UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
CAMILA TATYANNE SANTOS DE FREITAS
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DAS PROTEÍNAS CD34 E α-SMA EM CISTOS RADICULARES E CISTOS RADICULARES RESIDUAIS
NATAL/RN 2019
CAMILA TATYANNE SANTOS DE FREITAS
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DAS PROTEÍNAS CD34 E α-SMA EM CISTOS RADICULARES E CISTOS RADICULARES RESIDUAIS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Patologia Oral.
Orientadora: Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão.
NATAL/RN 2019
Em especial, a Deus, que me ajudou a todo instante em minha caminhada ao longo desses 2 anos de mestrado, por andar ao meu lado me dando força e persistência
nas minhas decisões.
Aos meus pais, Bonifácio Freitas e Nalcira Santos, por me apoiarem em todas as minhas escolhas e a quem eu devo toda a minha formação profissional e pessoal.
Ao meu marido, Anderson, pelo incentivo emocional e financeiro. E que apesar da distância sempre torceu pelo meu sucesso. Exemplo de homem íntegro e amoroso,
o qual torna minha vida mais feliz e mais fácil de ser enfrentada. Obrigado meu amor, por tudo!
Agradeço à minha orientadora, Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, por todos os ensinamentos adquiridos. Tenho total admiração pelo seu trabalho e
profissionalismo. És uma mulher de fé e muito carismática, sempre solicita a quem precisar, me amparou em alguns momentos de fragilidades durante minha trajetória
no mestrado com seus conselhos. Muito obrigada, pela paciência, incentivo e orientação. Só tenho a agradecer a senhora por tudo.
A Mary, tia Noe e ao Primo que me acolheram nesse último ano de mestrado em sua residência, agradeço demais pelo carinho e serei sempre grata por tamanho
gesto de bondade.
A todas as pessoas que acreditaram em mim, em especial, as minhas amigas da região Norte, Sarinha, Moyara, Silvia e Naíza, pessoas que levo em meu coração
apesar de toda a distância.
Ao meu ex-preceptor, Professor Jeconias Camara, homem de garra e personalidade forte, o qual tenho imensa admiração pelo trabalho realizado, sempre
lutando pela melhoria do serviço de Patologia da UFAM e por desenvolver um excelente trabalho em prol da formação profissional de seus residentes.
A minha ex-preceptora da Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Dra. Tatiana
Libório, por seu exemplo de dedicação e amor em tudo aquilo que realiza.
Agradeço demais pelos ensinamentos adquiridos e pela paciência. E por acreditar em mim em vários momentos durante minha vida de pós-graduação.
A Dra. Lélia Batista, pelo imenso amor e carinho pelo programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN e pela sua luta diária em fazer o programa crescer cada
dia mais.
Ao professor Kênio pelas aulas de bioestatística e pela disponibilidade em revisar os resultados desse trabalho. Agradeço demais!
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Patologia Oral da UFRN: Dr.
Leão Pinto, pela sua sabedoria de vida e dedicação ao trabalho, Dra. Roseana Freitas, pela seriedade, competência e liderança, Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa, exemplo de professor amigo, sempre disponível a ajudar os alunos e sempre
muito racional, Dra. Márcia Miguel, mulher de personalidade forte, que possui uma inteligência incomum e muito compromissada em suas atividades. Dra. Lélia Maria,
por seu exemplo de calmaria e serenidade, Dra. Éricka Janine, pessoa que ama o que faz e possui um enorme zelo com os pacientes da clínica de Estomatologia, Dr.
atividades realizadas. Verdadeiro exemplo de professor, o qual não mede esforços em ajudar os alunos.
Ao professor, Manuel Gordon, pela sua paciência, seriedade e profissionalismo. Muito obrigada pelas contribuições científicas ao trabalho desenvolvido e disponibilidade em ter que viajar de outro estado para fazer parte desse momento
tão importante de minha trajetória. Muita gratidão!
A minha turma de mestrado, Afonso, Nelmara, Rani, Patrícia e Rodrigo, pela persistência, convívio e momentos compartilhados ao longo desses 2 anos de
pós-graduação.
À Graçinha, pela simpatia e boa vontade. Ama o que faz e sempre exercendo seu trabalho com brilhantismo em prol dos alunos da pós-graduação.
Aos funcionários, Hévio, Sandrinha, Beth e Ricardo, pela ajuda nas confecções das lâminas e na imunostoquímica. Agradeço pelo trabalho exercido por todos.
Lourdinha, pela assiduidade e alegria contagiante.
A “minha irmã patológica”, Glorinha, uma menina muito esforçada e que me ajudou muito ao longo desse mestrado. Muito obrigada, pelos ensinamentos, jamais irei
esquecer o quanto fostes importante no meu crescimento profissional.
Ao meu irmão, Hugo Neto, uma pessoa muito educada e prestativa, agradeço pela amizade e por ter tido um convívio agradável ao longo do mestrado.
Ao “meu irmão caçula”, Joaquim Felipe, um exemplo de simpatia, menino de uma excelente convivência. Agradeço pela sua amizade.
Aos demais alunos de pós-graduação, Juliana Pinheiro, Rafaella Leite, Janaína,
Ana Claúdia, Ondina, Cristianne, Rodrigo Mafra, Carol Campos, Hélder, Fernanda, Cínthia e Carla, pelo convívio agradável ao longo do mestrado.
As bibliotecárias do Departamento de Odontologia da UFRN, agradeço pela formatação desse trabalho.
Agradeço à UFRN, pela seriedade institucional e qualidade do ensino. Foi um prazer enorme ter sido aluna dessa universidade, jamais irei esquecer os dias que passei
“A maior recompensa para o trabalho do homem não é o ele ganha com isso, mas o que ele se torna com isso.”
RESUMO
Introdução: Os cistos radiculares são lesões inflamatórias provenientes de
processos infecciosos da necrose da polpa. Os miofibroblastos (MFs) e a angiogênese são fatores importantes no desenvolvimento e progressão das lesões císticas, de modo que essas células secretam fatores de crescimento e proteases, assim como a angiogênese é importante para a produção de matriz e a migração celular, afetando o crescimento das periapicopatias. Objetivo: O presente trabalho consistiu em analisar, por meio da imunoistoquímica, as expressões do CD34 e α-SMA em cistos radiculares (CRs) e cistos radiculares residuais (CRRs), com o propósito de contribuir para um maior entendimento a respeito da expansão e progressão das lesões periapicais. Materiais e Métodos: Foram realizadas análises clínicas, morfológicas e imunoistoquímicas em 30 CRs e 30 CRRs. A presente pesquisa constituiu em uma análise descritiva e quantitativa das expressões imunoistoquímicas positivas do CD34 e SMA nos espécimes. A expressão do α-SMA foi avaliada na cápsula fibrosa das lesões em 10 campos, inicialmente a um aumento de (100x), posteriormente em (400x) e uma média final foi estabelecida, entretanto, para o índice angiogênico foi realizada a contagem de microvasos imunomarcados pelo anticorpo anti-CD34 em 10 campos de (200x). A análise estatística foi realizada através dos testes de Mann-Whitney, Qui-quadrado de Pearson e Correlação de Spearman, o nível de significância estabelecido foi p<0,05.
Resultados: Os resultados demonstraram diferenças estatisticamente significativas
referentes ao α-SMA e α-SMA versus CD34, todavia, com relação a imunomarcação do CD34 não revelou diferença estatística entre as lesões. Conclusão: Diante dos resultados obtidos consideramos que a correlação significativa entre a presença de miofibroblastos e o índice angiogênico entre as lesões estudadas estão relacionadas com o reparo das periapicopatias.
Palavras-chave: Miofibroblastos. Neovascularização Patológica. Cisto radicular. Cistos Odontogênicos. Inflamação. Imuno-histoquímica.
