Taís Thomsen Silveira
IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS
PLASMÁTICOS E URINÁRIOS DOS ÁCIDOS
CLOROGÊNICOS DE UMA INFUSÃO DE
FOLHAS DE Ilex paraguariensis EM ADULTOS
SAUDÁVEIS
Taís Thomsen Silveira
IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS PLASMÁTICOS
E URINÁRIOS DOS ÁCIDOS CLOROGÊNICOS DE
UMA INFUSÃO DE FOLHAS DE Ilex paraguariensis EM
ADULTOS SAUDÁVEIS
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição da Universidade Federal de Santa Cataria em cumprimento a re-quisito para obtenção do título de Mestre em Nutrição.
Orientador: Prof. Dr. Edson Luiz da Silva
através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da UFSC.
Silveira, Taís Thomsen
Identificação de metabólitos plasmáticos e urinários dos ácidos clorogênicos de uma infusão de folhas de Ilex paraguariensis em adultos saudáveis / Taís Thomsen Silveira ; orientador, Edson Luiz da Silva, 2018.
130 p.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde,
Programa de Pós-Graduação em Nutrição, Florianópolis, 2018.
Inclui referências.
1. Nutrição. 2. Ácidos clorogênicos. 3.
Metabólitos. 4. Absorção. 5. Ilex paraguariensis. I. Silva, Edson Luiz da. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Nutrição. III. Título.
Taís Thomsen Silveira
IDENTIFICAÇÃO DE METABÓLITOS PLASMÁTICOS
E URINÁRIOS DOS ÁCIDOS CLOROGÊNICOS DE
UMA INFUSÃO DE FOLHAS DE Ilex paraguariensis EM
ADULTOS SAUDÁVEIS
Esta dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mes-tre em Nutrição, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação em Nutrição da Universidade Federal de Santa Catarina.
Florianópolis, Novembro de 2018.
Prof.ª Patrícia Faria Di Pietro, Dra. Coordenadora do Curso
Prof. Dr. Edson Luiz da Silva Orientador e Presidente da banca
Universidade Federal de Santa Catarina
Banca examinadora:
Prof.ª Edna Regina Amante, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof.ª Elisabeth Wazlawik, Dra. Universidade Federal de Santa Catarina
Prof.ª Débora Kurrle Rieger Venske Universidade Federal de Santa Catarina
Dedico este trabalho à minha famí-lia, em especial aos meus pais e meu irmão, meus exemplos de dedicação e esforço.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC), por fornecer um ensino público de qualidade e pela formação acadêmica de excelência que me trouxeram maiores oportunidades na vida acadêmica, abrindo as portas da pós-graduação.
Ao Programa de Pós-Graduação em Nutrição, pela estrutura e apoio para a realização da pesquisa, e ao seu corpo docente por todos os ensina-mentos valiosos para a minha formação profissional e acadêmica.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa de estudos que permitiu a dedicação exclusiva na realização do curso de mestrado.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Edson Luiz da Silva, por todos os en-sinamentos, orientações, conselhos, momentos de auxílio na bancada do laboratório e pela extrema dedicação ao seu trabalho como pesquisador e docente. Agradeço muito também por toda a paciência no meu processo de desenvolvimento, e por todos os momentos de convivência e confra-ternização.
Aos participantes que voluntariamente doaram seu tempo e amos-tras biológicas para que esse estudo pudesse ser realizado. Obrigada pela disponibilidade e compreensão.
Às colegas de laboratório Cristiane Manfé Pagliosa e Ana Paula Prudêncio, pelo auxílio nas análises laboratoriais e na realização de di-ferentes etapas desse trabalho. Muito obrigada pela amizade, parceria e momentos de boa convivência. Jamais esquecerei nossos momentos jun-tas.
Às colegas de turma do mestrado, pelos momentos de convivência e aprendizado. Em especial às amigas que o mestrado meu deu, Aline Mi-roski de Abreu, Cândice Laís K. Copetti, Gilciane Ceolin e Luna Dias A. Oliveira, muito obrigada por todas as risadas, pelo carinho, pela parceria nos momentos de tensão, pelas confidências e confraternizações. Serei
Ao meu namorado, Guilherme Zanotelli dos Santos, por todo apoio moral e técnico ao longo de todo esse processo. Agradeço pelos conselhos, pelas conversas sobre as curiosidades da vida, pela compreensão e amor. Obrigada por ser um porto seguro.
E por fim, agradeço à minha mãe Claudia Kraemer Thomsen Sil-veira e ao meu pai Luiz Carlos Muller SilSil-veira, em primeiro lugar pela vida. Muito obrigada pelo apoio e amor incondicional. Vocês sempre me incentivaram a correr atrás dos meus sonhos e me deram o que eu precisei para realizá-los. Sou, e serei eternamente grata por ter nascido filha de vo-cês, meus heróis. Ao meu irmão João Vítor Thomsen Silveira, obrigada por ser um exemplo de esforço e determinação, por me escutar e acreditar em mim quando eu mesma não acreditei. Obrigada por ser meu melhor amigo! Aos acadêmicos e docentes da minha família obrigada pela inspi-ração!
A todos que de alguma forma contribuíram e fizeram parte desse processo, muito obrigada.
“I don’t have any special talent, I am only passionately curious”
RESUMO
A erva-mate (Ilex paraguariensis), planta amplamente consumida na for-ma de chá em países da América do Sul, possui inúmeras propriedades biológicas atribuídas aos seus constituintes químicos, principalmente aos ácidos fenólicos da família dos ácidos clorogênicos (CGAs), saponinas e metilxantinas. Os CGAs são amplamente estudados tendo em vista o ele-vado teor na erva-mate e suas atividades antioxidante, anti-inflamatória, vasorelaxante, hipoglicemiante, hipocolesterolêmica e emagrecedora. Le-vando em consideração que esses compostos são absorvidos e altamente metabolizados no organismo humano e a escassez de estudos avaliando a biodisponibilidade dos mesmos, o objetivo do presente estudo foi detectar e identificar os CGAs e seus metabólitos plasmáticos durante 8 h e uri-nários por até 10 h, com intervalos de uma e duas horas respectivamente, após ingestão de 200 mL de uma infusão de folhas de Ilex paraguariensis em 10 indivíduos adultos saudáveis. Foram identificados quatro metabó-litos no plasma e 11 na urina por cromatografia líquida de alta eficiência, com picos de absorção após 2 e 4 h, respectivamente. O ácido dihidroca-feico foi o principal metabólito no plasma, enquanto o ácido hipúrico foi o mais abundante nas amostras de urina. Além disto, foram detectados na urina os ácidos 3,4-dihidroxibenzóico, 3-cafeoilquínico, 5-cafeoilquínico, cafeico, p-cumárico e sinápico. Foram excretados, em média, aproxima-damente 9% de ácidos fenólicos totais em relação ao ingerido. Em suma, os CGAs de Ilex paraguariensis foram absorvidos e metabolizados e o aparecimento tardio de metabólitos demonstrou ação de enzimas da mi-crobiota e absorção colônica.
Palavras-chave: Ácidos clorogênicos, metabólitos, absorção, Ilex
ABSTRACT
Yerba mate (Ilex paraguariensis), a plant widely consumed in the form of tea in South American countries, has numerous biological properties attributed to its chemical constituents, mainly phenolic acids of the ch-lorogenic acids (CGAs) family, saponins, and methylxanthines. CGAs are widely studied due to their high content in yerba mate and its an-tioxidant, anti-inflammatory, and vasorelaxant activities, hypoglycemic, hypocholesterolemic and weight loss properties. Considering that these compounds are absorbed and highly metabolized in the human body and that studies evaluating their bioavailability are scarce, the present study ai-med to detect and identify the CGAs and their plasma metabolites for 8 h and urinary metabolites up to 10 h, with intervals of one and two hours, respectively, after ingestion of 200 mL of an Ilex paraguariensis leaves infusion, by 10 healthy adult subjects. Four metabolites were identified in plasma and 11 in urine by high performance liquid chromatography, with absorption peaks after 2 and 4 h, respectively. Dihydrocafeic acid was the major metabolite in plasma, whereas hippuric acid was the most abundant in urine samples. In addition, 3,4-dihydroxybenzoic, 3-caffeoylquinic, 5-caffeine, caffeic, p-coumaric, and synapic acids were detected in urine. Approximately 9% of total phenolic acids were excreted based on the in-gested amount. In summary, the CGAs of Ilex paraguariensis were absor-bed and metabolized and the late appearance of metabolites demonstrated the action of microbiota enzymes and colonic absorption.
