Síntese de ésteres derivados de triterpenos e esteroides com potencial atividade biológica

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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

MARCELO ÁLISON SOUSA DOS SANTOS

SÍNTESE DE ÉSTERES DERIVADOS DE TRITERPENOS E

ESTEROIDES COM POTENCIAL ATIVIDADE BIOLÓGICA.

Salvador

2015

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MARCELO ÁLISON SOUSA DOS SANTOS

SÍNTESE DE ÉSTERES DERIVADOS DE TRITERPENOS E

ESTEROIDES COM POTENCIAL ATIVIDADE BIOLÓGICA.

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química, Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do grau de Doutor em Química.

Orientador: Prof. Dr. Maurício Moraes Victor

Salvador

2015

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Sistema de Bibliotecas da UFBA

S237 Santos, Marcelo Álison Sousa dos.

Síntese de ésteres derivados de triterpenos e esteroides com potencial atividade biológica / Marcelo Álison Sousa dos Santos. - 2015.

242 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Maurício Moraes Victor.

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À dedicatória

Dedico esta tese a meu avô Venâncio Rodrigues (in memoriam). Sempre falo para meus colegas que se ao final de uma vida como pesquisador conseguir sintetizar um, apenas um tipo de molécula capaz de tornar efetivo o tratamento e cura do câncer, terei cumprido minha

missão como pesquisador. Desejo isso em legado a história de meu avô cuja vida foi encerrada pela doença e em benefício a milhares de pessoas que sofrem e possivelmente

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AGRADECIMENTOS

Este espaço é extremamente especial. É reservado para agradecer às pessoas que de alguma forma se envolveram com este trabalho..

Começarei então, citando aquelas que contribuíram no quesito profissional e técnico viabilizando as condições necessárias para que o trabalho fosse realizado ou fornecendo amostras precursoras, ou fazendo análises espectroscópicas ou espectrométricas, ou revisando/avaliando a tese.

 Aos Profs. Dra Marizeth Libório e Prof Dr. André Barreiros pelas mistura precursora de α e β amirina para o desenvolvimento de um trabalho em parceria.

 Ao Prof. Jorge Maurício David e seu aluno de mestrado Klauber Cardoso por fornecerem o precursor lupeol.

 Ao Fabio Ribeiro – aluno da UNICAMP – pela análise espectrometria de massas de alta resolução.

 Ao Prof. Dr. Frederico Guaré, coordenador do LABAREMN – IQ/UFBA e ao técnico Heiter Boness o meu muito obrigado por efetuarem as análises de ressonância magnética nuclear.

 A CAPES pela bolsa de doutorado entre maio de 2011 e maio de 2013 e ao Programa de Pós-Graduação em Química da Universidade Federal da Bahia (PPGQUIM - UFBA) por dar andamento trâmites necessários para a titulação de doutor em química pela UFBA.

 Aos membros da banca examinadora

 A Jucarlos Alves Santos pela adequação da tese às normas da ABNT.

 Prof. Msc. Carlos Daniel IFBA-SSA pela revisão da introdução e Prof. Msc. Emanoel Igor pela revisão técnica da introdução e discussão da dissertação.

Agora, citarei nomes de pessoas que não fazem parte do âmbito da pesquisa, porém, sem a existência deles, eu não estaria aqui escrevendo este agradecimento.

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 A meus pais, Antônio Sousa e Maria da Glória Sousa e meu irmão, que me acompanham e por tentarem sugerir alivio para as noites perdidas com conselhos para que eu fosse descansar. Vocês são minha família e sem vocês este sonho não se tornaria realidade.  Não poderia deixar de falar de meus avós, Saturnina Pereira (in memorian), Hildete Sousa (in memorian), Venâncio Rodrigues (in memorian). Em especial meu avô que morreu de câncer, cuja cura é um dos objetos alvo deste trabalho.

 Prof. Dra. Adelaide Maria Vieira Viveiros IQ/UFBA. Adelaide é minha amiga e conselheira. Foi minha professora de Química Geral, primeira disciplina de química que cursei na graduação e é, para mim, a tradução em pessoa de competência profissional, humildade, critério, rigor, amizade, honestidade e, acima de tudo, humanidade. Agradeço imensamente a Deus por ter colocado Adelaide em minha vida e agradeço a Adelaide por ter aceitado fazer parte dela.

Existem também, aquelas pessoas que, além do envolvimento pessoal acompanharam mais de perto a execução deste trabalho.

 Colegas do laboratório do GPSQ (Grupo de Pesquisa em Síntese Química) coordenado pelo Prof. Dr. Maurício Moraes Victor IQ/UFBA. Cito, Maria Kuliakita, Galber, Jaqueline Reis, Jaqueline Rosa, Ravir, Jaqueline França, Ana Clara Magalhães, Ananda Ribeiro, Cintia Lima, Éderson, Duane, Uchôa, dentre outros. Vocês foram pessoas que dividiram ansiedades, sorrisos, compartilharam momentos que aliviaram as tensões inerentes à execução do referido trabalho.

 Ao Prof. Dr. Jorge Maurício David. Professor Jorge foi quem abriu as portas na química orgânica para que eu desenvolvesse o mestrado. Por conseguinte, no doutorado, embora não tenha sido meu orientador, sempre se mostrou preocupado com o andamento do trabalho reiterando e fortalecendo a relação de amizade. Obrigado professor. Sua amizade é valiosa pra mim.

 Prof. Dr. Maurício Moraes Victor IQ/UFBA - meu orientador. Um fator que muitas vezes vem como determinante na execução de um trabalho dessa natureza, além de empenho e dedicação é relação aluno / orientador. Nossa relação sempre foi amistosa e isso foi importantíssimo para execução deste trabalho. Além da amizade, destaco a confiança que recebi após ter sido aprovado no concurso para professor DE efetivo do Instituto Federal da Bahia. Mesmo tendo um histórico no grupo como um aluno cumpridor de prazos, situações como essa sempre deixam os orientadores temerosos quanto ao andamento do trabalho; isso

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pelo simples fato de que inevitavelmente o tempo e o foco do aluno não estarão mais unicamente voltados para a execução do projeto. Eu pude contar com a confiança de Maurício e, devido à abertura de um processo interno, com a liberação pelo IFBA no último ano de doutorado. Essa liberação propiciou a execução de 70 % deste trabalho. Para consegui-la houve um período anterior de bastante desgaste na minha instituição de origem; desgaste necessário para conseguir e garantir a vigência do período afastado e, portanto, a dedicação plena e exclusiva para execução deste projeto. Nesse momento, o apoio de Maurício e de colegas professores do IFBA que acompanharam toda minha movimentação interna foi fundamental. É preciso relatar sobre sua (do Prof. Maurício) disponibilidade e dedicação que foram indispensáveis para que o tempo de afastamento do IFBA fosse utilizado da maneira mais eficiente. Eis, nesta tese, o fruto de toda dedicação, empenho e esforço de todos. Muito obrigado Maurício pela confiança. Ainda teremos artigos para produzir e parcerias promissoras em trabalhos futuros (o aparelho de ressonância magnética do IFBA em fase final de instalação, risos).

