Produção de enzimas celulolíticas e etanol celulósico a partir do resíduo de acerola

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO

PRODUÇÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS E ETANOL CELULÓSICO A PARTIR DO RESÍDUO DE ACEROLA

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CAMILLA RUAMA ROSA FERREIRA

PRODUÇÃO DE ENZIMAS CELULOLÍTICAS E ETANOL CELULÓSICO A PARTIR DO RESÍDUO DE ACEROLA

Trabalho de conclusão de curso de graduação apresentado à Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Engenheira Química.

Natal/RN, de 03 de novembro de 2020.

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Co-Orientadora: Juliene da Câmara Rocha

NATAL/RN 2020

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BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos Orientador – UFRN

Ma. Juliene da Câmara Rocha Coorientadora – UFRN

Prof. Dra Magna Angelica dos Santos Bezerra Sousa

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AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, a Ele toda a honra, toda glória e louvor, sem sua provisão, soberania e cuidado para comigo eu não estaria aqui.

Ao meu pai Paulo André Ferreira pelo seu cuidado, provisão e direcionamento, à minha mãe Genôra Lourenço Rosa Ferreira pelo seu amor, cuidado e proteção, ao meu irmão Francisco

Pedro da Costa Bisneto por sua companhia, irmandade e amor.

Aos meus avós Joanita Ferreira da Costa e José Augusto Ferreira que cuidaram e conviveram todos os dias comigo durante meus últimos três anos de graduação. Ao Victor Wallen de

Medeiros Annes que tem sido minha companhia durante os últimos anos de graduação, trazendo apoio e felicidade a todos meus dias.

A minha igreja Nazasul que desde 2016 tem cuidado da minha vida com tanta primazia, aos meus amigos do Nazafit que fortalecem minha fé e caminhada até a eternidade. Aos meus

amigos do BFF’s que estiveram comigo desde meu ensino médio e ao CCM que esteve comigo desde o primeiro dia da graduação, compartilhando juntos todos os desafios da vida

acadêmica. Sem meus amigos eu não teria sobrevivido à graduação de maneira mais leve e feliz.

Ao meu orientador Dr. Everaldo dos Santos Silvino que possibilitou a realização desse trabalho no LEB. A toda equipe do LEB que auxiliou meu dia a dia de pesquisa no laboratório. A professora Dra. Magna Angelica dos Santos por seu exemplo em ensino

durante a graduação e participação da banca.

A minha co-orientadora Juliene da Câmara Rocha que trouxe tanto amor e cuidado regado a ensino e pesquisa, pelo acompanhamento do início ao fim do projeto. Tenho certeza que não

teria conseguido sem seu auxílio.

Aos professores da UFRN que contribuíram com minha formação e ao Núcleo de Tecnologia de Engenharia Química (NuTEQ) que proporcionou meu crescimento acadêmico e

profissional.

A Deus seja toda a glória por ter me proporcionado conhecer as pessoas que me fizeram o ser humano que sou hoje.

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RESUMO

Nos processos tecnológicos, os resíduos de biomassa tornaram-se grande aliados à nova tecnologia verde e têm contribuído com a produção do bioetanol. O etanol é obtido a partir da fermentação alcoólica, via microrganismo, este se alimenta das moléculas de glicose. Na obtenção de etanol a partir de lignocelulósicos, a glicose é adquirida a partir da clivagem por enzimas celulolíticas (celulases) do polímero de celulose, o qual é constituinte de diversos vegetais, entre eles a acerola. Os resíduos agroindustriais têm como constituintes, majoritariamente, a celulose, hemicelulose e a lignina. O mesmo ocorre para a acerola, a qual tem em sua composição celulose, tornando-a como matéria-prima para microrganismos produtores de celulase. A partir da caracterização físico-química, realizou-se a produção de celulases por fermentação em estado sólido do resíduo agroindustrial utilizando o microrganismo Trichoderma reesei, avaliando-se ao longo do tempo de cultivo o pH, a concentração de açúcares redutores e a concentração das enzimas FPase, CMCase e xilanase. Realizou-se o pré-tratamento no intuito de facilitar o acesso à celulose através das enzimas sintetizadas pelo microrganismo (T. reesei). Após o pré-tratamento do resíduo com peróxido de hidrogênio e peróxido de hidrogênio alcalino, foi realizada a hidrólise no resíduo pré-tratado. O extrato enzimático sintetizado na fermentação em estado sólido é utilizado na etapa da hidrólise para aumentar o rendimento do etanol na última etapa do processo, a fermentação alcoólica. Obteve-se valor de atividade enzimática de até 1,08 FPU/g. O resultado obtido no trabalho mostra que o bagaço de acerola é um substrato viável para obtenção de açúcares fermentescíveis e sua subsequente conversão em etanol. Os resultados de caracterização físico-químicas tais como dos açúcares redutores totais (ART), proteína, celulose e hemicelulose, os resultados das atividades enzimáticas de CMCase e Xilanase, como também as etapas de hidrólise e fermentação alcoólica, não foram possíveis de serem obtidos. Por motivo dos experimentos serem interrompidos devido a interdição no laboratório LEB e na universidade UFRN por causa da pandemia provocada pelo vírus SARS-CoV2, ou seja, pela doença COVID-19.

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ABSTRACT

In technological process, biomass residue is envolved with the green technology and it has contributed with the bioethanol produce. The ethanol is produced from the alcoholic fermentation using the microorganism in the process, the glucose is the food to microorganism, and than, the microorganism grows and develops. Its possible get glucose from the cellulose polymer cleavege through cellulase. The cellulase is present in the various vegetables and fruits, including the acerola. The agroindustry residues are formed by, mostly, cellulose, hemicellulose and lignin. The acerola is formed the same way, it has cellulose as a constituent. Therefore is a good raw material to use for the food to microorganism that produce the cellulase. The seach starts with the physical-chemical caracterization, and after, the cellulase production by solid state fermentation using the biomass residue, the acerola, and the microorganism Trichoderma reesei. The process was measured all the time watching the pH, the reducing sugars concentration and the enzymes FPase concentration, CMCase concentration and xylanase concentration. The preatreatment is realized to facilitate the cellulose access to the enzymes produced by microorganism (T. reesei) to access the cellulose. After the pretreatment with hydrogen peroxide and alkaline hydrogen peroxide, was realized the residue hydrolysis. The enzymatic extract was synthesized in solid state fermentation is use in the hydrolysis stage to increase ethanol yield in the last process stage, thae alcoholic fermentation. The enzymes activity values was until 1,08 FPU/g. All stages this seach to show that the acerola residue is a viable substrate to get the fermentable sugars and the conversion to ethanol. The physical-chemical caracterization results like total reducing sugars, protein, cellulose and hemicellulose, the enzymatic activities like CMCase and Xylanase , the hydrolysis stage and alcoholic fermentation stage was not possible realized because the experiments were stopped and the laboratory (LEB) and the university (UFRN) werer stopped to working due to pandemic caused by virus SARS-CoV2, in other words, by COVID-19 desease.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Acerolas com cores e tamanhos diferentes. ...15

Figura 2. Aceroleira com florescimento e frutos em vários estágios de formação. ... 16

Figura 3. Ação sinérgica das enzimas do complexo enzimático. ... 21

Figura 4. Aparência do fungo Trichoderma reesei.. ... 31

Figura 5. Resíduo de acerola pré-tratado com peróxido de hidrogênio... 37

Figura 6. Resíduo de acerola pré-tratado com peróxido de hidrogênio alcalino. ... 37

