Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Biomonitoramento
Igor Leonardo Pereira Rodrigues
Metalotioneínas como biomarcadores de
poluição
por
metais-traços em corpos d`água utilizando Tilápias do Nilo
(Oreochromis niloticus, Linnaeus, 1758) como organismos-teste.
Salvador
2007
Universidade Federal da Bahia
Instituto de Biologia
Programa de Pós-Graduação em Ecologia e Biomonitoramento
Igor Leonardo Pereira Rodrigues
Metalotioneínas como biomarcadores de poluição por
metais-traços em corpos d`água utilizando Tilápias do Nilo (Oreochromis
niloticus, Linnaeus, 1758) como organismos-teste.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Ecologia e Biomonitoramento, do Instituto de Biologia da Universidade Federal da Bahia, como requisito final para obtenção do Título de Mestre em Ecologia e Biomonitoramento. Orientadora: Dra. Iracema Andrade Nascimento
Co-orientador: Dr. Mauro de Freitas Rebelo
Salvador
2007
Biblioteca Central Reitor Macêdo Costa - UFBA
R696 Rodrigues, Igor Leonardo Pereira.
Metalotioneínas como biomarcadores de poluição por metais - traços em corpos d’ água utilizando tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus, Linnaeus, 1758) como organismos-teste / Igor Leonardo Pereira Rodrigues. - 2007.
55 f. : il.
Orientadora : Dra. Iracema Andrade Nascimento. Co-orientador: Dr. Mauro de Freitas Rebelo.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal da Bahia, Instituto de Biologia, 2008.
1. Marcadores biológicos. 2. Indicadores biológicos. 3. Proteína de ligação. 4. Oreochromis niloticus. I. Nascimento, Iracema Andrade. II. Rebelo, Mauro de Freitas. III. Universidade Federal da Bahia. Instituto de Biologia. IV.Título.
CDD - 577.2 CDU - 504.06
“É necessário esforça-se, é necessário consagrar-se, é necessário também sofrer para obter resultados”
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha família, pelo apoio, empenho e incentivo durante toda a jornada do mestrado;
A minha orientadora, a Dra Iracema Andrade Nascimento, por me introduzir à Ecotoxicologia, ciência tão admirável e por me oferecer todas as ferramentas necessárias para a realização de um bom trabalho e, conseqüente, crescimento profissional. Tenho por ela uma extrema admiração;
A meu co-orientador, o Dr. Mauro de Freitas Rebelo, pelas orientações e ajuda no processo experimental e na composição deste trabalho;
À FAPESB, pela concessão da bolsa de mestrado e ao Programa de Pós Graduação em Ecologia e Biomonitoramento da UFBA pela oferta deste curso de pós-graduação;
Ao DNOCS, em especial a Bióloga Louirânia de Souza, pela doação das tilápias (sem elas, este trabalho não teria saído dos rascunhos!!!);
À toda equipe do Laboratório de Biologia Marinha e Biomonitoramento (em especial a Graça Matias, Maria Bernadete, Solange Pereira, Andréa Cruz, Débora Barros e a Vanessa Lacerda) pela amizade e apoio na execução deste trabalho; À toda equipe do Laboratório de Radioisótopos Eduardo Penna Franca (IBCCF-UFRJ) em especial ao mestre Rodrigo Wannick, a Andreza Maurat e a Diogo Coutinho pela ajuda e apoio nos meus experimentos;
À secretária do Colegiado da Pós Graduação, Jussara, pelas palavras de incentivo e pelos inestimáveis préstimos na hora da burocracia;
A minha prima Kátia Rodrigues Neves e a Rosa Maria Moysés por toda a ajuda e força em minha empreitada em São Paulo;
Á Renato Resende (OBRIGADO POR TUDO PARCEIRO!!!) e aos novos amigos conquistados em São Paulo:, Cristiane Souza, Elaine Pinto, Èleson Castro, Marcy, Marta e Cris (As Meninas do Céu), pelo apoio e palavras de carinho nos momentos mais oportunos;
À Família Aragão (Gustavão, Tia Dida, Juli) por todo o apoio, carinho e acolhimento durante a minha estadia no Rio de Janeiro. SEREI ETERNAMENTE GRATO A VOCÊS!!!.
À Gilson Freitas pelo apoio na execução das análises estatísticas;
Rodrigues, I.L.P. Metalotioneínas como biomarcadores de
poluição por metais-traços em corpos d`água utilizando Tilápias
do Nilo (Oreochromis niloticus, Linnaeus, 1758) como
organismos-teste.
RESUMO
A atividade industrial tem potencial para gerar resíduos tóxicos que podem atingir o ambiente. Nos complexos industriais, as correntes “não orgânicas” que compõem o sistema supostamente “não contaminado” são direcionadas a bacias de contenção, cujo reuso das águas pode ser feito, fundamentando-se na comprovação de sua qualidade. O uso de biomarcadores de exposição no embasamento de ações de controle e risco permite a detecção de impactos deletérios antes que sejam manifestados em níveis de populações ou comunidades. As metalotionéinas são proteínas que indicam a presença de metais traços no ambiente. Este trabalho visou avaliar a biodisponibilidade de metais traços na água e no sedimento de diferentes pontos de Bacias de Contenção de efluentes petroquímicos, utilizando como organismos-testes juvenis de Tilápias do Nilo (Oreochromis niloticus), através da indução de metalotioneínas. As tilápias foram expostas à água, proveniente de diversos pontos amostrais da bacia de contenção, bem como ao sedimento, por um período de 24 horas. Foram utilizadas 5 réplicas para cada ponto de amostragem, além de um ponto controle. Os resultados indicaram a presença de metais traços em concentrações acima das encontradas na amostra-controle, salientando a eficiência destes biomarcadores na avaliação da qualidade hídrica para o reuso industrial.
Palavras-chave: Metalotioneínas, biodisponibilidade, metais-traços, bacias de retenção de efluentes, Oreochromis niloticus, avaliação de corpos hídricos.
Rodrigues, I.L.P. Metallothioneins as biomarkers of trace-metal
pollution in water bodies using Nile Tilapias (Oreochromis
niloticus, Linnaeus, 1758) as test organisms.
ABSTRACT
The industrial activity has potential to generate waste, toxic to the environment. Non- organic industrial effluents are directed to containment basins and can be reused by the industrial processes if they have the necessary quality. The use of exposition biomarkers in the basement of risk assessment allows the detection of deleterious impacts before revealed in populations or community levels. The metallothioneins are biomarkers that evidence the presence of trace metals in the environment. This research aimed to evaluate the bioavailability of these contaminants in the water and in the sediment in different points of Contention basins of a Petrochemical Industrial region, by using juveniles of Nile Tilapias (Oreochromis niloticus) as test organisms for the evidence of the induction of metallothioneins. The fishes had been exposed to the water collected from the retention basin, as well as to the sediment, for a 24-hour period and in 5 replicates, for each sampling point, beyond a control point. The results had indicated the presence of trace metals in concentrations above the ones found in control samples, pointing out the efficiency of this biomarker for the evaluation of water quality for industrial reuse.
Key words: Metallothioneins, bioavailability, trace metals, effluent retention basin,
SUMÁRIO
RESUMO 6 ABSTRACT 7 LISTA DE FIGURAS 10 LISTA DE TABELAS 12 1. INTRODUÇÃO 14 1.1. Biomarcadores 1.2. Metais – traço 1.3. As Metalotioneínas 15 17 212. DESCRIÇÃO DA ÁREA DE ESTUDO 26
3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral 3.2. Objetivos Específicos 28 28 28 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Organismo – teste
4.1.1. Descrição e biologia da espécie
4.1.2. Obtenção dos organismos-teste e procedimentos de amostragem
4.2. Execução dos testes
4.2.1. Exposição dos organismos as amostras ambientais 4.2.2. Preparação do sobrenadante (centrifugação a 20000G) 4.2.3. Determinação da indução de metalotioneínas
4.2.3.1. Precipitação das metalotioneínas
4.2.3.2. Detecção das metalotioneínas: eletroforese em gel Tris/Tricina SDS-PAGE.
4.2.3.3. Quantificação das metalotioneínas 4.2.4. Dosagem de Proteínas Totais
4.2.5. Análise dos Parâmetros Físico-Químicos 4.2.6. Controle Positivo 29 29 30 31 34 34 35 37 37 38 40 41 42 42 5. TRATAMENTO ESTATÍSTICO 42
6. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6.1. Parâmetros físico-químicos
6.2. Eletroforese em gel Tris/Tricina SDS-PAGE (amostras líquidas
e de sedimento)
6.3. Indução de metalotioneínas em fígado de O. niloticus expostos às amostras líquidas
6.4. Indução de metalotioneínas em fígado de O. niloticus expostos às amostras de sedimento
6.5. Identificação dos metais-traços 6.5.1. Nas amostras líquidas
6.5.2. Nas amostras de sedimento
43 43 44 45 47 49 50 50 7. CONCLUSÕES 54 8. REFERÊNCIAS 55
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema geral para a absorção, distribuição e excreção de metais em
animais aquáticos.
