UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
Rodrigo Fabrizzio Inacio
Regulação de expressão e da via de transdução de
sinal do complexo de histocompatibilidade principal de
classe I (MHC I) em células PC12.
Campinas 2015
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por estar sempre comigo e me abençoar nos momentos felizes e difíceis do dia a dia.
Agradeço ao Professor Alexandre Leite Rodrigues Oliveira, um excelente amigo e orientador. Agradeço por ter me acompanhado por todo esse tempo e passando a serenidade para resolver os contratempos.
Agradeço a minha esposa Daiana Bernardi que sempre esteve comigo nesta fase do doutorado, sempre me apoiando e cobrando atenção. (Amo Você)
Agradeço minha família, em especial a minha super Mãe e ao meu Pai (em memória) que teve seu caminho traçado por Deus. Certeza que ele esteja me vendo e muito feliz.
Agradeço minha tiaMarice e minha Vó Luiza, a qual sempre com sua lucidez me trouxe palavras importantes com seus conselhos e histórias (profunda experiência de vida).
Agradeço a minha irmã Isley e meu cunhado Jamil, por sempre ajudarem e ainda trazer a luz a 2 lindos filhos, meus sobrinhos, Ana Luiza e Pedro Henrique.
Aos grandes “figuras” do Laboratório (Gustavo, Matheus, Giuliano). Aos amigos e amigas do laboratório de Regeneração Nervosa (Simone, Patrícia, Gabriela, André, Mateus, Roya, Marta, Greice, Melissa, Natália, Carol, Felipe, Giuliana; Roberta, Luciana, Gabriela, Marta, Sergy, Aline, Juliana). Obrigado pela dedicação e ajuda, carinho e respeito, que sempre tive de cada um.
Agradeço ao meu amigo Giuliano que esteve sempre comigo nessa empreitada. Ao Matheus, grande amigo, desde sempre, que esteve sempre junto, desde da época de graduação.
Aos técnicos do laboratório, Marco Aurélio, Nori, pelos auxílios em todas as necessidades dos laboratórios. Dona Marlene, Toni e Walter por estarem sempre à disposição para nos ajudar.
A coordenação de Pós-graduação, em especial a Lílian pela atenção prestada e aos puxões de orelha com os prazos.
Aos amigos dos outros laboratórios Rafael Burgos, Luiz Henrique, Aline Tucupi e Túlio.
A ProfHenrique, que co-corientoueste trabalho. Obrigado pela atenção prestada.
A Maria Eugênia, do LNBio/CNPEM pela grande colocaboração com a citometria de Fluxo.
Aos professores daÁrea de Anatomia: Profa. Maria Júlia, Profa. Valéria, Profa. Elaine, Profa. Evanisi eao Prof. Humberto.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural do Instituto de Biologia da Unicamp.
A todos amigos daárea de anatomia de anatomia, departamento de biologia Celular e Estrutural.
Resumo
Evidências que a expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) por neurônios influencia na plasticidade sináptica, abriu a possibilidade do melhor entendimento desse processo, bem como o potencial de modificá-lo como parte de estratégias pró-regenerativas do Sistema Nervoso. Nesse sentido, a existência de uma subunidade sinalizadora do receptor de células T no Sistema Nervoso Central, que ativa segundos mensageiros capazes de interferir na estabilidade sináptica, denominada CD3 ζ, tem sido o alvo para estudar a deflagração do sinal, bem como a modulação da expressão de MHC-I. O CD3 ζ tambémparticipa de um importante papel na diferenciação neuronal e na morfogênese. Outra proposta para amodulação do MHC-I seria através do COUP-TF II, tendo este umpapel importante na regulação de sua expressão, uma vez que as células submetidas ao silenciamento gênico para COUP-TFII tiveram aumento significativo na expressão de MHC-I. Nossos resultados mostraram que o aumento do MHC-I decorrente da super expressão CD3 ζ refletiu na retração sináptica. Já as células que tiveram o gene CD3 ζsilenciado, apresentaram intensa arborização e diminuição da expressão de MHC-I. Resultados obtidos através das análises do COUP-TF II, demonstraram reflexos positivosmodulatórios, já que o aumento desse fator de transcrição trouxe consigo diminuição do MHC-I e alterações na diferenciação celular, demonstradas pela intensa arborização dos neuritos. Já com as células que tiveram o gene COUP-TF II silenciado, observou-se aumento da expressão de MHC-I e, consequentemente, menor arborização, decorrente da retração neurítica. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que tanto o CD3 ζquanto o COUP-TF II tem papel importante na modulação do MHC-I, o que reflete de forma significativa na plasticidade sináptica.
Abstract
The large number of evidences that the expression of the major histocompatibility complex class I (MHC I) by neurons influences the synaptic plasticity opened the possibility of better understanding this process, as well as the potential to modify it as a part of pro-regenerative strategies of the nervous system. In this sense, the existence of a signaling subunit of T cell receptor in the central nervous system is well documented. It activates second messengers which are capable to interfere in the synaptic stability, one of them denominated CD3 ζ. In the present study we targeted such molecule to study the signal deflagration as well as the modulation of MHC-I expression. CD3 ζ has also an important role in neuronal differentiation and morphogenesis. Another objective of the present work was to evaluate the possible role of COUP-TF II on MHC-I modulation. We show that cells which were submitted to gene silencing for COUP-TFII presented significant increase in MHC-I expression. Our results showed that the increase of MHC-I, resulting from the overexpression of CD3 ζ, reflected in the synaptic retraction, considering that cells which had CD3 ζ gene silenced, presented intense arborization and decreased MHC-I expression. Results obtained with COUP-TF II analysis demonstrated positive modulatory effects, once the upregulation of such transcription factor caused decrease in MHC-I levels and alterations in cell differentiation, demonstrated by the intense neurite branching. COUP-TF II silenced cells displayed MHC-I upregulation and consequently decreased branching pattern, resulting from neurite retraction. The results obtained in the present work demonstrate that CD3 ζ and the COUP-TF II have important roles on MHC-I modulation, directly affecting synaptic plasticity.
Lista de figuras
Figura 1: MHC I no Sistema Imune ...14
Figura 2: Resumo simplificado das vias de cascata de sinalização do TCR- MHC-I...20
Figura 3: Mecanismo molecular do COUP-TF como repressor ...23
Figura 4: Mapa do vetor parental CD3ζ...30
Figura 5: Mapa de restrição para isolamento do gene CD3 ζ...30
Figura 6: Vetor FUW com a ligação do cassete para CD3 ζ...31
Figura 7: Vetor FUW com a ligação do cassete para Coup-TF II...21
Figura 8: Foto da medição dos prolongamentos entre os corpos celulares...35
Figura 9: Resultado de citometria de fluxo para células transduzidas com os vetores virais...39
Figura 10: Citometria de fluxo para avaliar expressão de eGFP nos clones celulares estabelecidos com o vetor viral FUW-CD3z-eGFP...40
Figura 11: Células PC12 transduzidas com vetor de super expressão CD3 ζ-GFP...42
Figura 12: Gráfico mostrando a quantificação da immunorreatividade anti-Sinaptofisina com 5 e 10 dias (PC12- CD3 ζ)...44
Figura 13: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de sinaptofisina com 5 dias de cultivo (CD3 ζ)...45
Figura 14: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de sinaptofisina com10 dias de cultivo (CD3 ζ)...46
Figura 15: Gráfico da quantificação da immunorreatividade anti-OX18 com 5 e 10 dias (PC12- CD3 ζ) anti-OX-18...48
Figura 16: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de MHC-I com 5 dias de cultivo (CD3 ζ)...48
Figura 17: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de MHC-I com 10 dias de cultivo (CD3 ζ)...50
Figura 18: Gráfico da quantificação para células submetidas a imunoblotting para CD3 ζ...51
Figura 19: Medições das frequências dos prolongamentos dos neuritos realizadas com 5 dias de cultivo(CD3 ζ) ...52
Figura 20: Medições das frequências dos prolongamentos dos neuritos realizadas com
10 dias de cultivo (CD3 ζ)...53
Figura 21: Quantidade das projeções celulares, medidas entre os corpos celulares e
entre os corpos celulares e as interseções com 5 e 10 de cultivo...54
Figura 22: Gráfico da quantificação da immunorreatividade anti-Sinaptofisina com 5 e
10 dias (PC12- COUP-TF II)...56
Figura 23: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de Sinaptofisina com 5
dias de cultivo (COUP-TF II)...57
Figura 24: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de Sinaptofisina com 10
dias de cultivo (COUP-TF II)...58
Figura 25: Gráfico da quantificação da immunorreatividade anti-OX-18 com 5 e 10
dias (PC12- COUP-TF II)...60
Figura 26: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de MHC-I com 5 dias de
cultivo (COUP-TF II)...61
Figura 27: Gráfico da quantificação em pixels da expressão de MHC-I com 10 dias de
cultivo (COUP-TF II) ...62
Figura 28: Gráfico da quantificação para células submetidas a imunoblotting para
COUP-TF II...63
Figura 29: Medições das frequências dos prolongamentos dos neuritos realizadas com
5 dias de cultivo(COUP-TF II) ...64
Figura 30: Medições das frequências dos prolongamentos dos neuritos realizadas com
Lista de abreviaturas
Ad-12 - Adenovirustype 12 – Adenovírus do tipo 12
CD3 - cluster of differentiation 3 – Cluster de diferenciação 3
COUP-TF II - Chicken Ovalbumin Upstream Promotor – transcription factor II. HLA - Humanleukocyteantigen – Antígeno Leucocitário Humano
IFN - Interferon Kda – kilodalton
Lck - lymphocyte-specific protein tyrosine kinase
MHC I - Major Histocompatibility Complex of class I (Complexo de histocompatibitity
principal de classe I)
NF-KB - nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells NK – Natural Killer
NGF - Nervegrowthfactor (Fator de crescimento neural)
PC12– PheochromocytomaoftheRat Adrenal Medulla - Feocromocitoma de medula
adrenal de Rato.