Figura 7. Cinética do cultivo utilizando resíduo de acerola por FES. . ... 38

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Caracterização Físico-Química do resíduo agroindustrial da acerola.. ... 18 Tabela 2. Características Físico-Químicas do resíduo de acerola.. ... 35

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

LEB – Laboratório de Engenharia Bioquímica DEQ – Departamento de Engenharia Química

UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte FES – Fermentação em Estado Sólido

SST – Sólidos Solúveis Totais Brix – Teor de sólidos solúveis EnG – Endoglucanases

ExG – Exoglucanases BG – β-glicosidases

CMC – Carboximetilcelulose DNS – Ácido 3,5 – dinitrosalicílico

CLAE – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência BDA – Ágar Batata Dextrose

Abs – Absorbância

HPLC – High Perfomance Liquid Chromatography SFS – Sacarificação e fermentação simultânea

T. reesei – Trichoderma Reesei

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Sumário

1. INTRODUÇÃO ... 12 2. OBJETIVOS... 14 2.1 Objetivo geral ... 14 2.2 Objetivos específicos... 14 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 15 3.1 Acerola ... 15 3.2 Comercialização ... 16 3.3 Resíduo Agroindustrial ... 17 3.4 Enzimas celulolíticas ... 19

3.4.1 Aplicação das celulases ... 19

3.4.2 Mecanismo de ação das celulases ... 20

3.4.3 Microrganismos produtores de celulases ... 21

3.5 Fermentação em estado sólido (FES) ... 22

3.6 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio ... 23

3.7 Hidrólise Enzimática ... 23

3.8 Processo Fermentativo ... 24

4. MATERIAL E MÉTODOS ... 26

4.1 Obtenção e preparo do adsorvente ... 26

4.2 Caracterização físico-química do resíduo ... 26

4.2.1 Densidade aparente ... 26

4.2.2 Granulometria ... 27

4.2.3 Diâmetro médio de Sauter (dps) ... 27

4.2.4 pH ... 27

4.2.5 Açúcares redutores (AR) ... 27

4.2.6 Teor de sólidos solúveis - ºBrix ... 28

4.2.7 Umidade ... 28

4.2.8 Extraíveis ... 29

4.2.9 Celulose, hemicelulose e lignina solúvel ... 29

4.2.9.1 Hidrólise com ácido sulfúrico 72% ... 29

4.2.9.2 Determinação de lignina insolúvel ... 30

4.3 Cultivo em estado sólido ... 31

4.3.1 Microrganismo e manutenção ... 31

4.3.2 Propagação de esporos e inóculo ... 32

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4.4 Extração de enzimas ... 32

4.4.1 Determinação da atividade enzimática FPase ... 33

4.5 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio e peróxido de hidrogênio alcalino ... 34

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 35

5.1 Caracterização físico-química ... 35

5.2 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino ... 36

5.3 Produção da celulase – Fermentação em estado sólido... 38

6. CONCLUSÕES ... 40

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12 - Introdução

1. INTRODUÇÃO

O mercado agroindustrial mundial destaca desde o pioneirismo das indústrias. O Brasil – um dos pioneiros nas agroindustrias – tem sido notado desde o início do século XX com a evolução da agroindústria brasileira (RAMOS, 2007), revigorando no presente e acentuando até eras futuras. De 1995 até 2003, o consumo per capita de frutas frescas cresceu 13% mundialmente. Em 2002 até 2005, o mercado de frutas frescas mundial aumentou em 53%; arrecadando um valor de US$ 51,3 bilhões (BRASIL, 2007). Orgãos internacionais e centros acadêmicos de pesquisa como OECD/FAO, USDA, FAPRI, IFPRI têm conduzido propostas de estudos mundiais a longo prazo para os resíduos agroindustriais (WILKSON, 2009) trazendo perspectivas do mercado para as próximas décadas.

O Brasil possui destaque na produção de resíduos agroindustriais por possuir uma ampla biodiversidade e ser um grande produtor de frutas tropicais. No mercado de frutas, o interesse mundial consiste em 3 classificações – grupo 1: Frutas Tropicais Tradicionais; grupo 2: Outras Frutas Tropicais; e, grupo 3: Frutas de Clima Temperado (MARTENELLI & CAMARGO, 2000). O Brasil está com predominância em 2 dessas 3 classificações. O país é o terceiro produtor mundial de frutas tropicais, com 39 milhões de toneladas em 2006 o que equivale a 5% da produção mundial, estando atrás apenas dos países China e Índia (FERNANDES, 2007). No ano de 2017, a produção frutífera no Brasil foi de 44 milhões de toneladas de frutas frescas (ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2016) o que demonstra indiretamente um crescimento e destaque da geração de resíduos provenientes do processamento de frutas nas indústrias de sucos e bebidas.

Com uma larga escala de produção frutífera no mercado agroindustrial, é válido observar a geração de resíduos orgânicos como subproduto do processo produtivo. A reutilização dos resíduos faz com que a utilização da matéria-prima ocorra com alto rendimento, fazendo com que sua decomposição não afete em grande escala o meio ambiente. Dentre os resíduos do mercado agroindustrial, o resíduo da fruta acerola (Malpighia glabra) é rico em nutrientes, minerais e vitaminas, como ácido ascórbico, o que traz interesse no mercado da reutilização desse resíduo. Por isso, os processos biotecnológicos podem gerar alto valor agregado, resultando em grandes vantagens ecológicas e econômicas (ROCHA, 2018).

Uma das alternativas para a reutilização do bagaço da acerola é o processo de produção de enzimas, pois nesse processamento utiliza-se do microrganismo para sintetizar as enzimas de interesse através do resíduo. Uma vez que essas enzimas clivam o polímero presente na matéria prima. Após essa hidrólise, geram-se os monômeros que são consumidos pelo

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13 CAMILLA RUAMA ROSA FERREIRA

- Introdução

microrganismo. Tendo em vista esses efeitos da matéria-prima para a produção de enzimas, o mercado de produção enzimática tem crescido significativamente nas duas últimas décadas. A previsão é que haja um retorno de 7% de crescimento nos anos de 2015 a 2020, podendo chegar a US$ 6,4 bilhões no final desse período. Por isso, é importante obter essas enzimas na sua forma mais ativa e a baixo custo (ROCHA, 2018).

A acerola, assim como a maioria dos resíduos agroindustriais, tem como seus constituintes a celulose, hemicelulose e lignina. Esse resíduo pode ser utilizado para o processo da hidrólise, clivando a celulose presente pela ação das celulases (BADHAN et al. 2007). Essas enzimas clivam a ligação β-1,4-glicosídica da cadeia da celulose presente na biomassa.

Uma alternativa para a produção de celulases como provável menor custo de produção é o cultivo microbiano em resíduos agroindustriais de origem vegetal por fermentação em estado sólido (FES). Essa fermentação consiste no crescimento do microrganismo sobre ou dentro de uma matriz sólida. Nessa matriz há uma porção de líquido existente no processo, que está a um nível de água que seja suficiente para que assegure o crescimento metabólico das células, mas que também não exceda a capacidade máxima de ligações da água com a matriz sólida (MÉLO, 2016).

Devido ao baixo nível de água na FES, os fungos filamentosos, como o Trichoderma

reesei, tem proporcionado interesse em centros de pesquisas, por possuir uma maior capacidade

de crescimento em baixa quantidade de água livre uma vez que conseguem se adequar ao meio e produzir enzimas nestas condições (MÉLO, 2016).