Keywords: Chlorogenic acids, metabolites, absorption, Ilex
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 – Árvore de Ilex paraguariensis, Santa Catarina, Brasil. 29
Figura 2 – Estrutura básica de um ácido fenólico . . . 35
Figura 3 – Estrutura básica de derivados cinâmicos e derivados
benzoicos . . . 35
Figura 4 – Estrutura química dos principais ácidos clorogênicos
da erva-mate. . . 38
Figura 5 – Esquema ilustrativo dos processos de absorção dos
áci-dos clorogênicos. . . 41
Figura 6 – Metabolização proposta para ácidos fenólicos . . . . 43
Figura 7 – Linha do tempo para o dia de coleta. . . 50
Figura 8 – Curva-padrão e equação da reta representativas do ácido
clorogênico. . . 53
Figura 1 – (Manuscrito) Perfil cinético da cafeína (a) e dos meta-bólitos de ácidos clorogênicos (CGAs) (b, c, d) encon-trados em amostras de plasma por 8 h após ingestão de uma infusão de folhas de Ilex paraguariensis. Valores
em média±DP. . . 69
Figura 2 – (Manuscrito) Proposta de esquema metabólico para os ácidos cafeoilquínicos (CQAs) presentes na infusão de folhas de Ilex paraguariensis, onde os isômeros de CQAs estão representados pelo ácido 5-cafeoilquínico (5-CQA) e os dímeros ácidos dicafeoilquínicos (diCQAs) pelo
ácido 3,5-dicafeoilquínico (3,5-diCQA). . . 76
Figura 9 – Cromatograma representativo do perfil de ácidos clo-rogênicos (325 nm e 280 nm) e metilxantinas (280 nm)
da infusão de folhas de Ilex paraguarienis (100 mg/mL). 87
Figura 10 – Espectros de absorção DAD dos ácidos clorogênicos e metilxantinas encontrados na infusão de folhas de Ilex
bólitos de CGAs em 280 nm e 325 nm e de metilxan-tinas em 280 nm amostra de plasma do voluntário D após 2 h da ingestão de infusão de folhas de Ilex
para-guariensis. . . . 89 Figura 12 – Perfil cinético individual (participantes A-J) da cafeína
em plasma durante 8 h após ingestão da infusão de
fo-lhas de Ilex paraguariensis. . . . 91
Figura 13 – Perfil cinético individual (participantes A-J) do ácido dihidrocafeico em plasma durante 8 h após ingestão da
infusão de folhas de Ilex paraguariensis. . . . 92
Figura 14 – Perfil cinético individual (participantes A-J) de DHCA1 (DHCA-sulfatado) em plasma durante 8 h após
inges-tão da infusão de folhas de Ilex paraguariensis. . . . 93
Figura 15 – Perfil cinético individual (participantes A-J) do CQA1 em plasma durante 8 h após ingestão da infusão de
fo-lhas de Ilex paraguariensis. . . . 94
Figura 16 – Comparação dos espectros de absorção do padrão de ácido di-hicrocafeico (DHCA) (a) e o DHCA1 (b) no
comprimento de onda 280 nm. . . 95
Figura 17 – Comparação dos espectros de absorção do padrão de ácido 3-cafeoilquínico (3-CQA) (a) e o CQA1 (b) no
comprimento de onda 325 nm. . . 95
Figura 18 – Comparação dos espectros de absorção do padrão de cafeína (a) e o CAF1 (b) no comprimento de onda 280 nm. 96 Figura 19 – Comparação dos espectros de absorção do padrão de
ácido ferúlico (a) e os FER1 (b) e FER2 (c) no
compri-mento de onda 325 nm. . . 97
Figura 20 – Cromatogramas representativo do perfil de metabóli-tos encontrados em urina de 0 a 10 h após ingestão de
Figura 21 – Cromatogramas representativo do perfil de metabóli-tos encontrados em urina de 0 a 10 h após ingestão de
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Condições cromatográficas para análises em
Cromato-grafia Líquida de Alta Eficiência. . . 53
Tabela 1 – (Manuscrito) Teor de CGAs e metilxantinas na infusão de folhas de Ilex paraguarienis preparada na
propor-ção de 100 mg/mL . . . 63
Tabela 2 – (Manuscrito) Características biodemográficas e
labo-ratoriais dos participantes do estudo. . . 65
Tabela 3 – (Manuscrito) Parâmetros cinéticos da cafeína e dos me-tabólitos de CGAs encontrados em amostras de plasma por 8 h após consumo da infusão de folhas de Ilex
pa-raguarienis. . . . 67 Tabela 4 – (Manuscrito) Excreção urinária de metabólitos dos CGAs
e da cafeína encontrados em amostras de urina coleta-das por até 10 h após consumo da infusão de folhas de
Ilex paraguarienis dos 10 voluntários. . . . 72 Tabela 5 – (Manuscrito) Excreção urinária de metabólitos dos CGAs
e da cafeína encontrados em amostras de urina por até 10 h após o consumo de infusão de folhas de Ilex
pa-raguarienis. . . . 74 Tabela 2 – Teor de ácidos clorogênicos e metilxantinas na infusão
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
3,4-DHBA Ácido 3,4-dihidroxibenzóico. 3,4-diCQA Ácido 3,4-dicafeoilquínico. 3,5-diCQA Ácido 3,5-dicafeoilquínico. 3-CQA Ácido 3-cafeoilquínico. 4,5-diCQA Ácido 4,5-dicafeoilquínico. 4-CQA Ácido 4-cafeoilquínico. 5-CQA Ácido 5-cafeoilquínico. AUC area under the curve. CGA Ácido clorogênico.
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. CQA Ácido cafeoilquínico.
Cmax Concentração máxima.
DHCA Ácido di-hidrocafeico. diCQA Ácido dicafeoilquínico. FQA Ácido feruloilquínico. pCoQA Ácido p-cumaroilquínico.
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO . . . . 23 1.1 OBJETIVOS . . . 27 1.1.1 Objetivo Geral . . . . 27 1.1.2 Objetivos Específicos . . . 27 2 REFERENCIAL TEÓRICO . . . . 29 2.1 ERVA-MATE . . . 29
2.1.1 Compostos bioativos e propriedades biológicas da erva-mate . . . . 32
2.2 COMPOSTOS FENÓLICOS . . . 34
2.3 ÁCIDOS CLOROGÊNICOS . . . 36
2.3.1 Metabolização e Absorção dos Ácidos Clorogênicos 39 3 MATERIAIS E MÉTODOS . . . . 47
3.1 EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES . . 47
3.2 DELINEAMENTO DO ESTUDO . . . 48
3.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL . . . 49
3.3.1 Extração dos ácidos clorogênicos e seus metabólitos das amostras biológicas . . . . 51 3.3.2 Análises em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 52
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA . . . 54
3.5 ASPECTOS ÉTICOS . . . 54
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO . . . . 55
4.1 MANUSCRITO . . . 55
4.2 RESULTADOS COMPLEMENTARES . . . 85
4.2.1 Infusão de folhas de Ilex paraguariensis . . . 85 4.2.2 Metabólitos plasmáticos . . . . 89 4.2.3 Metabólitos urinários . . . . 96
Referências . . . . 103 APÊNDICE A – DADOS PARA INCLUSÃO AO
ESTUDO . . . . 119 APÊNDICE B – ORIENTAÇÕES AOS
PARTICI-PANTES . . . . 123 APÊNDICE C – NOTA À IMPRENSA . . . . 125 ANEXO A – TERMO DE CONSENTIMENTO
23 1 INTRODUÇÃO
A Ilex paraguariensis, mais conhecida como erva-mate, é uma plan-ta amplamente consumida na forma de infusões na América do Sul, espe-cialmente nos países produtores Argentina, Paraguai, Uruguai e Brasil (re-giões sul e sudeste) (HECK; MEJIA, 2007). Devido às suas propriedades estimulante e antioxidante o interesse comercial nesse produto aumentou nas duas últimas décadas e a erva-mate passou a ser comercializada tam-bém na Europa e nos Estados Unidos da América (BRACESCO et al., 2011). Além do efeito antioxidante, tem sido atribuído à erva-mate efei-tos como hipoglicemiante, hipocolesterolêmico, inflamatório, anti-obesogênico e antimicrobiano em diversos modelos de estudo (BASTOS et al., 2007; BRACESCO et al., 2011; GAMBERO; RIBEIRO, 2015). Essas propriedades biológicas são conferidas à presença de compostos bioativos na erva-mate, como compostos fenólicos da ácidos clorogêni-cos (CGAs), metilxantinas (cafeína e teobromina), taninos e saponinas (HECK; MEJIA, 2007; CARDOZO; MORAND, 2016). Os CGAs são os principais compostos fenólicos da erva-mate, podendo representar até 42% do total de compostos orgânicos encontrados em extratos de erva-mate verde (BRACESCO et al., 2011). São quimicamente formados por ligação éster de uma molécula de ácido quínico com uma ou mais molé-culas de ácidos hidroxicinâmicos (ácidos cafeico, ferúlico ou p-cumárico) (CLIFFORD, 1999).
