISADOS ESCORE

EDEMA* Ausente Presente

CROSTA* Ausente Presente

NEOVASCULARIZAÇÃO* Ausente Presente

PAVIMENTAÇÃO EPITELIAL Parcial(<50%) Completa(>50%) PROLIFERAÇÃO FIBROBLÁSTICA* Ausente Presente INFILTRADO INFLAMATÓRIO** Leve Presença de <25% de cel. Inflamatórias Moderado Presença de <25-50% de cel. inflamatórias Intenso Presença de >50% de cel. Inflamatórias HIPEREMIA** Leve Presença de <25% de fibroblastos Moderado Presença de <25-50% de fibroblastos Intenso Presença de >50% de fibroblastos COLAGENIZAÇÃO** Leve Presença de <25% de matriz colágena Moderado Presença de <25-50% de matriz colágena Intenso Presença de >50% de matriz colágena

** Critérios avaliados como ausente (0), leve (1), moderado (2) ou intenso (3) * Critérios analisados quanto a sua ausência (0) ou presença (1)

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4.10. Análise Estatística

Para a construção do banco de dados e cálculos estatísticos, foi utilizado o programa SPSS (Statistical Package for Social Science, versão 10.0). Para a análise de três ou mais grupos concomitantemente, foi utilizado o teste Kruskal-Wallis. Este teste será utilizado para os resultados histológicos que variavam da graduação de 0 (ausente) a 3 (intenso). Para a comparação de proporções foi utilizado o teste Exato de Fischer, ou seja, para os critérios histológicos avaliados como ausente ou presente. Foi considerado como estatisticamente significante o p<0,05.