Porém, mesmo sendo um processo que rende a custo baixo, a FES também possui baixo rendimento (inferior a 20%) e esses resultados podem ser aprimorados com o uso do procedimento de pré-tratamento (HAMELINCK et al., 2005). O propósito do pré-tratamento é retirar as barreiras estruturais dos materiais lignocelulósicos, facilitando uma melhora no teor de celulose. Portanto, a hidrólise é favorecida pela acessibilidade de celulose na biomassa, promovendo um maior rendimento de açúcares fermentescíveis a partir da celulose (MOSIER

et al., 2005).

Diante dos aspectos citados, buscou-se avaliar a produção de celulases pelo microrganismo Trichoderma reesei, a eficiência do extrato enzimático na etapa de hidrólise do resíduo pré-tratado de acerola e, subsequentemente, a produção do etanol celulósico.

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14 Objetivos

2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral

Produção de enzimas celulolíticas por fermentação em estado sólido a partir do resíduo de acerola e avaliação da viabilidade de produção de etanol celulósico usando o resíduo de acerola.

2.2 Objetivos específicos

▪ Determinar a composição físico-química dos resíduos de acerola;

▪ Avaliar o emprego do resíduo de acerola como indutores para a produção de enzimas celulolíticas por fermentação em estado sólido;

▪ Obter enzimas celulolíticas da etapa anterior para a a avaliação de uma produção de etanol por fermentação alcoolica;

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Revisão Bibliográfica

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Acerola

O fruto acerola (Malpighia glabra) começou a ser cultivado por volta de 1950 em Porto Rico, logo após prosseguindo para o Havaí, Flórida e Cuba. Cerca de 50 anos atrás ocorrera a introdução da acerola no nosso país, tendo melhor continuidade de produtividade na região semi-árida do Nordeste Brasileiro (MATTA; CABRAL, 2010; RITZINGER; RITZINGER, 2011). O consumo da acerola é devido ao seu alto teor de ácido ascórbico (vitamina C) que em algumas variedades, chegam a 5000 mg/100 g de polpa, resultado que chega a ser superior 100 vezes ao índice da laranja e 10 vezes ao da goiaba (BRASÍLIA, 2012).

Os frutos possuem diversos formatos desde arrendodados, até ovalados e cônicos, dependendo da sua variedade. Quanto à cor, quando amadurecidas, podem ser vermelhas, roxas, amarelas e até branca (Figura 1). Essa coloração é um aspecto importante pois determina variação nas suas propriedades, como por exemplo o teor de ácido ascórbico (BRASÍLIA, 2012).

Figura 1. Acerolas com cores e tamanhos diferentes.

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16 Revisão Bibliográfica

A aceroleira, árvore do fruto acerola (Figura 2), também conhecida como cerejeira-das-antilhas, é originária de duas espécies Malpighia glabra e Malpighia punicifolia. Acredita-se que os pomares de aceroleiras que vinheram para o Brasil sejam originárias de Porto Rico e da espécie Malpighia punicifolia (BRASÍLIA, 2012).

Figura 2. Aceroleira com florescimento e frutos em vários estágios de formação.

Fonte: (BRASÍLIA, 2012).

3.2 Comercialização

No Brasil, a área plantada com acerola é cerca de 7200 ha, tendo na região Nordeste 3100 ha, o que torna a região como a maior produtora do país. Há, em média, 150 mil toneladas de frutas produzidas por ano. Atualmente, o Nordeste ocupa o ranking com participação de aproximadamente 64% desse total (BRASÍLIA, 2012).

A comercialização no mercado interno encontra-se 46% para indústria de processamento e 54% para o mercado de consumo. O Brasil é o maior produtor, consumidor e exportador mundial de acerola. Tendo como os estados maiores produtores Pernambuco (23/11%), Ceará (14,32%), São Paulo (11,39%) e Bahia (10,48%) (BRASÍLIA, 2012).

Apesar do cultivo da acerola possuir mais de 50 anos no Brasil, seu cultivo em escala comercial e com uso de tecnologias mais apropriadas é recente (BRASÍLIA, 2012). Por isso o uso de tecnologia com sua matéria-prima até os resíduos tem sido campo de investimento e pesquisa para desenvolvimento.

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3.3 Resíduo Agroindustrial

No Brasil, o setor agroindustrial gera grande quantidade de resíduos. Diante dos demais aspectos, alguns dos resíduos sólidos são gerados nas indústrias processadoras de frutas e hortaliças (tortas, refugo, bagaço e restos). Os resíduos são provenientes das cascas e sementes que não foram aproveitados no processamento, ou seja, que não houve a utilidade máxima do fruto. Não sendo reaproveitado nem reciclado adequadamente (SILVA, 2015).

Durante o processamento da acerola para a produção da polpa congelada ou suco, na etapa de prensagem é gerado o bagaço altamente fibroso da fruta. A coloração avermelhada intensa denota alta concentações de antocianinas e ácido ascórbico sendo que muitas vezes esse resíduo é descartado, gerando mais volume de resíduo orgânico durante a época de safra. O volume do bagaço gerado indica que ele pode ser utilizado para proporcionar valor comercial para a economia, tendo como consequência a valorização da matéria-prima e sua rentabilidade maximizada (SILVA, 2015).

Durante o processo fabril, cerca de 15 a 41% do volume total da acerola é de bagaço, cascas e sementes, sendo eles na maior parte descartados e considerado como custo operacional para as empresas. O sucesso da industrialização fica apenas creditado na quantidade de polpa comestível que a fruta produz, não sendo utilizado os resíduos para alguma aplicação, como adubo, ração animal e processos biotecnológicos (SILVA, 2015).

Devido à necessidade de valor agregado aos resíduos agroindustriais, a busca por inovação e utilização de forma prática tem sido tema de vários estudos com o intuito de que estes sejam adequadamente aproveitados. Para isso, é necessário o conhecimento de sua composição e seus constituintes através de uma investigação científica e tecnológica (VIEIRA et al., 2009). Para o estudo da composição da acerola, é importante denotar que seus resultados dependem das espécies, condições ambientais e também dos estágios de maturação da fruta.

As caracterizações físico-químicas do resíduo agroindustrial (Tabela 1) podem ser expressos por esses parâmetros.

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Tabela 1. Características físico-químicas do resíduo agroindustrial da acerola.

Propriedade SANCHO et al.,

2015 SILVA et al., 2014 MÉLO et al., 2014 Atividade de água 0,38 ± 0,01 - - pH 3,45 ± 0,03 - 3,54 ± 0,01

Sólidos solúveis totais (°Brix) 3,00 ± 0,04 - 29,97 ± 0,20

Acidez (g/ 100 g) 3,60 ± 0,40 - - Proteína (g/ 100 g) - - - Açúcares redutores (g/ 100 g) 15,29 ± 0,10 - 9,40 ± 0,10 Umidade (g/ 100 g) 4,90 ± 0,35 7,38±0,08 7,98 ± 0,21 Cinzas (g/ 100 g) 2,07 ± 0,07 2,36 ±0,01 2,36 ± 0,05 Lignina (%) - 28,37±0,05 - Lipídios (g/ 100 g) 2,92 ± 0,03 -

Fonte: (ROCHA, 2018; SILVA, 2014).