ABSTRACT
Introduction: Radicular cysts are inflammatory lesions resulting from infectious
processes of pulp necrosis. Myofibroblasts (MFs) and angiogenesis are important factors in the development and progression of cystic lesions, so that MFs secrete growth factors and proteases, as well as angiogenesis stimulates matrix deposition and cell migration, affecting the growth of periapicopathies. Objective: This study aims to evaluate the immunohistochemical expression of CD34 and α-SMA in radicular cysts (CRs) and residual radicular cysts (CRRs), in order to contribute a better understanding of expansion and progression of periapical lesions. Materials
and Methods: Clinical, morphological and immunohistochemical analyzes were
performed on 30 CRs and 30 CRRs. The present study constitutes a descriptive, quantitative and comparative analysis of CD34 and α-SMA positive immunohistochemical expression in the specimens. Expression of α-SMA was evaluated in the fibrous capsule, at 100x magnification 10 fields of higher immunolabeling were selected below epithelial lining, thereafter at 400X magnification, the positive cells were quantified and at the end were calculated the averages of positive cells per field. However, angiogenic index was performed by counting microvessels immunolabelled by anti-CD34 antibody in 10 (200x) fields. Statistical analysis was performed using the Mann-Whitney, Pearson's Chi-square test and Spearman's correlation, with significance level set (p <0.05). Results: The results showed that there were statistically significant differences regarding α-SMA and α-SMAxCD34, however with respect to the CD34 immunostaining, there were no statistical differences between the lesions. Conclusion: Myofibroblasts and angiogenic index among studied lesions presented a significant correlation. Thus, they are believed contributeto the repair of the periapicopathies.
Key words: Myofibroblasts. Neovascularization Pathologic. Radicular cyst. Odontogenic cysts. Inflammation. Immunohistochemistry.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIAÇÕES
Alfa-SMA (α-SMA): Alfa actina de músculo liso (do inglês “alpha-smooth muscle
actin’’)
BSA: Albumina de soro bovino (do inglês “bovine serum albumin’’) CCE: Carcinoma de células escamosas
CD31: Grupamento de diferenciação 31 (do inglês “cluster of differentiation 31’’) CD34: Grupamento de diferenciação 34 (do inglês “cluster of differentiation 34’’) CD105: Grupamento de diferenciação 105 (do inglês “cluster of differentiation 105’’) CD: Cisto dentígero
CG: cisto gengival
CO: ceratocisto odontogênico
COC: cisto odontogênico calcificante CPL: cisto periodontal lateral
CRs: Cistos radiculares
CRRs: Cistos radiculares residuais
GFAP: Proteína ácida fibrilar glial (do inglês “glial fibrillary acidic protein”) HE: Hematoxilina e Eosina
IFN-y: interferon gama (do inglês “interferon gamma”) IL-17: interleucina 17
LSAB: Método da estreptoavidina-biotina MFs: Miofibroblastos
MMP: Metaloproteinase da matriz MF: média final
MPC-1: proteína de quimioatração de monócitos (do inglês “monocyte
chemoattractant protein-1”)
MVC: contagem microvascular MVD: densidade microvascular MVV: volume microvascular
NK: células assassinas (do inglês “natural killer”) OMS: Organização Mundial da Saúde
OPG: osteoprotegerina (do inglês “osteoprotegerin”)
PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas (do inglês “platelet-derived
RANKL: ligante do receptor ativador do fator nuclear kB (do inglês “receptor
activator of nuclear fator kB ligand”)
REM: restos epiteliais de Malassez
TGF-B1: fator transformador de crescimento beta 1 (do inglês “transforming growth
fator-B”)
Th- células T auxiliar (do inglês “T helper”)
TNF: fator de necrose tumoral (do inglês “tumor necrosis factor”)
VEGF: fator de crescimento endotelial vascular (do inglês “vascular endotelial growth
factor”)
LISTA DE QUADROS E TABELAS
Quadro 1 Especificação, anticorpo, fabricante, clone, especificidade,
diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados na pesquisa... 34
Tabela 1 Distribuição dos casos de CRs e CRRs de acordo com o sexo, localização anatômica e sintomatologia... 38
Tabela 2 Distribuição dos casos de CRs e CRRs de acordo com a espessura do epitélio... 39
Tabela 3 Distribuição dos casos de CRs e CRRs de acordo com o grau de infiltrado inflamatório ... 39
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Origem dos miofibroblastos ... 15
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 Origem dos miofibroblastos... 19 Gráfico 1 Box-Plot relativo ao tamanho da lesão e o grau de infiltrado
inflamatório nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 40
Gráfico 2 Box-Plot relativo a imunomarcação do alfa-SMA nos cistos
radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 40
Gráfico 3 Box-Plot relativo a imunomarcação do CD34 nos cistos
radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 41
Gráfico 4 Gráfico de dispersão relativo a imunomarcação do alfa-SMA
e CD34 nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 41
Gráfico 5 Gráfico de dispersão relativo a imunomarcação do alfa-SMA
e tamanho nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 42
Gráfico 6 Gráfico de dispersão relativo a imunomarcação do CD34 e
tamanho nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 42
Gráfico 7 Box-Plot relativo ao infiltrado inflamatório a marcação do
alfa-SMA nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais 43
Gráfico 8 Box-Plot relativo ao infiltrado inflamatório a marcação do
CD34 nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais ... 43
Figura 1 (artigo) Achados morfológicos dos cistos radiculares ... 52
Figura 2 Achados morfológicos dos cistos radiculares residuais ... 52
Figura 3 Padrão de imunomarcação pelo alfa-SMA em cistos radiculares ... 53
Figura 4 Padrão de imunomarcação pelo alfa-SMA em cistos radiculares residuais ... 53
Figura 5 Padrão de imunomarcação pelo alfa-SMA e CD34 em cistos radiculares e cistos radiculares residuais ... 54
SUMÁRIO
1 REFERENCIAL TEÓRICO... 16
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DAS LESÕES PERIAPICAIS... 16
1.2 MIOFIBROBLASTOS... 18 1.3 ANGIOGÊNESE... ... 22 2 OBJETIVOS... 26 2.1 OBJETIVO GERAL... 26 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 26 3 ARTIGO CIENTÍFICO... 28 3.1 APRESENTAÇÃO... 28 3.2 ARTIGO A SER SUBMETIDO... 29
REFERÊNCIAS... 56 ANEXOS... 64 APÊNDICES... 77
16
1 REFERENCIAL TEÓRICO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS DAS LESÕES PERIAPICAIS
A Organização Mundial da Saúde (OMS) classifica os cistos na região maxilofacial em odontogênicos e não-odontogênicos. Nas lesões odontogênicas, elas são subdivididas em cistos de desenvolvimento e inflamatório (EL-NAGGAR et al., 2017).
Os cistos odontogênicos inflamatórios surgem em decorrência da proliferação dos restos epiteliais de Malassez (REM), presentes no ligamento periodontal (XIONG; GRONTHOS; BARTOLD, 2013), sob a influência de mediadores inflamatórios, citocinas e fatores de crescimento gerados por células imunes inatas e adaptativas (ANDRADE et al., 2013; DESSAUNE NETO et al., 2018).
O cisto radicular (CR) é a lesão cística mais comum nos maxilares, trata-se de uma resposta inflamatória com o objetivo de debelar a infecção bacteriana em direção à região periapical (CASSANTA et al., 2017; EL-NAGGAR et al., 2017). São geralmente lesões assintomáticas, sendo descoberta ocasionalmente nas radiografias de rotina, com exceção dos casos que apresentam exacerbação inflamatória (TOOTLA et al., 2017; TSAI et al., 2004).