Os CGAs são encontrados em uma diversidade de alimentos de origem vegetal como cereais, frutas e legumes e em bebidas como cer-veja, café, chá verde e erva-mate, contribuindo, dessa forma, com a in-gestão diária de compostos fenólicos (CLIFFORD, 1999; LAFAY; GIL-IZQUIERDO, 2008). O interesse pelos alimentos fonte de compostos fe-nólicos se iniciou por volta de 1990 instigado por publicações de estudos epidemiológicos indicando uma associação inversa entre o consumo des-ses alimentos e a incidência de doenças crônicas não transmissíveis
(do-enças cardiovasculares, diabetes mellitus e cânceres) (CROZIER; JAGA-NATH; CLIFFORD, 2009; CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010). Devido ao potencial antioxidante in vitro apresentado por esses compos-tos, a suposição usual era de que os benefícios in vivo associados ao seu consumo eram causados pela proteção contra os danos oxidativos (WIL-LIAMSON; MANACH, 2005; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009). Porém, atualmente sugere-se que essa suposição não reflita o que de fato acontece in vivo (CLIFFORD, 2004; LAFAY; GIL-IZQUIERDO, 2008; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009; ZHAO; MOGHA-DASIAN, 2010). Apesar de ser possível encontrar aumento na capacidade antioxidante do plasma após ingestão de alimentos ricos em compostos fe-nólicos, os mesmos apresentam baixas concentrações plasmáticas após a
ingestão (em média menor que 1 µmol/L), provavelmente devido à
absor-ção limitada, metabolizaabsor-ção intensa e/ou rápida eliminaabsor-ção (MANACH et al., 2004; CLIFFORD, 2004). Essas baixas concentrações plasmáticas não seriam suficientes para exercer um potencial antioxidante significa-tivo que justificasse a redução de risco para doenças crônicas por essa via (CLIFFORD, 2004; ZHAO; MOGHADASIAN, 2010).
Focando na atividade biológica desses compostos, novos mecanis-mos de ação, independentes da função antioxidante, têm sido propostos (CLIFFORD, 2004; LAFAY; GIL-IZQUIERDO, 2008; CROZIER; JA-GANATH; CLIFFORD, 2009; ZHAO; MOGHADASIAN, 2010). Por exemplo, evidências de estudos in vitro e in vivo sugerem que os
áci-dos clorogênicos dietéticos reduzem a deposição do peptídeoβ-amiloide
(YAN et al., 2001; ONO; HIROHATA; YAMADA, 2005), conferindo efeito neuroprotetor; estimulam a produção de óxido nítrico (NO) (WANG et al., 2004; SUZUKI et al., 2007) e reduzem a enzima conversora de angiotensina (ECA) (SUZUKI et al., 2002; ARDIANSYAH et al., 2008; SUZUKI et al., 2008), sendo cardioprotetores; bem como inibem a ab-sorção intestinal de glicose e aumentam a produção do hormônio GLP-1 (JOHNSTON; CLIFFORD; MORGAN, 2002; JOHNSTON et al., 2005;
25
BASSOLI et al., 2007), sugerindo potencial preventivo contra diabetes mellitus tipo 2 (CLIFFORD, 2004).
Ainda, tendo em vista que os compostos fenólicos são modificados durante a digestão, absorção e metabolização, os metabólitos que possi-velmente atingem os tecidos podem ser quimicamente e funcionalmente diferentes dos compostos presentes nos alimentos (BRAVO, 1998; CLIF-FORD, 1999; MANACH et al., 2004; CROZIER; DEL RIO; CLIFCLIF-FORD, 2010; D’ARCHIVIO et al., 2010; CLIFFORD; HOOFT; CROZIER, 2013; DEL RIO et al., 2013; HELENO et al., 2015). Dessa forma, questiona-se quais compostos/metabólitos seriam de fato bioativos após a ingestão?
Para esclarecer tal questão, é importante a compreensão dos meca-nismos de absorção e biodisponibilidade dos compostos fenólicos e seus alvos moleculares. A fim de tornar mais adequado o planejamento de pos-síveis estratégias nutricionais envolvendo esses compostos e seus alimen-tos fonte na prevenção e tratamento de doenças, uma das etapas necessá-rias para alcançar esse esclarecimento é a identificação e quantificação dos principais metabólitos encontrados no plasma após ingestão (CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010; CLIFFORD; HOOFT; CROZIER, 2013; HELENO et al., 2015).
Até o momento, um número limitado de estudos explorou a temá-tica de absorção e metabolização dos CGAs, e apenas alguns utilizaram a erva-mate como objeto de estudo. O grupo de pesquisa no qual esse projeto se insere, iniciou o estudo dos efeitos biológicos da erva-mate no início dos anos 2000 e a investigação dos metabólitos plasmáticos e uriná-rios de ácidos fenólicos e saponinas da erva-mate teve início em 2014 com as dissertações de mestrado de Alves (2016) e Cruz (2016), respectiva-mente. O estudo de Alves (2016) teve por objetivo detectar ácidos cloro-gênicos e seus metabólitos, além de metilxantinas, no plasma e na urina de indivíduos saudáveis após a ingestão de um extrato padronizado de erva-mate. Nesse estudo, foi possível detectar apenas o ácido di-hicrocafeico (DHCA) e quatro metabólitos (não identificados) dos CGAs em
amos-tras de plasma, além das metilxantinas cafeína e teobromina (ALVES, 2016). Com base nos resultados de estudo realizado com animais para comparar a biodisponibilidade dos compostos fenólicos de erva-mate e padrão de ácido 5-cafeoilquínico (5-CQA), Oliveira et al. (2016) consta-taram diferenças no perfil de metabólitos plasmáticos e urinários, sinali-zando a importância da matriz alimentar para a absorção e metabolização dos ácidos fenólicos. Enquanto o presente estudo estava sendo finalizado, Gómez-Juaristi et al. (2018) publicaram um estudo inédito sobre a biodis-ponibilidade de CGAs da erva-mate em adultos saudáveis e verificaram a presença de inúmeros metabólitos plasmáticos e urinários, sendo alguns deles de forma tardia com concentrações máximas aparecendo após 8 h da ingestão, demonstrando o importante papel da microbiota na digestão des-ses compostos. Porém, mesmo com os avanços recentes, não há consenso sobre a biodisponibilidade dos CGAs em seres humanos. O uso de dife-rentes matrizes alimentares e metodologias de extração e análise, tornam difícil a comparação dos resultados e complexa a análise da rota metabó-lica desses compostos, sendo necessária a realização de mais estudos.
Portanto, a pergunta de partida que norteou o presente estudo foi: Qual é o perfil e a concentração dos CGAs e de seus metabólitos no plasma e na urina de indivíduos adultos saudáveis após ingestão aguda de uma infusão de folhas de Ilex paraguarienis?
1.1. Objetivos 27
1.1 OBJETIVOS
1.1.1 Objetivo Geral
Detectar e quantificar os CGAs e seus metabólitos no plasma e na urina de indivíduos adultos saudáveis, antes e após a ingestão aguda de infusão de folhas de Ilex paraguarienis.
1.1.2 Objetivos Específicos
• Analisar o perfil e a concentração de CGAs na infusão de folhas de
Ilex paraguariensis;
• Identificar e quantificar os CGAs e seus metabólitos presentes no plasma, antes e após, a ingestão aguda de infusão de folhas de Ilex
paraguariensis;
• Identificar e quantificar os CGAs e seus metabólitos presentes na urina, antes e após, a ingestão aguda de infusão de folhas de Ilex
29 2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 ERVA-MATE
A Ilex paraguariensis (St-Hil.) (Figura 1) é uma espécie da fa-mília Aquifoliaceae, natural das regiões subtropicais da América do Sul. Pode ser encontrada no Brasil (Mato Grosso do Sul, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul), na Argentina (Corrientes, Misiones), Paraguai e Uruguai (HECK; MEJIA, 2007).
Figura 1 – Árvore de Ilex paraguariensis, Santa Catarina, Brasil.
fonte: Pagliosa (2009).
A erva-mate é amplamente consumida e possui um papel social quase ritualístico em algumas culturas modernas nesses países (HECK;
MEJIA, 2007; BASTOS et al., 2007; BRACESCO et al., 2011; CAR-DOZO; MORAND, 2016). A árvore de erva-mate pode atingir até 18 metros, floresce de outubro a novembro e produz fruto, de março a ju-nho. Ela exige períodos de chuva anual em quantidade (não menos de 1200 mm) e distribuição adequadas. A erva-mate suporta temperaturas de
até -6◦C com média anual de 21 a 22◦C, resistindo inclusive à neve em
algumas regiões (HECK; MEJIA, 2007).
A Argentina se destaca como maior produtor da planta, seguido pelo Brasil e Paraguai (HECK; MEJIA, 2007). Os três tipos primários de cultivo são extrativismo exploratório, sistemas mistos e plantações. O cultivo e colheita do mate não ocorrem de maneira uniforme nas diferentes regiões produtoras. No Brasil, por exemplo, os métodos encontrados são o de extrativismo exploratório de florestas nativas e os sistemas mistos de cultivo (HECK; MEJIA, 2007; CARDOZO; MORAND, 2016).