 Aos professores do IFBA que apoiaram meu processo de afastamento. Luisa Senna, Luiz Forte, Raigenis Fiuza, Roseli, Marcela Soares, Patrícia Medeiros, Livia Gozzer, Waneska Cunha, dentre outros. Obrigado.

 Agradeço imensamente a Deus por me ter dado o dom da vida e a capacidade de realizar este sonho e muitos outros.

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RESUMO

A síntese de novos compostos de produtos naturais bioativos abre um amplo espectro de possibilidades estratégicas no que se refere a modular ou mesmo descobrir novas propriedades. Triterpenos e esteroides são conhecidos por suas atividades biológicas. A síntese de derivados dessas substâncias propicia a obtenção de novos compostos que podem ser mais ativos do que seus precursores. Este trabalho descreve a síntese de quarenta bromoésteres e α-aminoésteres derivados dos esteroides β-sitosterol e estigmasterol (em mistura 7:3), da substância estigmasteriol, e dos triterpenos α e β amirina (em mistura 1:1), lupeol, ácido ursólico e ácido betulínico, a maioria sendo inédita. Os derivados obtidos foram caracterizados por espectrometria de massas de alta resolução, espectroscopia na região do de infravermelho, espectroscopia de ressonância magnética nuclear de 1H e 13C. Também foram efetuadas medidas de ponto de fusão e [α]D. Os derivados serão submetidos a teste de

atividade anti-HIV, atividade anti-proliferativa frente a determinadas linhagens de células tumorais e teste de atividade tripanocida.

Palavras-chave: Esteroides, Triterpenos, Lupeol, Ácido Betulínico, Ácido ursólico, α aminina,

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ABSTRACT

The synthesis of new compounds from bioactivity natural products opens a large spectrum of strategic possibilities in terms of modulating or even thought find new properties. Triterpenes and steroids are known for their biological activities. The synthesis provides derivatives of these substances to obtain new compounds which may be more active than their precursors. This work describes the synthesis and forty bromoésteres α-amino esters derivatives of steroids -sitosterol and stigmasterol (7:3 in mixture) of estigmasteriol substance, of triterpenes α and β amyrin (1:1 in mixture), lupeol, ursolic acid and betulinic acid, the most being unprecedented. The derivatives were characterized by spectrometry of high resolution mass spectroscopy, infrared spectroscopy, nuclear magnetic resonance of 1H and 13 C. They were also performed melting point measurements and [α]D. The derivatives

will submitted to anti-HIV activity test, anti-proliferative activity against certain cancer cell lines and trypanocide activity test.

Keywords: steroids, titerpenes, lupeol, betulinic acid, ursolic acid, α e β amyrin, sitosterol and stigmasterol.

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SÍMBOLOS E ABREVIATURAS

SÍMBOLO SIGNIFICADO

CC Cromatografia em coluna

CCD Cromatografia em camada delgada

DCM Diclorometano

MeCN Acetonitrilina

IV Infravermelho

RMN Ressonância Magnética Nuclear

Hz Hertz

J Constante de acoplamento

Mg Miligrama

PF Ponto de fusão

PPM Parte por milhão

Rf Fator de retenção δ Deslocamento químico em ppm ºC Graus Célsius THF Tetrahidrofurano PE Ponto de ebulição DMF Dimetilformamida

t.a Temperatura ambiente

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LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1. Síntese de 21 e 22 11

a) anidrido 2,2-dimetilsuccinico, DMAP, DMF, 70ºC. b) brometo de propagila, Cs2CO3,

DMF, THF (1:1). c) AZT, Cu, CuSO4.5H2O, H2O, t-BuOH, N2

Esquema 2A. 24

(a) HCOOH/HClO4/(CH2CO)2O; (b) (CH2CO)2O/Piridina; (c) C6H4COCl/C6H6; (d)

C6H5CHCHCOCl/ CH2Cl2;(e) reagente de Jones

Esquema 2B. 25

Derivados de α e β amirina. (a) 60/61 Anidrido benzoico, Piridina, refluxo, 50 ºC, éter etílico, 8 h. (b) 62/63 Anidrido succínico, DMAP, refluxo, 50 ºC, CH2Cl2, 8 h; (c) 64/65 Anidrido

maleico, refluxo, 50 ºC, CH2Cl2, 8 h; 66/67 Anidrido glutárico, DMAP, refluxo, 50 ºC,

CH2Cl2, 8 h Esquema 03. Formação do 81 41 Esquema 04. Formação do 82 46 Esquema 05. Síntese do 83 52 Esquema 06. Síntese do 84 58 Esquema 07. Síntese da 85 64 Esquema 08. Síntese do 86 70 Esquema 09. Síntese do 87 76 Esquema 10. Síntese do 88 82

Esquema 11. Formação da mistura de 81 e 89 93

Esquema 13. Síntese da mistura de 83 e 91 103

(13)

Esquema 27. Formação do 113 190

Esquema 28. Formação do (117) 194

Esquema 29. Síntese do (119) 199

Esquema 30. Síntese de (120) 204

Esquema 31. Primeira tentativa de obtenção do fragmento C1-C5 229

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Pessoas vivendo com HIV-AIDS por países, 2013 01

Figura 2. Pessoas vivendo com HIV na América Latina 02

Figura 3. Ciclo de replicação viral 03

Figura 4. Triterpenos e esteroides com atividade biológica 05

Figura 5. Estrutura do ácido betulínico (1) com numerações convencionais e esqueleto

lupano 06

Figura 6. Estrutura da betulina 06

Figura 7. Estrutura do acido dihidrobetulínico e do ácido 3,3 dimetilsuccinilbetulínico

ou ©Bevirimat 08

Figura 8. Estrutura de derivados do ácido betulínico com amidas substituídas em C-17 09 Figura 9. Estrutura de derivados do ácido betulínico com substituintes

3,28-di-O-dimetilsuccicil 09

Figura 10. Estrutura do derivado 3,28-di-O(3,3 dimetilglutaril)betulínico 10

Figura 11. Derivados polifuncionalizados do ácido betulínico substituídos em C-17 12

Figura 12. Derivado do ácido betulínico com grupo 3-O-ftálico substituído 13

Figura 13. Estrutura de derivados com anel A aberto 13

Figura 14. Estrutura do ácido ursólico 15

Figura 15. Estrutura de derivados do ácido ursólico 3-O-acilados 17

Figura 16. Derivados polifuncionalizados do ácido usólico 17

Figura 17. Estrutura de derivados do ácido ursólico 18

Figura 18. Relação entre estrutura molecular e atividade citotóxica para triterpenos

de esqueleto oleano e ursano 19

Figura 19. Estrutura do Lupeol 20

Figura 20. Estrutura do derivado esterificado do lupeol 21

Figura 21. Estrutura de derivados esterificados do lupeol 21

Figura 22. Derivado propagílico do lupeol 22

Figura 23. Estruturas da α e β amirina 23

Figura 24. Estrutura do β-sitosterol (6) e do estigmasterol (7) 26

Figura 25. Derivados epoxidados e hidroxilados do estigmasterol 27

Figura 26. Derivado oxidado e esterificado do β-sitosterol 28

(15)