O teor de umidade aumenta durante o desenvolvimento da acerola. Após seu desenvolvimento, em média, ainda há um crescimento da umidade, pela formação de água livre na fosforilação oxidativa do amadurecimento (MARANHÃO, 2010). Em literaturas, os valores de acerola chegam a ter variação entre 4,9% a 10,01% (MARANHÃO, 2010; ROCHA, 2018). Essa variação depende da metodologia utilizada, do período de maturação da fruta que produz o resíduo, da região e o período de colheita entre outros fatores.

O resíduo também apresenta valores variáveis de umidade, alguns fatores como a matéria-prima utilizada, o modo de secagem e o local de armazenamento do resíduo contruibuem para essa variação. De acordo com a literatura, ela ocorre entre 4,9% a 7,83% (SILVA, 2014; MELO et al. , 2014; SANCHO et al. 2015).

O pH pode ser variável quanto a espécie da aceroleira, períodos de safra, regiões de cultivo e outros fatores. Esses fatores provocam alterações no pH da acerola e consequentemente no resíduo. O pH da acerola reduz conforme seu desenvolvimento, o valor varia entre 3,5 a 4,28 (MARANHÃO, 2010). Na Tabela 1 é possível notar que os resíduos de acerola também apresentam uma linha próxima dos valores de pH, variando entre 3,45 a 3,54 (MELO et al. , 2014; SANCHO et al. 2015).

O valor baixo para sólidos solúveis totais (SST) sugere a ausência do sabor doce (propriedade organoléptica) da acerola, já valores altos indicam presença do sabor doce, que

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variam de acordo com a fase de maturação do fruto, as condições de cultivo e a espécie. (YUSOF; IBRAHIM, 1994).

A atividade de água representa a quantidade de água livre do meio e a umidade define a concentração de água presente no meio. O valor da atividade de água menor que 0,6 afirma a condição de não propiciar o crescimento microbiano quanto produzir de toxinas (CORREIA, 2004; SANCHO et al., 2015).

Por fim, destaca-se que a acerola é um material lignocelulósico e tem potencial para produção de celulases em FES por apresentar condições favoráveis ao processo de fermentação. Trabalhos publicados na literatura apontam para a produção da celulase no resíduo de acerola, com melhores resultados entre o 2º ao 4º dia de fermentação (ROCHA,2018).

3.4 Enzimas celulolíticas

Em meio natural, a celulose é degradada pelas celulases sintetizadas pelos microrganismos, os quais são pertencentes ao grupo dos fungos e eubactérias. As celulases, também chamado de enzimas celulolíticas, realizam a degradação da celulose. Essas enzimas hidrolisam oligossacarídeos e polissacarídeos e clivam as ligações β–1,4 entre as moléculas de glicose (HAICHAR et al., 2007).

3.4.1 Aplicação das celulases

As celulases começaram a ser produzidas em escala industrial por volta da década de 80, sendo utlizada como insumo para alimentos e aditivo para ração animal. Logo após começou a ser utilizada nas indústrias têxteis, de polpa e papel e em lavanderias (CASTRO & PEREIRA JR, 2010; COELHO, 2008).

As celulases, atualmente, estão entre uma das mais importantes classes de enzimas para os processos biotecnológicos, ocupando um ranking de terceiro lugar entre as enzimas industriais, devido sua utilização no processo industrial de algodão, reciclagem e papel, como enzima detergente, extração de suco e aditivo em ração animal (WILSON, 2009).

As celulases são usadas na indústria têxtil para deixar os tecidos mais lisos e macios. Elas também são aplicadas no ramo alimentício, na extração de componentes do chá verde, da proteína de soja, dos óleos essenciais e do amido de batata doce. Além do processo de produção de vinagre e laranja, do ágar, e na extração e clarificação de frutas cítricas (ORBERG, 1981).

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O ramo da produção de bioetanol também engloba a atuação das celulases durante a etapa do proceso de hidrólise. Esta etapa consiste na conversão da celulose em glicose, a fim de proporcionar a formação de açúcar fermentescível para consumo da levedura. E, dessa maneira, obter-se o etanol via microrganismo (AMORIM, 2010).

3.4.2 Mecanismo de ação das celulases

As celulases são classificadas de acordo com seu local de atuação no substrato celulósico. Os três grandes grupos da classificação são: endoglucanases (EnG), as quais clivam ligações internas da fibra celulósica; as exoglucanases (ExG) que atuam na região externa da celulose; e as β-glicosidases (BG) que hidrolisam celobioses solúveis em glicose (LYND, 2002).

As endoglucanases são enzimas responsáveis por iniciar a hidrólise da molécula de celulose. Elas atuam randomicamente na região amorfa da cadeia de celulose, clivando ligações β–1,4 na região central da molécula e liberando como produto oligossacarídeo de diversos graus de polimerização (DIENES et al., 2004). A carboximetilcelulose (CMC) é utilizada como substrato preferencial para quantificar a atividade dessas enzimas (CAO & TAN, 2002).

As exoglucanases agem nas extermidades da molécula de celulose monocristalina, liberando unidades de celobiose (CAO & TAN, 2002). As celobiohidrolases são exoglucanases que hidrolisam a celulose em unidades de celobioses (BON et al., 2008). As β-glucosidases atuam catalisando a hidrólise da celobiose em glicose, reduzindo a simbiose entre as enzimas endoglucanases e exoglucanases, pois todas essas estão atuando juntas para a obtenção do monômero de glicose. A atividade das enzimas do complexo celulítico na maioria dos casos ocorre de forma sinérgica (Figura 3) que consiste na atividade combinada das enzimas sendo maior do que o somatório das atividades individuais de cada componente (LYND et al., 2002).

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Figura 3. Ação sinérgica das enzimas do complexo enzimático.

Fonte: (CASTRO & PEREIRA JR, 2010).

3.4.3 Microrganismos produtores de celulases

As celulases podem ser produzidas de forma natural ou sintetizadas (manipulação da sua produção em laboratório) onde a segunda tem crescido de maneira exponencial nas pesquisas e estudos, proporcionando as melhores condições de cultivo e de produção. Para a produção da enzima, é necessário um microrganismo o qual atue como agente metabolizador da fonte de carbono presente no meio do cultivo, a partir das próprias enzimas excretadas. (TAVARES, 2009; DAMASO et al., 2012).

Dentre os microrganismos, existem os que são capazes de produzir celulases, o quais estão no grupo de bactérias anaeróbicas (Clostridium, Caldicellulosiruptor, Ruminococcus,

Acetivibrio, Butyrivibrio) e aeróbicas (Cellulomonas, Thermobifida, Cytophaga, Sporocytophaga), actinomicetos (Streptomyces), fungos filamentosos (Bulgaria, Chaetomium, Helotium, Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum, Serpula, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces), plantas (Fragaria) e animais (moluscos, insetos)

(LYND et al., 2002; PALOMER et al., 2004).

Porém, os mais levados em relevância comercial e que possuem bons resultados de produção são as espécies Penicillum oxalicum, Aspergillus niger e Trichoderma reesei. As enzimas produzidas por esses microrganismos tem gerado um potencial em torno de 400 milhões de dólares por ano, com crescimento nas áreas de desenvolvimento em biocombustíveis e na biotecnologia (ZHANG et al., 2006).

(22)

O gênero Trichoderma pertence aos fungos saprótifos mesofílicos o qual estão na divisão Ascomycota, da ordem Hyprocreales e da família Hypocreaceae, foi descrito em 1801 por Persoon ex Gray. Seu aspecto é verde brilhante, causado pelas conídias presentes nas hifas aéreas (SILVA, 2015). A espécie reesei do gênero em questão é um dos fungos que possui melhor desempenho em produção de celulase e de interesse em estudosna busca de aumentar sua produção enzimática (MONTENECOURT & EVELEIGH, 1977).