Figura 2 : Modelo da indução da expressão do gene da metalotioneína
Figura 3. Foto aérea da Bacia de Contenção de Efluentes
Figura 4. Oreochromis niloticus
Figura 5. Foto georeferenciada da área de amostragem
Figura 6. Garrafa de Van Dorn: coleta das amostras líquidas
Figura 7. Coleta de sedimento através da draga de Pettersen
Figura 8. Montagem do teste com as amostras líquidas
Figura 9. Montagem do teste com as amostras de sedimento
Figuras 10-15. Etapas seqüenciadas do processo experimental, desde a retirada
dos peixes dos aquários até a preservação dos pools de fígado de O. niloticus em nitrogênio líquido.
Figura 16. Transluminador UV acoplado ao sistema de digitalização de imagem
Figura 17. Gel Tris/Tricina SDS-PAGE com bandas de metalotioneínas marcadas
Figura 18. Equações da reta e seus respectivos coeficientes de correlação obtidos
através de regressão
Figuras 19 e 20. Determinação das proteínas totais (Bradford, 1976) em
espectrofotômetro de leitura em multiplaca.
Figura 21. Resultados de MT (µg. µL-1)/PTN total (mg.mL) em fígado de O.
niloticus expostos à água das bacias de contenção.
Figura 22. Análise de correspondência múltipla entre concentração de metais nas
amostras líquidas e a indução de metalotioneínas no fígado de O. niloticus expostos à referida matriz amostral. Altas concentrações em preto, pontos de amostragem em vermelho.
Figura 23. Resultados de MT (µg. µL-1)/PTN total (mg.mL) em fígado de O.
niloticus expostos ao sedimento das bacias de contenção.
Figura 24. Análise de correspondência múltipla entre concentração de metais nas
amostras de sedimento e a indução de metalotioneínas no fígado de O. niloticus expostos à referida matriz amostral. Altas concentrações em preto, pontos de amostragem em vermelho.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores de parâmetros físico-químicos nas amostras líquidas e valores
limites estabelecidos pela CONAMA 357/2005.
Tabela 2. Valores de parâmetros físico-químicos nas amostras de sedimento e
valores limites estabelecidos pela CONAMA 344/2004.
Tabela 3. Resultado da análise dos metais nas amostras líquidas e valores limites
estabelecidos pela CONAMA 357/2005 (coluna sombreada).
Tabela 4. Resultado da análise dos metais nas amostras de sedimento e valores
1. Introdução
A toxicidade é uma característica que indica reais ou potenciais efeitos deletérios causados por exposição de organismos vivos a contaminantes. A busca de ferramentas, para incorporação da avaliação de qualidade na gestão do uso de água, que vise análises quali-quantitativas de contaminantes em ecossistemas aquáticos, tornou-se um desafio contínuo para os cientistas ambientais (CETESB, 1986). Apesar das análises químicas serem apontadas como mecanismos de identificação de toxicidade, determinam apenas as concentrações de substâncias no meio, sendo incapazes de apontar ações sinérgicas ou aditivas entre contaminantes e entre eles e outros parâmetros físico-químicos ambientais, que podem ser responsáveis por um substancial aumento em suas ações tóxicas (Nascimento et al., 2002). Conseqüentemente, a definição de qualidade de um corpo de água, deve, obrigatoriamente, envolver parâmetros biológicos. Apenas organismos vivos são capazes de responder a ações tóxicas através de alterações bioquímicas, fisiológicas ou comportamentais. Dessa forma, bioensaios com peixes, invertebrados, culturas de células, bactérias ou algas têm sido tradicionalmente usados para avaliar a qualidade (toxicidade) de corpos de água receptores, de efluentes ou produtos industriais.
Atualmente, o setor industrial busca implementar metodologias mais eco-compatíveis em seus processos produtivos, objetivando minimizar os impactos proporcionados ao meio ambiente. A reutilização da água de bacias de contenção dos efluentes industriais “não orgânicos“ (não resultantes diretamente dos processos produtivos) para diluição de efluentes “orgânicos” gerados diretamente dos processos, pode ser uma alternativa viável, mas depende de análises ecotoxicológicas para avaliação de sua qualidade. Estes resíduos podem, eventualmente, conter substâncias tóxicas geradas pela atividade industrial petroquímica, principalmente metais traços.
Internacionalmente, a proteção e a restauração de ecossistemas têm sido itens incorporados a projetos de gerenciamento ambiental e de recursos hídricos em bacias hidrográficas. Quanto mais precisas as estimativas de impactos resultantes de eventos antrópicos, maior a efetividade das decisões de gestores (Luz, 2004), definidas através de avaliação de riscos. A análise de riscos aplicada à proteção de ecossistemas aquáticos exige o uso de indicadores biológicos, cujas repostas possam levar a uma avaliação eficaz, capaz de embasar ações de controle. A resposta biológica a agressões ambientais pode ser evidenciada em qualquer nível de organização, desde ecossistemas até compartimentos subcelulares ou reações bioquímicas intracelulares, passando por comunidades, populações, organismos, sistemas fisiológicos e células (Walker, et al., 1997)
A detecção prévia desse estresse, através de indicadores sensíveis, fornece subsídios ecotoxicológicos de avaliação, antes que severas mudanças atinjam a dinâmica do ecossistema (Nascimento et al., 2002). A resposta do organismo ao estresse ambiental é um dos primeiros sinais da tentativa de adaptação celular às condições de impacto.
1.1. Biomarcadores:
Os biomarcadores, como alterações biológicas que expressam a exposição e os efeitos tóxicos dos poluentes presentes no ambiente (Lam & Wu, 1999; Bainy, 2001), podem servir como ferramenta útil em programas de monitoramento ambiental, pois são preditivos, apresentam boa sensibilidade, relativa especificidade e baixo custo de análise.
Por serem técnicas preventivas, o uso de biomarcadores é considerado uma ferramenta promissora para detecção prévia de efeitos adversos de poluentes em organismos (Depledge, 1994; Nascimento et al., 1998b apud Martins et al., 2005). O efeito primário da ação destas substâncias compreende as perturbações dos processos bioquímicos e moleculares no interior das células, podendo alterar,
desta forma, as funções vitais dos organismos expostos (Bayne et al., 1988). Estas alterações também podem ser detectadas em níveis sub-celulares, sendo consideradas como “early warning markers”.
Os biomarcadores podem ser classificados como:
1.1.1. Biomarcadores de efeito: em geral, não são específicos em relação aos estressores e não fornecem informações sobre a sua natureza, mas são característicos da ocorrência de um estresse que poderá ser reversível tão logo o estressor cesse a sua atuação. São caracterizados pela indução de mecanismos de defesa celular, que se iniciam sempre como uma resposta adaptativa em nível molecular-bioquímico. Entretanto, se esse mecanismo falha ou se sua capacidade de resposta é ultrapassada, poderão ser desencadeadas alterações fisiológicas ou histológicas, podendo ser não reversíveis, dependendo da capacidade do sistema ou órgão em responder ao estressor. Alguns desses biomarcadores são órgão – específicos como enzimas tipo aminoferases, as proteínas de estresse (heat shock proteins), dentre outras (Mayer et al, 1992 ; Nascimento et al., 2006)
1.1.2. Biomarcadores de exposição: são assim classificados, pois estimam a dose interna ou biodisponibilidade de um xenobiótico particular ou de seus metabólitos em um organismo exposto. Deve representar uma resposta bem caracterizada, que leve em conta a farmacodinâmica e as propriedades físico-químicas do organismo e agente, respectivamente. Essa classe pode envolver desde indicadores de estresse generalizado a indicadores específicos de exposição a um poluente particular. A indução de metalotionéinas sob exposição a metais é um exemplo desse tipo de biomarcador (McCarthy & Shugart, 1990; Stegeman et al., 1992 apud Nascimento et al. 2006).
Segundo Livingstone, 1985; Versteeg et al., 1988, Nascimento et al., 2006, a escolha apropriada do biomarcador para a detecção e o monitoramento de
exposição e efeitos requer a consideração de uma série de fatores e condições (, dentre elas:
• Facilidade de medida, permitindo a quantificação de múltiplos indivíduos; • Resposta-dose ou tempo-dependente ao contaminante, de modo a poder
determinar a magnitude da exposição ou efeito;
• Compreensão e especificação de limites de variabilidade devida a outros fatores (sexo, idade, peso, manuseio, temperatura, pH, salinidade, etc.) que não a ação do contaminante em estudo;
• Significância biológica, ou seja, o biomarcador deve estar relacionado a processos biológicos – chave;
• Capacidade de atuar como indicador geral: monitoramento de varredura (screening);
• Sensibilidade relativa a outros endpoints convencionais, como crescimento e reprodução;
• Especificidade biológica e química.