Figura 28. Estrutura do (7) com as numerações convencionais 36

Figura 29. Espectro de infravermelho do (7) (KBr, cm-1) 36

Figura 30. Espectro de RMN de 1H do (7) [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 40

Figura 31. Espectro de RMN de 13C do (7) [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 40

Figura 32. Estrutura do (81) 41

Figura 33. Espectro de infravermelho do 81 (KBr, cm-1) 42

Figura 34. Espectro de RMN de 1H do 81 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 45

Figura 35. Espectro de RMN de 13C do 81 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 45

Figura 36. Estrutura do 82 46

Figura 40. Espectro de massas do 82 51

Figura 42. Espectro de infravermelho do 83 (KBr, cm-1₎ ₅₃

Figura 43. Espectro de RMN de 1_{H de 83 [(500 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 56 Figura 44. Espectro de RMN de 13_{C de 83 [(125 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 56

Figura 45. Expansão do espectro de massas do 83 57

Figura 50. Espectro de massas para 84 63

Figura 55. Espectro de massas do 85 69

Figura 59. Espectro de RMN de 1H de 86 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 74

Figura 60. Espectro de RMN 13C de 86 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 74

(16)

Figura 65. Espectro de RMN de 1H de 87 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 80

Figura 66. Espectro de RMN de 13C de 87 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 80

Figura 67. Espectro de massas da 87 81

Figura 72. Espectro de massas de 88 87

Figura 73. Estrutura do 6 (C22-C23) e 7 (C22=C23) com as respectivas

numerações convencionais 88

Figura 74. Espectro de infravermelho da mistura de 6 e 7 (KBr, cm-1) 89

Figura 75. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 6 e 7. [(500 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 92 Figura 76. Espectro de RMN de 13_{C da mistura de 6 e 7. [(125 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 92

Figura 77. Estrutura do 81 (C22=C23) e 89 (C22-C23) 93

Figura 78. Espectro de Infravermelho da mistura de 81 e 89 (em azul) e espectro

da mistura precursora (em vermelho) (KBr, cm-1) 94

Figura 79. Espectro de RMN de 1H da mistura de 81 e 89 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 97 Figura 80. Espectro de RMN de 13C da mistura de 81 e 89 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 97

Figura 81. Estruturas do 82 e 90 (à direita) 98

Figura 85. Estrutura de 83 (C22=C23) e 91 (C22-C23) 103

Figura 89. Estruturas do 84 (C22=C23) e 92 (C22-C23) 108

Figura 91. Espectro de RMN de 1H de 84 e 92 112

Figura 92. Espectro de RMN de 13C da mistura de 84 e 92 112

(17)

Figura 94. Espectro de infravermelho da mistura de 85 e 93 (em vermelho) e do

precursor (em azul) (KBr, cm-1) 114

Figura 97. Estrutura do 86 (C22=C23) e 94 (C22-C23) 118

Figura 101. Estrutura do 87 (C22=23) e 95 (C22-C23) 123

Figura 103. Espectro de RMN de 1H da mistura de 87 e 95 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 127 Figura 104. Espectro de RMN de 13C da mistura de 87 e 95 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 127

Figura 105. Estrutura do 88 (C22=23) e 96 (C22-C23) 128

Figura 106. Espectro de infravermelho da mistura 88 e 96 (KBr, cm-1) 129

Figura 107. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 88 e 96 [(500 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 132 Figura 108. Espectro de RMN de 13_{C da mistura de 88 e 96 [(125 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 132

Figura 109. Estrutura da α e β amirina com as numerações convencionais 133

Figura 111. Espectro de RMN de 1H da mistura de 4 e 5 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 137

Figura 112. Espectro de RMN de 13C de 4 e 5 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 137

Figura 113. Estrutura do 97 e 105 138

Figura 115. Espectro de RMN de 1H da mistura de 97 e 105 [(500 MHz, CDCl3,

δ (ppm)] 141

Figura 116. Espectro de RMN de 13C da mistura de 97 e 105 [(125 MHz, CDCl3,

δ (ppm)] 141

δ (ppm)] 146

Figura 121. Espectro de massas da mistura de 98 e 106 147

(18)

δ (ppm)] 152

Figura 127. Estrutura de 100 e 108 154

δ (ppm)] 158

δ(ppm)] 158

Figura 133. Espectro de infravermelho da mistura de 101 e 109 (KBr, cm-1₎ ₁₆₁

Figura 134. Espectro de RMN de 1_{H da mistura de 101 e 109 [(500 MHz, CDCl}

3,

δ (ppm)] 164

Figura 137. Estrutura da 102 e 110 166

δ (ppm)] 170

Figura 142. Estrutura da 103 e 111 172

Figura 143. Espectro da mistura de 103 e 111 (KBr, cm-1) 173

δ (ppm)] 176

(19)

Figura 147. Estrutura de 104 e 112 178

δ (ppm)] 182

Figura 152. Procedimento laboratorial inicial para obtenção dos extratos orgânicos

da Bowdichia virgilioides 185

Figura 153. Estrutura proposta para BV-3 185

Figura 154. Espectro de infravermelho para BV-3 186

Figura 155. Espectro de RMN de 1H de BV-3 [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 189

Figura 156. Espectro de 13C de BV-3 [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 189

Figura 158. Espectro de infravermelho do 113 (KBr, cm-1₎ ₁₉₁

Figura 159. Espectro de 1_{H de 113 [(500 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 193

Figura 160. Espectro de 13_{C do 113 [(125 MHz, CDCl}

3, δ (ppm)] 193

Figura 161. Estrutrura do (117) 194

Figura 162. Espectro de infravermelho de (117) (KBr, cm-1) 195

Figura 163. Espectro de RMN de 1H de (117) [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 197

Figura 164. Espectro de RMN de 13C do (117) (125 MHz, CDCl3) 197

Figura 165. Espectro de massas de (117) 198

Figura 166. Estrutura do (119) 199

Figura 167. Espectro de infravermelho do (119) (KBr, cm-1) 200

Figura 168. Espectro de RMN de 1H do (119) [(500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 202

Figura 169. Espectro de RMN de 13C do (119) [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 202

Figura 170. Espectro de massas do (119) 203

Figura 171. Estrutura de (120) 204

Figura 172. Espectro de infravermelho de (120) (KBr, cm-1) 205

Figura 173. Espectro de RMN de 1H de (120) [500 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 208

Figura 174. Espectro de RMN de 13C de (120) [(125 MHz, CDCl3, δ (ppm)] 208

Figura 175. Espectro de massas de (120) 209

Figura 176. Espectro de infravermelho do 114 218

(20)

Figura 181. Espectro de infravermelho do 122 220

Figura 188. Espectro de massas do 114 222

Figura 192. Família das decarestrictinas 225

Figura 193. Calicheamicina (1) Altromicine B (2). R1 = A, R2= OH R3 = N(CH3)2 226