Quanto às características histopatológicas, os CRs apresentam características similares aos cistos radiculares residuais (CRRs). Assim, ambas as lesões podem ser caracterizadas por uma cavidade patológica revestida parcial ou totalmente por epitélio do tipo pavimentoso estratificado, geralmente não ceratinizado e de espessura variável, podendo exibir graus diversos de espongiose, hiperplasia e exocitose (SANTOS et al., 2017b). A cápsula de tecido conjuntivo geralmente exibe quantidades diversas de células inflamatórias (HAO et al., 2015; RECHENBERG et al., 2014).
O aumento da atividade proliferativa no cisto radicular pode estar associado com a presença da inflamação no componente epitelial e capsular (SUZUKI et al., 2005). Dessa maneira, lesões císticas revestidas por epitélio hiperplásico geralmente contém mais inflamação quando comparadas as que apresentam epitélio atrófico (LIN; RICUCCI; LIN; ROSENBERG, 2009).
Analisando-se histologicamente, os miofibroblastos (MFs) são células cuja morfologia varia do fusiforme ao estrelado, apresentando citoplasma eosinofílico e
17
núcleo vesiculoso, exibindo discretas indentações e nucléolos pequenos que podem ser visualizadas com o auxílio da imunoistoquímica e o detalhamento celular pela microscopia eletrônica de transmissão (EYDEN et al., 2009). Sugere-se que os MFs presentes na cápsula de lesões odontogênicas estão associados ao crescimento das lesões por produzirem fatores de crescimento, componentes pró-angiogênicos, proteinases e síntese dos componentes da matriz extracelular (VERED et al., 2005)
Usualmente quando o CR permanece nos ossos gnáticos, por não ter sido removido ou tratado endodonticamente, surge uma entidade denominada cisto radicular residual (MENDONÇA et al., 2015). Os CRRs são considerados uma lesão intraóssea destrutiva, podendo regredir espontaneamente, desde que o processo inflamatório cesse, em outros casos, atinge dimensões grandiosas causando expansão óssea e fraturas patológicas (OLIVEIRA et al., 2011).
O CR cresce respeitando 3 fases: iniciação, formação cística e expansão (SHEAR; SPEIGHT, 2011). Na patogênese dos cistos radiculares, o mecanismo da primeira fase (iniciação) retrata que as células proliferam decorrente da inflamação, devido aos restos necróticos e antígenos bacterianos provenientes da polpa, estimulando a proliferação dos restos epiteliais de Malassez (REM) (LIN; HUANG; ROSENBERG, 2007).
A fase de formação cística torna-se revestida por epitélio proliferativo através de uma ação enzimática proteolítica ou a cavidade cística é formada dentro de um componente epitelial reativo pela degeneração e morte das células localizadas no centro do cisto pela falta de nutrição, denominada teoria da pressão osmótica (LIN; HUANG; ROSENBERG, 2007; LORETO et al., 2013).
A ação proliferativa do tecido epitelial pode envolver uma área de abscesso ou os REM podem adquirir propriedades antigênicas, ocorrendo uma reação cruzada entre os antígenos das células epiteliais e os de origem bacteriana pelos anticorpos, sistema complemento, células NK e linfócitos T citotóxicos (teoria imunológica). (LORETO et al., 2013).
Na fase de expansão, a parede cística apresenta-se menos inflamada e fibrosa (SHEAR; SPEIGHT, 2011). Os mecanismos exatos envolvidos no crescimento e expansão das lesões periapicais não são completamente compreendidos, cogita-se algumas teorias como aumento da pressão osmótica, vias moleculares, produções de citocinas e metaloproteinases da matriz, entretanto, todas as fases da patogênese cística tem sido alvo de especulações e pesquisas,
18
todavia, muito tem-se aprendido nos últimos anos, porém, mais estudos referente a temática (principalmente nessa última fase) tem sido realizada para maiores esclarecimentos de sua patogênese.
Com relação às modalidades terapêuticas indicadas para as lesões císticas radiculares, a terapia endodôntica do dente acometido, juntamente com a enucleação ou marsupialização da lesão são cruciais na remoção dos agentes invasores (SHEAR; SPEIGHT, 2011). Entretanto, o tratamento mais indicado para os cistos radiculares residuais é a enucleção cirúrgica, caso o procedimento não seja realizado, o aumento do cisto pode ocasionar reabsorção óssea e consequentemente fraturas nos ossos gnáticos (REGEZI; SCIUBBA; JORDAN, 2012).
1.2 MIOFIBROBLASTOS
Os miofibroblastos (MFs) foram descritos pela primeira vez em tecido de granulação por um pesquisador italiano Gulio Gabbiani em 1971, como sendo uma célula derivada de um fibroblasto, pois no seu aspecto morfológico exibia idêntica característica, exceto por apresentar miofilamentos de alfa actina de músculo liso no interior do seu citoplasma (GABBIANI, 2003; RIBATTI; TAMMA, 2019). Ultra-estruturalmente possui feixes de microfilamentos citoplasmáticos, mitocôndrias, retículo endoplasmático rugoso e complexo de golgi (MASHHADIABBAS et al., 2010).
Os MFs são células de origem mesenquimal bem desenvolvidas, as quais desempenham um importante papel em situações fisiológicas e patológicas. Em condições fisiológicas eles são encontrados em feridas cicatriciais, baço, vasos sanguíneos, útero e septos pulmonares. Entretanto, os MFs aparecem também em circunstâncias patológicas a exemplo de cicatrizes hipertróficas, cirrose de fígado e fibrose renal (ANNEGOWDA et al., 2018).
As células percursoras de MFs são recrutadas de diferentes fontes, dependendo do tipo de tecido a ser remodelado (CHAUDHARI, 2015). Elas podem ser derivadas de várias outras células a exemplo de fibroblastos, pré-adipócitos, pericitos, células endoteliais e demais células epiteliais de revestimento (Figura 1) (BAGUL et al., 2015).
19
Figura 1 - Origem dos miofibroblastos
Fonte: (BAGUL et al., 2015).
Dessa maneira, nos casos de injúrias de pele, presume-se que os MFs sejam derivados da derme ou de tecidos próximos à ferida. No caso dos pericitos, eles podem ser fonte de MFs, os quais são cruciais no reparo. Acredita-se que os MFs podem ser derivados de células epiteliais por meio da transição epitélio-mesênquima. Além disso, as células-tronco quando submetidas a fatores mecânicos geralmente originam miofibroblastos (LI, WANG; 2011).
Os MFs podem ser identificados através de alguns marcadores como a desmina, a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e a α-actina de músculo liso (α-SMA) (KELLERMANN et al., 2007). Entretanto, esse último marcador tem sido o mais importante na identificação dos MFs, essa proteína é imunoexpressa em células musculares lisas, endoteliais e mioepiteliais (WEVER et al., 2008).
A alfa actina de músculo liso é um miofilamento presente no citoplasma de células musculares lisas, a qual participa do sistema contrátil. As actinas além de atuarem na contratilidade, possuem um papel importante na mobilidade, divisão, adesão e manutenção da morfologia celular (CHAPONNIER; GABBIANI, 2004).
A família das actinas é composta por seis tipos de isoformas: esquelética, cardíaca, α-SMA, γ-actina de músculo liso e as actinas citoplasmáticas (α e β), a essas diversas isoformas implicam em funções divergentes em diferentes tecidos ou tipos celulares. Algumas delas inclui divisão celular, migração, formação de junções
20
intercelulares, remodelação de cromatina, regulação transcricional e regulação da forma celular (PERRIN; ERVASTI, 2010).
Em referência à cicatrização das feridas, após a injúria, a inflamação produz tecido de granulação e nesse exsudato os MFs estão presentes (DARBY; HEWITSON, 2007). Outro fator chave no evento da cicatrização é o fortalecimento da ferida por deposição de colágeno, o qual acontece devido aos MFs possuírem filamentos de α-SMA (PINISETTI et al., 2014).