3.5 Fermentação em estado sólido (FES)

Também conhecida como fermentação semissólida, é definida como o processo fermentativo em que ocorre o crescimento do microrganismo com quase ausência de água livre, contendo apenas a água suficiente para o substrato (SOCCOL & VANDENBERGHE, 2003). A presença de água é importante para o bioprocesso, como difusão de nutrientes no meio reacional, absorção destes pelos agentes microbianos, remoção de metabólito, manutenção e estabilidade da estrutura biológica. Nesse processo, a água encontra-se complexada com a matriz sólida ou como uma fina camada absorvida na superfície do resíduo particulado (CASTRO & PEREIRA JR, 2010).

A vantagem da FES é porque ela proporciona uma fácil manutenção, menor custo de operação, maior concentração de produtos formados, facilidade na extração do produto utilizando os solventes adequados e espaço físico reduzido em comparação a outros tipos de fermentação como, por exemplo, a fermentação submersa (ALBANO, 2012).

Além disso, o crescimento microbiano que ocorre na FES é semelhante à maneira que ocorre em condições naturais e isso é um dos fatores que proporciona a produção de várias enzimas (DALSENTER et al., 2005). A FES possibilita a utilização de resíduos agroindustriais como substrato para obtenção de enzimas com alto valor agregado; isto torna atrativo o interesse industrial. Trazendo ao mercado alimentício e de resíduos agroindustriais uma solução para a reutilização dos seus resíduos.

Porém, o processo também apresenta algumas desvantagens, por ser um processo semelhante ao que ocorre na natureza, há dificuldade no monitoramento e controle dos parâmetros da fermentação, como o conteúdo da biomassa, pH, temperatura, umidade e dificuldade, principalmente em larga escala, do controle da temperatura e umidade além da perda do produto durante o processo de extração (HAMIDI-ESFAHANI et al., 2004).

(23)

3.6 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio

O peróxido de hidrogênio é utilizado significativamente nas indústrias de papel e celulose como agente de branqueamento. Quando usado no pré-tratamento de biomassa lignocelulósica, possui vantagem por não deixar resíduo de biomassa uma vez que peróxido se decompõe em água e oxigênio. Quanto à formação de produtos secundários, possíveis inibidores dos processos enzimáticos e fermentativos são praticamente inexistentes (ALBANO, 2012). Tornando-se uma vantagem, pois a utilização da água no processo é um fator notório para a produção de etanol (RABELO et al., 2011).

De acordo com Gould (1984), a deslignificação dos resíduos depende do valor do pH da solução de pré-tratamento, buscando estar entre as faixas de 10,5 a 11,5. Quando associado ao hidróxido de sódio, a solução torna-se mais efetiva para a deslignificação e solubilização da hemicelulose, devido a formação do ânion (HOO-) formado no pH alcalino, sendo a espécie mais ativa no peróxido. Além disso, o peróxido de hidrogênio é instável em meio alcalino e decompõe em radicais hidroxil (OH-_{) e superóxido (O}

-2), atuando na oxidação da lignina, a qual

ataca grupos hidrofílicos, quebrando algumas ligações, levando à dissolução da lignina e hemicelulose (GONÇALVES, 2014).

Pesquisas apontam que o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio rende consideráveis quantidades de açúcares na hidrólise de diferentes biomassas (SILVA, 2017). O bagaço da cana-de-açúcar pré-tratado com peróxido de hidrogênio alcalino na concentração de 7,35% de H2O2

rendeu 92,59% da hidrólise (RABELO et al., 2014). Em outro trabalho, a alga Ulva prolifera obteve rendimento de 92,5% na hidrólise usando apenas 0,2% de H2O2 (LI et al., 2016). Mesmo

diante de bons resultados, o efeito do pré-tratamento irá variar de acordo com a composição da biomassa, concentração da solução, tempo de pré-tratamento e carga da biomassa (ZHAO et al., 2016).

3.7 Hidrólise Enzimática

Quando longas cadeias de celulose e hemicelulose conseguem ser quebradas em açúcares pelas enzimas, estas são caracterizadas como celulases e hemicelulases, respectivamente, e o processo denominado de hidrólise enzimática. Já a degradação da lignina, pelas ligninases.

(24)

No ramo das enzimas, existem diversas delas que atuam na hidrólise da celulose (endoglucanase, avicelase, celobiase e carboximetilcelulase) e na hemicelulose (glicanases, xilanases e galactanases) e as fenoloxidades que atuam sobre a lignina (manganês-peroxidase, lignina-peroxidase e lacase) (WOOD & GARCIA-CAMPAYO, 1990; TUOR et al., 1995).

No meio hemicelulolítico, as β-1,4-endoxilanases despolimerizam a xilana pela hidrólise randômica do esqueleto principal. E, as β-xilosidases quebram a xilana em pequenos oligossacarídeos; liberando a xilose (LEE, 1997; BUCKERIDGE et al., 2008).

3.8 Processo Fermentativo

Há duas principais estratégias para produzir etanol a partir de resíduos lignocelulósicos, conduzindo a hidrólise enzimática e a fermentação de forma separada, ou de forma simultânea, ocorrendo essas etapas juntas. Na estratégia de hidrólise e fermentação, ocorrendo em etapas separadas, pode-se definir as condições ótimas de pH e temperatura individualmente para cada fase. No entanto, pode ocorrer acúmulo da glicose e celobiose na etapa de hidrólise, provocando a não absorção total dos açúcares pelo microrganismo para a síntese do etanol (XIAO et al., 2004).

Na estratégia de sacarificação e fermentação simultânea, as etapas de fermentação e hidrólise ocorrem ao mesmo tempo, fazendo com que os açúcares fermentescíveis que são liberados na ação enzimática, sejam de imediato disponibilizado no meio para absorção pelo microrganismo para a síntese de etanol, o que minimiza a inibição catabólica (DE SOUZA et al., 2012). O que traz de benefício da segunda estratégia, é que a mesma possibilita maiores conversões de celulose e hemicelulose em açúcares fermentescíveis. Além disso, gera um menor custo devido a redução da carga enzimática utilizada durante a hidrólise do material e maior produtividade volumétrica de etanol, quando comparado a primeira estratégia. Outra vantagem é que quando a hidrólise e a fermentação ocorrem simultaneamente, a presença do etanol diminui o risco de contaminação microbiana, além da necessidade de apenas um reator (SHEN & AGBLEVOR, 2010). Como contraponto, a estratégia de hidrólise e fermentação separadas fornecem uma maior velocidade na hidrólise, devido o ajuste de pH e temperatura ótimos para atuação das enzimas.

Há a possibilidade de uma estratégia de sacarificação e fermentação semi-simultânea, o que proporciona a extração dos melhores pontos de cada estratégia, permitindo a amenização desses desafios (MESA et al., 2011). Dessa forma, é esperado que a sacarificação e fermentação

(25)

semi-simultânea seja a que forneça maior produção e rendimento do etanol em comparação com as demais estratégias. Além disso, possui um tempo de pré-sacarificação apropriado uma vez que a execução considera o ponto de equilíbrio entre os fatores inibitórios e as taxas de conversões dos açúcares. (SHEN & AGBLEVOR, 2010; MESA et al., 2011).