Figura 194. Análise retrossintética da decarestrictina K 227

Figura 195. Proposta de síntese dos antibióticos híbridos com L-rhodinal 228

Figura 196. Artigo Convergent of 3,6-Dihydroxydec-4-enolides 230

Figura 197. Rota empregada na síntese da decarestrictina K por Willis e colaboradores 231 Figura 198. Espectro de RMN de 1H do 137 [material bruto] [(300 MHz, CDCl3,

δ (ppm)] 232

Figura 199. Espectro de RMN de 13C do 137 [material bruto] [(75 MHz, CDCl3,

δ (ppm)] 233

Figura 200. Espectro de RMN de 1H do 138 [material bruto] [(300 MHz, CDCl3,

δ (ppm)] 234

Figura 202. Espectro de RMN de 1H do 141 [material bruto] [500 MHz, CDCl3,

δ (ppm)] 236

(21)

Figura 206. Espectro de 13C do 142 (CDCl3, 125 MHz) 238

Figura 207. Espectro de infravermelho do cetal (Filme, cm-1) 239

(22)

LISTA DE TABELAS

Tabela 01. Valores de IC50 para linhagens de células tumorais frente ao ácido ursólico 16

Tabela 02. Substâncias usadas neste trabalho 32

Tabela 03. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (7) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 39 Tabela 04. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (81) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 44 Tabela 05. Dados de RMN de 1_{H (500 MHz) e de}13_{C (125 MHz) do (82) [CDCl} 3, J (Hz), δ (ppm)] 49 Tabela 06. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (83) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 55 Tabela 07. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (84) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 61 Tabela 08. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (85) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 67 Tabela 09. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (86) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 73 Tabela 10. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (87) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 79 Tabela 11. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do (88) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 85

Tabela 12. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) da mistura de (6)

e (7) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 91

e (89) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 96

e (90) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 101

Tabela 15. Dados de RMN de 1_{H (500 MHz) e de}13_{C (125 MHz) da mistura de (83)}

e (91) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 106

(23)

e (93) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 116

e (94) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 121

e (95) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 126

e (96) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 131

e (5) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 136

e (105) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 140

e (106) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 145

e (107) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 151

e (108) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 157

e (109) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 163

e (110) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 169

e (111) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 175

e (112) [CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 181

Tabela 30. Relação das frações obtidas mais os agrupamentos feitos a partir da

purificação dos extrato metanólico de Bowdichia virgilioides 184 Tabela 31. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) do lupeol (3)

[CDCl3, J (Hz), δ (ppm)] 188

Tabela 32. Dados de RMN de 1H (500 MHz) e de 13C (125 MHz) de (113) [CDCl3,

J (Hz), δ (ppm)] 192

(24)

J (Hz), δ (ppm)] 201

J (Hz), δ (ppm)] 207

Tabela 36. Dados complementares para caracterização dos compostos 114-116, 118,

121-128 218

(25)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 01 2. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVA 29 3. MATERIAIS 32 4. MÉTODOS 33 5. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 34

6. RESULTADOS E DISCUSSÃO ESTIGMASTEROL E DERIVADOS 36

6.1 Estigmasterol

6.1.1 Espectroscopia na região do infravermelho 36 6.1.2 Espectroscopia de RMN de 1H 37 6.1.3 Espectroscopia de RMN de 13C 38 6.2 Bromoacetato de estigmasterila 41

6.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho 41 6.2.2 Espectroscopia de RMN de 1H 42 6.2.3 Espectroscopia de RMN de 13C 43 6.3 2-dietilamin-1-il acetato de estigmasterila 46

6.3.1 Espectroscopia na região do infravermelho 46 6.3.2 Espectroscopia de RMN de 1H 47 6.3.3 Espectroscopia de RMN de 13C 48 6.3.4 Espectrometria de massas de alta resolução 51 6.4 2-piperidin-1-il acetato de estigmasterola 52

6.4.1 Espectroscopia na região do infravermelho 52 6.4.2 Espectroscopia de RMN de 1H 53 6.4.3 Espectroscopia de RMN de 13C 54 6.4.4 Espectrometria de massas de alta resolução 57 6.5 2-morfolin-1-il acetato de estigmasterila 58

6.5.1 Espectroscopia na região do infravermelho 58 6.5.2 Espectroscopia de RMN de 1_{H 59}

6.5.3 Espectroscopia de RMN de 13C 59 6.5.4 Espectrometria de massas de alta resolução 63 6.6 2-pirrolidin-1-il acetato de estigmasterila 64

(26)

6.6.1 Espectroscopia na região do infravermelho 64 6.6.2 Espectroscopia de RMN de 1H 65 6.6.3 Espectroscopia de RMN de 13C 66 6.6.4 Espectrometria de massas de alta resolução 69 6.7 2-anilin-1-il acetato de estigmasterila 70

6.7.1 Espectroscopia na região do infravermelho 70 6.7.2 Espectroscopia de RMN de 1H 71 6.7.3 Espectroscopia de RMN de 13C 72 6.7.4 Espectrometria de massas de alta resolução 75 6.8 2-benzilamin-1-il acetato de estigmasterila 76

6.8.1 Espectroscopia na região do infravermelho 76 6.8.2 Espectroscopia de RMN de 1H 77 6.8.3 Espectroscopia de RMN de 13C 78 6.8.4 Espectrometria de massas de alta resolução 81 6.9 2-imidazo-1-il acetato de estigmasterila 82

6.9.3 Espectroscopia de RMN de 13C 84 6.9.4 Espectrometria de massas de alta resolução 87

7. RESULTADOS E DISCUSSÃO – MISTURA DE β SITOSTEROL E 88

ESTIGMASTEROL E DERIVADOS

7.1 Mistura β Sitosterol e Estigmasterol 88

7.1.1 Espectroscopia na região do infravermelho 88 7.1.2 Espectroscopia de RMN de 1H 89 7.1.3 Espectroscopia de RMN de 13C 90

7.2 Mistura de Bromoacetato de β sitsoterola e bromoacetato de estigmasterila 93

7.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho 93 7.2.2 Espectroscopia de RMN de 1H 94 7.2.3 Espectroscopia de RMN de 13C 95 7.3 Mistura de 2-dietilamin1-il acetato de β sitosterila e 2-dietilamin-1-il acetato

de Estigmasterila 98

7.3.1 Espectroscopia na região do infravermelho 98 7.3.2 Espectroscopia de RMN de 1H 99

(27)

7.3.3 Espectroscopia de RMN de 13C 100 7.4 Mistura de 2-piperidin-1-il acetato de β sitosterila e 2-piperidin-1-il acetato

7.4.1 Espectroscopia na região do infravermelho 103 7.4.2 Espectroscopia de RMN de 1H 104 7.4.3 Espectroscopia de RMN de 13C 105 7.5 Mistura de 2-morfolin-1-il acetato de β sitosterila e 2-morfolin-1-il acetato

7.5.1 Espectroscopia na região do infravermelho 108 7.5.2 Espectroscopia de RMN de 1H 109 7.5.3 Espectroscopia de RMN de 13C 110 7.6 Mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de β sitosterila e 2-pirrolidin-1-il acetato