Os MFs têm sido estudados em vários processos patológicos envolvendo o complexo maxilofacial como cistos e tumores odontogênicos, tumores de glândulas salivares, lesões potencialmente malignas e carcinoma de células escamosas (CCE) (BAGUL et al., 2015; DARBY; HEWITSON, 2007; PRABAKAR et al., 2016).
Em se tratando de lesões odontogênicas, existem poucos estudos mencionando a presença de MFs em cistos e tumores odontogênicos. Neste sentido, o primeiro trabalho analisando MFs em lesões odontogênica foi desenvolvido por Lombardi e Morgan (1995) que estudaram ceratocistos odontogênicos (CO), cistos dentígeros (CD), cistos radiculares (CR), cistos radiculares residuais (CRRs), cistos periodontais laterais (CPL), cistos gengivais (CG) e cistos odontogênicos calcificantes (COC). Nessa pesquisa, a maioria das lesões apresentaram imunoexpressão para os MFs por meio da positividade do marcador α-SMA, com exceção do COC e CG. Assim, os autores concluíram que os MFs são componentes importantes na cápsula fibrosa dos cistos odontogênicos.
Vered et al. (2005) estudaram a presença de MFs em cistos e tumores odontogênicos. Os ceratocistos odontogênicos tiveram o maior número dessas células e o cisto dentígero, o menor. Em tumores odontogênicos, os MFs foram mais presentes em ameloblastoma. Concluindo nesse estudo, que os MFs podem contribuir para variações no comportamento biológico das lesões, esses autores associaram que quanto maior o número de MFs em lesões císticas e tumorais, mais agressiva a lesão.
Mashhadiabbas et al. (2010) estudaram também 3 tipos de lesões odontogênicas: ceratocisto, cisto dentígero e ameloblastoma. Esses autores demonstraram que a alta frequência de miofibroblastos na cápsula de ceratocistos podem contribuir para a natureza agressiva desse cisto, todavia, em cistos dentígeros e ameloblastoma a presença dessas células não apresentaram associação com a agressividade.
21
Nonaka et al. (2012) analisaram a presença de MFs em ceratocistos associado à síndrome de Gorlin e os não relacionados à essa lesão, além de estudar o papel de reguladores de reabsorção óssea (RANKL), osteoprotegerina (OPG) e o índice angiogênico. Os autores verificaram que os MFs apesar de estarem presentes nesses grupos de lesões, não houve diferença significante nas referidas lesões, sugerindo assim que essas células poderiam não estar relacionadas ao comportamento biológico do ceratocisto odontogênico.
Nadalin et al. (2012) avaliaram a relação entre diferentes cistos e a frequência de MFs e MMP-2 em sua cápsula, esses pesquisadores estudaram essas células em ceratocisto, cisto dentígero e radicular, constatando que o ceratocisto odontogênico apresentou (46,67%) de imunomarcação para o α-SMA, o cisto dentígero (36,84%) e o cisto radicular (31,04%). Os resultados nesse estudo específico demonstraram que essas células podem favorecer a progressão e o crescimento dessas lesões odontogênicas.
Santos et al. (2017a) investigaram a presença de MFs em lesões odontogênicas epiteliais e correlacionaram os achados com a agressividade, assim como analisaram a expressão de TGF- β1 e IFN- γ no processo de diferenciação dessas células. Os pesquisadores encontraram um número maior de MFs em ameloblastomas sólidos, ceratocistos e ameloblastomas unicísticos associando a presença dessas células como um fator responsável pelo comportamento biológico mais agressivo dessas lesões. Entretanto, não houve correlação entre o número de MFs e a imunomarcação de TGF- β1 e IFN- γ e que apenas o uso da imunoistoquímica é um parâmetro limitante para essa análise quanto a diferenciação celular.
Acredita-se que os MFs desempenham um papel na síntese e reorganização da matriz extracelular, o que poderia contribuir para o comportamento biológico agressivo de algumas lesões odontogênicas como ceratocisto e o ameloblastoma (SYAMALA et al., 2016). Entretanto, o papel dos MFs ainda não é bem estabelecido nas lesões odontogênicas, pois ainda existem divergências de opiniões na literatura referente a temática (ANNEGOWDA et al., 2018).
Em se tratando de neoplasmas malignos, os MFs são células que apresentam um importante significado no estroma de carcinomas orais, apesar de nem sempre serem evidenciados em alguns casos (LÚCIO et al., 2013; SEKHON et al., 2016). A inflamação e a angiogênese induzida pelos MFs auxiliam no crescimento tumoral,
22
assim como, secreção de enzimas proteolíticas, citocinas e fatores de crescimento facilitam a sua invasão (KELLERMANN et al., 2007; RADISKY; KENNY; BISSELL, 2007). Desse modo, mais pesquisas são necessárias para compreender melhor os mecanismos moleculares dos MFs e sua influência no comportamento biológico dos carcinomas escamosos (SEKHON et al., 2016).
Com base em estudos quantitativos a respeito dos miofibroblastos, a presença dessas células tem sido associada à progressão tumoral. Estudos clinopatológicos demonstram que os MFs no front de invasão do tumor tem relação com parâmetros clínicos: aumento do tumor, presença de metástase e recidiva, além de menores taxas de sobrevivência(LI et al., 2015; LUKSIC et al., 2015).
Poucos estudos existem abordando a relação dos miofibroblastos com lesões císticas odontogênicas. A literatura aponta mais trabalhos relacionados ao ceratocisto odontogênico. Gabhane et al. (2015) avaliaram a frequência dos miofibroblastos em cistos odontogênicos diferentes: ceratocistos, cistos dentígeros e cistos radiculares. Essa pesquisa demonstrou que o número de miofibroblastos em ceratocistos foi alto, em contraste, nas demais lesões os resultados foram significativamente mais baixos. Desse modo, tais autores acreditam que a maior quantidade de miofibroblastos estão relacionados com um comportamento mais agressivo.
1.3 ANGIOGÊNESE
A angiogênese é um processo complexo, a qual está envolvida tanto em condições de saúde quanto doença (VEMPATI; POPEL; MAC GABHANN, 2014). Em processos fisiológicos, a angiogênese é crucial em inúmeros eventos como reparação das feridas, desenvolvimento embrionário e no ciclo reprodutivo feminino (GADBAIL et al., 2013). Entretanto, em condições patológicas como nas isquemias e doenças degenerativas, todos esses processos são iniciados pela angiogênese insatisfatória e/ou regressão anormal dos vasos (CLAPP et al., 2009). O fluido sanguíneo e a oxigenação por meio da formação de novos vasos acontecem de maneira desorganizada, contribuindo no crescimento e progressão da doença (KOUHSOLTANI et al., 2015).
A angiogênese envolve diversas etapas: vasodilatação, permeabilidade endotelial, proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência das células
23
endotelias para formar microvasos, os quais permitem a passagem dos nutrientes (FALLAH et al., 2019).
A angiogênese pode ser avaliada através de vários índices: microdensidade vascular (MVD), que mede o valor médio da contagem dos números de vasos em áreas mais vascularizadas, volume microvascular (MVV) e a contagem microvascular (MVC), em que são quantificados os campos de maior vascularização dos espécimes (FREITAS et al., 2005).
O processo de angiogênese envolve fatores pró e antiangiogênicos, podendo existir um desequilíbrio dessas condições (ALBINI et al.; 2005; GOMES et al., 2013; KERBEL, 2008), assim essa desregulação pode acontecer por células do próprio tumor pelo fato de estimular células endoteliais, por células do próprio tecido conjuntivo em condições de normalidade e em casos de inflamação por induzir um fenômeno indireto pelo recrutamento de células endoteliais para que ocorra a neovascularização (ALBINI et al.; 2005; KERBEL, 2008).