1. 2. Metais – traço:
Os organismos aquáticos estão continuamente expostos a concentrações variáveis de metais na água. Isto ocorre particularmente nas regiões costeiras que são influenciadas pela contaminação por metais de origem antropogênica (Viarengo & Nott, 1993). Um modelo generalizado de absorção, translocação, armazenamento e excreção dos metais em organismos aquáticos está representado na Figura 1.
Figura 1. Esquema geral para a absorção, distribuição e excreção de metais em
animais aquáticos. Adaptado de Roesijadi (1992).
O termo metais-traço refere-se aos metais pertencentes aos grupos 11 e 12 da tabela periódica. Entre estes elementos estão o zinco (Zn2+) e o cobre (Cu2+),
oligoelementos essenciais para o metabolismo celular; assim como o cádmio, mercúrio e prata, para os quais não existe função biológica definida. Todos estes metais produzem efeitos tóxicos quando penetram em excesso na célula (Viarengo & Nott, 1993). Devido às suas características eletrônicas, estes metais possuem grande afinidade por enxofre (Eichorn, 1973).
Os metais presentes na água exibem seus maiores níveis de toxicidade a organismos aquáticos em situações de baixo pH e carbono orgânico dissolvido.
Isto é explicado pela competição que se estabelece entre os íons Ca2+ e Mg2+ e os
íons metálicos pelos sítios de ligação dentro do organismo. Agentes complexantes de metais como o carbono orgânico dissolvido e os ácidos húmicos e fúlvicos podem diminuir a toxicidade dos metais traço presentes na água pela redução do número de íons metálicos livres disponíveis a interagir com os organismos. (Nogami et al., 2000). Corpos hídricos ácidos, com altas concentrações de íons hidrogênio, podem também competir com os cátions metálicos pelos sítios de ligação pelo mesmo processo descrito para os íons cálcio e magnésio em águas duras (Penttinen et al., 1995). Os íons de hidrogênio podem deslocar os cátions metálicos complexados pela presença de carbono orgânico dissolvido e dos ácidos húmicos e fúlvicos, tornando-os biodisponíveis na coluna d’água.
As brânquias dos peixes de água doce são muito finas e delicadas, podendo apresentar uma carga líquida negativa significativa em sua superfície, resultando em alta afinidade por íons metálicos. O estágio juvenil apresenta maior sensibilidade aos efeitos tóxicos dos metais-traço quando comparado com o estágio adulto (Gardner & Yevich, 1970 ; Muramoto, 1981).
O processo de resistência das brânquias a metais – traço em peixes de água doce é dividido em três etapas. As brânquias correspondem ao primeiro órgão-alvo afetado pela exposição a metais em peixes (McDonald & Wood, 1993 ; Wu et al., 2007), onde a produção de muco na superfície destes órgãos corresponde a primeira linha de defesa frente a exposição de metais. Este mecanismo de defesa apresenta considerável influência no acúmulo de metais-traço nas brânquias (Handy & Eddy, 1990). Apesar da síntese de muco servir de obstáculo ao acesso destes poluentes a superfície epitelial destas estruturas, dados em literatura comprovam que o cádmio pode ser translocado da camada de muco para o interior das células epteliais destes organismos (Shu, et al, 2000). A segunda etapa compreende a fase de compensação e reparo dos danos branquiais. A terceira etapa consiste de um processo adaptativo, onde verifica-se um aumento
da tolerância à presença de metais no organismos dos peixes mediante uma diminuição da bioacumulação destes elementos pelas brânquias. Esta etapa também pode ser caracterizada pela indução da síntese de metalotioneínas, que atuará no mecanismo de detoxificação destes metais. (Oost et al., 2003 ; Wu et al., 2007)
O cádmio (Cd), por exemplo, é amplamente usado na indústria, em ligas, baterias e em pigmentos utilizados em tintas, borrachas e esmalte (Timbrell, 2003). As principais fontes antropogências de Cd são: refino e uso, mineração de cobre e níquel e queima de combustíveis fósseis. As fontes naturais de Cd para a atmosfera são representadas pela atividade vulcânica, pelos incêndios florestais e pelo transporte de partículas de solo pelo vento (Waisberg et al., 2003). As fontes antropogênicas de Cd contribuem com 3 a 10 vezes mais Cd do que as fontes naturais (Irwin et al., 1997).
O cádmio é um metal biologicamente não essencial, que ocorre em concentrações < 0,1 µg/L em corpos hídricos em suas condições naturais; mas em ambientes antropologicamente impactados, as suas concentrações podem alcançar níveis mais elevados (USEPA, 2001). Esse metal entra no meio ambiente através de inúmeras fontes antropogênicas, como produtos resultantes do refino do zinco, combustão do carvão, dejetos da mineração, produção de ferro e aço, pigmentos e pesticidas (USEPA, 2001).
O cádmio pode ser incorporado ao sistema biológico dos organismos aquáticos por intermédio de duas rotas principais: ingestão e absorção branquial. Nos peixes, o cádmio acumula-se no fígado, nas brânquias, nos rins e no trato gastrointestinal (Hogstrand & Haux, 1991). Nos peixes, este metal pode contribuir com um amplo espectro de efeitos patológicos como deformidades esqueléticas, danos na estrutura branquial, distúrbios respiratórios, alterações de alguns parâmetros hematológicos, como as taxas de cortisol e glucose que revelam sinais de estresse em peixes, alterações em todo o sistema de regulação iônica,
especialmente, o balanço de cálcio nestes animais (Gardner & Yevich, 1970; Muramoto, 1981 ; Karlsson-Norrgren et al., 1985; Verbost et al., 1987;Fun et al., 1990 ; Pratap & Wendelaar Bonga, 1993; Wicklund Glynn et al., 1994 ; McGeer et al., 2000; Zikic et al., 2001;Thophon et al., 2003;Chowdhury et al., 2004; Lacroix & Hontela, 2004).
Os rins representam os órgãos mais sensíveis ao efeito tóxico do cádmio (Woo et al., 1993). A exposição excessiva ao cádmio promove a produção de altos níveis de proteinúria, que representa o “end-point” mais sensível indicativo de toxicidade renal (Nicholson et al., 1983 apud Nogami et al., 2000). O cádmio como também o mercúrio induzem a síntese de metalotioneínas no fígado. Sais de cádmio são mal absorvidos pelo trato gastrointestinal. A absorção de cádmio está ligada às proteínas plasmáticas que são transportadas ao fígado, onde são liberadas lentamente com conseqüente acúmulo nos rins. O zinco pode contribuir com o aumento do acúmulo de cádmio no fígado e nos rins (Wicklund et al., 1988). Os demais metais têm efeitos semelhantes sobre a biota.
1.3. As Metalotioneínas:
Entre os mecanismos de homeostase de metais pesados, pode-se destacar aquele que envolve a síntese de uma classe de proteínas denominadas metalotioneínas (MTs). Vários autores têm proposto o uso de MTs como biomarcador de exposição a metais (Brown et al., 1977; Olafson et al., 1979; Bayne et al., 1980; Engel & Roesijadi, 1987; Viarengo et al.,1999; Cosson, 2000; Lange et al.,2002). Alguns organismos biondicadores, tais como, peixes, moluscos e crustáceos, têm sido utilizados na aplicação das MTs como biomarcadores (Viarengo et al., 1999).
As metalotioneínas são proteínas citosólicas, de baixo peso molecular (6 a 8 Kda), ricas em cisteína , que se ligam a metais, e cujo aumento de indução resulta de uma resposta específica de exposição a metais como o cobre, zinco, cádmio e mercúrio (Engel & Roesijadi, 1987; Viarengo et al.,1997). Estudos recentes relacionam o mecanismo de regulação indutiva da expressão das metalotioneínas pelos metais e suas interações com moléculas-alvo e fornecem informações importantes da significância toxicológica da indução destes biomarcadores por metais traços (Roesijadi, 1996).
A análise da indução de metalotioneínas em teleósteos e a sua capacidade de se ligar com os metais, tem sido aplicada com sucesso em inúmeros estudos de biomonitoramento em diversos ecossistemas aquáticos impactados por poluentes e pode servir como um indicador prévio de estresse ambiental , fornecendo informações valiosas sobre a extensão e as possíveis conseqüências da exposição crônica a estes poluentes (Chesman, et al, 2007).