7.6.3 Espectroscopia de RMN de 13_{C 115}

7.7 Mistura de 2-morfolin-1-il acetato de β sitosterila e 2-anilin-1-il acetato de Estigmasterila 118

7.7.1 Espectroscopia na região do infravermelho 118 7.7.2 Espectroscopia de RMN de 1H 119 7.7.3 Espectroscopia de RMN de 13C 120 7.8 Mistura de 2- benzilamin-1-il acetato de β sitosterila e 2-benzilamin-1-il

acetato de estigmasterila 123

7.8.1 Espectroscopia na região do infravermelho 123 7.8.2 Espectroscopia de RMN de 1H 124 7.8.3 Espectroscopia de RMN de 13C 125 7.9 Mistura de 2-imidazo-1-il acetato de β sitosterila e 2-imidazo-1-il acetato

(28)

8. RESULTADOS E DISCUSSÃO – MISTURA DE α E β AMIRINA E E 133 DERIVADOS

8.1 Mistura de α e β amirina. 133

8.2 Mistura de bromoacetato de α amirinila e bromoacetato de β amirinila 138

8.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho 138 8.2.2 Espectroscopia de RMN de 1H 139 8.2.3 Espectroscopia de RMN de 13C 139 8.3 Mistura de 2-dietilamin-1-il acetato de α amirinila e 2-dietilamin-1-il acetato

de β amirinila 142

8.3.1 Espectroscopia na região do infravermelho 142 8.3.2 Espectroscopia de RMN de 1H 143 8.3.3 Espectroscopia de RMN de 13_{C 143}

8.3.4 Espectrometria de massas de alta resolução 147 8.4 Mistura de 2-piperidin-1-il acetato de α amirinila e 2-piperidin-1-il acetato

8.4.1 Espectroscopia na região do infravermelho 148 8.4.2 Espectroscopia de RMN de 1H 149 8.4.3 Espectroscopia de RMN de 13C 149 8.4.4 Espectrometria de massas de alta resolução 153 8.5 Mistura de 2-morfolin-1-il acetato de α amirinila e 2-morfolin-1-il acetato

8.5.1 Espectroscopia na região do infravermelho 154 8.5.2 Espectroscopia de RMN de 1H 155 8.5.3 Espectroscopia de RMN de 13C 155 8.5.4 Espectrometria de massas de alta resolução 159 8.6 Mistura de 2-pirrolidin-1-il acetato de α amirinila e 2-pirrolidin-1-il acetato

8.6.1 Espectroscopia na região do infravermelho 160 8.6.2 Espectroscopia de RMN de 1H 161 8.6.3 Espectroscopia de RMN de 13C 161 8.6.4 Espectrometria de massas de alta resolução 165

(29)

8.7 Mistura de 2-anilin-1-il acetato de α amirinila e 2-anilin-1-il acetato de β

Amirinila 166

8.7.1 Espectroscopia na região do infravermelho 166 8.7.2 Espectroscopia de RMN de 1H 167 8.7.3 Espectroscopia de RMN de 13C 167 8.7.4 Espectrometria de massas de alta resolução 171 8.8 Mistura de 2-benzilamin-1-il acetato de α amirinila e 2-benzilamin-1-il acetato

8.8.1 Espectroscopia na região do infravermelho 172 8.8.2 Espectroscopia de RMN de 1H 173 8.8.3 Espectroscopia de RMN de 13C 173 8.8.4 Espectrometria de massas de alta resolução 177 8.9 Mistura de 2-imidazo-1-il acetato de α amirinila e 2-imidazo-1-il acetato de β

amirinila. 178

8.9.3 Espectroscopia de RMN de 13_{C 179}

8.9.4 Espectrometria de massas de alta resolução 183

9. RESULTADOS E DISCUSSÃO LUPEOL E DERIVADOS 184

9.1 Lupeol 184

9.1.1 Espectroscopia na região do infravermelho 186 9.1.2 Espectroscopia de RMN de 1H 187 9.1.3 Espectroscopia de RMN de 13C 187 9.2 Bromoacetato de lupeoíla 190

10. RESULTADOS E DISCUSSÃO ÁCIDO BETULÍNICO E DERIVADOS

10.1 Bromoacetato de betulinila 194 10.1.1 Espectroscopia na região do infravermelho 194 10.1.2 Espectroscopia de RMN de 1H 195 10.1.3 Espectroscopia de RMN de 13C 195 10.1.4 Espectrometria de massas de alta resolução 198

(30)

10.2 2-benzilamin-1-il acetato de betulinila 199 10.2.1 Espectroscopia na região do infravermelho 199 10.2.2 Espectroscopia de RMN de 1H 200 10.2.3 Espectroscopia de RMN de 13C 200 10.2.4 Espectrometria de massas de alta resolução 203 10.3 2-imidazo-1-il acetato de betulinila. 204 10.3.1 Espectroscopia na região do infravermelho 204 10.3.2 Espectroscopia de RMN de 1H 205 10.3.3 Espectroscopia de RMN de 13C 205 10.3.4 Espectrometria de massas de alta resolução 209

11. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS 210

12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 212

13. APÊNDICE I – Trabalho em Conclusão 218

(31)

1

1. INTRODUÇÃO

PANORAMA GLOBAL DA AIDS.

A Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS) é uma doença grave causada pelo vírus da Imunodeficiência Humana (HIV), que desde seu surgimento na década de 1980 vêm se constituindo como uma epidemia mundial, de caráter pandêmico, marcada por transformações epidemiológicas e processos como a pauperização, feminização, heterossexualização, interiorização e juvenilização da doença. Desde 1980 já vitimou 22 milhões de pessoas no mundo, perdendo apenas para epidemias como a tuberculose (1 bilhão), varíola (300 milhões) e peste negra (50 milhões). Dados do Programa Conjunto das Nações Unidas sobre HIV/AIDS (UNAIDS) estimam que atualmente 35,3 milhões de pessoas vivem com HIV no mundo, nesse sentido, a AIDS continua sendo um dos grandes desafios para a saúde púbica, reforçado pela estimativa de 2,5 milhões de novas infecções anuais1.

Os índices por continente revelam que 15 países são responsáveis por 75% do total de infectados. Desses, grande parte são países do sul da África, seguido por países do sul e sudeste da Ásia, leste Europeu, Ásia central, América do Norte, América Latina, Norte da África, Oriente Médio, Caribe e Oceania (Figura 1).

Figura 1. Pessoas vivendo com HIV-AIDS por países, 2013. FONTE: The Gap Report-UNAIDS

Na América Latina, estima-se atualmente que 1,6 milhões de pessoas vivem com o vírus HIV, sendo que 75% desse quantitativo distribui-se entre países como Brasil (47%) México (11%), Colômbia (9%) e Venezuela (7%)1. (Figura 2).

(32)

2

Figura 2. Pessoas vivendo com HIV na América Latina. FONTE: The Gap Report – UNAIDS.

Dados mais animadores aparecem quando se considera o número de pessoas acessando o tratamento e o número de mortes relacionadas à AIDS dos últimos 10 anos. Estima-se que o número de mortes reduziu de 2,3 para 1,6 milhões/ano. Isso também devido ao número de pessoas fazendo uso de medicamentos antirretrovirais, que aumentou de 1,3 para 12,9 milhões nos últimos 10 anos. A quantidade de novos infectados também reduziu de 3,4 para 2,3 milhões/ano. Entre crianças reduziu de 550 mil para 260 mil/ano, entretanto, estes números estão bastante distantes no que se refere ao controle e extinção da epidemia1.