A parte da planta que é utilizada para produção da erva a ser consu-mida são as folhas colhidas a partir do corte dos ramos. Após a colheita, as folhas frescas de erva-mate são submetidas a diversas etapas de pro-dução antes de serem embaladas para consumo (HECK; MEJIA, 2007). Tipicamente, o mate passa por três etapas: o sapeco a secagem e o can-cheamento. O sapeco consiste em uma passagem rápida de ramos com folhas por fogo direto, com o objetivo de retirar a umidade superficial e inativar enzimas oxidativas (fenol-oxidases). A secagem pode ser feita em dois tipos de secadores mecânicos: rotativo ou esteira. A principal diferença entre os dois é que no secador rotativo o produto tem contato direto com a fumaça e na esteira esse contato é indireto. O cancheamento é a trituração da erva, que posteriormente é peneirada e embalada (ESME-LINDRO et al., 2002). Dentre os processos citados, as etapas de sapeco e secagem são as que mais interferem nas características físico-químicas da erva-mate por conta das altas temperaturas e já foi demonstrado que o processamento pode reduzir significativamente as concentrações de ca-feína (ESMELINDRO et al., 2002). Porém, ao investigar o teor de ácido
2.1. Erva-mate 31
clorogênico e cafeína em relação ao nível de umidade e processamento da erva-mate, Bastos, Fornari et al. (2006) encontraram aumento nas con-centrações de ácido clorogênico e cafeína com aumento do processamento das folhas.
A erva-mate é mais comumente consumida na forma de infusões. O seu consumo remete à época pré colonização, visto que séculos antes da chegada dos europeus na América do Sul, era utilizada pelos habitantes nativos (Guaranís) da região que compreende o Paraguai, Uruguai, nor-deste da Argentina e sul do Brasil. Após o processo de colonização, foi adotada pela população branca por suas propriedades medicinais e estimu-lantes (BRACESCO et al., 2011). O modo de consumo mais tradicional na América Latina, e especialmente, na região Sul do Brasil, é a bebida chamada “chimarrão”. Para o preparo dessa bebida as folhas verdes, secas e cancheadas de erva-mate (cerca de 50 g) são prensados em uma “cuia”
e é adicionada água quente (80◦C). O líquido resultante é sugado com
um canudo de metal chamado “bomba”. Depois que a “cuia” está pronta com a erva prensada, esse processo pode ser repetido diversas vezes para o consumo de uma pessoa ou compartilhada em grupo. Por isso, o con-sumo pode chegar a até meio litro de mate por pessoa por preparação do mate ou até 2 litros por dia (HECK; MEJIA, 2007). Quando a erva-mate é preparada de maneira similar, porém com água fria, a bebida chama-se “tererê”, usualmente consumida no Paraguai e em localidades do centro-oeste Brasileiro (BRACESCO et al., 2011). O consumo da erva-mate pode ocorrer também na forma de infusão conhecida como chá mate, obtida a partir das folhas tostadas da erva-mate que podem ser encontradas co-mercializadas na forma de sachês ou bebida instantânea fria (CARDOZO; MORAND, 2016). Adicionalmente, a erva-mate pode ser consumida de outras formas, pois atualmente existe uma gama de produtos com patente registrada que incluem o mate em sua composição (BASTOS et al., 2007; BRACESCO et al., 2011). Por exemplo, nos Estados Unidos da Amé-rica o mate é comercializado em sachês de folhas tostadas contendo de 1
a 2 g, ou em forma de extrato concentrado para ser utilizado em receitas ou na indústria de suplementos dietéticos (HECK; MEJIA, 2007). Extra-tos de erva-mate são também exportados para a Europa e Estados Unidos da América para a produção de bebidas, incluindo cervejas, energéticos e isotônicos (BRACESCO et al., 2011). O Uruguai é o país com maior
con-sumo per capita anual (8 a 10 kg), seguido da Argentina com 6,5 kg, sendo
que o sul do Brasil tem consumo estimado de 3 a 5 kg (CARDOZO; MO-RAND, 2016). Dessa forma, o consumo da erva-mate ocorre de maneira variada, o que dificulta precisar a média de ingestão de nutrientes e com-postos bioativos pelo consumo das bebidas tradicionais e não-tradicionais (CARDOZO; MORAND, 2016).
2.1.1 Compostos bioativos e propriedades biológicas da erva-mate
A erva-mate contém diversos compostos bioativos tanto em suas folhas quanto nos resíduos da planta (galhos e casca) (MAZZAFERA, 1997). Esses compostos possuem propriedades biológicas, especialmente atividade antioxidante demonstrada in vivo e in vitro (BASTOS et al., 2007; HECK; MEJIA, 2007; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009; BRACESCO et al., 2011; GAMBERO; RIBEIRO, 2015; CARDOZO; MORAND, 2016).
Os extratos e infusões de erva-mate verde têm em sua composição metilxantinas (como a cafeína), flavonoides, algumas vitaminas (como A, C, E e do complexo B), taninos, CGAs e seus derivados, bem como saponinas triterpênicas derivadas do ácido ursólico também conhecidas como matesaponinas (BASTOS et al., 2007; HECK; MEJIA, 2007; BRA-CESCO et al., 2011; CARDOZO; MORAND, 2016). Dentre esses com-postos bioativos, os principais são da classe dos ácidos fenólicos da família dos CGAs, que representam cerca de 42% dos principais compostos orgâ-nicos presentes em extratos de erva-mate (BRACESCO et al., 2011). A predominância e diversidade dos ácidos cafeoilquínicos (ácidos clorogê-nicos formados por ácido cafeico e ácido quínico) são uma peculiaridade
2.1. Erva-mate 33
dos produtos de erva-mate comparado com outras bebidas tradicionais, como o café (CARDOZO; MORAND, 2016).
Alguns fatores podem influenciar a composição desses compostos bioativos nas folhas de erva-mate, como a variação genética e respostas ambientais (NAKAMURA et al., 2009). Ao avaliar o teor de umidade e a eficiência da extração aquosa de compostos bioativos da erva-mate foi observado que o processamento das folhas aumentou significativamente as quantidades de CGAs e cafeína (BASTOS; FORNARI et al., 2006).
Nos últimos anos, foram identificados efeitos benéficos da erva-mate como a propriedade antioxidante in vivo em uma população de in-divíduos saudáveis (GUGLIUCCI, 1996; DA SILVA et al., 2008; FER-NANDES et al., 2012; BOAVENTURA et al., 2015; PANZA et al., 2016) e dislipidêmicos (BOAVENTURA et al., 2012, 2013), bem como em es-tudos in vitro (SCHINELLA et al., 2000; ANESINI; FERRARO; FILIP, 2006; BASTOS; ISHIMOTO et al., 2006; PAGLIOSA et al., 2010; PRU-DÊNCIO et al., 2012; ANESINI et al., 2012; PERES et al., 2013; BAEZA et al., 2016) e em animais (FERNANDES et al., 2016; PEREIRA et al., 2017).
Outras propriedades podem ser citadas, como, a inibição da glica-ção de proteínas in vitro (GUGLIUCCI et al., 2009; BAINS; GUGLIUCCI, 2017) e em modelo animal (PEREIRA et al., 2012). Além disto, também foram reportadas diminuição das concentrações de glicose de jejum e de hemoglobina glicada me indivíduos com diabetes mellitus tipo 2 (KLEIN et al., 2011) e pacientes hospitalizados com nutrição enteral (RIBEIRO et al., 2017), e em modelo animal (ARÇARI et al., 2011; SILVA et al., 2011; PEREIRA et al., 2012; JACOB, 2012; KANG et al., 2012). Ainda, em modelos animais foram demonstradas as propriedades anti-obesidade (PANG; CHOI; PARK, 2008; SILVA et al., 2011; JACOB, 2012; KANG et al., 2012; ARÇARI et al., 2013; GAMBERO; RIBEIRO, 2015), e anti-inflamatória (LANZETTI et al., 2008; ARÇARI et al., 2011; JACOB, 2012; PIMENTEL et al., 2013) as quais também foram comprovadas in
vitro (LUZ et al., 2016; MUNOZ-CULLA et al., 2016).
A capacidade hipocolesterolêmica foi estudada em pacientes dis-lipidêmicos (MORAIS et al., 2009) e em modelo animal (KANG et al., 2012; FERNANDES et al., 2016). A erva-mate também demonstrou po-tencial cardioprotetor em modelo animal pela redução do dano oxidativo via produção de NO após isquemia do miocardio (SCHINELLA; FAN-TINELLI; MOSCA, 2005), redução das moléculas vasoconstritoras en-dotelina e tromboxano B2 e aumento da produção de NO e expressão do gene para o receptor de LDL (GAO et al., 2013), e redução da proteína de adesão celular p-selectina e agregação plaquetária em ratos hiperlipide-micos (BAEZA et al., 2017). Em indivíduos com viscosidade do sangue elevada, o tratamento com erva-mate provocou aumento do vasodilatador
6-keto-PGF1-αe redução do tromboxano B2, aumentando a velocidade
do fluxo sanguíneo e melhorando a microcirculação (YU et al., 2015). A erva-mate e seus CGAs também possuem atividade anti-microbi-ana (BURRIS et al., 2011; MARTIN et al., 2013), e seu efeito de inibição da proliferação de células cancerígenas também já foi demonstrada in vitro (MEJIA et al., 2010).
Por serem os compostos fenólicos mais abundantes nos extratos de erva-mate (PAGLIOSA et al., 2010; LIMA et al., 2016), os efeitos cita-dos já foram indiretamente atribuícita-dos aos CGAs (BASTOS et al., 2007; HECK; MEJIA, 2007; BRACESCO et al., 2011; HELENO et al., 2015; CARDOZO; MORAND, 2016).