PTK - proteína tirosina- quinase RAR – Receptor de Ácido Retinóico RXR – Receptor de Ácido Retinóico X SNC - Sistema nervoso central
SNP - Sistema nervoso periférico SI – Sistema Imunológico
TCR - T cell receptor – Receptor de Células T TAP - transporter associated with antigen processing β2m – Beta 2 microgobulina
Índice
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 17
3.1Manutenção da linhagem PC12...17
3.2Desenho de sequencias de shRNA...17
3.3 Vetores para superexpressão e knockdown de Coup TF II...18
5. 1. INTRODUÇÃO ...12 2. OBJETIVO ... 26 2.1 Objetivos gerais ... 26 2.2 Objetivos específicos ... 26 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 27 3.1 Manutenção da linhagem PC12 ... 27
3.2 Desenho de sequências de shRNA ... 27
3.3 Vetores para superexpressão e knockdown de Coup TF II ...28
3.4 Construção do vetor plasmidial FU-CD3zGFP-W para superexpressão de CD3 zeta ... 28
3.5 Preparação dos vetores plasmidias para produção de vírus ... 32
3.6 Produção Viral ... 32
3.7 Estabelecimento de clones celulares de PC12 transduzidas com vetores virais.33 3.8 Imunocitoquímica ...33
3.9 Medição dos neuritos ... 34
3.10 Western blotting ... 35
3.11 Citometria de Fluxo ... 37
4. RESULTADOS ... 38
4.1 Estabelecimento de linhagens celulares ... 38
4.2 Efeito do Silenciamento ou Super expressão De CD3 ζ ... 41
4.3 Efeito do Silenciamento ou Super expressão de COUP-TF II ...55
5. DISCUSSÃO ...66 6. CONCLUSÕES ... 74 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 75 8. ANEXO ... 90 8.1. Declaraçãode biossegurança ... 90 8.2. Declaração de autoria ... 91
1. INTRODUÇÃO
A organização do Sistema Nervoso Central (SNC) depende do preciso estabelecimentoe refinamento das conexões sinápticas durante o desenvolvimento. Estes processos estão baseados na combinação de mecanismos moleculares, ainda pouco conhecidos,bem como da atividade neural (Mcallister,2007). A formação e funçãoinadequadas das sinapses podem levar a desordens do desenvolvimento neurológico, tais como esquizofrenia e autismo (Boulanger&Shatz, 2004).Neste sentido, um importante papel, no desenvolvimento do SNC,tem sido atribuído às moléculas do complexo de histocompatibilidadeprincipal de classe I (MHCI), presente em neurônios e glia. Há evidências que MHC I possua atividade relacionada ao refinamento sináptico, no desenvolvimento das projeções visuais da retina ao núcleo geniculado lateral, plasticidade sináptica no hipocampo e cerebelo e na formação de redes neurais em culturas hipocampais(Corriveau et. al., 1998; Huh, 2000; Goddard et. al. 2007, McConnell et. al. 2009; Datwani, 2009).
A família do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) possui mais de 200 genes e situa-se no cromossomo 17, apresentando a função codificar proteínas transmembrana polimórficas encontradas na superfície de quase todas as células nucleadas (Ploegh et al., 1981). Em humanos, as moléculas do complexo MHC são codificadas por genes do complexo HLA, encontrados no braço curto do cromossomo 6. Tais genes são divididos em três principais categorias: MHC classe I (equivalente ao HLA A, B e C em humanos), MHC classe II (HLA DP, DQ e DR em humanos) e MHC classe III, que inclui componentes do sistema complemento (Boulanger&Shatz, 2004). Ainda, moléculas derivadas dos genes para MHC classe I podem ser subdivididas de acordo com a presença ou não de polimorfismo. Diferem entre si, através da forma
como são expressas na superfície celular: MHC I clássico (Ia) e MHC I não clássico (Ib) (Hoare et al., 2006, Braud et al., 1999).
A função das moléculas de MHC é revelar, na superfície celular, amostras dos constituintes protéicos das células, sinalizando ao Sistema Imunológico (SI)ausência de infecções, isto é, que as proteínas sintetizadas no interior celular são próprias dessas células. No entanto, pode revelar que seu maquinário de síntese protéica está desviado de suas funções, apresentando peptídeos de microorganismos, bactérias ou vírus, dando assim início a uma resposta imune (Thorsby, 1999).
É por intermédio de moléculas MHC I (complexo de histocompatibilidade principal de classe I), que peptídeos derivados de antígenos endógenos são apresentados aos linfócitos T que, por meio de seus receptores (TCR T cell receptorou PirB), que re-conhecem o complexo antígeno peptídeo-MHC (Babbitt, 1985; Parnes, 1989). Osreceptores do tipo imunoglobulina emparelhados do tipo B(PIR) foram pela primeira vez
identificados como homólogos ao receptor Fc humano (FcR) de imunoglobulina A (IgA). Posteriormente identificaram a relação entre PIR-B e MHC-I, clássico e não clássico, demonstrando que há ligação entre eles (Takai& Ono, 2001; Ho et al., 1999) e mais tarde demonstrado que estes receptores se ligam ao MHC classe I (Nakamura et al., 2004;Kollnbergeret al., 2004).
A maior parte dos peptídeos origina-se de proteínas do citosol ou do núcleo pela degradação, no proteossoma, sendo transferidas para o lúmen do retículo endoplasmático por meio de moléculas transmembranatransportadoras de peptídeos TAP 1 e TAP 2 (transporterassociatedwithantigenprocessing). No interior do retículo endoplasmático, um complexo polipeptídico estável é formado, constituído de cadeias α
pesadas polimórficas (α-1, α-2 e α-3 com PM total de 43,000Kda), de uma molécula não-polimórfica de microglobulina β2 (β2m, PM 12,000kda) e de um peptídeo variável, constituindo o complexo peptídeo-MHC (Grommé&Neefjes, 2002). A mutação do gene responsável pela expressão de TAP 2 em humanos também induz à baixa expressão das proteínas TAP e microglobulina β2 (De La Salle et al., 1994). Dessa forma, o TAP 1 e 2 e também a microglobulina β2, são moléculas necessárias para o processamento e apresentação adequados de MHC I na superfície das células (Fig. 1, Boulanger et al., 2001; Grommé&Neefjes, 2002). Ainda, moléculas de MHC I podem ser reconhecidas por uma série de receptores de superfície em células NK (natural killer) e dímeros de proteínas CD8 (Morettaet al., 1997; Ugolini&Vivier, 2000).