Especialistas acreditam que a epidemia possa ser controlada até 2030, entretanto relatórios2 da Organização das Nações Unidas (ONU) e do Ministério da Saúde apontam que os novos casos de infecção pelo HIV e de mortes associadas à doença cresceram no Brasil nos últimos oito anos, ou seja, a tendência do país é contrária à global. Possíveis causas podem ser citadas como: sexo desprotegido, banalização do possível uso da profilaxia pós-exposição. Na América Latina, houve uma pequena queda dos novos casos da infecção pelo HIV de 2% entre 2005 e 2013 em países como México, Colômbia e Venezuela, diferentemente do que ocorreu no Brasil, no Chile e no Paraguai.

De acordo com a UNAIDS dez novas infecções pelo HIV acontecem a cada hora, e pelo menos um terço dos novos casos da doença ocorre entre jovens de 15 a 24 anos. Esse fato somado ao fato de que o vírus HIV sofre mutações tornando-se resistente aos tratamentos convencionais reforça a necessidade de novos agentes antirretrovirais. A abordagem terapêutica precede, entretanto, conhecer como ocorre a infecção pelo HIV, bem como investigar a disponibilidade de inibidores químicos potentes e específicos para inibir a replicação do vírus.

____________

1_{SIDIBÉ, M. The Gap Report. UNAIDS, 2013.}

(33)

3

CARACTERÍSTICAS DO VÍRUS DA AIDS: O HIV.

O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um vírus da classe dos retrovírus (grupo

de vírus cujo material genético é constituído por RNA), apresenta formato esférico, possui 0,1

µm de diâmetro e apresenta em sua composição dois envelopes de glicoproteínas: gp 41 e gp

120. A gp 41 é uma glicoproteína de massa molar 41 KDa que está inserida na membrana

celular; e a gp 120 uma glicoproteína de massa molar 120 KDa que encontra-se no meio extracelular, sendo ambas derivadas de gp 160. Além disso, HIV é constituído por dois

nucleocapsídeos formados predominantemente pelas proteínas p24 e p18, as quais têm função

de proteger duas fitas idênticas de RNA e três enzimas fundamentais: transcriptase reversa,

integrase e protease3.

Por meio do receptor CD4, o vírus HIV se incorpora à membrana celular e libera o conteúdo de sua cápside no citoplasma celular. Em seguida, a enzima transcriptase reversa traduz RNA viral em dupla fita de DNA. Após, a dupla fita de DNA é transportada por meio da integrase ao núcleo da célula, ou seja, a integrase promove a incorporação do DNA viral ao material genético da célula hospedeira. A partir do DNA viral incorporado, o vírus sintetiza novas moléculas de RNA e proteínas essenciais para formação de outros vírus. A ação da protease vem como determinante no sentido de catalisar, a partir das poliproteínas

gag e pol, a síntese de proteínas e enzimas estruturalmente funcionais e necessárias para o

ciclo de vida do HIV. Ou seja, sem a ação da enzima protease o vírus é imaturo e, portanto, incapaz de infectar novas células. Figura 3.

Figura 3. Ciclo de replicação viral4_.

___________

3_{JANEWAY, J. C. A.; TRAVERS, P. The Figures Database from Immunobiology: the Immune System in Health and Disease. Annals of}

the Rheum. Dis. v. 40, p. 466-469, 1996.

(34)

4

Atualmente, a maioria dos medicamentos antirretrovirais tem como finalidade inibir três classes de enzimas. São os inibidores da integrase (IN), transcriptase reversa (RT) e a

protease (PR). Quando administrados em combinação, estas três classes de medicamentos

podem efetivamente reduzir a replicação do vírus a níveis indetectáveis. A estrutura do sítio ativo dessas enzimas é composta basicamente por aminoácidos, a exemplo da protease que é composta por ácido aspártico, glicina e isoleucina. Ou seja, o desenvolvimento de novas moléculas ativas perpassa estrategicamente por investigar compostos com esse tipo de atividade já relatada na literatura e compreender aspectos da estrutura química relacionados a interação ligante-sítio ativo.

COMPOSTOS NATURAIS COM PROMISSORA ATIVIDADE BIOLÓGICA CONTRA HIV/AIDS.

Os triterpenos e esteroides são metabólitos secundários de origem natural que constituem classes de substâncias promissoras com inúmeras propriedades biológicas já relatadas na literatura. Potencializar essas propriedades significa efetuar modificações estruturais modulando: flexibilidade, rigidez, volume da molécula, funcionalidade (adição ou remoção de determinados grupos funcionais), número de sítios de ácidos e bases de Lewis e número de sítios passíveis de formar ligações de hidrogênio. Essas modificações são feitas no intuito de provocar mudanças na interação ligante-receptor e, consequentemente, alterar propriedades biológicas e farmacológicas.

Ao efetuar as modificações mencionadas é possível inclusive modular a toxicidade, o que abre a possibilidade de obter drogas com menos efeitos colaterais, o que é bastante desejável, pois os medicamentos antirretroviais existentes exibem efeitos colaterais severos tais como: diarreia, vômitos, náuseas, manchas avermelhadas pelo corpo (chamadas pelos médicos de rash cutâneo), agitação, insônia e sonhos vívidos, além de danos aos rins, fígado, estômago e intestino. Além disso, podem modificar o metabolismo, provocando lipodistrofia (mudança na distribuição de gordura pelo corpo), diabetes, entre outras doenças, reduzindo a adesão do paciente ao tratamento.

(35)

5

Entre os triterpenos com atividades biológicas promissoras, pode-se destacar o ácido betulínico (1), o ácido ursólico (2), o lupeol (3) e as α e β amirinas (4, 5). Alguns esteroides podem também ser citados, como o β-sitosterol (6) e o estigmasterol (7), pois derivados análogos constituem uma potencial classe de inibidores do HIV-1, além de suas atuações como agentes anti-câncer e outros tipos de atividade5. Figura 4.

Figura 4. Triterpenos e esteroides com atividade biológica.

HO O OH 1 HO O OH 2 HO 3 HO R₂ R R1 R, R₂= CH₃, R₁= H, ( amirina) 4 R, R₁= CH₃, R₂= H, ( amirina) 5 HO 6 HO 7 ______________

5_{FUJIOKA, T.; J. KASHIWADA, Y.; KILKUSKIE, R. E. et al. Anti-AIDS agents, 11. Betulinic acid and platanic acid as anti-HIV}

(36)

6

ÁCIDO BETULÍNICO

O ácido betulínico (1) ou ácido (3β)-3-Hidroxi-lup-20(29)-en-28-oico é um triterpeno pentacíclico. O esqueleto pentacíclico é do tipo lupano e confere ao referido ácido propriedades lipofílicas (Figura 5). Há também dois grupos hidrófilos: o grupo OH em C-3 e o grupo COOH em C-17 que, juntamente com o grupo olefínico, definem sítios de reatividade na molécula.