2.2 COMPOSTOS FENÓLICOS
Os compostos fenólicos constituem um grande grupo de metabóli-tos secundários de plantas e fungos. São composmetabóli-tos produzidos com a fun-ção de proteger as plantas contra fatores externos (radiafun-ção UV, insetos, vírus e bactérias) e promover o crescimento. Os compostos fenólicos são amplamente encontrados em cereais, legumes, frutas, chás, café, cerveja e vinho, estando dessa forma muito presentes na dieta humana (BRAVO,
2.2. Compostos Fenólicos 35
1998; CLIFFORD, 1999; MANACH et al., 2004; HELENO et al., 2015) Estruturalmente, os compostos fenólicos podem variar de molécu-las simples, como o fenol, até polímeros altamente ramificados. Podem ser divididos em, pelo menos, 10 classes diferentes dependendo de sua estrutura química básica. Dentre essas, a classe dos ácidos fenólicos tem
como estrutura básica C6-C1(Figura 2) (VOGEL, 1981; BRAVO, 1998).
Figura 2 – Estrutura básica de um ácido fenólico
COOH
Fonte: Adaptado de Bravo (1998).
Os ácidos fenólicos são sintetizados nas plantas pela via metabólica
do ácido chiquímico a partir dos aminoácidosL-fenilalanina eL-tirosina.
São divididos em dois grandes grupos: ácidos hidroxibenzóicos e ácidos hidroxicinâmicos (Figura 3). Em sua estrutura química, esses compostos contêm pelo menos um anel aromático, no qual ocorre a substituição de uma ou mais moléculas de hidrogênio por um ou mais grupos hidroxila (HELENO et al., 2015).
Figura 3 – Estrutura básica de derivados cinâmicos e derivados benzoicos
R3 R4 O OH R1 R2
(a) derivado cinâmico
R3 R4 O OH R1 R2 (b) derivado benzóico Fonte: Adaptado de Heleno et al. (2015).
que equivale a, aproximadamente, 60% do total de compostos fenólicos ingeridos, variando de acordo com hábitos alimentares e preferências de cada indivíduo (CLIFFORD, 1999; KOCH et al., 2015).
As recomendações dietéticas para a ingestão adequada de frutas e vegetais são feitas levando-se em consideração os efeitos protetores que esses alimentos apresentam por conter em sua composição, além de fibras, as vitaminas e minerais, e os compostos fenólicos e flavonoides (CRO-ZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010). Levando-se em consideração que a ocorrência de compostos fenólicos é abundante e sua composição é variá-vel nos alimentos, o interesse nesses compostos tem aumentado nas últi-mas décadas, principalmente devido aos seus benefícios à saúde humana (BRAVO, 1998; MANACH et al., 2004; HELENO et al., 2015). Dessa forma, os principais objetivos dos estudos são estabelecer evidências para os efeitos dos compostos fenólicos e identificar quais das centenas de po-lifenóis existentes são prováveis provedores de proteção contra doenças no contexto da nutrição preventiva (MANACH et al., 2004).
Tendo em vista que esses compostos são extensivamente metabo-lizados por enzimas hepáticas e da microbiota intestinal, conhecimentos a respeito da sua biodisponibilidade e metabolização são necessários para avaliar sua atividade biológica nos tecidos alvo (BRAVO, 1998; CLIF-FORD, 1999; MANACH et al., 2004; CROZIER; DEL RIO; CLIFCLIF-FORD, 2010; D’ARCHIVIO et al., 2010; CLIFFORD; HOOFT; CROZIER, 2013; DEL RIO et al., 2013; HELENO et al., 2015).
2.3 ÁCIDOS CLOROGÊNICOS
Em artigo de revisão, Clifford (1999) cita que, possivelmente, o primeiro registro sobre ácidos clorogênicos foi publicado em 1837 por Robiquet e Bourton, mas o termo em si parece ter sido usado pela primeira vez em 1846 por Payen.
Pertencentes à classe dos ácidos fenólicos, os ácidos clorogênicos compõem uma família de ésteres formados por certos ácidos
hidroxicinâ-2.3. Ácidos Clorogênicos 37
micos e ácido quínico. Eles podem ser subdivididos de acordo com a iden-tidade, número e posição dos radicais acil. Dessa forma, alguns dos sub-grupos conhecidos são: os monoésteres de ácido cafeico - os ácidos cafe-oilquínicos (CQAs) -, de ácido p-cumárico - os ácidos p-cumarcafe-oilquínicos (pCoQAs) - e de ácidos ferúlicos - os ácidos feruloilquínicos (FQAs); bem como diésteres de ácido cafeíco - os ácidos dicafeoilquínicos (diCQAs). Ainda há os combinados de ácido cafeico com ácido ferúlico - os ácidos cafeoilferuloilquínicos (CFQAs) -, muito comuns em espécies de café, e a combinação de ácido cafeico com ácido sinápico - os ácidos cafeoilsina-poilquínicos (CSiQAs) - encontrados na planta jasmin (CLIFFORD, 1999; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009). O ácido cafeico aparenta ser o ácido cinâmico com maior ocorrência, usualmente na forma esterifi-cada, sendo os isômeros mais comuns o 5-CQA e o ácido 3-cafeoilquínico (3-CQA) (CLIFFORD, 1999).
A presença dos ácidos fenólicos nas folhas de erva-mate é conhe-cida desde 1935, quando Woodard e Cowland (apud Alikardis 1987) des-creveram a presença de uma substância então chamada de “coffetannin” que, quando hidrolisada resultava em ácido cafeico (ALIKARIDIS, 1987). Dentre os CGAs encontrados na erva-mate, os principais são os monoés-teres de ácido cafeico, os ácido 3-cafeoilquínico, ácido 4-cafeoilquínico (4-CQA) e 5-CQA, e os dímeros ácido 3,4-dicafeoilquínico (3,4-diCQA), ácido 3,5-dicafeoilquínico (3,5-diCQA) e ácido 4,5-dicafeoilquínico (4,5-diCQA) (Figura 4) (OLIVEIRA, 2013).
Nas últimas décadas, a atividade antioxidante dos CGAs sintéti-cos foi descrita em estudos in vitro e in vivo (KONO et al., 1997; PARI; KARTHIKESAN; MENON, 2010; SATO et al., 2011), bem como dos CGAs de extrato de erva-mate também in vitro (GUGLIUCCI et al., 2009). Além disto, efeitos hipolipêmico e hipoglicemiante (ONG; HSU; TAN, 2013; PENG et al., 2015), e atividade anticarcinogênica (PUANGPRA-PHANT et al., 2011; UPADHYAY; RAO, 2013; TAJIK et al., 2017) tam-bém foram reportados.
Figura 4 – Estrutura química dos principais ácidos clorogênicos da erva-mate. OH OH O O OH OH OH O H O
(a) ácido 5-cafeoilquínico
OH O O OH OH OH OH O H O (b) ácido 4-cafeoilquínico O H O OH O O OH OH OH O H (c) ácido 3-cafeoilquínico O O OH OH OH O O OH OH OH O H O (d) ácido 3,5-dicafeoilquínico O O OH OH O O OH OH OH OH O H O
(e) ácido 3,4-dicafeoilquínico
OH O O OH OH O O OH OH OH O H O (f) ácido 4,5-dicafeoilquínico
2.3. Ácidos Clorogênicos 39
Além da erva-mate, os CGAs estão presentes em outras fontes ali-mentares na dieta humana, tais como cacau, maçã, pera, cereja, mirtilo, amora, uva e frutas cítricas, dentre outras, também em vegetais como couve, repolho, alface, brócolis, mostarda, espinafre, beterraba, pimentão, aipo, cenoura, manjericão, orégano, pimenta do reino, ervilha e milho, em cereais como castanhas e em bebidas como café, chá verde, chá preto, vinho e cerveja, dentre outros (CLIFFORD, 1999; D’ARCHIVIO et al., 2010). Os grãos verdes de café são considerados a maior fonte de CGAs, porém quantidades similares desses compostos também são encontradas nas folhas in natura e nas cascas de erva-mate (BRAVO; GOYA; LE-CUMBERRI, 2007; PAGLIOSA et al., 2010; PRUDÊNCIO et al., 2012; LIMA et al., 2016). Por ser amplamente consumida, especialmente na região sul do Brasil, a erva-mate pode representar uma das principais fon-tes alimentares de CGAs para essa população (BRACESCO et al., 2011; CARDOZO; MORAND, 2016; OLIVEIRA et al., 2016).
2.3.1 Metabolização e Absorção dos Ácidos Clorogênicos
Para um nutricionista é necessário conhecer não somente a ingestão dietética de compostos fenólicos, mas também a sua biodisponibilidade, visto que o impacto nutricional desses compostos e seus efeitos sistêmi-cos dependem, em grande parte, do seu comportamento no trato digestivo (BRAVO, 1998; D’ARCHIVIO et al., 2010).
Quando se fala em alimentos, a biodisponibilidade é definida como a proporção de um nutriente ou composto de um alimento que é digerida, absorvida e metabolizada (D’ARCHIVIO et al., 2007). O organismo hu-mano não possui mecanismos específicos para o acúmulo ou retenção de compostos fenólicos e esses são, então, reconhecidos como xenobióticos. Portanto, as transformações biológicas que ocorrem em tais compostos representam um processo metabólico de detoxificação, por aumentarem a hidrofilicidade dos compostos facilitando, assim, a eliminação biliar e/ou urinária (D’ARCHIVIO et al., 2007).