(26)

26 Material e métodos

4. MATERIAL E MÉTODOS

Todos os procedimentos experimentais descritos neste trabalho foram realizados no Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) do Departamento de Engenharia Química (DEQ) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

4.1 Obtenção e preparo do adsorvente

O resíduo de acerola (Malpighia glabra) foi obtido através da empresa Sterbom situada na cidade de Macaíba-RN, Brasil. O resíduo passou pela etapa de secagem em uma estufa com circulação forçada de ar 60ºC por 48 h. Após a secagem, ele foi triturado em um moinho (TE-680 Tipo Willye da Tecnal) com abertura de 20 mesh e armazenamento à temperatura ambiente.

4.2 Caracterização físico-química do resíduo

As caracterizações físico-químicas avaliadas foram densidade aparente, granulometria, diâmetro médio, pH, açúcares redutores, sólidos solúveis totais, umidade, extraíveis, cinzas totais, lignina e proteína. Os procedimentos de cada análise estão descritos abaixo:

4.2.1 Densidade aparente

Em uma proveta, foram adicionados 100g do resíduo, evitando compactação do mesmo. Logo após, mediu-se o valor do volume preenchido (CORREIA, 2004). Para estimar o valor da densidade aparente, utilizou-se a Equação (1) descrita abaixo:

𝐷𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑎𝑝𝑎𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 (𝑔)

𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑜𝑐𝑢𝑝𝑎𝑑𝑜 (𝑚𝐿) (1)

Onde:

Densidade aparente: Densidade aparente do resíduo; Massa (g): Massa do resíduo expressa em gramas;

(27)

Material e métodos

4.2.2 Granulometria

Pesaram-se 50g do resíduo de acerola que foram colocados em um agitador de peneiras (Moo: 53TE, Série nº: TE 8248) por 10 minutos. O conjunto de peneiras foi constituído por 4 peneiras de acordo as regras da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT): 20 mesh (0,83 mm), 48 mesh (0,30 mm) e 60 mesh (0,27 mm) e 80 mesh (0,18 mm) (MCCABE; SMITH; HARRIOTT, 1993). As peneiras foram pesadas previamente. E após a execução do procedimento acima, a fração mássica retida em cada peneira foi obtida por diferença de massa. As frações mássicas foram expressas em percentagem (CORREIA, 2004).

4.2.3 Diâmetro médio de Sauter (dps)

Após a granulometria, o diâmetro médio de Sauter foi estimado, conforme Eq. (2) (TANNOUS & ROCHA, 2018):

𝑑𝑝𝑠 = 1

∑(xi _di)

(2)

Sendo:

dps : Diâmetro médio de Sauter

xi : A fração mássica retida entre as peneiras;

di : diâmetro médio entre as aberturas das peneiras superiores e inferiores de cada nível.

4.2.4 pH

Adicionou-se 1,0g do resíduo em uma solução de 10 mL de água destilada. Homogenizando-se a solução em vórtex por 30 segundos. Em seguida, deixou-se a suspensão em repouso por 30 minutos, medindo-se o valor do pH em um potenciômetro digital (Multi3403, WTW, Alemanha), previamente calibrado com as soluções padrões (IAL, 2008).

4.2.5 Açúcares redutores (AR)

Inseriu-se 1,0 de resíduo em 10 mL de água destilada. Homogenizando-se e, então, deixando-se a suspensão em respouso por 30 minutos. Logo após, retirou-se uma alíquota para análise. A determinação dos açúcares redutores foi realizada pelo método proposto por Miller (1959).

(28)

Para a quantificação dos açúcares redutores necessita-se da construção de uma curva de calibração de ácido 3,5 – dinitrosalicílico (DNS) para dela obter-se os valores de açúcares. As diluições foram preparadas a partir de uma solução de glicose (1,0 g/L). Em seguida, 0,25 mL da alíquota de concentração conhecida de glicose foram adicionados aos tubos de ensaio contendo 0,25 mL de DNS; agitaram-se os tubos em vórtex, com o propósito de homogeneizá-los. Em seguida, esses tubos foram colocados em banho-maria a 100 ºC por 5 minutos, resfriados em banho com gelo por mais 5 minutos, adicionados 2,0 mL de água destilada e agitados em vórtex. Ao final, a leitura da absorbância (λ = 540 nm) foi realizada em espectrofotômetro (Thermo Spectronic, Genesys 10 UV, USA).

As amostras do resíduo seguiu o mesmo protocolo acima. A curva padrão construída possuía diferentes concentrações de glicose [0,1 – 1,0 g/L].

4.2.6 Teor de sólidos solúveis - °Brix

O teor de sólidos solúveis foi estimado pela mistura de 1,0 g de resíduo com 9,0 mL de água destilada, homogeneizando-se, e deixando-se em repouso por 30 minutos. Nesse caso, agitava-se em intervalos não contínuos. O líquido filtrado foi levado ao refratômetro digital (Smart-1/Atago/n° 3150) para medição do °Brix (IAL, 2008).

4.2.7 Umidade

A umidade foi obtida, pesando-se 1,0g do resíduo de acerola em um cadinho previamente tarado. O conjunto (cadinho+amostra) foi encaminhado para a estufa por 24 horas a 105ºC. Em seguida, o conjunto (cadinho + amostra seco) foi pesado para obter a massa seca do resíduo, ou seja, sem a presença de água. Esse valor é obtido pela diferença de massa do conjunto antes e após a estufa. O cálculo da umidade foi determinado pela Equação (3):

𝑈𝑚𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (%) = (1 − 𝑀𝑠𝑒𝑐𝑎(𝑔)

𝑀ú𝑚𝑖𝑑𝑎(𝑔)) 𝑥 100 (3)

Sendo:

Umidade (%) = Umidade expresso em porcentagem.

Mseca = massa seca do resíduo (diferença entre a massa do conjunto cadinho/resíduo

(29)

Material e métodos

Múmida = massa úmida do resíduo (a massa do resíduo estocado) expresso em gramas.

4.2.8 Extraíveis

Para a determinação de extraíveis foi usado o método adaptado da NREL –

“Determination of Extractives in Biomass” (SLUITER et al., 2008). Inseriram-se 2,0 g de

resíduo de acerola, colocando-os no aparelho de Soxhlet. Os solventes utilizados foram água deionizada e álcool etílico (C2H6O, 95%, v/v), em temperaturas de 120 °C e 80 °C, respectivamente. O resíduo esteve em contato com cada solvente durante 24 horas e o volume do solvente foi de 70,0 mL para ambos solventes.

A finalidade de utilizar primeiramente a água no processo extrativo é para retirar os compostos hidrofílicos. Após o término das 24 horas, no mesmo cartucho que continha o resíduo analisado lavou-se com C2H6O por mais 24 horas, para garantir que os compostos hidrofóbicos pudessem ser extraídos. A posteriori, esse mesmo cartucho foi seco em estufa a 105 °C durante 24 horas. A porcentagem de extraíveis foi calculada pela diferença das massas antes do processo de extraçãoe após a finalização do processo de acordo com Equação (4):

𝐸𝑥𝑡𝑟𝑎í𝑣𝑒𝑖𝑠 (%) = (1 −𝑀𝑖−𝑀𝑓

𝑀𝑠𝑒𝑐 ) 𝑥 100 (4)

Onde:

Extraíveis (%) = Extraíveis expresso em porcentagem;

Mi = massa do tubo Sohxlet antes da extração, expressa em gramas;

Mf = massa do tubo Sohxlet contendo extraíveis ao término do processo, expressa em

gramas;

Mseca = massa do resíduo em base seca, expressa em gramas;

4.2.9 Celulose, hemicelulose e lignina solúvel 4.2.9.1 Hidrólise com ácido sulfúrico 72%

Para a determinação dos polissacarídeos foi empregado o método da NREL- “Determination of Structural Carbohydrates and Lignin Biomass” (SLUITER et al., 2011). Usaram-se 0,3 g de resíduo isento de extraíveis com 3,0 mL de ácido sulfúrico (H2SO4, 72%, v/v). A mistura líquida obtida foi mantida em banho-maria a 30 ± 3°C durante 1 hora,

(30)

agitando-30 Material e métodos

se a cada 10 minutos. Após a retirada do banho, foram adicionadas 84,0g de água deionizada e agitou-se, lentamente, a mistura para proporcionar a homogeneização. Logo após, o conjunto foi submetido ao aquecimento na autoclave a 121 °C e 1,0 atm por uma hora. Os ensaios foram realizados em triplicata.