Todas as células nucleadas expressam MHC I, embora o nível de expressão varie entre os tipos celulares. As células hepáticas, por exemplo, expressam níveis relativamente baixos, enquanto as do Sistema Imunológico o expressam em grande quantidade (Janeway&Travers, 1997).
Figura 1: MHC I no Sistema Imune. A molécula TAP é requerida no retículo endoplasmático para a apresentação do peptídeo pelo MHC. A subunidade microglobulina beta-2 (β2-m) completa a estrutura da molécula para sua expressão na superfície celular. O receptor associado à unidade CD3ζ, é expresso pelos linfócitos T e interage com o complexo MHC-peptídeo (Boulanger et al., 2001).
O Sistema Nervoso Central (SNC) é muito sensível a lesões e sua capacidade regenerativa é limitada. Assim, na maioria dos casos, o reparo tecidual não ocorre ou ocorre de forma incompleta, causando danos irreversíveis (Moran&Graeber, 2004). Acidentes, cujo trauma acomete estruturas do Sistema Nervoso (SN), desencadeiam uma série de alterações morfofuncionais que representam a resposta pós-lesão. A modulação da expressão de MHC I interfere no nível de reatividade dos astrócitos, alterando o processo de plasticidade sináptica. Dessa forma, é estabelecida uma correlação entre MHC I, gliose e plasticidade. Nesse contexto, o MHC I pode ser visto como um mecanismo de comunicação entre neurônios e glia e, de alguma forma, contribui para a coordenação das alterações morfológicas, metabólicas e inflamatórias, que ocorrem frente a um comprometimento do tecido nervoso. Estes mecanismos envolvem tanto modificações da reatividade glial quanto da atividade neuronal, buscando o retorno da homeostase. Contudo, o entendimento dos processos pós-lesão, em nível de interação neurônio-glial e interneuronal ainda é, apesar de relativamente extenso, insuficiente para permitir uma interferência terapêutica que induza o reparo adequado das estruturas lesadas.
As mudanças na expressão dos níveis de MHC I, independentemente dos peptídeos apresentados, pode ser o mais relevante para o desenvolvimento neurológico (Escande-Beillard et al., 2010). Em contrapartida, estudos realizados em camundongos deficientes de MHC I tiveram como objetivo estudar o papel do MHC I na plasticidade sináptica e regeneração nervosa após axotomia. Descobriu-se que, após a secção do nervo isquiático, neurônios motores lesionados,em camundongos deficientes deMHC I, apresentaram extensos destacamentos sinápticos, comparativamente aos motoneurônios
dos animais selvagens (Oliveira et al., 2004). Ressalte-se que os terminais pré-sinápticos inibitórios (glicinérgicos e GABAérgicos) foram os mais afetado, sendo a regeneração axonal reduzida (Zanon&Oliveira, 2006;Thamset al, 2008).
No que diz respeito ao rearranjo do microambiente dos neurônios após uma lesão, alterações na densidade e tipos de sinapses é um fenômeno bastante conhecido e estudado, mas ainda pouco compreendido em termos moleculares. Neste sentido, a proposta relativamente recente de que os neurônios utilizam o complexo de histocompatibilidade principal de classe I (MHC I) como aparato para deflagrar eventos de plasticidade sináptica, foi particularmente instigante.
No SN, a barreira hemato-encefálica constitui uma proteção a possíveis agentes patológicos e também impede, numa situação de normalidade, a passagem de células do SI para o parênquima do SNC (Piehl&Lidman, 2001). Dessa forma, as células nervosas não expressam ou expressam níveis muito baixos de moléculas relacionadas à resposta imune, tais como o MHC I, sendo, portanto, considerados “imunoprivilegiados” (Lampson&Hickey, 1986;Ljunggren&Kärre, 1990; Jolyet al., 1991; Rallet al., 1994). As células imunocompetentes mostram-se prontas para responder a um estímulo, seja ele desencadeado por situações de desordem imunológica, infecções ou trauma. É interessante ressaltar que a expressão de MHC I pode ser modulada, exercendo assim um importante papel na comunicação neurônio-glial, influenciando na resposta frente à lesão periférica, afetando diretamente a plasticidade sináptica (Oliveiraet al., 2004) e a reatividade glial(Lidmanet al., 2002; Emirandettiet al., 2006).Estudos em ratos deficientes de MHC I,envolvendo brotamento neuronal, padrões de conexões sinápticas, morfologia e eletrofisiologia, forneceram evidências que a expressão de MHC Ipode gerar consequências negativas na fisiologia relacionada ao desenvolvimento do sistema nervoso, bem como seu reparo(Wuet. al., 2011).
Atualmente sabe-se quevários tipos neuronais expressam MHC I, como os neurônios dos gânglios dasraízes dorsais (Neumannet al., 1997),motoneurônios medulares (Lindaet al., 1998), neurônios do sistema visual (Corriveauet al., 1998), da substância negra, dos núcleos da base, das células piramidais do hipocampo e do hipotálamo (Lidmanet al., 1999), células piramidais da camada 5 do córtex somatosensorial(Corriveauet al., 1998)e em células PC12 (Feocrocitoma de medula adrenal) (Inacio et al. 2012). Essas observações demonstram que a expressão de MHC I no SNC pode estar relacionada a funções diferentes de seu conhecido papel no SI (Lindaet al., 1999; Lidmanet al., 1999).
Assim como as moléculas que funcionam como segundos-mensageiros, é possível que outras proteínas/receptores desempenhem funções distintas em diferentes sistemas. Alguns achados têm demonstrado claramente a superposição de um repertório molecular entre o SN e o SI, o que abre a possibilidade de entendimento de diferentes processos nas células nervosas. Neste contexto, pesquisas recentes apontam que a sinalização do MHC I, uma molécula funcionalmente ligada à resposta imune, possa ser utilizada por neurônios e glia como meio de interação no desenvolvimento, na homeostase e em processos patológicos ou regenerativos. Atualmente, sabemos que a organização do SNC depende do preciso estabelecimento e refinamento das conexões sinápticas durante o desenvolvimento (Mcallister, 2007) e que essa organização é dependente da presença do MHC I (Needleman, 2010). As moléculas de MHC I são reconhecidas por váriasfamílias de receptores no SI, incluindo TCRs, receptores de células natural killer (NK) e TCD8 (Morettaet al., 1997; Ugolini&Vivier, 2000). Acredita-se que o MHC I participe da regulação do refinamento das projeções sinápticas no desenvolvimento do sistema visual, plasticidade sináptica no hipocampo e no
cerebelo e transmissão sináptica (Corriveauet al., 1998; Datwaniet al., 2009). Apesar dos mecanismos intrínsecos do processo de plasticidade sináptica no SNC serem virtualmente desconhecidos, um mecanismo envolvendo a expressão do MHC I foi proposto (Huhet al., 2000), o qual demonstra que camundongos transgênicos, incapazes de expressar o MHC I, apresentavam uma falha no processo de segregação das aferências provenientes da retina para o corpo geniculado lateral, durante o desenvolvimento do Sistema Visual, levando à conclusão de que o sinal proveniente do MHC I é de fundamental importância para a remoção de conexões sinápticas extranumerárias durante o desenvolvimento.
A influência de moléculas de MHC I no processo de estabilização de sinapses inibitórias após a transecção do nervo isquiático. Nesse caso, a expressão de MHC I no tecido nervoso da medula espinal aumentou a eliminação e retração dos terminais inibitórios (glicinérgicos e GABAérgicos) em relação aos corpos neuronais que normalmente ocorrem em resposta a uma lesão nervosa periférica (Oliveira et al., 2004). O aumento induzido da expressão de MHC I no microambiente medular, por meio do tratamento cominterferon 1bexógeno, juntamente àaxotomia periférica, mostrou a influência dessa molécula sobre o processo de eliminação sináptica. Dessa forma, quando presente a expressão de MHC I, mantém-se a seletividade para a retração ou eliminação de terminais sinápticos em relação aos corpos neuronais cujos axônios foram comprometidos pela lesão(Zanon&Oliveira, 2009). Porém, até o momento não foram estabelecidas as vias intracelulares através das quais o MHC I possivelmente desempenhe seu papel no SNC. No SI, os fragmentos peptídicos derivados dos antígenos endógenos expressos na superfície celular via MHC-I são reconhecidos pelas células T.