As metalotioneínas apresentam similaridade na massa molecular, espectro de absorção, ponto isoelétrico e composição de aminoácidos, em diferentes espécies. A indução de metalotioneínas representa o primeiro sistema de defesa da célula contra a presença de metais-traço e é um marcador bioquímico em potencial na contaminação por metais. Os grupos sulfidrílicos – SH da MT ligam-se aos íons metálicos dos grupos 11 e 12 da tabela periódica , como Zn 2+, Cd 2+, Hg 2+ e Cu2+
,
prevenindo sua ação tóxica e danos celulares. Dessa forma, as metalotioneínas contribuem para a detoxificação de metais e, consequentemente, aumentam a tolerância dos organismos a estes elementos. Essas proteínas vêm sendo identificadas em vários órgãos de peixes expostos a metais, sendo o fígado o órgão no qual tem sido encontrada em maiores concentrações. As MTs também têm sido relacionadas com a proteção das células contra espécies reativas de oxigênio e drogas anti-câncer eletrofílicas, atuando como um “scavenger” deradicais livres (Chan et al., 2002). Esta classe de proteínas também pode influenciar o processo de transcrição através da ligação a zinco, diminuindo os níveis intracelulares deste metal e, assim, diminuindo a atividade de proteínas “Zinc finger” que atuam como fatores de transcrição (Zeng et al., 1991;Heuchel et al., 1994; Abolmaali et al., 1998;Coyle et al., 2002;).
De acordo com Stennard et al. (1994) existem 4 classes de metalotioneínas nos vertebrados: MT-1, MT-2, MT-3 e MT-4. As metalotioneínas 1 e 2 estão presentes na maioria dos tecidos, enquanto que as classes 3 e 4 predominam no cérebro e células epiteliais escamosas, respectivamente (Quaife, et al. 1994). A Classe I tem uma estrutura primária equivalente à proteína descrita pela primeira vez em rim eqüino e é caracterizada por “motivos” Cys-X-Cys, Cys-X-X-Cys e Cys-Cys. Nesta classe estão as MTs de vertebrados e alguns invertebrados como nematóides e moluscos. As MTs da Classe II diferem da Classe I em relação à posição dos resíduos de cisteína e são tipicamente encontradas em ouriço do mar, trigo, levedura e alguns procariotos. A Classe III consiste de polipeptídeos metal-tiolato atípicos, como as fitoquelatinas, presentes em plantas (Chan et al., 2002; Kojima, 1991). A Classe IV restringe-se ao tecido epitelial encontrado na pele, língua e na parte superior do trato alimentar de mamíferos (Chan et al., 2002).
A expressão do gene de MT é controlada ao nível de transcrição (Figura 2), onde após a ativação de um fator pela ligação com Zn, se liga ao promotor iniciando a expressão (Rebelo, 2001). Um aumento na expressão da proteína pode ser alcançado também, através da amplificação do gene de MT (Andrews, 1990). A extremidade 5’ dos genes das MT-I e MT-II apresenta um TATA box e vários elementos cis: elementos de resposta a metais (MRE – metal response element), elementos de resposta a glucocorticóides e elementos de resposta antioxidante (ARE – antioxidant response elements). Modelos anteriores, revisados por Roesijadi (1996) descreviam um mecanismo baseado na associação do Zn2+ com MTF-1. Atualmente, Saydam et al. (2002) demonstraram que o mecanismo de indução é bastante complexo, como os resultados experimentais de indução por
diversos metais vinham sugerindo. O Zn2+ é necessário apenas para a ligação do
MTF-1 (uma proteína zinc-finger) com os elementos cis- no DNA na região promotora do gene da MT.
A presença de metais (e estressores) ativa uma série de cascatas de sinalização celular que levam a fosforilação de resíduos de MTF-1. De acordo com os autores, vias de PKC, Caseína cinase II, tirosina-cinase e Ca2+ estão envolvidas no controle da expressão. O tipo e a quantidade do metal induzem a fosforilação de MTF1 em múltiplos resíduos de Serina por diferentes vias, produzindo um “ajuste fino” na indução da MT (Rebelo, 2004).
Os promotores do gene da MT humana possuem outros elementos de resposta, incluindo elementos de aumento de nível basal, GC-box, elementos de resposta a interferon, elementos de resposta a agentes promotores de tumores (TPA) e sítios de ligação a proteína ativadora 2 (AP2) (Haq; Mahoney; Koropatnick, 2003; Klaassen; Liu; Choudhuri, 1999 apud Müller 2004). Outros metais ,como Cd e Hg, competem com o Zn na ligação com as metalotioneínas. Como eles apresentam maior afinidade pela proteína, eles induziriam a síntese de RNA mensageiro (RNAm) de MT pela liberação de Zn ligado ao fator no citoplasma (Roesijadi,1996).
Segundo Tanguy e Moraga (2001), a região central do MRE é conservada entre as espécies, enquanto os nucleotídeos que a flanqueiam apresentam divergências. Os genes de MT possuem cópias múltiplas dos MRE, os quais podem agir cooperativamente. Ainda segundo estes mesmos autores, o número de cópias dos MRE poderia ter um papel na regulação da ativação da transcrição. O MTF-1 foi descrito em 1988 como uma proteína ligante ao MRE que necessitava de altos níveis de Zn para sua ligação ao DNA (Westin & Schaffner, 1988). O gene do MTF-1 humano codifica uma proteína de 753 aminoácidos. Ela contém, na região N-terminal, 6 motivos Cys2-His2, chamados de “zinc finger prints”, que intermediam a ligação da proteína ao DNA e pelo menos um dos motivos tem características que sugerem uma capacidade da proteína de modular a atividade
transcricional em resposta aos níveis intercelulares de Zn. Os metais traço (com exceção do zinco) que entram na célula substituem o zinco de proteínas de armazenamento intra e extracelulares, aumentando a concentração de Zn livre disponível para a ativação do MTF-1. Além disso, metais como o Cd, podem causar estresse oxidativo na célula e ativar a síntese de MT através dos ARE - elementos de resposta a antioxidantes - (Haq; Mahoney; Koropatnick, 2003 apud Müller, 2004).
Figura 2 : Modelo da indução da expressão do gene da metalotioneína. Me: Metal.
PM: proteína reguladora de metais (por exemplo, metalotioneína). Zn: zinco. ARE: elemento de resposta antioxidante. E Box: elemento cis associado ao fator regulatório upstream. MTF-1: fator de transcrição por metais (Haq; Mahoney; Koropatnick., 2003 apud Müller, 2004).
A indução de MT por agentes quelantes, em fígado e rim, também ocorre. Os agentes quelantes podem induzir a síntese de metalotioneína indiretamente pela
alteração na homeostase de metais endógenos essenciais; os quelantes podem aumentar a capacitação hepática de metais essenciais devido a sua redistribuição, o que poderia estimular a síntese de MT; devido ao caráter lipofílico de alguns quelantes, estes poderiam agir intracelularmente e induzir a síntese de metalotioneínas (Goering, et al. 1985).
2. Descrição da área de estudo:
A área de estudo compreende uma região de intensa atividade petroquímica, situada na região metropolitana de Salvador, a cerca de 56 km da capital do Estado da Bahia, onde se instalaram diversas indústrias do ramo petroleiro, que iniciaram sua operação na década de 70, e vêm operando e aumentando, desde então, a sua produção (First et al., 1991). Atualmente as indústrias buscam a aplicação de metodologias mais eco-compatíveis em seus processos produtivos, objetivando minimizar os impactos proporcionados ao meio ambiente.
Uma das alternativas é diminuir o uso de água limpa, tentando o reuso da massa hídrica de bacias de contenção, por exemplo. O reaproveitamento da água destas bacias pode ser a alternativa viável, mas requer estudos de diagnóstico e biomonitoramento eficientes para a sua implementação.
Figura 3. Foto aérea da Bacia de Contenção de Efluentes (Fonte: CETREL).
Estas bacias receptoras vem recebendo efluentes do “sistema não-orgânico” há vários anos (lixiviação de pátios, água de chuva, etc) que podem estar carreando poluentes prioritários, de longa meia vida.
O trabalho teve como principal objetivo avaliar a biodisponibilidade de metais traços na água e no sedimento destas bacias, através da utilização da Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus, Linnaeus, 1758) como organismo-teste.
3. Objetivos
3. 1. Objetivo Geral:
Contribuir para a determinação da qualidade da água das bacias de contenção de efluentes pela avaliação da biodisponibilidade de metais na água e no sedimento superficial.
3. 2. Objetivos Específicos:
1- Quantificar a indução de metalotioneínas (proteínas de estresse) como mecanismo compensatório e defensivo de poluição por metais traços (Cd, Hg e Zn), e indicador da presença destes metais, em concentrações capazes de causar efeitos nocivos em organismos aquáticos;
2- Avaliar a eficiência da técnica de expressão das metalotioneínas como instrumento de avaliação da qualidade da água em corpos receptores industriais.