Figura 5. Estrutura do ácido betulínico (1) com numerações convencionais e esqueleto lupano.

O ácido betulínico (1) ocorre nas cascas de várias espécies de árvores e, na forma de betulina (8) Figura 6, está disponível na casca das bétulas branca da espécie Betula alba5. Seu primeiro relato como inibidor do HIV-1 ocorreu em 1994 quando pesquisadores da Universidade de Carolina do Norte concluíram que produtos químicos encontrados na casca da Betula retardaram o crescimento do vírus, na literatura encontram-se também relatos sobre a atividade antiproliferativa para melanoma5,6.

Figura 6. Estrutura da betulina.

_______________

6 _{PISHA, E.; CHAI, H.; LEE, I. S.; CHAGWEDERA, T. E. et al. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that}

(37)

7

Posteriormente foi indicado que essa atividade era atribuída ao ácido betulínico que atuava inibindo enzimas envolvidas no processo de replicação viral7: a transcriptase reversa8 e a protease9.

Outras atividades decorrentes da estrutura molecular do ácido betulínico podem ser destacadas como: anti-inflamatória, antibacteriana, antimalárica e antioxidante5,6. Além dessas, ácido betulínico e seus derivados exibem atividade anti-tumoral contra os vários tipos de células cancerosas tais como o melanoma (MEL2), do cólon, câncer da próstata, leucemia (U937, K562, HL60), o câncer de ovário (A2780, OVCAR-5) e carcinoma de pulmão (IGROV-1), o câncer do colo (A431, H460), carcinoma endotelial, carcinoma epidermoide oral, (células KB), câncer de mama, neuroblastoma (NB-1, SKNSH), glioblastoma (A172, U138MG, U373), meduloblastoma (MHH1, MEB1), carcinoma hepatocelular, osteosarcoma e rabdomiossarcoma10.

Na literatura, há várias modificações estruturais descritas para ácido betulínico. O objetivo delas inclui modular e potencializar as atividades biológicas, para obtenção de derivados análogos mais ativos. Alguns aspectos que relacionam determinadas alterações estruturais e sua influência na atividade anti HIV e anticâncer seguem descritos.

Perumal e colaboradores11 _{relataram que a hidrogenação da dupla C}

22=C23 do ácido

betulínico, gerando o ácido dihidrobetulínico (9) Figura 7, não aumenta muito a atividade anti HIV. EC50 = 1,4 µM para ácido betulínico (1) e EC50 = 0,9 µM. Possivelmente por não

interferir significativamente em interações hidrofóbicas com o sítio receptor das enzimas. Kashiwada e colaboradores12 descreveram a formação de acil derivados substituídos em C-3, obtidos por reação com anidrido 3,3-dimetilglutárico e anidrido glicólico em piridina e 4-dimetilaminopiridina levando à formação dos derivados (10) e (11) Figura 7 potentes frente a linfócitos infectados (ED50 ˂ 3,5 x 10-4 µM).

_____________

7 _{MAYAUX, J. F.; A, BOUSSEAU.; L, PAUWELS. et al. Triterpene derivatives that block entry of human immunodeficiency virus type 1}

into cells. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. v. 91, p. 3564, 1994.

8_{PENGSUPARP, T.; CAI, L.; FONG, H. H.; KINGHORN, A. D. et al. Pentacyclic triterpenes derived from Maprounea africana are potent}

inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. J. Nat. Prod. v. 57, p. 415, 1994.

9_{XU, H. X.; ZENG, F. Q.; WAM, M. et al. Anti-HIV triterpene acids from Geum japonicum. J. Nat. Prod. v. 59, p. 643, 1996.}

10_{JONNALAGADDA, S. C.; CORSELLO, M. A.; SLEET, C. A. Betulin-betulinic acid natural product based analogs as anti-cancer agentes.}

Anti-cancer agents in Med. Chem. v. 13, p. 1477-1499, 2013.

11_{PERUMAL, Y.; DHARMARAJAN, S. Betulinic Acid and Its Derivatives: A Review on their Biological Properties. Curr. Med. Chem. v.}

12, p. 657-666, 2005.

12_{KASHIWADA, Y.; HASHIMOTO, F.; COSENTINO, L. M. et al. Betulinic Acid and Dihydrobetulinic Acid Derivatives as Potent}

(38)

8

Evers e colaboradores13 _{sintetizaram derivados do ácido betulínico e identificaram que}

a introdução de mais um grupo OH no anel A e modificações no anel lupânico levam a considerável perda na atividade biológica, reforçando a especificidade ao anel. Algumas interações favoráveis foram observadas para substituintes como aminas primárias e secundárias e para a carboxila livre em C-17. Sun e colaboradores14 em seu trabalho envolvendo a síntese de vários derivados acilados do ácido betulínico concluíram que a acilação tem maior efeito se feita na posição C-3 e/ou C-17, com elevação substancial na seletividade e nos valores de EC50, levando a análogos mais potentes na inibição das enzimas.

Cichewicz e colaboradores15 enunciaram, com base em derivatizações feitas com o ácido betulínico, que as modificações para formações de análogos mais ativos precedem requisitos estruturais. O grupo hidroxila na posição 3β foi enunciada como essencial para a atividade anti HIV-1. Alterações neste para grupo 3α hidroxilo (epímero), 3β-metóxi, 3β amino, cetona ou derivado 3-deoxi resultam em perda na atividade10. No caso do epímero, provavelmente modificações neste centro colocam o grupo OH em posição desfavorável para interação com aminoácidos do sítio ativo da protease. Os autores também enunciaram que modificações no anel A resultam em perda da atividade devido à síntese de derivados 2-hidroxil, 2,3-dicetona e 2,3 dihidro por terem levando a compostos com perda de atividade.

_____________

13 _{EVERS, M.; POUJADE, C.; SOLER, F. et al. Betulinic acid derivatives: a new class of human immunodeficiency virus type 1 specific}

inhibitors with a new mode of action. J. Med. Chem. v. 39, p. 1069,1996.

14_{SUN, I. C.; CHEN, C. H.; KASHIWADA, Y.; WU, J. H. et al. Anti-AIDS agents 49. Synthesis, anti-HIV, and anti-fusion activities of}

IC9564 analogues based on betulinic acid J. Med. Chem. v. 45, p. 4271, 2002.

15_{CICHEWICZ, H, R.; KOUZI, R. A. Chemistry, biological activity, and chemotherapeutic potential of betulinic acid for the prevention and}

(39)

9

Evers e colaboradores16, em seu trabalho envolvendo a síntese de amidas (12-15)

Figura 8 derivadas do ácido betulínico, também sugeriram a falta de requisitos estéricos para

substituintes em C-30 dos compostos 12-15. Isso porque a atividade anti HIV-1 não mudou muito para substituintes volumoso como o grupo SCH2CH2N(Et)2 ou, um pequeno grupo OH.

Figura 8. Estrutura de derivados do ácido betulínico com amidas substituídas em C-17.