Até o momento, baseados no que se sabe a respeito do sistema imune, a expressão de receptores como TCR e PirB foi detectada do SNC e está associada ao MHC-I (Syken et al., 2006).A descoberta do PIR-B (receptor de imunoglobulina tipo B) proporcionouum novo sistema de reconhecimento de MHC de classe I, com significado fisiológico e patológico, onde PIR-B regula o limiar de ativação de células, tais comoneurônios (Omoto et al., 2011 e Nakamura et al., 2011), células B, mastócitos, neutrófilos, macrófagos e DC, além de previnir reação indesejada para tecidos autólogos (Toshiyuki, 2005).Já osgenes para receptores de células T, TCR-beta estão presentes nas células nervosas, destacando-se os neurônios corticais (Syken&Shatz, 2003).
Os peptídeos derivados de antígenos endógenos são apresentados aos linfócitos T que, por meio de seus receptores TCR (T cell receptor), reconhecem o complexo antígeno peptídeo-MHC (Babbitt et al., 1985; Parnes, 1989). Os sinais bioquímicos que são desencadeados nas células T pelo reconhecimento do antígeno, não são transduzidos pelo próprio TCR e sim por proteínas invariáveis designadas CD3 e ζ (Zeta) (Samelsonet al., 1985). Quando o TCR liga-se ao complexo peptídeo-MHC, uma proteína tirosino-quinase (PTK), associada às caudas citoplasmáticas do CD4 ou do CD8, denominada Lck, fosforila as tirosinas das cadeias CD3 e ζ. Estas proteínas têm um importante papel na sinalização intracelular, ou seja, ligam o reconhecimento do antígeno pelo TCR aos eventos bioquímicos que induzem a ativação funcional das células T (figura 2).
Assim, a ligação de uma célula T aos peptídeos associados ao MHC resulta no agrupamento do TCR, da molécula CD3 e da cadeia ζ. Esta associação coloca os receptores associados da PTK na proximidade de vários substratos. A fosforilação da tirosina desses substratos representa o evento central das vias de transdução de sinais
nas células T (Lanier, 2001; Pitcher&VanOers, 2003). A tirosina fosforilada na cadeia ζ torna-se um substrato para a tirosina-quinase chamada ZAP-70 (Proteína Associada à Zeta de 70-KDa). Quando a ZAP-70 liga-se à cadeia ζ fosforilada, ocorre sua ativação e esta é então capaz de atuar sobre certo número de moléculas citoplasmáticas sinalizadoras. Notavelmente, vários componentes chave da sinalização clássica através do MHC I, anteriormente reconhecidos como imune-específicos, têm sido detectados no SNC e alguns já foram demonstrados como participantes da plasticidade neuronal.
Evidências sugerem que o MHC-I e o CD3 ζ têm um importante papel, não apenas como molécula de defesa do SI, mas também como reguladores do desenvolvimento e na plasticidade do SNC (Sourial-Bassillious et al., 2006).
Figura 2: Resumo simplificado das vias de cascata de sinalização do TCR- MHC-I, fosforilação de outros receptores de MHC-I no sistema imune. Resumo parcial de moléculas sinalizadoras envolvidas na cascata de ativação do TCR (assim como a maioria dos outros receptores MHCI do sistema imunitário). As moléculas em azul não são conhecidos por expressar em neurônios; moléculas em preto são expressas nos neurônios; moléculas vermelhas são expressas nos neurónios e implicada na plasticidade sináptica. (Shatz et. al., 2001).
Recentes evidencias indicam que várias moléculas relacionadas anteriormente e são também expressas no SNC, contribuindo para funções específicas do SN (Mcallister&Van deWater, 2009). Estudos realizados em camundongos knockout têm mostrado que o MHC-I e CD3 ζ são importantes para a atividade guiada para remodelação estrutural e plasticidade sináptica (Huhel al., 2000).Foi visto que neurônios do núcleo geniculado lateral expressam a subunidade ζ do CD3 (Boulangeret al., 2001; Linda et al., 1999). Isto sugere que o MHC I é posicionado nos terminais pós-sinápticos e transmitem sinais retrógrados para os pré-sinápticos contendo receptores CD3 ζ (Corriveau, 1998). Estudos donúcleo geniculado lateral têm indicado que o MHC I e o CD3 ζ também funcionam como moléculas sinalizadoras envolvidas na maturação pós-natal bem como na função neuronal (Huhet al., 2000). A regulação da conectividade neuronal e da transmissão sináptica obtidas pelo CD3 ζ são associadas com uma ação proeminente na morfologia neuronal, particularmente na formação dendrítica. Além disso, observou-se que a subunidade CD3 ζ pode estar envolvida com o mecanismo de reconhecimento de algumas das moléculas de MHC-I no SN (Boulanger&Shatz, 2004). Este receptor reconhece fragmentos proteicos apresentados pelo MHC, sendo assim responsável pelo reconhecimento antigênico (Samelsonet al. 1985). O CD3 ζ é uma das primeiras moléculas detectadas após ativação do TCR expresso pelas células T. A molécula ZAP-70 é recrutada pelo CD3 ζ, ligando-se duplamente por ITAMsfosforilados, através de proteínas homólogas do domínio do conjunto Src (SH2) (Iwashima et al., 1994; VanOers et al., 1996; Chan et al., 1992; Chanet al.,1995; Wange et al., 1995). Uma proteína de 66-KDa foiidentificada através da utilização de vários anticorpos contra ZAP-70, indicando uma grande homologia entre a proteína de 70-KDa do sistema imune e essa proteína de 66-KDa do SNC (Yoneyaet al., 1998; Inatomeet al., 2000).
Outra possibilidade de estudar a modulação do MHC-I seria através do receptor nuclear COUP-TF II (Chicken ovalbumin upstream promotor – transcription factor II),que é uma subfamília de receptores que participa de vários processos celulares, tais como na angiogênese, desenvolvimento neuronal, organogênese e na homeostase metabólica (Wanget al, 1989; Ladias, 1991; Wang et al., 1991; Kastner et al., 1995; Mangelsdorf et al., 1995; Ritchie et al., 1990; Qiu et al., 1994).
Em várias espécies, nas quais a expressão de COUP-TFfoi estudada durante o desenvolvimento, notou-se grande associação com a neurogênese (Fjose et al. 1993; Lu et al.1994; Lutz et al.1994; Qiu et al.1994; Pereira et al.1995; Vlahou et al.1995). Foi demonstrado que a super expressão de COUP-TF resulta na estabilidade sináptica, diminuindo o contato entre neuritos e o substrato das células, sugerindo que o COUP-TF está envolvido na regulação do contato entre os neuritos das células(Connoret al.1995). Estudos referenciais, utilizando genes alvo, sugerem que COUP-TF está envolvido na modulação do crescimento axonal (Qiuet al.1997; Zhouet al.1999). De fato, o knockoutpara COUP-TF, em camundongos, resulta em diminuição da arborização dos nervos espinais (QIUet al.1997) e morfogênese anormal do n. glossofaríngeo, IX par de nervo craniano e do respectivo gânglio (Qiuet al.1997). Também gera defeitos na orientação dos axônios que emanam dos neurônios talâmicos que projetam normalmente para a IV camada cortical (Zhouet al.1999). Um transtorno de COUP-TFI, em camundongos, resulta na regionalização imprópria do cérebro. Estes resultados sugerem claramenteque o COUP-TFI é um componente importante na regulação da neurogênese e diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário em vários organismos.
Resultados obtidos em humanos, baseado em imunoistoquímica em secções detecido cerebral, representam o primeiro estudo a demonstrar COUP-TFII e sua distribuição na parte frontal do cérebro fetal. COUP-TFII é expresso desde a mais tenra fase do desenvolvimento, avaliada nesse estudo (9 semanas gestacionais), tanto na porção ventral quanto na partedorsal do SNC, incluindo o córtex cerebral (Reinchisi et al. 2012).