4. Material e Métodos
4. 1. Organismos-teste
A escolha, bem como a manutenção e o cultivo de organismos aquáticos, se revestem da mesma importância atribuída aos métodos para avaliar efeitos tóxicos de poluentes a esses organismos. Estes aspectos, desde que não atentamente observados, podem influenciar tanto a confiabilidade dos resultados analíticos obtidos, como a comparação dos resultados entre os diferentes grupos de organismos testados (Domingues & Bertoletti, 2006)
A utilização de peixes em modelos experimentais é amplamente aplicada na avaliação da integridade de ecossistemas aquáticos e de patologias associadas ao efeito tóxico de poluentes presentes no meio ambiente. A Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus, Linnaeus, 1758) pertence a um dos mais importantes grupos de peixes reconhecidos como bons modelos biológicos, em virtude de sua fácil manipulação, criação, manutenção em laboratório e por possibilitar a avaliação de possíveis adaptações destes organismos a poluentes em estudos ecotoxicológicos. (Wu et al, 1999; Almeida et al.,2002)
Taxonomia: Reino Animalia Filo Chordatha Subfilo: Pisces Família: Cichlidae Subfamília: Pseudocrenilabrinae Classe: Actinopterygii Ordem: Perciformes Gênero: Oreochromis
Espécie: Oreochromis niloticus
4. 1. 1. Descrição e biologia da espécie:
A Tilápia é a denominação comum de uma grande gama de espécies de peixes ciclídeos que se distribuem originalmente do centro-sul da África até o norte da Síria (Popma & Phelps, 1998). Cerca de 22 espécies de tilápias são cultivadas no mundo, onde as espécies de maior potencial comercial são: a tilápia do nilo (Oreochromis niloticus), a tilápia mossâmbica (Oreochromis mossambicus), a tilápia azul (Oreochromis aureus) , Oreochromis maccrochir, Oreochromis
hornorum, Oreochromis galilaeus, Tilapia zillii e Tilapia rendalli (El-Sayed, 1999).
Das várias espécies que têm sido introduzidas, provavelmente a mais conhecida e abundante seja a tilápia-do-Nilo (Oreochromis niloticus) originária das bacias dos Rios Nilo, Chad e Níger.
Segundo Lovshin (1997), a distribuição das tilápias pelo mundo começou objetivando o cultivo de peixes para a subsistência em países em desenvolvimento. A primeira espécie introduzida em outros países foi a
Oreochromis mossambicus, porém, este organismo apresentou baixo rendimento
para a aquicultura (Lazard & Rognon, 1997). Entretanto, no final dos anos 70, a espécie Oreochromis niloticus demonstrou um elevado potencial nesta prática comercial, em vários sistemas de criação. (Lazard, 1984 apud Lazard & Rognon, 1997).
No Brasil, a Tilápia do Nilo foi introduzida na região Nordeste em 1971 e então distribuída pelo território brasileiro, destacando-se como a espécie mais cultivada no país. A Tilápia do Nilo é cultivada desde a Bacia do Rio Amazonas até o Rio Grande do Sul. O grande interesse pelo cultivo desta espécie, no sul e no sudoeste do país, apresentou um crescimento expressivo nos últimos anos pela introdução da tecnologia da reversão sexual e a prática da pesca esportiva. A tilápia é criada em diversos sistemas de cultivo, desde a cultura semi-intensiva em tanques, com suporte nutritivo proveniente de resíduos orgânicos de animais
como também em culturas intensivas, tipo “raceways” e tanques redes (Lovshin & Ciryno, 1998).
A Tilápia do Nilo é uma espécie onívora, apresentando um amplo espectro com relação à sua diversidade alimentar. Membros desta espécie podem sobreviver em condições ambientais adversas em virtude de seu grau de resistência à doenças, por sua baixa demanda respiratória e por tolerarem situação de hipoxia e altos níveis de amônia (Zhou et al., 1998).
Dos peixes de água doce cultivados, a tilápia é aquele de maior expressão. A tecnologia para produção de alevinos está bem desenvolvida. Machos e fêmeas reproduzem-se com facilidade em águas paradas, mas sobrevivem muito bem também nos rios. Esta espécie exótica apresenta grandes vantagens de produção, como crescimento rápido, rusticidade e bom sabor da carne, e está servindo como alvo de projetos nacionais de estímulo à piscicultura. Devido à sua grande adaptabilidade, têm alto potencial de colonização de novos ambientes, e medidas preventivas para sua propagação devem ser consideradas como condicionantes para sua produção.
4. 1. 2. Obtenção dos organismos-teste e procedimentos de amostragem:
Os organismos utilizados nos ensaios (juvenis de Tilápia do Nilo) foram obtidos através do Departamento Nacional de Obras contra as Secas (DNOCS), onde são criados sob condições controladas. As coletas foram realizadas em 4 campanhas amostrais(Abril, Maio, Junho e Dezembro de 2006).
A área amostral foi dividida em 5 locações (P1 a P5) sendo que os pontos P1 a P4 (pontos localizados na Bacia de Contenção de Efluentes 1) e o P5 localiza-se no interior da Bacia Contenção de Efluentes 2). Os pontos foram determinados após levantamento de dados preliminares pela equipe em função da localização e
importância dos mesmos para análise, devido às contribuições dos efluentes das empresas. O georeferenciamento destes pontos foi realizado com o GPS TRIMBLE GEOEXPLORER 3 e as coordenadas são expressas em UTM -Projeção Universal Transversal de Mercator – (Figura 5).
Figura 5. Foto georeferenciada da área de amostragem.
Foram coletadas amostras líquidas (efluente) e de sedimento em todos os pontos de amostragem, usando-se Garrafa de Van Dorn (Kramer et al., 1994) - Figura 6 e draga de Pettersen (Boyd, 1995) - Figura 7, respectivamente. As amostras coletadas foram levadas ao LABIOMAR, onde o trabalho experimental foi
realizado obedecendo a protocolos de testes existentes no laboratório (CETESB, 1990a; CETESB, 1990b; Nascimento, 2000; Nascimento, 2002).
P1- Borda oeste da Bacia de Contenção 1
(X:574.368.43/Y:8.601.863.59) P2 - Borda leste da Bacia de Contenção 1
(X:575.036.78/Y:8.602.061.69) P3 – Parte profunda da Bacia de Contenção 1 (X:574.839.77/Y: 8.602.131.93) P4 – Interior da Bacia de Contenção 1 (X:574.396.94/ Y:8.601.735.88) P5 - Bacia de Contenção 2 (X:569.472.52/Y:8.602.585.15)
Figura 6. Garrafa de Van Dorn: coleta das amostras líquidas.
4.2. Execução dos testes
4.2.1. Exposição dos organismos às amostras ambientais:
Os animais foram selecionados, com base no tamanho (9 - 13 cm) e peso (30 a 40 g). Esta seleção dá uma idéia aproximada da idade (fase juvenil) e maturidade dos animais. As tilápias foram expostas à água proveniente de diversos pontos das bacias de contenção, bem como ao sedimento, por um período de 24 horas, e com 5 réplicas, para cada ponto de amostragem, além de um ponto controle. Cada aquário (capacidade de 10L) continha 4 L de água (amostra) e um exemplar juvenil de tilápia. As amostras de sedimento foram dispostas em aquários sob as mesmas condições, com 300g de sedimento /aquário, perfazendo uma camada de 1,5cm coberta por 4L de água de diluição, cuja qualidade foi previamente analisada no laboratório (Figuras 8 e 9).
Figura 9. Montagem do teste com as amostras de sedimento: o peixe foi colocado
após decantação do sedimento.
4.2.2. Preparação do sobrenadante (centrifugação a 20.000G)
Após a exposição, os peixes foram sacrificados e a sua biometria e sexagem foram realizadas. Para cada peixe, o fígado foi extraído, lavado com solução de KCl 0,150M para a remoção de resíduos sanguíneos, congelado em nitrogênio líquido e armazenado em freezer -80ºC. Foram utilizados pools de fígados obtidos pelas réplicas de cada ponto de amostragem. Para a obtenção do homogeneizado, foi utilizado 0,5g do tecido dos pools, embebidos em 1,5mL da solução A+B (solução A: tampão para extração de tecido / solução B: inibidora de proteases). Este procedimento de mistura foi feito conforme exigências do prospecto do KIT MT PAGE TISSUE® produzido pela IKZUS ENVIRONMENT - Itália) suplementada com o 2-mercaptoetanol (agente anti-oxidante) através de um homogeneizador Janke & Kunkel modelo RW20 em condições de refrigeração adequadas. Alíquotas de 2mL foram transferidas para microtubos Eppendorfs®, previamente identificados e centrifugados a 20.000G por 40 minutos.
Figuras 10-15. Etapas seqüenciadas do processo experimental, desde a retirada
dos peixes dos aquários até a preservação dos pools de fígado de O. niloticus em nitrogênio líquido.
1 2
3 4
4.2.3. Determinação da indução de Metalotioneínas:
A detecção de metalotioneínas foi realizada pela técnica de Viarengo et al, 1997 adaptada para a utilização do Kit MT PAGE TISSUE® produzido pela IKZUS ENVIRONMENT- Itália, aliada a um ensaio eletroforético por luminescência, realizado no Laboratório de Radioisótopos Eduardo Penna Franca, Instituto de Biofísica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, seguindo os procedimentos descritos a seguir.