Dentre os fatores que interferem na biodisponibilidade de compos-tos bioativos alimentares estão a complexidade da matriz alimentícia, a ingestão concomitante de diferentes compostos, a estrutura química do composto de interesse, e ainda, variáveis como tempo de trânsito intesti-nal e esvaziamento gástrico, grau de conjugação do composto, interação com proteínas, composição da microbiota intestinal e o perfil genético do indivíduo (CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009). Por conta desses fatores pode haver grande variabilidade intra e inter-individuais na biodisponibilidade de certos compostos fenólicos (CLIFFORD; HOOFT; CROZIER, 2013).
Apesar do grande avanço no conhecimento da biodisponibilidade dos flavonoides (ou polifenóis) a absorção e o metabolismo dos ácidos fe-nólicos, particularmente da família dos CGAs, são pouco compreendidos. Os resultados obtidos em animais de experimentação são controversos e pouco aplicáveis aos seres humanos em decorrência das particularidades metabólicas de cada espécie. Por outro lado, existem poucos estudos em seres humanos e, mesmo assim, na sua grande maioria, eles foram desen-volvidos com café (MONTEIRO et al., 2007; FARAH et al., 2008; MACH et al., 2009; CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010; STAL-MACH et al., 2010) e somente dois com erva-mate em seres humanos (ALVES, 2016; GÓMEZ-JUARISTI et al., 2018) e um em animais (OLI-VEIRA et al., 2016). De fato, já foi demonstrado que a matriz alimentar pode influenciar a biodisponibilidade dos compostos fenólicos constituin-tes (OLIVEIRA et al., 2016).
Em estudo realizado com ratos wistar suplementados com 5-CQA e outros ácidos hidroxicinâmicos isolados, foi verificado que a absorção desses compostos teve início no estômago, porém, em baixa proporção (LAFAY et al., 2006). Em seres humanos, considera-se que a absorção dos CGAs no estômago e intestino delgado seja igualmente baixa, visto que o trato gastrointestinal humano não possuí esterases necessárias para hidro-lisar esses compostos, os quais são encontrados nas plantas, normalmente,
2.3. Ácidos Clorogênicos 41
na forma esterificada (OLTHOF; HOLLMAN; KATAN, 2001; RECH-NER et al., 2001; MANACH et al., 2004). Entretanto, existem esterases de origem bacteriana no intestino grosso (Figura 5) (STALMACH et al., 2010; CROZIER; DEL RIO; CLIFFORD, 2010; OLIVEIRA et al., 2016). Figura 5 – Esquema ilustrativo dos processos de absorção dos ácidos
clo-rogênicos.
Absorção Baixa proporção
Estômago Intestino delgado
Microbiota cólon - esterases Trato gastro intestinal não possui esterases.
ácidos hidroxicinâmicos livres ácido clorogênico (?)
clivagem da ligação éster e absorção ácido 5-cafeoilquínico
ácido quínico
ácido cafeico
Sendo assim, os ácidos hidroxicinâmicos livres provenientes dos alimentos e que não foram absorvidos no estômago, seguem para o intes-tino delgado onde são rapidamente absorvidos (OLTHOF; HOLLMAN; KATAN, 2001). Os compostos esterificados que não foram absorvidos seguem até o intestino grosso, particularmente no cólon, onde a microbi-ota exerce papel importante no metabolismo dos CGAs e de ácidos fenó-licos em geral. Após a clivagem da ligação éster entre o ácido quínico e os ácidos hidroxicinâmicos pelas esterases microbianas, os ácidos li-vres podem seguir por duas rotas: i) são absorvidos pela mucosa intes-tinal e passam para a corrente sanguínea (na forma livre ou após con-jugação por enzimas endógenas nos enterócitos) ou; ii) permanecem no intestino grosso e sofrem metabolização adicional pela microbiota produ-zindo compostos fenólicos de menor massa molecular (ácidos p-cumárico,
hipúrico, hidroxibenzóico, dihidrocafeico e vanílico) que são absorvidos ou excretados nas fezes (WILLIAMSON; MANACH, 2005). Após a ab-sorção, os ácidos hidroxicinâmicos são conjugados nos enterócitos intesti-nais, e posteriormente, no fígado por ação de enzimas de fase II, onde ocor-rem os processos de metilação, sulfatação e glicuronidação pela ação das enzimas catecol-o-metiltransferases (COMT), sulfotransferases e uridina-difosfato-glicuroniltransferases (UDP-glicotransferases), respectivamente (Figura 6) (MANACH et al., 2004; CROZIER; JAGANATH; CLIFFORD, 2009; HELENO et al., 2015).
Olthof, Hollman e Katan (2001) estudaram sete indivíduos ileos-tomizados e demonstraram que 33% dos CGAs (isômeros 3, 4 e 5-CQA) ingeridos foram absorvidos no estômago e no intestino delgado, enquanto a absorção do ácido cafeico livre, administrado na mesma dose, foi de 95%.
Monteiro et al. (2007) analisaram a absorção de CGAs de café em indivíduos adultos saudáveis (n=6) e observaram a presença de seis áci-dos cafeoilquínicos ( isômeros 3-CQA, 4-CQA e 5-CQA, e os dímeros 3,4-diCQA, 3,5-diCQA e 4,5-diCQA) no plasma após a ingestão aguda de 190 mL de café. A concentração plasmática total de CGAs foi de
7,66 µmol/L. O ácido cafeico também foi identificado em todas as
amos-tras de plasma. Nas amosamos-tras de urina, o único composto identificado foi o 5-CQA e em menores quantidades foram encontrados os ácidos hidro-xicinâmicos p-cumárico, ferúlico e cafeico. Dois picos de absorção foram identificados em todos os indivíduos, entre 30 e 60 min e entre 90 e 240 min. Uma alta variabilidade inter-individual também foi observada nas amostras de plasma e de urina.
Em estudo posterior do mesmo grupo de pesquisa, com delinea-mento e resultados similares e concentração maior de CGAs no café inge-rido, Farah et al. (2008) detectaram metabólitos sulfatados e glicuronados de CGAs na urina de alguns, porém não todos, participantes.
(in-2.3. Ácidos Clorogênicos 43 Figura 6 – Metabolização proposta para ácidos fenólicos Ácidos fenólicos dietéticos Intestino delgado Glicuronidação (UDP-glicotransferases) Metilação (Catecol-O-Metiltransferases) Fígado Glicuronidação (UDP-glicotransferases) Metilação (Catecol-O-Metiltransferases) Sulfatação (Sulfurotransferases) Cólon Hidrólise (Esterases) T ecidos Rins Metilação (Catecol-O-Metiltransferases) Urina Fezes Fonte: Adaptado de Heleno et al. (2015 ).
cluindo formas não conjugadas, sulfatadas ou glicuronadas) após ingestão de 200 mL de café em amostras de plasma e urina de 11 indivíduos
sau-dáveis. Houve detecção de compostos na ordem de nmol/L durante a
primeira hora após a ingestão, sugerindo absorção no intestino delgado. As detecções máximas de ácido dihidroferúlico, do seu metábolito 4-O-sulfato e ácido 3-O-4-O-sulfato-dihidrocafeico foram em 4 h, indicando meta-bolização pela microbiota intestinal. A excreção total dos CGAs na urina foi de 29,1% em relação à quantidade ingerida. Posteriormente, ainda uti-lizando o café, Stalmach et al. (2010) verificaram a absorção dos CGAs em população de indivíduos ileostomizados no período de 0-24 h após a ingestão da bebida. Os resultados mostraram presença de 71% dos CGAs ingeridos no líquido ileal, indicando potencial absorção de 29% no intes-tino delgado.
Evidências a respeito da biodisponibilidade dos CGAs da erva-mate são poucas. Em ratos Wistar, foi comparada a administração de chá mate com 5-CQA isolado (OLIVEIRA et al., 2016). Os resultados mos-traram a presença de CGAs em todos os tecidos e no plasma. Nos animais que receberam a erva-mate, o principal composto encontrado no plasma foi o ácido cafeico, enquanto naqueles que receberam o composto isolado foi o 5-CQA, demonstrando que a matriz alimentar interferiu na absorção e metabolização desses compostos. Além disto, com base nos resultados desse estudo a absorção dos CGAs da erva-mate começou no estômago, porém, a maior parte foi absorvida no intestino grosso, principalmente após a metabolização por bactérias (OLIVEIRA et al., 2016).
Em outro estudo, avaliou-se a biodisponibilidade de polifenóis de
Ilex paraguariensis em seres humanos através da determinação de fenóis
totais no plasma, após a ingestão de 300 mL de infusão de folhas de Ilex
paraguarienis. A atividade antioxidante no plasma também foi
determi-nada. Com base nos resultados, aproximadamente 49% dos compostos fenólicos do mate foram absorvidos. O aumento da atividade antioxidante no plasma foi proporcional ao aumento da concentração plasmática de
fe-2.3. Ácidos Clorogênicos 45
nóis totais (BOADO; FRETES; BRUMOVSKY, 2015).