A angiogênese pode acontecer de duas maneiras. A primeira delas, por meio da intussuscepção, nesse fenômeno há formação de pilares teciduais transluminais no interior dos capilares, os quais se unem formando novos vasos sanguíneos (MAKANYA; HLUSHCHUK; DJONOV, 2009; RIBATTI; NICO; CRIVELLATO, 2009). E o segundo evento acontece, devido ao brotamento de células endoteliais, a partir de estruturas vasculares pré-existentes de tecidos circunvizinhos (UCUZIAN et al., 2010).
Existem alguns marcadores imunoistoquímicos, os quais são utilizados para a evidenciação dos vasos sanguíneos; alguns deles são CD34, CD31, fator de von Willebrand e CD105 (CHOI et al., 2005). O CD34 é considerado um excelente marcador do endotélio vascular, trata-se de um proteína de transmembrana, a qual cora vasos de tecido normal ou lesionado (GADBAIL et al., 2013).
A glicoproteína CD34 é uma molécula associada ao tecido vascular presente em vasos sanguíneos neoformados e quiescentes, essa proteína tem sido usada para mensurar a angiogênese (SEIFI; SHAFAIL; GHANDIRI, 2011). Na literatura observamos muitos estudos sobre o CD34 e a carcinogênese, entretanto, poucos trabalhos foram realizados abordando cistos odontogênicos inflamatórios.
A associação entre angiogênese e lesões crônicas inflamatórias tem sido alvo de estudos, acredita-se que esse processo inicie durante a inflamação, pois essas
24
células estão em alta demanda por nutrientes e oxigenação. O aumento da permeabilidade vascular e a maior quantidade de infiltrado inflamatório, apresentam um papel importante na nutrição dos tecidos, pois, a neoformação vascular é uma rica fonte de citocinas, proteases e quimiocinas (GRIFFIOEN; MOLEMA, 2000; RUBINI et al., 2011). Em estudos correlacionando a contagem das células endoteliais CD34 e o infiltrado inflamatório em cistos radiculares. Observou-se nesse estudo específico, correlação positiva entre a população de linfócitos e o números de vasos CD34. Desse modo, parece que o infiltrado inflamatório e a neoangiogênese apresentam um importante papel no desenvolvimento e crescimento dos cistos radiculares (ZIZZI et al., 2013).
Alguns estudos mostram que a angiogênese é importante no desenvolvimento e progressão das lesões císticas, tumorais odontogênicas de desenvolvimento e inflamatória (ALAEDDINI et al., 2009; GADBAIL et al., 2013). Além de que, a maior expressão do índice angiogênico sugere-se um comportamento mais agressivo das lesões, pois um maior aporte de oxigênio e nutrientes são necessários, o que reflete uma maior quantidade de vasos (SOUSA-NETO et al., 2016).
Nonaka et al. (2012) estudaram ceratocistos isolados e associados a Síndrome de Gorlin-Goltz assim como esclarecer o comportamento biológico deles, tais autores avaliaram o índice angiogênico através da imunomarcação do CD34 nessas lesões, entretanto, não foi observado diferenças estatisticamente significativas do índice angiogênico entre as lesões estudadas.
De acordo com Khajuria et al. (2016) avaliaram a angiogênese em diferentes lesões odontogênicas: ceratocistos, cistos dentígeros e cistos radiculares, os dados desse presente estudo retrataram que a angiogênese pode ser importante na progressão e no aumento dos cistos odontogênicos, semelhante ao que ocorre em condições neoplásicas.
Graziani et al. (2006) estudaram a angiogênese através dos marcadores anti-VEGF e anti-CD34 em cistos radiculares. Esse estudo observou uma correlação positiva entre a densidade microvascular e a expressão do VEGF. Além disso, o aumento na expressão desse fator pró-angiogênico está intimamente relacionado à intensidade do infiltrado inflamatório.
Nonaka et al. (2008), com objetivo de esclarecer o papel da angiogênese em lesões periapicais, observou-se que os cistos radiculares apresentaram maior
25
número de vasos sanguíneos em comparação com os granulomas e cistos radiculares residuais, tais autores acreditam que a diferença na quantidade de vasos pode estar relacionado a uma possível conversão do tecido de granulação em um cisto.
Existem poucos estudos na literatura voltados exclusivamente para avaliação de marcadores vasculares em lesões císticas odontogênicas inflamatórias. Ainda não existem evidências científicas, as quais relacionem o papel dos miofibroblastos e a angiogênese em cistos radiculares e cistos radiculares residuais. Dessa forma, esse estudo tem a pretensão de melhor esclarecer a patogênese das lesões perirradiculares inflamatórias.
26
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente estudo tem por objetivo avaliar e comparar por meio da imunomarcação das proteínas α-SMA e CD34, em espécimes de cistos radiculares e cistos radiculares residuais, com o propósito de verificar a interação entre os miofibroblastos e a angiogênese, na expansão e progressão dessas lesões periapicais.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Realizar o estudo morfológico de CRs e CRRs, classificando-os de acordo com o grau de infiltrado inflamatório segundo os critérios de Tsai et al. (2004) em grau I (leve), grau II (moderado) e grau III (intenso) e por Moreira et al (2000) classificando o componente epitelial em espessura atrófica e hiperplásica.
- Analisar o tamanho das lesões e o grau de infiltrado inflamatório em cistos radiculares e cistos radiculares residuais.
- Verificar a expressão imunoistoquímica de α-SMA entre as lesões estudadas. - Verificar a expressão da proteína CD34 entre cistos radiculares e cistos radiculares residuais.
- Comparar a imunoexpressão das proteínas CD34 e α-SMA em cistos radiculares e cistos radiculares residuais.
- Verificar a correlação entre a imunoexpressão do CD34, α-SMA e o tamanho das lesões estudadas.
28
3 ARTIGO CIENTÍFICO
3.1 APRESENTAÇÃO
O artigo apresentado é tema da dissertação de mestrado intitulado em: “Estudo
imunoistoquímico das proteínas CD34 e α-SMA em cistos radiculares e cistos radiculares residuais’’. O mesmo será submetido ao períodico Journal of
Endodontics (Qualis Odontologia A2), cujas normas de submissão se encontram em anexo C.
29
3.2 ARTIGO A SER SUBMETIDO
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DAS PROTEÍNAS CD34 E α-SMA EM CISTOS RADICULARES E CISTOS RADICULARES RESIDUAIS
Camila Tatyanne Santos de Freitas1, Glória Maria de França1, Kenio Costa de Lima2, Hébel
Cavalcanti Galvão1
Autor correspondente: Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão,
Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Av. Senador Salgado Filho, 1787, Lagoa Nova, Natal, RN, CEP 59056-000, Brasil (Tel./fax: +55 3215-3148; e-mail: hebel.galvao@yahoo.com.br)
1 Programa de Pós-graduação em Patologia Oral, Departamento de Odontologia, Universidade
Federal do Rio Grande do Norte-UFRN.