4.2.3.1. Precipitação das metalotioneínas:
Após a centrifugação, foi feita a transferência de uma alíquota de 300 µL do sobrenadante para outro microtubo de 2mL. Para a realização do procedimento de precipitação das metalotioneínas, foram adicionados 750µL de álcool etílico absoluto a -20ºC (solubilização de compostos polares) e 80µL de clorofórmio (dissolução de gordura – fase inferior) no microtubo contendo o homogeneizado. Esta mistura foi submetida à agitação em um homogeneizador e centrifugada a 6000G por 10 minutos a 4ºC.
Em seguida, foi recolhido 300µL do sobrenadante e transferido para um novo microtubo, onde foram adicionados 900µL de álcool etílico absoluto a -20ºC e 50µL de HCl a 37% (reage com grupos NH2 , tornando o composto mais polar).
Estes tubos foram mantidos em um freezer a -20ºC por 1h para finalizar o processo de precipitação e centrifugados a 6000G por 10 minutos à 4ºC. O “pellet” obtido neste processo compreende a massa de metalotioneína precipitada presente no homogeneizado de fígado.
Todo o sobrenadante foi cuidadosamente descartado, posicionando-se os tubos de forma invertida. O “pellet” de proteína foi então lavado com 900µL de álcool
etílico absoluto a -20ºC, 15µL de clorofórmio e 150µL da solução C (tampão de ressuspensão), onde o excesso de álcool foi drenado com o uso de uma micropipeta. O “pellet” foi ressuspenso em 12,5µL da solução C (tampão de ressuspensão), até a completa dissolução da massa de proteína (esse procedimento foi feito com uma micropipeta Eppendorf de 20µL).
As amostras foram incubadas em banho seco a 65ºC por 15 minutos. Após esse intervalo, foi adicionado aos tubos 1µL da solução D (que corresponde ao corante fluorescente – Bromobimano - que apresenta alta especificidade e sensibilidade com os grupos sulfidrila presentes na molécula da metalotioneína, emitindo fluorescência mediante transluminação ultra-violeta) enquanto as amostras ainda permaneciam a 65ºC. Todo o conteúdo dos microtubos foi misturado e mantido a temperatura ambiente por 5 minutos. Logo em seguida, adicionou-se 13µL da solução E (tampão de corrida) suplementada com o β-mercaptoetanol (concentração de 200uM). Os tubos foram centrifugados a 10.000G por 1 minuto a 4ºC.
4.2.3.2. Detecção das metalotioneínas: eletroforese em gel Tris/Tricina SDS-PAGE.
Um gel Tris/Tricina SDS-PAGE de 1,5mm apropriado para eletroforese consiste de: Gel Separador (10%T 3% C) e Gel de Empilhamento (4% T 3% C). O preparo das substâncias e do gel SDS-PAGE para a corrida de eletroforese seguiu o protocolo estabelecido para o método.
O gel foi carregado com três concentrações do padrão de MT (3, 9 e 12µL, previamente tratado com o corante fluorescente, sob as mesmas condições exigidas para o homogeneizado de fígado) e com 20µL do precipitado de metalotioneína. Realizou-se eletroforese a 35µA (80V) por 2 horas e meia sob condições de refrigeração adequadas e sem exposição direta à luz. Após esse período, o gel foi transferido para uma plataforma plástica e fixado com metanol e
ácido acético (proporção de 3:1) por 30 minutos sob agitação constante. O gel fixado foi, então, lavado com água destilada. As bandas de metalotioneínas formadas no gel foram visualizadas e digitalizadas em um transiluminador de UV (Fisher Scientific, modelo FB-TI-614A) acoplado a um sistema de digitalização (Software VisionWorks® LS Image Acquisition and Analysis Software, versão 97-0186-02 e máquina digital Olympus®) instalado em um laptop (Dell®) – Figura 16.
Figura 16. Transluminador UV acoplado ao sistema de digitalização de imagem.
Os géis Tris/Tricina SDS PAGE constavam de 10 “slots”, onde os três primeiros correspondiam as diferentes concentrações do padrão de MT presentes no kit (3µL, 9µL e 12µL). Nos demais “slots”, foram aplicadas alíquotas de 20µL de cada fração amostral tratada preparada para a corrida, expostos as amostras ambientais (água e sedimento). A Figura 17 mostra o gel Tris/Tricina SDS-PAGE com as bandas de metalotioneínas marcadas com o corante fluorescente bromobimano.
Figura 17. Gel Tris/Tricina SDS-PAGE com bandas de metalotioneínas marcadas
pelo Bromobimano.
4.2.3.3. Quantificação das metalotioneínas:
A quantificação relativa das metalotioneínas foi realizada por densitometria das bandas através do uso do programa IMAGE J (disponível para download em
www.rsb.info.nih.gov/ij/), que mede o número e a intensidade dos píxeis da área
das bandas formadas nas fotos digitalizadas dos géis SDS-PAGE. Realizou-se o cálculo para a determinação dos valores reais de fluorescência das bandas formadas (obtido pela diferença das áreas das bandas formadas e de seus respectivos “background”). Para a obtenção das concentrações totais de metalotionéinas (µg. µL -1) nas amostras foi realizado um cálculo de regressão (determinação da curva padrão de cada gel com suas respectivas equações da reta e coeficientes de correlação) - Figura 18.
Figura 18. Equações da reta e seus respectivos coeficientes de correlação obtidos
através de regressão.
Utilizando como exemplo a equação Y= 71250x + 3256,7, temos: • X = nº de píxeis da banda de MT (calculado no IMAGE J); • Y= Proteína (Metalotioneína em µg. µL -1)
4.2.4. Dosagem de Proteínas Totais:
Foi realizada, concomitantemente aos ensaios, a determinação de proteínas totais em todas as amostras de fígado dos peixes pela metodologia de Bradford (1976) por espectrofotometria.
Figuras 19 e 20. Determinação das proteínas totais (Bradford, 1976) em
4.2.5. Análise dos parâmetros físico-químicos:
Parâmetros físico-químicos como temperatura, pH, salinidade e oxigênio dissolvido foram determinados através de aparelho multiparâmetro (marca Multiline, modelo P4/F SET-3). Os níveis de nitrato, amônia e dureza da água (Standard Methods, 1995), além da determinação de carbono orgânico por calcinação (Luczak et al., 1997) e da granulometria (EMBRAPA, 1997) foram determinadas para garantir que os resultados obtidos nos mesmos refletissem a ação tóxica dos poluentes e não uma provável variação desses parâmetros. Todas as amostras ambientais líquidas e de sedimento foram submetidas à determinação da concentração de metais traços por espectrofotometria de absorção atômica através do Método MESP 110 – ASTM D5258/02 no Laboratório de Espectroscopia do Centro de Tecnologia Industrial Pedro Ribeiro – CETIND (Salvador – Bahia).
4.2.6. Controle positivo:
Com o intuito de se estabelecer um padrão de referência da indução de metalotioneínas em peixes, foi realizado um experimento de exposição dos juvenis de O. niloticus a uma substância de referência, o cloreto de cádmio (CdCl2. H2O),
em concentrações de 0,5 µg/L e 2,5 µg /L com 5 réplicas para cada concentração.
5. Tratamento estatístico:
As ferramentas estatísticas utilizadas para relacionar a indução de metalotioneínas com as concentrações de metais-traço nas amostras ambientais foram análise multivariada e análise de correspondência múltipla (MCA).
6. Resultados e Discussão:
6.1. Parâmetros físico-químicos
Durante todos os testes realizados, os parâmetros ambientais controlados nos aquários (Temperatura (Tº), pH, Saliniddade (S%0), Oxigênio Dissolvido (OD),
Nitrito (N-NO2), Nitrato (N-NH3), carbono orgânico, dureza e granulometria do
sedimento) raramente atingiram ou ultrapassaram os padrões estabelecidos (CONAMA 357/2005); conseqüentemente, considera-se que não tenham interferido nos resultados das determinações ecotoxicológicas (Tabelas 1 e 2).
Tabela 1. Valores de parâmetros físico-químicos nas amostras líquidas e valores
limites estabelecidos pela CONAMA 357/2005.