Em estudo realizado em nosso laboratório com oito indivíduos sau-dáveis demonstrou-se que, após a ingestão de um extrato liofilizado padro-nizado de erva-mate verde, foi possível detectar o DHCA havendo quatro metabólitos plasmáticos não identificados, além das metilxantinas cafeína e teobromina após 4 h de ingestão de infusão de erva-mate. Foram encon-trados os metabólitos urinários ácidos sinápico, cafeico, p-cumárico, e va-nílico, sendo também detectada a presença de CQAs e diCQAs na forma de agliconas (não metabolizados) (ALVES, 2016). No estudo anterior de Alves (2016), ainda não publicado na forma de artigos, optou-se em uti-lizar as enzimas esterases, glicuronidase e sulfatase, para o isolamento e identificação dos metabólitos e das agliconas no plasma e na urina. Porém, poucos metabólitos foram identificados, principalmente no plasma. As-sim, no presente estudo, foram introduzidas modificações metodológicas visando a identificação de um número maior de metabólitos fenólicos, os quais devem ser abundantes, tendo em vista os diferentes tipos de CGAs presentes na erva-mate.
De fato, recentemente, foi avaliada a biodisponibilidade dos CGAs de uma infusão de erva-mate comercial para chimarrão em 12 indivíduos saudáveis durante 24 h de intervenção. Foram encontrados cerca de 40 metabólitos, dos quais 31 foram plasmáticos, porém apenas 16 apresen-taram valores acima do limite de detecção. Não foram encontrados com-postos fenólicos não metabolizados e a absorção colônica dos metabólitos foi comprovada pela identificação de compostos nos tempos mais tardios de coleta (após 6 h). A excreção urinária de compostos fenólicos totais em relação ao ingerido foi de 13,2% (GÓMEZ-JUARISTI et al., 2018).
47 3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES
As folhas de Ilex paraguariensis foram fornecidas pela empresa Matebrás - Indústria do Mate do Brasil® em setembro de 2016. As folhas foram provenientes de cultivo em erval adensado em área de sub-bosque de floresta de araucárias, no município de Catanduvas, localizado na re-gião centro-oeste do estado de Santa Catarina. As folhas foram coletadas de forma aleatória das árvores de erva-mate com mais de 20 anos de idade e submetidas ao processo de secagem em equipamento elétrico projetado
pela empresa, à temperatura de 50◦C, e trituração. Segundo resultado
da análise química para o controle de qualidade do produto na empresa, as folhas de I. paraguariensis se apresentaram isentas de hidrocarbone-tos policiclícos aromáticos (HPAs). Para garantir melhor conservação, a amostra de erva-mate foi embalada a vácuo em sacos de polietileno de alta densidade (Selovac, modelo 200 B, Santo Amaro, SP) e armazenada em freezer a -18 ± 2°C até o momento do preparo das infusões e análises.
As análises de compostos fenólicos e metilxantinas presentes na erva-mate e no plasma e urina dos participantes foram realizadas por Cro-matografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em equipamento com in-jetor manual, conectado ao degaseificador DGU 20A5 com integrador CBM 20A, detector ultravioleta-visível (UV-Vis) e de arranjo de diodos (DAD) SPDM-20A, bomba LC-20AD, controlado pelo software LC So-lution 1.2 (Schimadzu, Kyoto, Japão). Todas as amostras injetadas foram filtradas em membranas de poro 22 µm, enquanto as fases móveis empre-gadas foram filtradas em membranas de poro 45 µm Millipore (Billerica, MA, EUA).
As análises dos parâmetros bioquímicos séricos, como ureia, cre-atinina, transaminases, creatina quinase, perfil lipídico, glicose e ácido úrico foram feitas utilizando-se métodos rotineiros de laboratório no
equi-pamento automatizado Cobas Mira®- Roche (Basel, Canton, Suíça) com reagentes LabTest (Lagoa Santa, MG).
Os reagentes relacionados a seguir foram adquiridos da Sigma Al-drich (St. Louis, MO, EUA): reagente de Folin-Ciocalteu, acetato de só-dio, ácidos cítrico, ascórbico, gálico, cafeico, 3-cafeoilquínico (3-CQA), 4-cafeoilquínico (4-CQA), 5-cafeoilquínico (5-CQA), 3,4-dicafeoilquínico (3,4-diCQA), 3,5-dicafeoilquínico (3,5-diCQA), 4,5-dicafeoilquínico (4,5-diCQA), hipúrico, ferúlico, vanílico, dihidrocafeico, p-cumárico, cafeico, teobromina e cafeína.
Ácido acético glacial e etanol foram obtidos da empresa Labsynth (Diadema, SP). Vanilina, ácido clorídrico, clorofórmio, peróxido de
hi-drogênio e fosfato de potássio monobásico (KH2PO4) foram adquiridos
da empresa VETEC (Rio de Janeiro, RJ). Ácido perclórico, fosfato de
só-dio monobásico (NaH2PO4.H2O) e demais reagentes foram adquiridos de
outras marcas nacionais. Todas as soluções foram preparadas com água
ultrapura (Milli-Q Direct-Q 3 UV-R, Millipore®- Billerica, MA, EUA).
3.2 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O estudo foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Lipídeos, Antioxidantes e Aterosclerose e se caracterizou como ensaio clínico ex-perimental de ingestão. A intervenção foi feita em um período total de 10 h de coleta, onde os participantes ingeriram uma infusão de folhas de Ilex
paraguarienis e foram coletadas amostras de sangue antes e após 1, 2, 3,
4, 5, 6, 7 e 8 h da ingestão, e amostras de urina antes e nos intervalos de 0 a 2, 2 a 4, 4 a 6, 6 a 8 e 8 a 10 h após a ingestão.
No momento do recrutamento os participantes responderam a um questionário para a coleta dos dados de inclusão ao estudo (APÊNDICE
A). A estatura e o peso foram aferidos com estadiômetro (Sanny®, São
Bernardo do Campo, SP) e balança (Marte®, São Paulo, SP),
respectiva-mente, por pesquisador treinado. As medidas de peso e estatura foram utilizadas para o cálculo do índice de massa corporal (IMC), onde o peso,
3.3. Protocolo experimental 49
expresso em quilogramas, é dividido pela estatura ao quadrado em metros (WHO, 2006). A seleção dos participantes respeitou os seguintes critérios de inclusão: idade entre 19 e 50 anos e apresentar valores de parâmetros bioquímicos séricos e hematológicos de rotina dentro das faixas de refe-rência. Além disto, foram utilizados os seguintes critérios de exclusão: ser fumante, ser usuário de bebidas alcoólicas, ser usuário de suplementos vitamínicos, apresentar IMC superior ou igual a 30,0 kg/m², ser portador de quaisquer desordens patológicas, incluindo processos infecciosos ou inflamatórios e doenças crônico-degenerativas, mulheres em período de gestação ou lactantes e ser sensível à erva-mate (principalmente à cafeína, responsável por provocar desconforto gástrico e azia, tremores, taquicar-dia e/ou insônia).
Previamente ao dia de coleta, foram realizados exames laboratori-ais bioquímicos e hematológicos para a confirmação do estado de saúde adequado ao estudo. Foram avaliadas ureia, creatinina, alanina amino-transferase (ALT), aspartato aminoamino-transferase (AST), ácido úrico, glice-mia de jejum, colesterol total (CT), triglicerídeos (TG), HDL-c e LDL-c.
Os resultados foram expressos em mg/dL ou U/L e foram seguidos os
valores de referência de cada analito bioquímico.
3.3 PROTOCOLO EXPERIMENTAL
De forma a manter uma ingestão alimentar padronizada e com baixo teor de ácidos clorogênicos por 48 h previamente ao estudo, os partici-pantes foram instruídos verbalmente e receberam orientações por escrito com uma lista de alimentos permitidos para consumo (APÊNDICE B). Para avaliar o seguimento das instruções de ingestão alimentar foi apli-cado questionário recordatório 24 h (R24h) no dia do estudo. Além disso, os participantes foram orientados a fazer jejum de 12 h antes da coleta.
A infusão foi preparada individualmente adicionando-se 300 mL
de água a 80◦C em 30 g de folhas de erva-mate (seguindo a proporção
temperatura ambiente e ao abrigo de luz por 10 min. Em seguida, a bebida
foi filtrada e quando atingiu 30◦C foi ofertada aos participantes. A bebida
assim preparada rendeu 200 mL de infusão, visto que parte da água é ad-sorvida pelas folhas. Então, os voluntários ingeriram 200 mL de infusão em um período máximo de 5 min. As amostras de sangue foram coletadas por meio de punção da veia intermédia do antebraço, com sistema a vácuo (Vacutainer-BD-São Paulo, SP) em tubos contendo heparina (4 mL), antes e a cada hora por até 8 h após o consumo, por profissional treinado. Para a separação do plasma, as amostras de sangue foram imediatamente
cen-trifugadas (750 x g, 10 min, 4◦C; Eppendorf®Hamburgo, Alemanha). A
coleta das amostras de urina foi realizada antes e em intervalos de duas em duas horas durante 10 h em coletor de urina 24 h contendo 5 mg de ácido ascórbico (Figura 7).