Estudos realizados com células Ad-12 transformadas e COUP-TF,relacionadocom a enzima histona deacetilase, indica sua associação repressora de expressão de MHC, por meio da sua extremidade do terminal C, desempenhando importante papel na regulação negativa da transcrição do complexo de MHC I (Smirnovet. al., 2000) (figura 3). Isto também demonstra, pela primeira vez, que o
Figura 3: Mecanismo molecular do COUP-TF como repressor. DR: repetição direta,
HRE: elemento de resposta hormonal, MHC: Complexo de histocompatilibilidadeprincipal, ApoAI: apolipoproteinaAI (Tsai et.al., 2003).
COUP-TF pode reprimir MHC I, através de mecanismos similares, quejá foram descritos por receptores de ácido retinóico(RAR/RXR), estando ligado à histona deacetilase(Perlman& Evans 1997).Osreceptores nucleares RAR/RXR ou TR/RXR podem contribuir significativamente para o papel regulatório negativo do COUP-TF (Mangelsdorf& Vans, 1995).
Adicionalmente, pesquisas também realizadas em células AD12- transformadas mostraram que uma repressão ao sitio de ligação R2, na região 5’, leva a aumento do repressor que influencia a baixa regulação da transcrição do MHC-I (Ruewen et al., 1992). Pesquisadores utilizaram o mesmo raciocínio,e mostraram que em células tumorais AD12 transformadas, que possuem transcrição a partir do promotor classe I, comportam-se como um regulador negativo, resultando na ligação do repressor COUP-TF no sítio R2, comprometendo a atividade do ativador NF-KB no sitio R1 (Liu et al., 1994; Kushneret al.,1996). Isto leva a uma diminuição da expressão de MHC classe I. Por outro lado, células Ad5- transformadas, que possuem um baixo nível de COUP-TF (nocaute) e alto nível de NF-KB ligados ao DNA, apresentam aumento na atividade do MHC classe I(Liuet al.,1994; Kushneret al., 1996).
O conhecimento dos receptores, das moléculas e das vias de sinalização ativando MHC no SNC é de fundamental importância para o entendimento da plasticidade neural, uma vez que o sinal proveniente do MHC I é essencial para remoção de conexões sinápticas extranumerárias durante o desenvolvimento e, como o RNAm para as moléculas de MHC classe I tem sido identificado em muitas populações neuronais, sugeriu-se que os próprios neurônios estejam envolvidos nessa sinalização (Huhet al., 2000).
Uma vez que o MHC-I está envolvido no desenvolvimento, plasticidade sináptica e manutenção da homeostase do SNC, é de grande relevância entender os mecanismos de transdução do sinal e de modulação dessa via.
2. Objetivos
2.1. Objetivos Gerais
Avaliar o papel de Coup-TFII na regulação da expressão de MHC-I em neurônios e o papel do CD3 ζ como receptor da via de transdução de sinal de MHC-I na plasticidade sináptica in vitro.
2.2. Objetivos específicos
Gerar células da linhagem PC12 superexpressando ou silenciadas para os genes CD3ζ e COUP-TF através da transdução viral destas células com cassetes de expressão contendo a região codante e uma versão fita-dupla (hairpin), respectivamente, em ambos os genes.
Analisar o padrãode arborização durante a diferenciação neuronal nas células PC12superexpressandoou silenciadas para CD3ζ e COUP-TF. Analisar o efeito da modulação da expressão de CD3ζ e COUP-TF sobre
MHC-I e sinaptofisina (marcador de sinapses)através deimunocitoquímica,nas células PC12 transduzidas.
Analisar o efeito da modulação da expressão de CD3ζ e COUP-TF sobre o comprimento de dendritos dos neurônios formados a partir da diferenciação das células PC12superexpressandoou silenciadas para os genes CD3ζ e COUP-TF.
3. Material e Método
Para o presente estudo, foram utilizadas células de linhagem de feocromocitoma de medula adrenal de rato (PC 12), as quais foram transduzidas com vetores virais, promovendo superexpressãoousilenciamento de CD3 ζ e COUP-TF II.
As culturas transgênicas, após estabelecidas, foram diferenciadas e mantidas por 5 e 10 dias de cultivo. Após esse período, foram fixadas e submetidas àImunocitoquímica para avaliar a expressão de CD3 ζ e COUP-TF.
3.1. Manutenção da linhagem PC12
A linhagem PC12, derivada de feocromocitoma de medula adrenal, foi adquirida do laboratório de farmacologia da USP de Ribeirão Preto. As células foram mantidas em meio DMEM (Nutricell®), suplementado com glicose, 10% de soro fetal equino e 5% de soro fetal bovino. Ficaram mantidas em garrafas de 75 cm², em estufa de incubação contendo atmosfera úmida (5% de CO2 a 37ºC), até atingirem a fase exponencial de crescimento.
3.2. Desenho de sequências de shRNA
As seqüências de shRNA dirigidas ao Knockdown de cd3z foram desenhadas por Marcio Bajgelman, do LNBio/CNPEM, utilizando-se algoritmo baseado em (Heale, et al. 2005). As seqüências de shRNA para o silenciamento de Coup TF II foram desenhadas pelo Dr. TakuyaShimazaki (DepartmentofPhysiology, KeioUniversitySchoolof Medicine)
.
3.3. Vetores para superexpressão e knockdown de Coup TF II
Os vetores plasmidiais foram gentilmente cedidos porDr. TakuyaShimazaki (DepartmentofPhysiology, KeioUniversitySchoolof Medicine). Estes vetores plasmidiais foram utilizados para produção de partículas virais pelo LVV/LNBio/CNPEM, conforme descrito adiante.
3.4. Construção do vetor plasmidial FU-CD3zGFP-W para superexpressão de CD3 zeta.
O vetor plasmidial FU-CD3zGFP-W é um vetor de transferência lentiviral utilizado para produção de partículas virais recombinantes. A construção do vetor foi feita removendo-se o cassete CD3zGFP do vetor pd1EGFP-N1 Cd3zGFP (gentilmente cedido pela Dra. HeleneBoudin, Univerdidade de Nantes - França) (Figura 4), que foi inserido no vetor FUGW (Loiset al. 2002).A construção foi feita no Laboratório de Vetores Virais do Laboratório Nacional de Biociências (LNBio), Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, sob a coordenação do Prof. Dr. Marcio C. Bajgelman.
O plasmídeo viral FUGW (Loiset al. 2002) foi inicialmente digerido com EcoRI, seguindo-se tratamento com T4 DNA pol para completar extremidades coesivas. A seguir, a enzima T4 DNA pol foi inativada e efetuamos defosforilação com fosfatase alcalina (CIP). Logo após, efetuamos extração fenol-clorofórmio. O plasmídeo foi digerido com BamHI, liberando o fragmento correspondente ao cDNA do eGFP. O vetor digerido e linearizado foi isolado do gel. A seguir, efetuamos o preparo do inserto, removendo-se um fragmento contendo o cassete Cd3ζ gfp do vetor parental
pd1-egfp-N1-CD3z. O primeiro passo consistiu em digerí-lo com a enzima NotI, seguindo-se tratamento com T4 DNA pol para complementar as extremidades coesivas. Após inativar a T4 DNA pol, efetuamos extração fenol-clorofórmio, precipitação emEtOH e então, o DNA foi digerido com a enzima Bgl II, liberando-se um fragmento de 1500bp, correspondente ao cDNA do CD3ζ GFP, denominado inserto, o qual foi isolado do gel. O último passo consistiu em ligar o inserto ao vetor, utilizando-se dois mols de inserto para um mol de vetor. O esquema da clonagem e o mapa do vetor construído pode ser observado nas figuras 5 e 6. As enzimas de restrição, fosfatase alcalina e ligase foram adquiridas da New EnglandBiolab®, EUA, senguindo-se protocolo fornecido pelo fabricante. Os fragmentos foram isolados em gel utilizando-se kit de purificação da marca Qiagen, conforme protocolo do fabricante.