Campanha Parâmetro Limite Controle P1 P2 P3 P4 P5
O.D mg/L > 4 8,3 7,2 7,5 8,0 6,6 8,0 pH < 8-8,5 7,3 7,2 6,9 7,1 7,3 7,5 T Cº >27-30 26 27 26 26 26 26 Salinidade (ppt) <0,5 – 1 0 0 1 0 1 0 Amônia mg/N-NH3/L <0,45-2 0,1 0,2 0,1 0,3 0,4 0,2 Nitrito mg N - NO2/L <1 0,0 0,0 0 0,1 0,3 0,1 1
Dureza da água (ppm) <300 semi-duras
O.D mg/L > 4 8,0 7,6 7,4 7,0 6,5 7,1 pH < 8-8,5 7,0 6,0 6,8 7,1 7,1 6,4 T Cº >27-30 25 25 25 25 25 25 Salinidade (ppt) <0,5 – 1 0 0 0 0 0 0 Amônia mg/N-NH3/L <0,45-2 2,1 2,2 2,1 2,0 1,8 1,8 Nitrito mg N - NO2/L <1 0,0 0,2 1,6 1,7 0,5 0,0 2
Dureza da água (ppm) <300 semi-duras
O.D mg/L > 4 7,0 8,0 7,7 7,6 7,7 7,8 pH < 8-8,5 6,1 6,0 7,0 6,9 6,8 6,3 T Cº >27-30 25 25 25 25 25 25 Salinidade (ppt) <0,5 – 1 0 1 1 1 1 0 Amônia mg/N-NH3/L <0,45-2 1,5 2,0 1,8 0,9 1,3 1,2 Nitrito mg N - NO2/L <1 0,1 0,8 2,2 2,3 1,5 0,1 3
Tabela 2. Valores de parâmetros físico-químicos nas amostras de sedimento e
valores limites estabelecidos pela CONAMA 344/2004.
Campanha Parâmetro Limite Controle P1 P2 P3 P4 P5
O.D mg/L > 4 8,2 7,8 6,5 6,6 7,0 7,4 pH (laboratório) < 8-8,5 6,8 7,1 8,0 7,6 7,1 6,8 T Cº >27-30 27 27 27 26 27 27 Salinidade (ppt) <0,5 – 1 1 0 0 1 1 0 Amônia mg/N-NH3/L <0,45-2 0,7 0,4 0,1 0,6 0,2 1,0 Nitrito mg N - NO2/L <1 0,1 0,0 0,0 0,1 0,6 0,2 1
Dureza da água (ppm) <300 Semi-dura
O.D mg/L > 4 8,0 7,7 7,7 7,1 7,2 7,8 pH (laboratório) < 8-8,5 6,7 6,5 7,1 7,1 6,6 6,7 T Cº >27-30 26 26 27 27 27 27 Salinidade (ppt) <0,5 – 1 1 1 0 0 0 0 Amônia mg/N-NH3/L <0,45-2 2,7 2,2 2,4 2,5 2,2 1,4 Nitrito mg N - NO2/L <1 0 0,5 0,2 0,1 0,1 0 2
Dureza da água (ppm) <300 Semi-dura
O.D mg/L > 4 8,0 7,6 7,8 7,7 7,8 7,2 pH (laboratório) < 8-8,5 6,4 5,7 7,2 7 6,4 6,4 T Cº >27-30 25 25 25 25 25 25 Salinidade (ppt) <0,5 – 1 0 1 1 0 1 0 Amônia mg/N-NH3/L <0,45-2 2,2 2,0 1,6 2,0 1,7 1,8 Nitrito mg N - NO2/L <1 0,4 0,1 0,2 0,1 0,3 0,1 3
Dureza da água (ppm) <300 Semi-dura
6.2. Eletroforese em gel Tris/Tricina SDS-PAGE (amostras líquidas e de sedimento):
Os “pellets” das amostras de fígado de O. niloticus, obtidos de animais do grupo controle (expostos a amostras de áreas não impactadas) e dos grupos expostos as amostras líquidas e de sedimento das bacias de contenção de efluentes petroquímicos, foram submetidos à eletroforese em gradiente SDS - PAGE, com o objetivo de detectar o perfil de indução de metalotioneínas nestes diferentes tratamentos de exposição.
A intensidade da fluorescência das bandas está diretamente relacionada com o grau de indução de metalotioneínas nos fígados expostos as amostras ambientais. Através da análise do perfil eletroforético dos géis, foram evidenciados diferentes picos de indução de metalotioneínas, constatados pelos diferentes níveis de
intensidade da fluorescência das bandas formadas. Este fato está relacionado com as diferentes concentrações e tipos de metais-traços presentes nas amostras testadas das diferentes alocações amostrais.
6.3. Indução de metalotioneínas em fígado de O. niloticus expostos as amostras líquidas:
A partir da execução das análises, foram evidenciados diferentes níveis de indução de metalotioneínas nos diversos pontos de amostragem das bacias de contenção. As análises químicas realizadas nas amostras de água superficial revelaram a presença de metais traços essenciais e não essenciais como: Mercúrio , Zinco, Chumbo ,Cromo , Ferro ,Manganês e Alumínio. As respostas biológicas encontradas nos ensaios indicativas de toxicidade fundamentaram-se, principalmente, nas concentrações de metais traços não essenciais (Hg, Pb e Cd) presentes nas amostras analisadas.
Dentre os pontos amostrados na bacia de contenção de efluentes 1, as estações P1 e P2 (Figura 21) apresentaram os maiores níveis de indução de metalotioneínas. É importante salientar que estes pontos amostrais estão localizados nas margens da bacia receptora de efluentes 1, onde o processo de revolvimento do sedimento pode explicar os altos índices de indução de MT nestas estações, por conta da translocação das espécies químicas metálicas para a coluna d’água. Os demais pontos analisados neste mesmo corpo hídrico receptor não apresentaram diferenças significativas quando comparados com o controle (área não impactada).
A bacia receptora de efluentes 2 apresentou um baixo índice de indução de metalotioneínas , que pode ser explicado pelas altas concentrações de cobre detectadas neste local, que inibiram a indução deste biomarcador ( 0,156 µg/L , 0,16 µg/L e 0,19 µg/L , respectivamente
Figura 21. Resultados de MT (µg. µL-1)/PTN total (mg.mL) em fígado de O.
niloticus expostos à água das bacias de contenção.
Em algumas estações, foi constatada uma maior magnitude de resposta biológica utilizando à indução das metalotioneínas em fígados de peixes expostos as amostras de água e sedimento. Para avaliar a relação destes dados com tantos valores baixos e não-detectáveis, os resultados foram categorizados e uma análise de correspondência múltipla foi realizada. A categorização tentou dividir os valores das concentrações em 3 categorias: ND, valores não detectáveis ou perto do limite de detecção; valores baixo-médio e altos, essas duas últimas ordens de grandeza são superiores às outras.
A Figura 22 mostra que as maiores concentrações de metais encontradas na água corresponderam aos maiores níveis de indução de metalotioneínas, corroborando o fato de que espécies metálicas solúveis são fatores importantes para a indução de metalotioneínas. Ambos os eixos parecem ser influenciados pela presença de cobre. Em relação ao primeiro eixo (explicando 27% dos resultados), as amostras que apresentaram as maiores concentrações de cobre estão situadas à direita. Todas elas pertencem ao P5, que corresponderam perfeitamente com as concentrações de cobre superiores a 2000 μg.g-1 (categoria 20). As amostras que não apresentaram concentrações detectáveis deste metal,
estão na porção inferior do segundo eixo (17%), influenciando a separação das estações P1-P4. Valores intermediários (MT: 5) e elevados (MT: 20) de indução de metalotioneína foram observados no P2, aliados as maiores concentrações de Zn e especialmente Hg, um forte indutor de MT.
Figura 22. Análise de correspondência múltipla entre concentração de metais nas
amostras líquidas e a indução de metalotioneínas no fígado de O. niloticus expostos à referida matriz amostral. Altas concentrações em preto, pontos de amostragem em vermelho.
6.4. Indução de metalotioneínas em fígado de O. niloticus expostos as amostras de sedimento:
Com relação às análises do sedimento, os resultados obtidos pela medida de indução de metalotioneínas (Figura 23) também constataram diferentes padrões
de indução para este biomarcador. Destacam-se os níveis de indução de metalotioneínas no ponto 2 (o mais tóxico). O ponto 5, por ser um corpo receptor de efluentes ricos em cobre, também apresentou níveis significativos de indução de metalotioneínas. Os demais pontos amostrados, apesar de evidenciarem a indução deste biomarcador, não apresentaram diferenças significativas quando comparados ao controle. As concentrações de metais detectadas nas amostras de sedimento embasam as respostas biológicas (indução de metalotioneínas) encontradas nos testes.
Figura 23. Resultados de MT (µg. µL-1)/PTN total (mg.mL) em fígado de O.
niloticus expostos ao sedimento das bacia de contenção.