Figura 7 – Linha do tempo para o dia de coleta.
Basal: sangue urina 2h sangue 4h sangue 5h sangue 7h sangue Ingestão 200 mL infusão (5 min) 1h sangue 3h sangue 6h sangue 8h sangue
Café da manhã Almoço 0-2 h urina 2-4 h urina 4-6 h urina 6-8 h urina 8-10 h urina
Em estudo prévio, Alves (2016) comprovou que as amostras de plasma foram estáveis por apenas 24 h após armazenamento sob condição
de congelamento em freezer−80◦C, portanto, as mesmas foram
conge-ladas imediatamente, armazenadas a−80◦C e analisadas no dia seguinte.
As amostras de urina foram avaliadas no dia da coleta. O consumo de água foi permitido ad libitum e 2 h após o momento da ingestão da
infu-3.3. Protocolo experimental 51
são de folhas de Ilex paraguariensis foi ofertada uma refeição pobre em ácidos fenólicos composta por pão branco, requeijão, queijo e blanquet de peru, e após 6 h uma refeição de macarrão com molho branco, sas-same de frango e batata palha (MONTEIRO et al., 2007; ALVES, 2016; GÓMEZ-JUARISTI et al., 2018).
3.3.1 Extração dos ácidos clorogênicos e seus metabólitos das amos-tras biológicas
Foi realizada uma extração líquido-líquido e desproteinização com acetonitrila e metanol para isolamento dos compostos do plasma conforme descrito por Day et al. (2001) com modificações de acordo com Gómez-Juaristi et al. (2018). Após o descongelamento, 400 µL de plasma foram acidificados com 12 µL de ácido fórmico 50% e agitados por 30 segun-dos em agitador tipo vórtex. O plasma acidificado foi adicionado em
gotas a 1000 µL de solução de acetonitrila resfriada contendo 0,2 g/mL
de ácido ascórbico, a mistura foi agitada em vórtex por 60 segundos e
centrifugada a 10 rpm, por 10 min a 4◦C em centrífuga para microtubos
(Eppendorf®USA). O sobrenadante foi reservado e o sedimento proteico
foi suspendido novamente com 1000 µL de metanol e centrifugado nas mesmas condições descritas. Os sobrenadantes foram combinados e con-centrados por meio da evaporação a vácuo do solvente (Centrifuge for Va-cuum Concentrator – SCANVAC, Lynge, Hovedstaden, Dinamarca) por
aproximadamente 3 h a 45◦C. O resíduo foi suspendido em 100 µL de
solução de ácido fórmico 0,1% e acetonitrila (acidificada com 0,1% ácido fórmico, concentração final) (90 µL de ácido fórmico 0,1% e 10 µL de
ace-tonitrila) e centrifugado a 10.000 g, por 20 min a 4◦C. O sobrenadante foi
filtrado com membranas 22 µm (Merck Millipore®, Billerica, MA, EUA)
e analisado por CLAE.
Para o controle de qualidade, a taxa de recuperação dos compos-tos após os processos de extração e isolamento foi avaliada pela adição de padrões de 5-CQA, ácido cafeico, ácido p-cumárico e cafeína
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) em alíquotas de plasma que não continham quantidades detectáveis de CGAs. Os resultados dos testes das taxas de recuperação para cada dia de análise foram utilizados para corrigir os va-lores dos metabólitos plasmáticos.
As amostras de urina foram diluídas com volume equivalente de
água Milli-Q e centrifugadas a 14.000 g, por 20 min a 4◦C. O
sobre-nadante foi filtrado com membranas 22 µm e analisado por CLAE nas mesmas condições das análises nas amostras de plasma. Os metabólitos foram quantificados e a excreção urinária foi normalizada considerando o volume total de urina excretada em cada intervalo de coleta sendo os resultados expressos em µmol.
3.3.2 Análises em Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
A identificação e quantificação dos ácidos fenólicos da infusão de folhas de Ilex paraguarienis, bem como das amostras de plasma e urina foram realizadas por CLAE conforme descrito por Farah et al. (2005) com modificação no gradiente de fase móvel, de acordo com o trabalho de
Al-ves (2016). Foi utilizada coluna de fase reversa Supelco C18 (4,6 mm x
250 mm, 5 µm) e pré-coluna Phenomenex C18 (4 mm x 2 mm, 5 µm) em equipamento com injetor automático, conectado ao degaseificador DGU 20A5 com integrador CBM 20A e detector UV-Visível DAD SPD-M20A (Shimadzu, Kyoto, Japão) operando em 325 nm para a detecção de CGAs e em 280 nm para metilxantinas e outros ácidos hidroxicinâmicos. A fase móvel foi composta por 80% de uma solução de ácido cítrico 10 mM aci-dificada ao pH de 2,5 com ácido clorídrico 6 N e 20% de metanol (Fase
A) e metanol (Fase B). O fluxo foi de 1,0 mL/min em um gradiente linear
com as condições apresentadas na Tabela 1.
Foram preparadas três infusões e após o preparo, cada infusão foi
diluída 100 vezes (1 mg/mL) e alíquotas de 1 mL foram centrifugadas
(1.000 x g, 10 min, 25◦C) e filtradas em membranas 45 µm (Merck
3.3. Protocolo experimental 53
Tabela 1 – Condições cromatográficas para análises em Cromatografia Lí-quida de Alta Eficiência.
Tempo (min) Fluxo (% v/v)
Fase A Fase B
0,01 100 0
15 80 20
25 80 20
30 100 0
cada infusão foram injetados em coluna cromatográfica em triplicata. Os compostos foram identificados por comparação de seus tempos de retenção e espectro de absorção com padrões comerciais e a quantifica-ção foi calculada empregando-se a equaquantifica-ção da reta obtida pela regressão linear das curvas analíticas dos respectivos padrões (Figura 8).
Figura 8 – Curva-padrão e equação da reta representativas do ácido cloro-gênico. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 1 2 3 4 5 ·10 6 R2 =0,999 Ácido clorogênico(µg/mL) Área ( mAu )
Nas amostras de plasma e urina, além da presença dos principais ácidos clorogênicos encontrados na erva-mate (CQA e diCQA), também foram investigados os compostos que poderiam ser formados após meta-bolização por enzimas endógenas de fase I e II (metabólitos primários) como os ácidos cafeico e ferúlico, e derivados glicuronados e/ou sulfata-dos; ou após metabolização por enzimas provenientes da microbiota in-testinal (metabólitos secundários) como os ácidos p-cumárico, hipúrico, hidroxibenzóico, dihidrocafeico e vanílico (GONTHIER et al., 2003; LA-FAY et al., 2006; FARAH et al., 2008; STALMACH et al., 2009).
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as análises estatísticas foi usado o programa Data Analysis and Statistical Software (STATA, versão 11 para Windows – Stata Corpo-ration, College Station, Texas, EUA). A normalidade dos dados foi veri-ficada pelo teste de Shapiro-Wilk. Para o tratamento dos dados foi em-pregada a estatística descritiva, com medidas de tendência central e vari-abilidade em média e desvio padrão (DP). As concentrações plasmáticas dos metabólitos de CGA e da cafeína foram utilizadas para obtenção dos
seguintes parâmetros cinéticos: concentração máxima (Cmax), tempo para
concentração máxima (Tmax) e a área sob a curva (area under the curve
-AUC), calculada pelo método trapezóide, total e individual.
3.5 ASPECTOS ÉTICOS
Este estudo teve aprovação do Comitê de Ética com pesquisas em seres humanos da Universidade do Estado de Santa Catarina (UDESC), sob o número 39469014.3.0000.0118. Os indivíduos foram convidados a participar do estudo de maneira voluntária, e todos os participantes as-sinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) (ANEXO A), segundo resolução do Conselho Nacional de Saúde, nº 466, de 2012 (BRASIL, 2012).
55 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A apresentação dos Resultados e da Discussão do presente estudo será feita na forma de um manuscrito, conforme modelo e critérios defi-nidos pelo Programa de Pós-Graduação em Nutrição da UFSC.
4.1 MANUSCRITO
Manuscrito a ser submetido ao Journal of Functional Foods (Qualis A1)
Título
Absorção e identificação de ácidos clorogênicos e seus metabóli-tos após o consumo de uma infusão de Ilex paraguariensis em adulmetabóli-tos brasileiros saudáveis.
Palavras-chave
Ácidos clorogênicos, metabólitos, absorção, Ilex paraguariensis
Resumo
Os ácidos clorogênicos (CGAs) são os principais compostos bio-ativos de Ilex paraguariensis. Além da ação antioxidante, novos meca-nismos de ação têm sido sugeridos para esses compostos. Levando em consideração que os CGAs são absorvidos e rapidamente metabolizados pelo organismo humano e a escassez de estudos avaliando a biodisponi-bilidade dos mesmos, o objetivo do presente estudo foi detectar e identi-ficar os CGAs e seus metabólitos durante 10 h após ingestão de 200 mL de uma infusão de folhas de Ilex paraguariensis em dez indivíduos adul-tos saudáveis. Foram identificados quatro metabóliadul-tos plasmáticos e onze urinários por cromatografia líquida de alta eficiência, com concentrações