Após essa etapa, a mistura foi filtrada utilizando o papel de filtro previamente tarado para com a finalidade de obter o material hidrolisado. Armazenaram-se, então, as alíquotas do hidrolisado em microtubos e estocadas a -20 ºC para posterior análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). O sólido retido no papel de filtro foi lavado com 100 mL de água deionizada e seco em estufa, na temperatura de 105 °C por 24 h – permitindo a determinação da lignina presente no material.

4.2.9.2 Determinação de lignina insolúvel

Após a etapa de hidrólise com ácido sulfúrico (72%), o material retido no papel de filtro foi utilizado para determinar o teor de lignina insolúvel. Dessa forma, transferiu-se o resíduo contido no papel de filtro seco para um cadinho de porcelana, previamente tarado, e digeriu-se a amostra à 300 °C por 10 minutos – permitindo assim inibir a expansão do material no interior da mufla – e, a posteriori, a amostra foi calcinada por duas horas à 800 °C. O conjunto (cadinho + cinzas) da lignina foi resfriado em dessecador por 30 minutos e foi pesado em balança analítica. Por último, o teor de lignina (%, m/m) foi calculado de acordo as diferenças de massas do conjunto através da Equação (5) para todas as amostras.

𝐿𝑖𝑔𝑛𝑖𝑛𝑎 (%) = ((𝑀(m + pf)sc, ah − M pfsc) − (𝑀(c + cz) am − M c )(𝑔)

𝑀a, h ) 𝑥 100 (5)

Sendo:

Lignina (%) = Valor da lignina insolúvel em porcentagem;

M(m+pf)sc,ah (g) = massa do filtrado com papel de filtro seco após hidrólise, expressa em gramas;

Mpfsc (g) = massa do papel de filtro, expressa em gramas;

M(c+cz)am (g) = massa do cadinho mais cinzas após a mufla, expressa em gramas; Mc (g) = massa do cadinho seco e Ma,h (g) – massa da amostra usada na hidrólise,

(31)

Material e métodos

expressa em gramas.

4.3 Cultivo em estado sólido

4.3.1 Microrganismo e manutenção

O microrganismo Trichoderma reesei é armazenado em temperaturas abaixo de 0ºC no laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) para mantê-lo em condições adequadas.

Para fornecer seu crescimento, foi realizado a retirada do microrganismo de baixas temperaturas, em seguida o descongelamento e o preparo do meio que ocorreu em meio Ágar Batata Dextrose (BDA) na estufa a 30 ºC por 7 dias.

As características macroscópica e morfológica esperadas do Trichoderma reesei cultivado em meio PDA e em sabugo de milho pode ser representado na figura a seguir (Figura 4).

Figura 4. Aparência do fungo Trichoderma reesei.

Fonte: Própria autora (2020).

Os aspectos quanto às características macroscópicas do Trichoderma reesei é de esporos com coloração verdeada. Além de ter apresentado aspectos saprofíticos e mesofílicos durante o desenvolvimento de seu crescimento (MEYER, 2019). O microrganismo apresenta crescimento vísivel ao olho nu em média de 1 a 3 dias, é possível verificar o formato circular com coloração

(32)

verdeada ao centro e esbranquiçada nas bordas.

4.3.2 Propagação de esporos e inóculo

A realização da propagação dos esporos ocorre após a ativação do fungo, realizada em placas de Petri contendo meio Ágar Batata Dextrose (BDA), em Erlenmeyers (125 mL), inserindo 4,6 g de sabugo de milho triturado e inteirado com solução nutriente constituída por peptona (56 g/L), KH2PO4 (0,76 g/L), ZnSO4 (0,02 g/L) e FeSO4 (0,02 g/L). Os Erlenmeyers foram incubados a 30 °C por 7 dias. Após esse processo, inseriram-se 20 mL de solução Tween 80 (0,5%, m/v) nos frascos.

Em tubos de ensaio autoclavados, coletava-se o máximo da suspensão. Logo após, realiza-se uma diluição 1:100 da suspensão transferindo-se 20 μL da mesma para a câmara de Neubauer, para se fazer a contagem dos esporos utilizando o microscópio óptico. O valor de 1 x 107 esporos/g de substrato foi adotado como padrão para concentração para todos os ensaios.

4.3.3 Condições de cultivo

Para o resíduo, a FES foi realizada em frascos Erlenmeyer (250 mL) contendo 5,0 g do resíduo durante 10 dias (240 horas). As condições de cultivo foram as seguintes: concentração de inóculo a 107 esporos/g de resíduo, temperatura a 30 °C, pH inicial de 4,5, sulfato de amônio (3,3 g/L), fosfato de potássio (1,5 g/L) e umidade a 40% definido pela construção da curva de umidade versus atividade de água (KASHYAP et al., 2001; YADAV et al., 2009; AHMED et al., 2016; SUHAIMI et al., 2016).

4.4 Extração de enzimas

Para a extração das enzimas durante a FES, uma amostra foi coletada a cada 24 horas fazendo-se a extração das enzimas usando tampão acetato de sódio (200 mM, pH 4,5). Determinou-se a razão tampão:resíduo de 10 mL/ g de resíduo. Após adição do tampão acetato, agitava-se a mistura em incubador rotativo a 150 rpm por 30 minutos na temperatura de 30 °C (SANTOS et al., 2008). Após, o micélio fúngico foi separado do extrato enzimático por filtração sendo o permeado coletado em tubos de centrífuga, tipo Falcon (25 mL). Em seguida, o filtrado foi submetido à centrifugação (3500 rpm, 15 min) e, por último, o extrato enzimático foi armazenado a -20 °C para determinação da atividade da FPase.

(33)

Material e métodos

Para uma determinação enzimática eficaz, os tubos foram dividos em controle, amostras e branco. O tubo-branco serve para zerar o equipamento de leitura, o tubo-controle quantifica os açúcares já existentes no extrato enzimático e os tubos-amostras quantifica os açúcares resultantes da ação enzimática.

4.4.1 Determinação da atividade enzimática FPase

Na atividade de determinação da atividade enzimática de FPase (celulase total), é determinada a concentração dos açúcares redutores liberados do sobrenadante durante a degradação de uma fita de papel de filtro pela ação da enzima. Para a produção, adicionou-se em tubos de ensaio 1,0 mL de tampão acetato (50 mM, pH 4,8) - para cada tubo. O substrato foi a fita de papel de filtro (Whatman n° 1, 1 cm x 6 cm, 50 mg).