2 Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, Departamento de Odontologia, Universidade
30
RESUMO
Introdução: Os miofibroblastos (MFs) e a angiogênese são fatores importantes no
desenvolvimento e expansão das lesões císticas, de modo que essas células secretam fatores de crescimento e proteases, assim como a angiogênese estimula a deposição de matriz e a migração celular, afetando o crescimento das periapicopatias. Objetivo: O presente trabalho objetivou avaliar a expressão imunoistoquímica do CD34 e α-SMA em cistos radiculares (CRs) e cistos radiculares residuais (CRRs), com o propósito de contribuir para um maior entendimento a respeito da expansão e progressão das referidas lesões periapicais. Materiais e
Métodos: A presente pesquisa constituiu em uma análise descritiva, quantitativa e
comparativa das expressões imunoistoquímicas positivas do CD34 e α-SMA nos espécimes de 30 CRs e 30 CRRs. A expressão do α-SMA foi avaliada na cápsula fibrosa das lesões, em um aumento de (100x) abaixo do revestimento epitelial foram selecionados 10 campos de maior imunomarcação, posteriormente, em um aumento de (400X), foram quantificados as células positivas e no final foi calculado as médias das células positivas por campo. Entretanto, o índice angiogênico foi realizado pela contagem de microvasos imunomarcados pelo anticorpo anti-CD34 em 10 campos de (200x). Resultados: Os resultados demonstraram diferenças estatisticamente significativas referente a imunomarcação do α-SMA (p=0,035) e a relação α-SMA versus CD34 em CRRs (p=0,004), porém a imunomarcação para o CD34 não revelou existir diferenças estatísticas entre as lesões (p=0,988). Conclusão: Diante dos resultados obtidos consideramos que a correlação significativa entre a presença de miofibroblastos e o índice angiogênico entre as lesões estudadas estão relacionados com o reparo nos CRRs.
31
ABSTRACT
Introduction: Myofibroblasts (MFs) and angiogenesis are important factors in the
development and progression of cystic lesions, so MFs secrete growth factors and proteases, as well as stimulate angiogenesis, matrix deposition and cell migration, affecting the growth of periapicopathies. Objective: This study aims to evaluate the immunohistochemical expression of CD34 and α-SMA in root cysts (CRs) and residual root cysts (CRRs), in order to contribute to a better understanding of the expansion and progression of periapical lesions. Materials and Methods: Clinical, morphological and immunohistochemical analyzes were performed on 30 CRs and 30 CRRs. The present study constitutes a descriptive, quantitative and comparative analysis of the positive immunohistochemical expression of CD34 and α-SMA in the specimens. Expression of α-SMA was evaluated in the fibrous capsule of the lesions, at a magnification of 100x below the epithelial lining 10 fields of higher immunolabeling were selected, thereafter at a 400X magnification, the positive cells were quantified and at the end were calculated the averages of positive cells per field. However, the angiogenic index was performed by counting microvessels immunolabelled by the anti-CD34 antibody in 5 (200x) fields. Results: The results showed that there were statistically significant differences regarding α-SMA immunostaining (p=0,035) and α-SMA versus CD34 in CRRs (p=0,004), but the immunostaining for CD34 did not reveal statistical differences between the lesions (p=0,988). Conclusion: Myofibroblasts and angiogenic index among studied lesions presented a significant correlation. Thus, they are believed contribute to the repair of the residual root cysts.
32
INTRODUÇÃO
As lesões periapicais são condições inflamatórias dos tecidos perirradiculares resultantes de sequelas diretas de infecções provenientes de necrose pulpar e consequente progressão para a região apical (1), relacionando-se a fragilidade dos
mecanismos de defesa do hospedeiro em extirpar a contaminação pela persistência dos agentes antigênicos (2).
A inflamação da polpa de dentes necróticos resulta na proliferação dos restos epiteliais de Malassez, os quais são remanescentes da bainha epitelial radicular de Hertwig que são estimulados a se proliferarem, resultando em cistos radiculares (3,4).
Apesar da intensa investigação, os mecanismos moleculares exatos envolvidos no crescimento e expansão das lesões císticas não são bem estabelecidos.
Nessa perspectiva, estudos envolvendo lesões odontogênicas inflamatórias revelam que os miofibroblastos (MFs) estão relacionados com o crescimento e expansão dos cistos, modulando mecanismos de deposição colagênica e angiogênese, por essas células serem responsáveis pela síntese de enzimas capazes de degradar a matriz extracelular, podendo desse modo, controlar o crescimento das lesões e a angiogênese (5,6).
Os MFs são células do tecido conjuntivo que exibem um fenótipo híbrido apresentando-se morfologicamente como células grandes e fusiformes, exibindo características entre o fibroblasto e célula de músculo liso (7), a apresentação de tal
fenótipo denominada transdiferenciação é importante para expressar a α-actina de músculo liso (α-SMA), proteína essa essencial na identificação dos MFs, os quais são reconhecidos em lesões císticas e tumorais, controlando fenômenos como a angiogênese e capacidade de reorganização tecidual (7,8).
A angiogênese tem um importante papel na etiopatogenia das lesões inflamatórias crônicas, visto que, com a formação de novos vasos sanguíneos pela demanda de oxigênio, acontece a deposição de matriz, a qual representa um fator crucial para a migração celular, gerando maior aglomeração de células inflamatórias e consequentemente, mais fluido estará presente na cavidade cística, afetando desse modo seu crescimento (9).
Em se tratando de lesões odontogênicas inflamatórias, não há pesquisas analisando a expressão de α-SMA (miofibroblastos) e CD34 (angiogênese) em
33
cistos radiculares e cistos radiculares residuais. Nessa perspectiva e diante da escassez de estudos associando a relação dos MFs e a angiogênese em cistos odontogênicos inflamatórios, esse trabalho tem o propósito de melhor avaliar a patogênese e crescimento das lesões periapicais estudadas através da expressão imunoistoquímica das proteínas supracitadas.
MATERIAIS E MÉTODOS
Desenho do estudo e amostras teciduais
Trinta casos de cistos radiculares (CRs) e trinta casos de cistos radiculares residuais (CRRs) foram obtidos a partir dos registros de anatomopatologia do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Somente os espécimes que possuíam material biológico com qualidade e quantidade suficiente foram selecionados para o estudo. Para ambos os espécimes (CRs e CRRs) foram escolhidos os fragmentos que exibiam uma cavidade patológica revestida total ou parcialmente por epitélio e uma quantidade suficiente de cápsula fibrosa para realização das avaliações imunoistoquímicas. Foram coletadas informações a respeito do sexo, idade, localização anatômica, sintomatologia e tamanho da lesão, caso as fichas clínicas tivessem informações insuficientes com relação a essas variáveis foram excluídas da pesquisa. Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da instituição envolvendo seres humanos (Parecer 2.820.373-CEP/UFRN).
Análise morfológica
Os fragmentos dos casos selecionados foram examinados em lâminas de 5µm de espessura e corados pela técnica Hematoxilina/Eosina (HE) e em seguida analisados, na microscopia de luz (Olympus BX41, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) nos aumentos de 40x, 100x e 400x. A intensidade do infiltrado inflamatório foi analisada sob o aumento de 400x e adaptado de acordo com os critérios dos autores Tsai e colaboradores (10). Segundo metodologia proposta por tais autores,
para os CRs e CRRs, foram selecionados 9 campos microscópicos divididos em conjuntos de 3 campos consecutivos começando a análise do epitélio e se
34
extendendo profundamente até a cápsula. Foram considerados como Grau I (leve infiltrado), os espécimes cujo infiltrado inflamatório se apresentou restrito a 1/3 do campo microscópico; as lesões com células inflamatórias presentes em até 2/3 do campo microscópico foram definidas como de Grau II (moderado infiltrado); e as lesões que exibiram infiltrado inflamatório em mais que 2/3 do campo microscópico, foram categorizadas como de Grau III (intenso infiltrado). Ao final, foi obtido a média de cada conjunto de 3 campos e estabelecida a intensidade do infiltrado inflamatório do caso. A espessura do revestimento epitelial dos cistos foi analisada de acordo com a metodologia proposta pelos autores Moreira e colaboradores (11). Nesta
perspectiva, foram considerados atróficos os epitélios císticos que apresentarem em sua maior extensão camada epitelial constituída por 2 a 10 camadas de células e hiperplásicos acima de 10 camadas.