Em contrapartida, Kashiwada e colaboradores12_{em estudos com a série de derivados}

3,28-O-di-3,3 dimetilsuccinilbetulínico substituídos em C-3 e C-17 (16-19) Figura 9, mostraram que pequenas modificações nas posições de metilas no R substituinte em 3 e C-17 foram suficientes para variar entre 0,02 µM e 0,87 µM os valores de EC50, levando

inclusive à formação de um análogo tóxico (19) reiterando a importância de substituintes nessas posições. O composto mais potente 16 apresentou EC50 = 0,02 µM por inibição em

células H-9 (linfócitos) infectadas por HIV-1.

Figura 9. Estrutura de derivados do ácido betulínico com substituintes 3,28-di-O-dimetilsuccicil.

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16 _{EVERS, M.; POUJADE, C.; SOLER, F. et al. Betulinic acid derivatives: a new class of human immunodeficiency virus type 1 specific}

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10

Ainda em estudos com a série de ésteres, derivados como 3,28-O-di-3,3 dimetilglutaril de betulina (20) Figura 10 mostraram valor de IC50 = 6,6.10-1 µM. Outros ésteres como

3-O-(3,3 dimetilsuccinil) derivado do ácido betulínico mostrou potente atividade anti HIV-1, com valores de EC50 ˂ 3,5.10-4 µM, reiterando a importância da funcionalidade éster na posição

C-3. Em 2007, o ácido 3-O-(3,3 dimetilsuccinil)betulínico (10), com esforços de Delain-Bioton e colaboradores17 passou a compor a primeira classe de inibidores de maturação do vírus HIV-1 por sua notável atividade anti-HIV como o medicamento Bevirimat©.

Figura 10. Estrutura do derivado 3,28-di-O(3,3 dimetilglutaril)betulínico.

Como estratégia recente de obtenção de derivados ativos do ácido betulínico relata-se o trabalho de Bori e colaboradores18 que para conexão do fragmento AZT-Bevirimat utilizou reação click. A formação do alcino (21) a partir do ácido betulínico ocorre em duas etapas. A primeira utiliza anidrido 2,2 dimetilsuccinico, DMAP, DMF, 70ºC. A segunda utiliza brometo de propagila, Cs2CO3, DMF/THF (1:1), t.a. A formação do híbrido Bevirimat-AZT (19)

ocorre em uma etapa utilizando AZT, Cu, CuSO4.5H2O, t-BuOH, em atmosfera inerte. Os

compostos 21 e 22 (EC50 = 0,1 µM e 0,067 µM, respectivamente) sintetizados mostraram

atividade comparável à atividade já descrita para o AZT (EC50 = 0,1µM). Esquema 1.

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17 _{DELAIN-BIOTON, L.; VILLEMIN, D.; LOHIER, J.F. et al. Synthesis of triazolyl-alkylphosphonate starting from}

ω-azidoalkylphosphonates or ω-alkynylphosphonates. Tetrahedron Lett. v. 63, p. 9677–9684. 2007.

18_{BORI, I. D.; HUNG, H. Y.; KIAN, K. et al. Anti-AIDS agents 88. Anti-HIV conjugates of betulin and betulinic acid with AZT prepared}

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11

Esquema 1. Síntese de 21 e 22. a) anidrido 2,2-dimetilsuccinico, DMAP, DMF, 70ºC. b) brometo de propagila,

Cs2CO3, DMF, THF (1:1), 43%. c) AZT, Cu, CuSO4.5H2O, H2O, t-BuOH, N2, 87%.

Aiken e colaboradores19 relatam outros antirretrovirais potentes (10, 23-26) Figura 11 para inibição do HIV-1 podendo-se destacar os derivados do ácido betulínico. Todos substituídos em C-3 e ou C-17 e com maior diversidade estrutural e funcional comparado ao precursor, o ácido betulínico. As estruturas seguem descritas na Figura 11.

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12

.Figura 11. Derivados polifuncionalizados do ácido betulínico substituídos em C-17.

No que se refere à atividade anticâncer, há uma quantidade modesta de relatos da síntese de derivados de ácido betulínico, embora a ação anticancerígena do ácido betulínico esteja reconhecida já há algum tempo. Alguns requisitos estruturais também estão intimamente relacionados na obtenção de derivados com maior potencial anticâncer. Kim e colaboradores20 sumarizaram que substituição em C-17 por oxima, aldeído, éster e álcool também resultou em perda da atividade, reforçando a importância da carboxila livre em C-17 para a atividade biológica.

Kvasanica e colaboradores21 _{efetuaram a síntese de vários derivados com ésteres}

3-O-fitálicos substituídos. O composto 27 da Figura 12 foi encontrado como o mais ativo nesta série com IC50 de 5,7 µg.ml-1, 8,8 µg.ml-1, 7,5 μg.ml-1, respectivamente, CEM (linfócitos),

K562 (eritroleucemia) e HT29 (adrenocarcinoma colorretal), linhagens celulares de câncer. Quando no fragmento ftálico estão substituintes doadores de densidade eletrônica, observou-se aumento na atividade citotóxica.

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20 _{KIM D. S. H. L.; PEZZUTO, J. M.; PISHA, E. Synthesis of betulinic acid derivatives with activity against human melanoma. Bioorg.}

Med. Chem. Lett. v. 8, p. 1707–1712, 1998.

21_{KVASNICA. M.; SAREK, J.; KLINOTOVA, E. et al. Synthesis of phthalates of betulinic acid and betulin with cytotoxic activity. Bioorg.}

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13

Em contrapartida, grupos retiradores de densidade eletrônica reduzem a atividade, reforçando a importância da substituição por um grupo éster em C-3 e influência de grupos doadores e retiradores para substituintes aromáticos em C-3.

Figura 12. Derivado do ácido betulínico com grupo 3-O-ftálico substituído.

De um modo geral substituições em C20=C29 não são favoráveis para derivatização do

ácido betulínico, conforme enunciado por Kim e colaboradores20 devido a uma gama de modificações feitas nesta posição sem resultados positivos. Embora alguns autores tenham enunciado a abertura de anel A como prejudicial para a atividade anti HIV-1, Hung e colaboradores22 obtiveram derivados com potente ação quimiopreventiva provenientes de abertura de anel nas posições 3,4.

Nos seus estudos, Kim e colaboradores20_{descrevem alguns aspectos da estrutura} versus atividade anticâncer sintetizados como segue: a abertura 3,4 pode significativamente

aumentar a atividade quimiopreventiva, um ácido carboxílico C-3 é melhor de um éster metílico, um C-4 metileno é melhor do que hidroximetil ou grupos acetoximetila, um ácido carboxílico C-28 é consideravelmente melhor do que n-acetamida-heptano. Dentre os compostos por ele sintetizados, seguem as estruturas 28-31 Figura 13 dos que apresentaram significativo potencial quimiopreventivo comparado ao padrão TPA (12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato) frente ao vírus da EBV-EA e EBA-EA (o símbolo EB significa Epstein Barr ou herpes tipo 4. A letra “V” de vírus “A” de antígeno).

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22_{HUNG, H. Y.; NAKAGAWA-GOTO, K.; TOKUDA, H. et al. A-ring modified betulinic acid derivatives as potent cancer preventive}

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