Para os metais no sedimento, apenas o Cr, Ni, Zn, Cd, Cu apresentaram concentrações expressivas. A Figura 24 mostra a MCA para a concentração de metais no sedimento e indução de metalotioneínas em fígado de peixes expostos aos sedimentos das bacias de contenção. O primeiro eixo (26% potencial explicativo), foi caracterizado pela presença de diferentes metais, com Cd empurrando o eixo para a direita. A concentração de Cu foi o principal fator a contribuir para o segundo eixo (18%), com maiores concentrações na extremidade inferior. Pequenas concentrações de metal (não detectável - ND ou abaixo do limite de detecção) estavam concentradas na origem dos dois eixos, indicando
baixo potencial para a distinção das estações, levando-se em consideração as concentrações destes elementos. Apesar do maior nível de indução de MT estar frequentemente relacionado ao P2, a indução de MT não foi suficiente para distinguir as estações. Provavelmente, os metais encontrados no sedimento estavam sob a forma química e não sob a forma solúvel. Consequentemente, durante o período da exposição não exerceram influência na indução de metalotioneínas nos fígados das Tilápias.
Figura 24. Análise de correspondência múltipla entre concentração de metais nas
amostras de sedimento e a indução de metalotioneínas no fígado de O. niloticus expostos à referida matriz amostral. Altas concentrações em preto, pontos de amostragem em vermelho.
6.5. Identificação dos metais-traços:
As análises químicas foram realizadas em todas as amostras ambientais líquidas e de sedimento sendo submetidas à determinação da concentração de metais
traços por espectroscopia através do Método MESP 110 – ASTM D5258/02 no Laboratório de Espectroscopia do Centro de Tecnologia Industrial Pedro Ribeiro – CETIND.
Os resultados encontrados nas amostras líquidas foram comparados com a legislação CONAMA Nº 357 de 17 de Janeiro de 2005, que dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes. Os resultados encontrados nas amostras de sedimento foram comparados com a legislação CONAMA Nº 344 de 25 de março de 2004 que estabelece as diretrizes gerais e os procedimentos mínimos para a avaliação do material a ser dragado em águas jurisdicionais brasileiras, e dá outras providências, visando estabelecer o grau de contaminação da água das bacias de contenção e de seus sedimentos.
6.5.1. Nas amostras líquidas
As análises revelaram a presença de metais-traços essenciais e não essenciais em diferentes concentrações. Dentre estes elementos, destacou-se a presença de ferro, zinco, manganês, cobre e, principalmente, alumínio em altas concentrações na maioria das amostras coletadas. Os outros metais detectados apresentaram concentrações acima das estabelecidas pela legislação em vigor (Tabela 3).
Este padrão de resposta embasa os diferentes níveis de indução de metalotioneínas nos fígados de O. niloticus expostos aos diferentes tratamentos.
6.5.2. Nas amostras de sedimento:
As análises revelaram a presença de metais-traços essenciais (Cu, Zn) e não essenciais (Cr, Cd, Ni, Pb) em diferentes concentrações. Dentre eles, destacou-se
a presença de Cu, Cd e Zn em todas as amostras testadas. As concentrações nominais destes elementos mostraram-se bem mais elevadas quando comparadas com as concentrações presentes nas amostras líquidas (Tabela 4). Estas constatações demonstram que o panorama de toxicidade deste ambiente é bem claro: os metais-traços não se encontram biodisponíveis na coluna d’agua. Eles encontram-se aderidos as partículas de sedimento das bacias de contenção.
Tabela 3. Resultado da análise dos metais nas amostras líquidas e valores limites
estabelecidos pela CONAMA 357/2005 (coluna sombreada).
Campanha Parâmetro Limite P1 P2 P3 P4 P5 Mercúrio (ug/L) <0,0002 0,25 0,56 0,38 0,10 0,08 Cobre (ug/L) <0,009 0,039 0,072 0,069 0,030 0,156 Chumbo (ug/L) <0,01 0,049 0,051 0,053 0,061 0,026 Zinco (ug/L) <0,18 0,128 0,099 0,079 0,120 0,057 Níquel (ug/L) <0,025 0,032 0,044 0,046 0,031 0,027 Cromo (ug/L) <0,05 0,012 0,013 0,012 0,014 0,012 Ferro (ug/L) <0,3 0,818 0,349 0,321 0,609 0,640 Manganês (ug/L)) <0,1 0,078 0,066 0,055 0,078 0,035 Alumínio (ug/L) <0,1 4,164 2,072 1,496 3,374 0,652 Cádmio (ug/L) <0,001 0 0 0 0 0 1 Arsênio (ug/L) <0,01 0 0 0 0 0 Mercúrio (ug/L) <0,0002 0,76 0,44 0,67 0,50 N/D Cobre (mg/L) <0,009 0,05 0,04 0,05 0,03 0,16 Chumbo (ug/L) <0,01 0 0 0 0 0 Zinco (ug/L) <0,18 0,12 0,05 0,04 0,06 0,04 Níquel (ug/L) <0,025 0,01 0,01 0,02 0,01 0,01 Cromo (ug/L) <0,05 0 0 0 0 0 Ferro (ug/L) <0,3 2,44 1,22 0,61 1,15 0,24 Manganês (ug/L) <0,1 0,12 0,05 0,05 0,06 0,02 Alumínio (ug/L) <0,1 10,75 4,59 1,74 3,15 19,28 Cádmio (ug/L) <0,001 0 0 0 0 0 2 Arsênio (ug/L) <0,01 0 0 44 0 55 Mercúrio (ug/L) <0,0002 0,56 1,28 0,84 0,17 0 Cobre (ug/L) <0,009 0,03 0,03 0,03 0 0,19 Chumbo (ug/L) <0,01 0,04 0,04 0 0 0,04 Zinco (ug/L) <0,18 0,10 0,06 0,04 0,05 0,08 Níquel (ug/L) <0,025 0,05 0,05 0,06 0,05 0,06 Cromo (ug/L) <0,05 0 0 0 0 0 Ferro (ug/L) <0,3 0,99 0,50 0,40 0,57 0,22 Manganês (ug/L) <0,1 0,10 0,05 0,04 0,05 0,03 Alumínio ug/L) <0,1 3,34 0,77 0,62 1,53 0,44 Cádmio (ug/L) <0,001 0 0 0 0 0 3 Arsênio (ug/L) <0,01 0 0 0 0 0
Tabela 4. Resultado da análise dos metais nas amostras de sedimento e valores
limites estabelecidos pela CONAMA 344/2004 (coluna sombreada).
Campanha Parâmetro Limite P1 P2 P3 P4 P5
Cobre (ug/g) 2,5 (mg/Kg) 129,0 85,20 106,0 64,80 6,80 Cromo (ug/g) 2,5(mg/Kg) 7,0 12,20 33,90 2,400 3,000 Cádmio (ug/g) 1,0(mg/Kg) 484,0 1090,0 27,60 564,0 14,20 Níquel (ug/g) 2,5(mg/Kg) 23,50 148,0 356,0 30,30 51,30 Chumbo (ug/g) 2,5(mg/Kg) 152,0 120,0 207,0 136,0 22,20 1 Zinco (ug/g) 2,5(mg/Kg) 228,0 1650,0 3530,0 174,0 170,0 Cobre (ug/g) 2,5(mg/Kg) 83,0 88,0 113,0 50,0 67,0 Cromo (ug/g) 2,5(mg/Kg) 13,60 18,400 16,600 10,900 19,500 Cádmio (ug/g) 1,0(mg/Kg) 1270 1810,0 3160,0 772,0 19300 Níquel (ug/g) 2,5(mg/Kg) 245,0 245,0 284,0 69,0 686,0 Chumbo (ug/g) 2,5(mg/Kg) 213,0 201,0 222,0 112,0 395,00 2 Zinco (ug/g) 2,5(mg/Kg) 1870 2010,0 3340,0 918,0 1190,0 Cobre (ug/g) 2,5(mg/Kg) 1095 2530 3970 1500 1110 Cromo (ug/g) 2,5(mg/Kg) 131 122,0 95,3 99,2 2,5 Cádmio (ug/g) 1,0(mg/Kg) 9,0 24,0 42,2 15,2 0,0 Níquel (ug/g) 2,5(mg/Kg) 212,5 217 401 160,0 23,9 Chumbo (ug/g) 2,5(mg/Kg) 193 238 223 211 30,4 3 Zinco (ug/g) 2,5(mg/Kg) 1065 2700 4970 1300 63,5
A presença de metais traços não essenciais (Al, Cu, Cr, Ni, Pb, Cd) e essenciais (Fe, Zn, Mn) nas amostras líquidas e de sedimento foi responsável pelos diferentes níveis de indução de metalotioneinas nos pontos amostrados relacionados com a atividade de detoxificação celular desenvolvida pelos organismos expostos.
Este padrão de resposta biológica, verificada no ponto 1, nas amostras líquidas, (os mais tóxicos) e nos pontos 1, 2 e 5 nas amostras de sedimento,corresponde à ação tóxica exercida pela presença destes metais no ambiente. Os diferentes níveis de indução de metalotioneínas relacionados à ocorrência de metais traços essenciais (Cu, Zn, Fe, Mn) verificados nas amostras líquidas e nas amostras de sedimento, são atribuídos ao processo de homeostase celular que, conseqüentemente, indica a presença de concentrações destes metais no