Análise imunoistoquímica
A coloração para o α -SMA (DAKO, Carpinteria, CA, USA) foi realizada para confirmar a marcação dos miofibroblastos e o anticorpo CD34 (QBEnd/10) foi utilizado para mensurar o índice angiogênico. As especificações de cada anticorpo podem ser observados no quadro 1.
Quadro 1 - Especificação, anticorpo, fabricante, clone, especificidade, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos anticorpos primários utilizados na pesquisa. Natal/RN, 2019.
Anticorpo Fabricante Clone Especificidade Diluição Recuperação Antigênica
Incubação
α-SMA DAKO 1A4 monoclonal 1:500 Citrato ph 6.0 Pascal
60’ CD34 CELL
MARQUE
QBEnd/10 monoclonal 1:200 Citrato ph 6.0 Pascal
60’
Todos os espécimes fixados em formol a 10% e emblocados em parafina referentes aos casos selecionados para esse estudo, foram submetidos a cortes histológicos de 3m de espessura, os quais foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas, preparadas com adesivo à base de 3-aminopropyltrietoxy-silano (Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). O material posteriormente foi submetido aos anticorpos, sendo empregado à técnica de imunoistoquímica pelo método da estreptoavidina-biotina (LSAB-estroptoavidin biotin complex).
35
Os controles positivos para os anticorpos α-SMA e CD34 foram realizados com cortes histológicos de hemangioma capilar. O controle negativo consistiu na substituição do anticorpo primário por albumina de soro bovino à 1% (BSA) em solução tampão, seguido por todos os passos subsequentes do protocolo descrito a seguir:
⇨ Em um recipiente, todas as amostras serão imersas em solução preparada contendo Trilogy®, seguindo, então, as amostras teciduais para panela pascal
para desparafinização, reidratação e recuperação dos sítios antigênicos (quadro 1);
⇨ Lavagem do material em água corrente por 3 minutos e duas passagens por água destilada (1 minuto cada);
⇨ Duas incubações dos cortes, pelo período de 15 minutos, em solução de peróxido de hidrogênio 10 volumes (3%) para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual;
⇨ Lavagem em água destilada;
⇨ Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos cada;
⇨ Incubação com a proteína Background Block (Cell Marque, Rocklin, Califórnia, EUA) por 10 minutos;
⇨ Lavagem em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos; ⇨ Incubação dos cortes com anticorpos primários diluídos (Envision Flex
Antibody Diluent – DM830). Para CD34 e alpha-SMA, tempo de incubação de 60 minutos;
⇨ Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos cada;
⇨ Incubação com anticorpo secundário com Sistema Hi Def Detection (Cell Marque; Rocklin, Califórnia, EUA) com aplicação de solução amplificadora por 20 minutos;
⇨ Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos;
36
⇨ Duas passagens em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 por 5 minutos cada;
⇨ Aplicação do agente cromógeno DAB (diaminobenzidina; Scytek Laboratories; Logan, Utah, USA), durante 5 minutos à temperatura ambiente;
⇨ Duas incubações em TRIS-HCl por 5 minutos cada; ⇨ Aplicação do agente cromógeno DAB durante 5 minutos;
⇨ Imersão em solução de Tween20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 durante 5 minutos;
⇨ Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente, durante 5 minutos;
⇨ Passagens rápidas em água destilada (3 trocas); ⇨ Desidratação em cadeia ascendente de etanóis: ⇨ Álcool etílico 80°GL (3 minutos);
⇨ Álcool etílico 95°GL (3 minutos); ⇨ Álcool etílico absoluto I (5 minutos); ⇨ Álcool etílico absoluto II (5 minutos); ⇨ Álcool etílico absoluto III (5 minutos); ⇨ Imersão em xilol I (5 minutos);
⇨ Imersão em xilol II (5 minutos);
⇨ Montagem da lamínula contra a lâmina em resina Permount® (Fisher Chemical Inc., Fair Lawn, NJ, USA) para observação em microscópio de luz.
Análise do perfil imunoistoquímico
Cada caso foi analisado por 2 examinadores, previamente calibrados, sob microscopia de luz (Olympus BX41, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão). Posteriormente, as lâminas foram escaneadas (Panoramic MIDI, 1.15 SPI, 3D HISTECH, Budapest, Hungria) e obtidas imagens por meio do programa Panoramic Viewer 1.15.2 (3D HISTECH, Budapest, Hungria).
A análise dos miofibroblastos através da marcação alfa-SMA, baseou-se na metodologia de Vered e colaboradores(5). Em um aumento de 100x abaixo do
37
cada um desses campos, em um aumento de 400X, foram quantificadas as células positivas, eliminando aquelas situadas na periferia dos vasos sanguíneos. Os valores obtidos foram somados e posteriormente calculada as médias das células positivas por campo, para cada caso individualmente. Os avaliadores fizeram as análises das lesões em separado e na presença de quaisquer discordâncias foram reavaliados os casos até que um consenso fosse alcançado.
Com relação ao índice angiogênico foi avaliado por meio da contagem microvascular (MVC). Desse modo, por meio da adaptação do estudo de Maeda e colaboradores (12). Em um aumento de 100X, abaixo do revestimento epitelial, foram
selecionados 10 campos de maior imunomarcação para o anticorpo CD34. Posteriormente, sob aumento de 200X, foram quantificados os microvasos em cada um desses campos. Os valores obtidos foram somados, estabelecendo-se o número total de microvasos. Por fim, foi calculada a média de microvasos por campo em cada caso.
Análise estatística
Os resultados obtidos com a análise imunoistoquímica foram digitados em planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2016®) e posteriormente exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 24.0; SPSS Inc., Chicago, IL, USA), por meio da versão free, no qual foram realizadas as análises estatísticas.
A análise estatística foi realizada através dos testes não paramétrico Mann-Whitney, Qui-quadrado de Pearson e correlação de Spearman. Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).
38
RESULTADOS
Resultados Clínicos
A amostra do presente estudo foi intencional e constituída de 60 casos, dos quais 30 (50,0%) foram diagnosticados como CRs e 30 (50,0%) como CRRs. Com relação à variável sexo, o feminino foi predominante nos CRs e o masculino nos CRRs. Quanto à localização anatômica, ambas as lesões demonstraram a região anterior da maxila como o sítio mais acometido. A média de idade para os casos de CR foi de (34,1±13,21) e os casos de CRRs foi de (52,8±13,34). Em relação à sintomatologia, os casos assintomáticos foram predominantes em ambas as lesões císticas. Os resultados referentes a cada uma das lesões podem ser visualizados na (tabela 1).
Tabela 1 - Distribuição dos casos de CRs e CRRs de acordo com o sexo, localização anatômica e sintomatologia. Natal/RN 2019.
Variáveis Lesões periapicais
CRs n (%) CRRs n (%) Sexo Feminino 24 (80%) 10 (33,3%) Masculino 6 (20%) 20 (66,7%) Total 30 (100%) 30 (100%) Localização Anatômica Maxila anterior 16 (53,3%) 16 (53,3%) Maxila posterior 6 (20%) 5 (16,7%) Mandíbula anterior 2 (6,7%) 3 (10%) Mandíbula posterior 6 (20%) 6 (20%) Total 30 (100%) 30 (100%) Sintomatologia Assintomática 22 (73,3%) 21 (70%) Sintomática 8 (26,7%) 9 (30%) Total 30 (100%) 30 (100%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.
Resultados Morfológicos
Em relação à espessura do epitélio, o teste qui-quadrado demonstrou associação significativa entre o revestimento epitelial e os tipos de lesões estudadas (tabela 2). Os CRs apresentaram maior frequência de epitélio hiperplásico em comparação com os CRRs que possuíam epitélio atrófico.