O produto de ligação foi utilizado para transformar bactérias termo-competentes, que foram incubadas por 16h a 37°C. Escolhemos 24 colônias para fazer preparações de plasmídeo em pequena escala (miniprep (Thermoscientific®), utilizando-se protocolo detalhadamente descrito em Sambrook et al., (1989). Utilizou-se 4 uL de cada miniprep para fazer varredura dos clones positivos com a enzima XhoI e eletroforese em gel de agarose. Os clones positivos apresentaram bandas de 2kb e 8.5kb, conforme perfil previsto para enzima XhoI. O clone denominado FU-CD3ζ GFP-W#219 foi sequenciado verificando-se a integridade entre as extremidades do cassete clonado e presença dos transgenes.
Figura 4: Mapa do vetor parental cedido pela professora HélèneBoudin, da Universidade de Nantes (França).
Figura 6: Vetor FUW com a ligação do cassete para CD3ζ.
Figura 7: Vetor FUW com a ligação do cassete para Coup-TF II. A- Plasmídeo para Sh-Coup
TF II (Silenciamento de Coup TF II. B- Plasmídeo Sh-Controle e em C- Plasmídeo Rescue (Super expressão de Coup TF II).
3.5. Preparação dos vetores plasmidias para produção de vírus
Os vetores plasmidias foram purificados utilizando-se kit comercial da marca Qiagen(Alemanha), conforme protocolo descrito pelo fabricante. No caso de vetores recebidos de outros laboratórios, sob a forma de plasmídeos, estes foram inicialmente incorporados em bactérias termo competentes. Utilizamos o kit Qiagen-midi para purificar de até 100ug de DNA e Qiagen-maxi, para cerca de 500ug de DNA. Após a preparação, os plasmídios foram eluídos em tampão TE e então analisados por espectrofotometria para determinar a concentração e relação 260/280 nm, indicativa da pureza e qualidade do DNA. Todos os vetores purificados foram digeridos com enzimas de restrição, procedendo-se a eletroforese e corrida em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo, com a finalidade de confirmar identidade dos vetores. A digestão das amostras e eletroforese foram efetuadas conforme técnicas de biologia molecular convencionais, detalhadamente descritas em Sambrook et al.,(1989). Os mapas dos vetores utilizados neste projeto podem ser observados nas figuras 4 e 5.
3.6. Produção Viral
As preparações lentivirais foram efetuadas, observando-se nível 2 de biossegurança, pelo Laboratório de Vetores Virais do Laboratório Nacional de Biociências do Centro Nacional de Pesquisas em Energia e Materiais. A metodologia de produção seguiu protocolo adaptado de produção retroviral (Bajgelmanet al. 2003). O sistema de produção lentiviral possibilita a produção de partículas defectivas, que não apresentam possibilidade de replicação. As partículas virais são produzidas em linhagens empacotadoras, sendo que os genes associados à replicação e patogenicidade viral estão ausentes do vetor de transferência Fu-CD3ζ GFP-W, que codifica o genoma
viral. Dessa forma, os genes estruturais são providos em “trans”, na célula empacotadora. As partículas virais são então coletadas no sobrenadante das células produtoras, purificadas e tituladas para determinar-se a viabilidade e concentração de partículas por unidade de volume.
3.7. Estabelecimento de clones celularesde PC12 transduzidas com vetores virais
Após a produção das preparações virais para superexpressão ou knockdown dos alvos desejados, efetuaou-se a transdução de células PC12. As células foram plaqueadas na densidade de 104 células por poço e mantidas por 24 horas na incubadora em temperatura de 37ºC e com atmosfera de 5% de CO². Após esse período, as células foram submetidas ao procedimento de transdução viral, onde o lentivírus veicula os genes de interesse que então são incorporados em seu genoma. Para que ocorra a facilitação da entrada do vírus é usado um adjuvante denominado polibreno, na concentração final de 8ug/mL. Cada pool de células transduzidas foi individualmente clonado. O protocolo de clonagem consistiu em semear 500 células numa placa de 10cm. Após cerca de 3 semanas observamos a formação de colônias que foram transferidas para uma placa de 96 poços, utilizando-se uma micropipeta. A seguir cada clone foi expandido e posteriormente avaliado para expressão ou silenciamento do alvo.
3.8. Imunocitoquímica
Após o tempo de cultivo, as culturas foram fixadas com formaldeído 10%, para análise de imunofluorescência. Para as culturas de células PC12/CD3 ζ foram utilizados os seguintes anticorpos primários: camundongo anti-Sinaptofisina (Dako), camundongo anti-Sinaptofisina (Millipore), coelho anti-OX-18 (1:200)/ MHC I (Santa Cruz) e
camundongo anti- CD3ζ (Santa Cruz) (1:100). Após lavagem em solução tampão, as células foram incubadas com os anticorpos secundários adequados: burro anti-camundongo ou coelho (Cy3)(Jackson Immunoresearch).
Para as células PC12 com superexpressão ou silenciamento para COUP-TF II, foi utilizado o seguinte anticorpo primário: coelho anti-COUP-TF II. Após lavagem em solução tampão, as células foram incubadas com anticorpo secundário burro anti-coelho, conjugado com cianina 3 (Cy3; Jackson Immunoresearch).
A quantificação da imunoreatividade dos anticorpos utilizados (densidade integrada de pixels), bem como a mensuração dos neuritosfoi feita com o auxílio dos softwares ImageJ(versão 1.33u, NationalInstitutesof Health, USA) e Image tool (versão 3.0, UTHSCSA, USA),respectivamente.
3.9. Medição dos neuritos
Os neuritos foram medidos através do programa ImageTool (versão 3.0, UTHSCSA, USA). A mensuração foi realizada a partir de pontos sinápticos até o corpo neuronal, bem como entre pontos sinápticos (Figura 8). As medidas foram agrupadas em intervalos de freqüência e a média entre as freqüências nos diferentes grupos experimentais: células transduzidas, com superexpressão (RESCUE) e silenciamento (Sh COUP-TF II), bem como nas células PC12 normais e controle do silenciamento (Sh CONTROLE). O mesmo foi feito com as células transduzidas com superexpressão e silenciamento do CD3 zeta e nas células normais.
3.10. Western blotting
Para esta técnica, foram feitos homogenatos das células contidas na área de crescimento da garrafa de 25 cm², referentesà superexpressão e silenciamento para COUP TF II. Às células, foram adicionados 100 μl de tampão Ripa (150mM NaCl, 50mM Tris pH8.0, 1mM PMSF, 1mM EDTA, 0.5%) e todas as amostras foram homogeinizadas durante 1 min. Os homogenatosforam centrifugados a 10.000 xgdurante 10 min a 5°C, em centrífugarefrigerada (Bio-Spin-R, BioAgency). Os sobrenadantes foram coletados e estocados a -80ºC. Paracada amostra, realizou-sequantificação da concentração total de proteína por Bradford, em espectrofotômetro. Após isto, as proteínas foram separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS 12% e transferidas (Sistema Hoefer) para uma membrana de nitrocelulose
Figura 8:Foto representativa da medição dos prolongamentos entre os corpos
(Amersham),sob corrente constante de 400 mA, em cuba refrigerada. A qualidade da transferência de proteínas foi analisada pela coloração das membranas com Ponceau S.
As membranas foram bloqueadas com leite desnatado 5%. Para análise, as membranas foram incubadas com os seguintes anticorpos primários, por 18 horas: coelho anti-COUP-TF II (ABCAM, Ab64849)ecoelho anti-Beta-Actina (Sigma, A2228).A seguir, as membranas foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário marcado com peroxidase (burro anti-coelho-HRP) (Jackson Lab., USA) por 45 minutos. Após nova série de lavagens, as bandas foram visualizadas por reação de quimioluminescência através de sistema G-BOX, por três minutos. A intensidade de marcação, obtida nas diferentes situações experimentais, foi determinada por densitometria das bandas, utilizando-se o programa ImageJ (versão 1.33u, NationalInstitutesof Health, USA). Assim, as bandas de proteína com pesos equivalentes foram quantificadas de acordo com a técnica da Densidade Integrada de Pixels (DIP). Os valores das intensidades das bandas, em todos os casos, foram normalizados com a média dos respectivos controles presentes em cada membrana (valor da DIP de cada banda/média da DIP de todos os controles da mesma membrana x100).