39
Tabela 2 - Distribuição dos casos de CRs e CRRs de acordo com a espessura do epitélio. Natal/RN 2019. Espessura do epitélio Atrófico N(%) Hiperplásico N(%) R.P (IC 95%) P valor CRs 13 (43,3) 17 (56,7) 0,61 (0,38-0,99) 0,037 a* CRRs 21 (70,0) 9 (30,0)
Razão de prevalência R.P, a* associação significativa para o teste Qui-quadrado. Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.
A análise da intensidade do infiltrado inflamatório revelou o predomínio do grau intenso em CRs. De forma divergente, os CRRs revelaram frequências maiores nos graus leve e moderado (tabela 3).
Tabela 3 - Distribuição dos casos de CRs e CRRs de acordo com o grau de infiltrado inflamatório e correlação entre o tamanho e o grau de infiltrado inflamatório. Natal/RN 2019
Infiltrado inflamatório Grau 1 N(%) Grau 2 N(%) Grau 3 N(%)
Mediana (Q25-Q75) Média dos postos
U P valor
CRs 2 (6,7) 7 (23,3) 21(70,0) 3,0 (2,0-3,0) 37,92 227,5 <0,001a*
CRRs 11(36,7) 11(36,7) 8(26,7) 2,0 (1,0-3,0) 23,08
a* diferença estatisticamente significativa para o teste Mann-Whitney
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/UFRN.
Com relação ao tamanho das lesões analisadas, os CRRs apresentaram dimensões maiores quando comparados aos CRs, as primeiras lesões exibiam 2 cm de diâmetro, em contrapartida, os CRs demonstraram 1,4 cm de diâmetro, levando em consideração as medidas macroscópicas. Nos casos de CRs a mediana encontrada (0,57±2,25) e nos CRRs (1,4±3,0).
Analisando as variáveis tamanho e o infiltrado inflamatório, de acordo com os testes de Spearman, observou-se que nos CRs não apresentaram correlações. Todavia, foi constatada correlação positiva moderada para os casos de CRRs (Gráfico 1).
40
Gráfico 1 - Box-Plot relativo ao tamanho da lesão e o grau de infiltrado inflamatório nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
Resultados Imunoistoquímicos Imunoexpressão do alfa-SMA
A análise dos miofibroblastos, identificados pela imunomarcação ao anticorpo alfa-SMA revelou a existência dessas células na maioria dos casos. Nos casos de cistos radiculares a média encontrada foi de 10 miofibroblastos por campo e mediana (0,0±40,0). Nos cistos radiculares residuais a média de miofibroblastos foi de 31,8 células por campo e mediana (3,7±77,6). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney demonstrou existir diferença estatisticamente significativa entre as lesões (gráfico 2).
Gráfico 2 - Box-Plot relativo a imunomarcação do alfa-SMA nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
p=0,087
p = 0,035*
rs= -0,318 rs= 0,375
41
Imunoexpressão do CD34
A avaliação das lesões imunomarcadas pelo anticorpo anti-CD34 revelou a imunoexpressão em células endoteliais. A análise do índice angiogênico foi avaliado por meio da MVC que revelou, para os cistos radiculares (mediana: 60,1) e nos CRRs (mediana: 58,1). O teste não-paramétrico de Mann-Whitney não revelou presença de diferença estatisticamente significativa entre as lesões (Gráfico 3).
Gráfico 3 - Box-Plot relativo a imunomarcação do CD34 nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
Com relação à imunomarcação do alfa-SMA e o CD34 entre as lesões periapicais. Os CRRs, de acordo com o teste de Spearman, apresentou correlação significativa do tipo positiva e moderada (Gráfico 4).
Gráfico 4 - Gráfico de dispersão relativo a imunomarcação do alfa-SMA e CD34 nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
A B p=0,231 rs=0,226 p=0,004* rs=0,509 p=0,988
42
Analisando o tamanho das lesões e comparando com a imunomarcação do alfa-SMA, a expressão do alfa-SMA foi maior nos cistos radiculares residuais de tamanhos maiores, exibindo desse modo, correlação positiva e moderada para o teste de Spearman. Porém, não foi observada significância estatística nos cistos radiculares (Gráfico 5).
Gráfico 5 - Gráfico de dispersão relativo a imunomarcação do alfa-SMA e tamanho nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019
Para as variáveis quantidades de vasos (CD34) e o tamanho, não foram constatadas correlações para as lesões estudadas, segundo o teste de Spearman (Gráfico 6).
Gráfico 6 - Gráfico de dispersão relativo a imunomarcação do CD34 e tamanho nos cistos radicularese nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
rs=-0,003
p=0,987 p=0,004* rs=0,510
rs=0,106 p=0,579
43
Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas com relação a expressão imunoistoquímica do alfa-SMA e o CD34 com a intensidade do infiltrado inflamatório presente nas lesões estudadas (Gráfico 7 e 8)
Gráfico 7 - Box-Plot relativo ao infiltrado inflamatório a marcação do alfa-SMA nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
Gráfico 8 - Box-Plot relativo ao infiltrado inflamatório a marcação do CD34 nos cistos radiculares e nos cistos radiculares residuais. Natal/RN 2019.
p= 0,923 p = 0,219 rs= 0,019 rs= 0,231 rs= -0,148 rs= 0,019 rs= -0,012 p= 0,949 p= 0,436
44
DISCUSSÃO
As lesões periapicais representam uma reação inflamatória dinâmica, ocasionada muitas vezes por necrose pulpar e processo bacteriano persistente do sistema de canais radiculares do dente (13). Contudo, a etiopatogenia das lesões
císticas odontogênicas inflamatórias e os seus mecanismos de crescimento e expansão não são completamente compreendidos.
Os cistos radiculares e os residuais são cistos odontogênicos inflamatórios. O primeiro, acontece mediante à estimulação inflamatória dos restos epiteliais de Malassez, secundária a um processo infeccioso, o qual foi além do sistema de canais radiculares e alcançaram os tecidos periapicais (14). Entretanto, os cistos
radiculares residuais são provenientes de cistos radiculares ou de outros cistos inflamatórios, os quais permaneceram no osso após procedimento cirúrgico inadequado ou incompleto e continuam o seu desenvolvimento (15).
Os CRs e CRRs possuem características histopatológicas bem semelhantes, entretanto, o estímulo determinante está presente nos CRs e ausente nos CRRs (16).
Por essas lesões estudadas se tratarem de natureza inflamatória, todos os casos foram classificados quanto à intensidade do infiltrado inflamatório. Desse modo, observou-se que os casos de CRs examinados apresentaram infiltrado inflamatório intenso (70%) corroborando com os estudos de Andrade e colaboradores(17) e Santos
Netto e colaboradores (18). Por sua vez, a maioria dos casos de CRRs exibiu infiltrado
inflamatório leve (36,7%), moderado (36,7%) e intenso (26,7%), estando em consonância com a pesquisa (17). Presume-se assim, que a intensidade do infiltrado
inflamatório ser maior nos CRs em relação aos CRRs, acontece na primeira lesão pela atividade metabólica ser mais intensa e na segunda pelos principais estímulos antigênicos não estarem mais presentes. (17).
Os espécimes de CRs e CRRs foram avaliados quanto ao tamanho e demonstraram maiores dimensões nos CRRs quando comparados aos CRs, corroborando com o estudo de Lopes, Armada e Pires. (19) De acordo com os autores
Cavalli e colaboradores (20), os CRRs continuam a crescer independente do estímulo
que o determinou. Alguns agentes irritantes como por exemplo os materiais obturadores extravasados para os tecidos periapicais podem contribuir para a inflamação persistir, favorecendo o crescimento cístico e explicando assim o motivo da não regressão de alguns casos (21). Outros pesquisadores a exemplo de Andrade