O procedimento realizado para as células com superexpressão e silenciamento para CD3ζ foram através do bloqueio com leite desnatado 5% sendo logo após incubadas com os seguintes anticorpos primários, por 18 horas: coelho anti-CD3 ζ (Abcam, Ab64849) e coelho anti-Beta-Actina (Sigma, A2228).A seguir, as membranas foram lavadas e incubadas com anticorpo secundário marcado com peroxidase (burro anti-coelho-HRP) (Jackson Lab., USA) por 45 minutos. Após a série de lavagens, as bandas foram visualizadas por reação de quimioluminescência através de sistema G-BOX, por três minutos. A intensidade de marcação, obtida nas diferentes situações
experimentais, foi determinada por densitometria das bandas, utilizando-se o programa ImageJ (versão 1.33u, NationalInstitutesof Health, USA). Assim, as bandas de proteína com pesos equivalentes foram quantificadas de acordo com a técnica da Densidade Integrada de Pixels (DIP). Os valores das intensidades das bandas, em todos os casos, foram normalizados com a média dos respectivos controles presentes em cada membrana (valor da DIP de cada banda/média da DIP de todos os controles da mesma membrana x100).
3.11. Citometria de Fluxo
Após estabelecimento de clones celulares conforme descrito anteriormente executou-sea citometria de fluxo para avaliar a eficiência de expressão de GFP. Para este experimento, as células foram tripsinizadas e ressuspendidas em PBS na concentração de 5x10(5) células/mL e colocadas nos tubos para posterior leitura.
4. RESULTADOS
4.1. Estabelecimento de linhagens celulares
Após a transdução células com os genes CD3ζ e COUP-TF II, as mesmas foram mantidas em cultivo em placas de 6 poços, contendo o número de 104células/poço. Quando atingiram 90% de sua confluência, as células que continham GFP foram manualmente coletadas e replaqueadas em placas de 24 poços. Isto foi feito para que ocorresse controle populacional das células transduzidas, com os genes que possuíam em seu cassete a proteína GFP. Já para as células que não possuíam GFP, a seleção foi realizada através do emprego de antibióticos específicos, sendo a puromicina para as células Sh CD3ζ (silenciamento de CD3 ζ) e higromicina para as células RESCUE (superexpressão de COUP-TF II). Foi realizada uma curva de dose resposta para identificar a concentração ideal para que ocorresse a seleção de células. As células PC12 que possuíam o silenciamento para COUP-TF II e o controle do silenciamento (Sh Controle) continham em seu cassete a proteína GFP. Para avaliar a quantidade de células transduzidas, foi realizada a técnica de citometria de fluxo para esses dois grupos, onde se observou 71,7% (Sh controle) e 65,9%(Sh COUP-TF II) de eficiência na transdução. (Figura10).
Figura 9:Citometria de fluxo de células transduzidas com os vetores virais. As células dos
tubos A, B, C e D foram ressuspendidas em PBS 1X e submetidas à citometria para avaliar a expressão dos repórteres. Os tubos A e B contêm respectivamente, células parentais e células transduzidas com o vetor Rescue, que não apresentam genes repórteres e foram utilizados como controle negativo. Os tubos C e D contém células respectivamente transduzidas com vetores de shRNA controle e shRNA Coup TF II. Como estes vetores de shRNA apresentam o gene repórter, é possível observar fluorescência nas células transduzidas, no eixo X, denominado FITC, nos gráficos.
As células PC12 que tinham a superexpressão de CD3 ζ continham em seu cassete a proteína GFP. Para avaliar a quantidade de células transduzidas foi realizada a técnica de citometria de fluxo para este grupo. Observa-se que no tubo 3, 4 e 6 atingiram acima de 90%. O grupo 3 foi o escolhido para este experimento já que a concentração de células com GFP atingiram 94,08% de eficiência na transdução (figura 10).
4.2. EfeitodoSilenciamento ouSuperexpressão deCD3ζ
Figura 10:Citometria de fluxo para avaliar expressão de eGFP nos clones celulares
estabelecidos com o vetor viral FUW-CD3z-eGFP. O vetor viral possibilita a expressão simultânea do cDNA de CD3z e do repórter eGFP. Em A, células pertencentes ao grupo controle. B, C, D, E, F e G são clones de seleção GFP das células realizadas manualmente. Para o experimento, o Grupo D foi escolhido por apresentar mais de 94% de células positivas.
4.2. EfeitodoSilenciamento ouSuperexpressão deCD3ζ
As células PC12 CD3ζ-GFP foram mantidas por 5 e 10 dias de cultivo, tendo a influência ou não do fator de crescimento do nervo (NGF). As células PC12 CD3 ζ-GFP foram comparadas com o grupo PC12 normal. A principal característica morfológica é a extensão e quantidade de neuritos, que variou entre os grupos. Observa-se que as células que possuem a superexpressão de CD3 ζ-GFP tem uma intensa atrofia dos neuritos e uma diminuição na densidade da arborização. Já o grupo de células PC12 normais apresentou maior comprimento dos neuritos e na densidade da arborização. (Figura 11).
Figura 11:Em A e B, 5 e 10 dias respectivamente: células PC12 transduzidas com vetor de super
expressão CD3 ζ-GFP. Observa-se retração e diminuição na arborização das projeções celulares tratadas com NGF (50µm). Nas imagensde contraste de fase E e F, observa-se, que nas células normais tratadas com NFG apresentam maior formação de neuritos e maior arborização (20 µm).
As células PC12 submetidas à superexpressão e ao silenciamento para CD3 ζ apresentaram imunoreatividade distinta para sinaptofisina. As células que continham o cassete de superexpressão para CD3 ζ tiveram redução de reatividade para sinaptofisina, quando comparadas com as células silenciadas. Tanto as células PC12 normais quanto as células do grupo Sh Controle, não apresentaram diferença significativa na expressão de sinaptofisina. Escala = 50µm (figura 13 e 14).
Figura 12: Quantificação da immunorreatividade anti-sinaptofisina, com 5 e 10 dias de cultivo para
células silenciadas ou super expressando CD3ζ . As células PC12 do grupo A e B, e as células Sh controle, do grupo C e D) pertencem ao grupo controle. Os grupos E e F (Sh CD3ζ - silenciamento), apresentaram significativa diferença quando comparadas com o grupo G e H, células com o gene superexpresso (CD3ζ) na expressão de sinaptofisina (50 ).
Figura 13: Quantificação de sinaptofisina, através da densidade integrada de pixels, com 5 dias
de cultivo. As células PC12, as quais tiveram o gene superexpresso (CD3ζ), apresentaram menor intensidade na expressão de sinaptofisina, comparativamente às células do grupo normal (PC12) e Sh controle e uma significativa diferença, quando comparada com o grupo Sh CD3ζ (silenciamento).(***P< 0.001)
Figura 14: Quantificação de sinaptofisina, através da densidade integrada de pixels, com 10
dias de cultivo. As células PC12, as quais tiveram o gene super expresso (CD3ζ) mantiveram a intensidade elevada na expressão de sinaptofisina, comparativamente às células do grupo normal (PC12) e Sh controle e uma significativa diferença mantida também em comparação ao grupo Sh CD3ζ (silenciamento).(***P< 0.001)
As células PC12 submetidas à super expressão e ao silenciamento para CD3 ζ apresentaram imunoreatividade distinta para MHC I. As células que continham o cassete de superexpressão para CD3 ζ tiveram aumento de reatividade para MHC I, quando comparadas com as células silenciadas. Escala = 50µm (figura 15).
Figura 15: Quantificação da immunorreatividade anti-OX-18 com 5 e 10 dias de cultivo. As
células PC12, as quais tiveram o gene super expresso (CD3ζ) (G e F), mostraram maior intensidade na expressão de MHC-I, quando comparadas com as células do grupo normal (PC12) (A e B) e Sh controle (C e D). Apresentaram significativa diferença quando comparadas com o grupo Sh CD3ζ (E e F) (silenciamento) (50 ).
Figura 16: Quantificação de OX-18, através da densidade integrada de pixels, com 5 dias de
cultivo. As células PC12, as quais tiveram o gene super expresso (CD3ζ), apresentaram maior intensidade na expressão de MHC-I, comparativamente às células do grupo normal (PC12) e Sh controle e uma significativa diferença, quando comparada com o grupo Sh CD3ζ (silenciamento).(***P< 0.001)
Figura 17: Quantificação de OX-18, através da densidade integrada de pixels, com 10
dias de cultivo. As células PC12, as quais tiveram o gene super expresso (CD3ζ), mantiveram maior intensidade na expressão de MHC-I, comparativamente às células do grupo normal (PC12) e Sh controle e uma significativa diferença mantida, quando comparada com o grupo Sh CD3ζ (silenciamento).(***P< 0.001)
Com relação às células que apresentava silenciamento gênico (Sh CD3ζ) demonstrou-se maior extensão no comprimento dos prolongamentos. Com relação às células PC12 e as células Sh Controle, observa-se um comportamento semelhante nos comprimentos dos neuritos. As Figuras 19 e 20 apresentam as medidas feitas com 5 e 10 dias, respectivamente.
Figura 18: Em A, quantificação através da densidade integrada de pixels para células submetidas
a imunoblotting para CD3 ζ, representadas em B. Na avaliação das células que continham o gene Knockout para CD3 ζ, observou-se diminuição da expressão quando comparado com o grupo que continha o gene super expresso para CD3ζ. As células do grupo PC12 selvagem e Sh Controle não apresentaram diferenças significativas em ambos os grupos. (***P< 0.001)
Figura 19: Medições dos prolongamentos realizadas com 5 dias de cultivo. Média das
freqüências dadas entre contatos corpos celulares e entre corpos celulares e as interseções. Em A e B, grupo PC12 normal e Sh controle respectivamente. Observa-se em D maior número de neuritos, bem como neuritos com maiores comprimentos, quando comparada com o grupo C (CD3ζ).
Figura 20: Medições dos prolongamentos realizadas com 10 dias de cultivo. Media das
freqüências dadas entre contatos corpos celulares e entre corpos celulares e as interseções. Em A e B, grupo PC12 normal e Sh controle respectivamente. Observa-se em D maior número de neuritos, quando comparados com o grupo C (CD3ζ).
Figura 21: Quantidade das projeções celulares, medidas entre os corpos celulares e entre
os corpos celulares e as interseções. Medidas realizadas com 5 (A) e 10 (B)dias de cultivo.
4.3. Efeito doSilenciamentoouSuperexpressão de COUP-TF II
As células PC12 submetidas à superexpressão e ao silenciamento para COUP-TFII apresentaram expressão alterada de SYPH. Células que superexpressam COUP-TF II tiveram uma maior expressão de sinaptofisina (proteína relacionada ao processo de fusão das vesículas sinápticas à membrana celular) quando comparadas com as células silenciadas para COUP-TF II (Sh COUP-TF II). No grupo silenciando observamos que as células não diferenciaram ou apresentaram pequenas arborização de neuritos ou apenas brotamentos, mesmo com o tratamento de NGF. Já nos demais grupos, a arborização se formou, tendo maior arborização nas células que superexpressam COUP-TF II, notada pela rede de neuritos e também pelos contatos sinápticos marcados com anti-sinaptofisina (figura 22).
Figura 22: Imunocitoquímica para SYPH com 5 e 10 dias de cultivo. Em A e B (PC12 normal) e
E e F (Sh controle). As células que continham o gene que super expressa COUP-TF (C e D) apresentaram aumento na expressão de sinaptofisina quando comparada com as células que tiveram o gene silenciado (Sh Coup) (G e H). Escala = 50µm.
As células PC12 que possuem superexpressão e silenciamento para COUP-TF II tiveram alterações na expressão de sinaptofisina. Observa-se na figura 23 que há um aumento de sinaptofisina nas células mantidas por 5 dias em cultivo, que super expressam COUP-TF II em relação às células silenciadas. O mesmo padrão de expressão é observado também nas células mantidas por 10 dias em cultivo (figura 24) (p<0.001).
Figura 23: Quantificação através da densidade integrada de pixels para células
submetidas a Imunocitoquímica para Sinaptofisina, cultivadas por 5 dias. As células do grupo PC12 selvagem e Sh Controle não apresentaram diferenças. Já as células que possuem o gene que super expressa COUP-TF, apresentaram aumento na expressão de sinaptofisina quando comparada com as células que tiveram o gene silenciado (Sh Coup). (***P< 0.001)
Figura 24: Quantificação através da densidade integrada de pixels para células submetidas
à Imunocitoquímica para Sinaptofisina, cultivadas por 10 dias. As células do grupo PC12 selvagem e Sh Controle não apresentaram diferenças. Já as células que continham o gene que super expressa COUP-TF, apresentaram aumento na expressão de sinaptofisina quando comparada com as células que tiveram o gene silenciado (Sh Coup). (***P< 0.001)
As células PC12 submetidas à superexpressão e ao silenciamento para COUP-TF II apresentaram variações no padrão de expressão de MHC I. O grupo que super expressa COUP-TF II(Rescue) mostrou uma menor expressão de MHC-I quando comparado com o grupo que possui um silenciamento na expressão de COUP-TF II. As células PC12 normais e as células que continham o cassete de controle (Sh Controle) mostram imunoreatividade equivalentes tanto no grupo de 5 dias quanto no grupo de 10 dias (figura 25).
Figura 25: Imunocitoquímica para OX-18 com 5 e 10 dias de cultivo. As células Rescue (super
expressão de COUP-TF - C e D) apresentaram diminuição na expressão de MHC-I quando comparada com as células do grupo normal (PC12) e Sh controle. O Grupo Rescue apresentou diminuição de imunoreatividade comparada com o grupo Sh COUP (silenciamento). Escala = 50µm.
As células PC12 que possuem superexpressão e silenciamento para COUP-TF II tiveram alterações na expressão de MHC-I. Observa-se na figura 26 que há um aumento de MHC-I nas células mantidas por 5 dias em cultivo, que possuem silenciamento para COUP-TF II em relação às células que superexpressam. O mesmo padrão de expressão é observado também nas células mantidas por 10 dias em cultivo (figura 27) (p<0.001).
Figura 26: Quantificação através da densidade integrada de pixels para células
submetidas à imunocitoquímica anti-MHC classe I, cultivadas por 5 dias. As células do grupo PC12 selvagem e Sh Controle não apresentaram diferenças. Já as células que continham o gene que super expressa COUP-TF, apresentaram diminuição na expressão de MHC-I quando comparada com as células que tiveram o gene silenciado (Sh Coup). (***P< 0.001).
Figura 27: Quantificação através da densidade integrada de pixels para células
submetidas à imunocitoquímica para MHC classe I, cultivadas por 10 dias. As células do grupo PC12 selvagem e Sh Controle não apresentaram diferenças. Já as células que apresentavam o gene que super expressa COUP-TF, apresentaram diminuição na expressão de MHC-I quando comparada com as células que tiveram o gene silenciado (Sh Coup). (***P< 0.001)
Os Neuritos foram medidos entre os pontos sinápticos com o programa Image tool e feito estatística pela freqüência dos comprimentos mensurados através do programa Origin®. As células comsilenciamento para COUP-TF (Sh Coup) demonstraram um menor comprimento dos neuritos ou apenas brotamentos. Observa-se, tomando como referencia a linha pontilhada horizontal, que o grupo “Rescue” apresenta neuritos com maior comprimento. Com relaçãoàs células PC12 e as células Sh Controle, observa-se um comportamento semelhante nos comprimentos dos neuritos. As Figuras29 e 30 apresentam as medidas feitas com 5 e 10 dias, respectivamente.
Figura 28: Em A, quantificação através da densidade integrada de pixel para células submetidas a
imunoblotting para COUP-TF II. Na avaliação das células que possuía o gene Knockout para COUP-TF II observou-se uma diminuição da expressão quando comparada com o grupo que continha o gene super expresso para COUP-TF II. As células do grupo PC12 selvagem e Sh Controle não apresentaram diferenças em ambos os grupos, como visto em B. (***P< 0.001)
Figura 29: Medições dos prolongamentos realizadas com 5 dias de cultivo. Media das
freqüências dadas entre contatos corpos celulares e entre corpos celulares e as interseções. Observa-se em B (Rescue), maior comprimento e número de neuritos quando comparadas com o grupo silenciado (Sh Coup), em D, as quais apresentaram apenas brotamentos neuríticos. Em A, observamos o grupo PC12 normal e em C o grupo Sh controle.