Os tubos-amostras e o tubo-branco foram destinados ao banho maria (50 °C) durante 60 minutos. Após o tempo de incubação das amostras e do branco, 0,25 mL da mistura reacional de cada tudo foram transferidos para os tubos respectivos que continha 0,25 mL de DNS. Nos tubos-controle, o procedimento foi executado da seguinte forma: no instante que foi transferido o extrato enzimático, o tubo foi agitado em vórtex (5 s), e 0,25 mL da mistura foi transferido para novo tubo de ensaio contendo 0,25 mL de DNS e agitado novamente em vórtex (5 s). As etapas posteriores de quantificação dos açúcares estão descritas na seção 4.4.2 Açúcares redutores.

Para o preparo foi introduzido os constituintes dos tubos-controles foram 1,0 mL tampão de acetato + 0,5 mL de extrato enzimático, para os tubos-amostras foram 01 papel de filtro + 1,0 mL de tampão acetato + 0,5 mL de extrato enzimático. Para o tubo-branco foi 01 papel de filtro + 1,0 mL de tampão acetato.

A concentração da atividade enzimática de FPase foi calculada conforme Equação (6) (GHOSE, 1987). [𝐹𝑃𝑎𝑠𝑒] (𝐹𝑃𝑈 𝑔 ) = ( 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑖çã𝑜 𝑥 𝐴𝑏𝑠 𝑥 𝐹 (µ𝑚𝑜𝑙_{𝑚𝐿 ) 𝑥VMR(mL)x VE(mL)} 𝑡R (min)𝑥 𝑉EE(𝑚𝐿)𝑥𝑀(𝑔) ) 𝑥100 (6) Onde:

FPU/g = concentração enzimáticada celulase total (µmol/min.g); Abs = absorbância real da amostra;

(34)

F = fator de conversão da curva de calibração;

VMR = volume total da mistura reacional, expresso em mililítros; VE = volume usado do solvente de extração, expresso em mililítros; tR = tempo de incubação da reação enzimática, expresso em minutos; VEE = volume utilizado de extrato enzimático, expresso em mililítros; M = massa de resíduo, expresso em gramas;

4.5 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio e peróxido de hidrogênio alcalino Para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio, foi reservado o resíduo de acerola (4% m/v do material lignocelulósico) com 31,75 mL de peróxido de hidrogênio (concentração de 7,35% v/v de peróxido de hidrogênio) em um frasco de 250 mL a 25 ºC com agitação de 150 rpm durante 1 hora com o pH em torno de 3,5 a 4,0.

Para o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino, foram realizadas todas as etapas anteriores, sofrendo um ajuste de pH coma inserção hidróxido de sódio, tendo o pH em torno de 11,5 (Rabelo et al., 2011). Em seguida, a solução foi colocada em agitação de 150 rpm a 25ºC por uma hora. A parte líquida foi descartada, e a parte sólida foi secada e estocada.

(35)

Resultados e discussão

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Caracterização físico-química

Os resultados da caracterização físico-química encontram-se na Tabela 2. Tabela 2. Caracterização físico-químicas do resíduo de acerola.

Propriedades

físico-químicas Resíduo acerola Umidade (%) 6,8201 ± 0,0670

pH 4,09 ± 0,0000

SST (ºBrix) 18,55 ± 0,0707 Diâmetro médio de Sauter 0,3373

Densidade aparente (g/L) 0,3135 ± 0,0001 ART (g/100 mL) - Proteína (%) N.A. Extraíveis (%) 19,7526 ± 0,8522 Celulose (%) N.A. Hemicelulose (%) N.A. Lignina (%) 20,9709 ± 1,5973 Cinzas totais (%) 1,9833 ± 0,0685

Fonte: Própria Autora (2020). Análise ANOVA (Analysis of Variance). Tipo de análise:

one-way ANOVA, Type I (sequential). Post-hoc: homogeneous group (α = 0,05), teste Tukey HSD

(High statistical difference). N.A. – não analisado.

De acordo com os resultados obtidos pelos autores Sancho et al (2015) , Melo et al (2014) e Silva (2014), a faixa de umidade em base úmida dos seus resultados compreende entre os valores de 4,90 e 7,98. O valor de umidade é variável pois depende de alguns fatores para sua determinação, como o local de armazenamento e metodologia do experimento. O experimento do trabalho foi expresso em base úmida e compreende na faixa desejada da literatura, com o valor de 6,82.

A faixa de pH esperada para o resíduo de acerola, compreende entre 3,45 a 3,54 de acordo com os autores Melo et al. (2014) e Sancho et al (2015). O pH 4,09 compreende um valor de acidez maior em relação a literatura, porém um valor próximo. A variedade de acerola pode ser classificada em doces, semidoces e ácidas, isso ocorre devido ao SST e sua acidez (ANDRADE NETO et al., 2017). Consequentemente, os resíduos também passam por essas variações de valores tanto no pH como no valor de sólidos solúveis totais.

(36)

36 Resultados e discussão

Referente aos sólidos solúveis totais, autores como Sancho et al (2015) e Melo et al. (2014) apontaram valores de ºBRIX com variação de 3,00 e 29,97, respectivamente, trazendo em destaque uma faixa mais extensa de resultados esperados. Essa variação é devido à metodologia do experimento e as condições expostas do resíduo. Os resultados obtidos por Rocha (2018) demonstram a variação do valor de SST de acordo com seu processo de lavagem. Para o resíduo de acerola não lavado o valor do ºBRIX é de 27,28 e do resíduo lavado 3,83.

O valor obtido dos experimentos desse trabalho refere-se ao resíduo da acerola sem o processo de lavagem, trazendo valores expressivos de quantidade de açúcares, assim como demonstrato na literatura, a qual pode ou não inibir o crescimento do microrganismo e da produção de celulases.

Os açúcares redutores (AR) representam a quantidade de açúcares existentes no resíduo, este valor estar em concordância com o valor de BRIX (ROCHA, 2018). Ou seja, quanto maior o valor de BRIX proporcionalmente maior o valor de AR e o mesmo ocorre para situações de baixa concentrações.

Os resultados dos açúcares redutores totais (AR), proteína, celulose e hemicelulose não foram possíveis de serem obtidos uma vez que os experimentos tiveram que ser interrompidos pois o LEB/UFRN foi interditado devido a pandemia provocada pelo vírus SARS-CoV2, ou seja, pela doença COVID-19.

Os valores esperados pela literatura de lignina para o resíduo de acerola, de acordo com os autores Silva (2014) e Rocha (2018), está entre 28,37 e 26,23, respectivamente. É desejável identificar a presença de lignina no resíduo para a etapa de pré-tratamento, onde há interesse em proporcionar a deslignificação do resíduo, promover a quebra da lignina para que haja um maior rendimento da quantidade de açúcares na hidrólise enzimática. O resultado obtido no experimento desse trabalho compreende valores significativos mediante a literatura.

5.2 Pré-tratamento com peróxido de hidrogênio alcalino

Para o experimento, foram realizados testes do resíduo pré-tratado apenas com peróxido de hidrogênio e outra demanda foi realizado testes com peróxido de hidrogênio alcalino. Ambos os testes apresentaram aspectos macroscópicos representado abaixo (Figura 5 e 6).

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Fonte: Própria autora (2020).

Figura 6. Resíduo de acerola pré-tratado com peróxido de hidrogênio alcalino.

É possível observar colorações diferentes do pré-tratamento, sendo o resíduo pré-tratado com peróxido de hidrogênio alcalino com coloração mais escura do que o teste realizado apenas com peróxido de hidrogênio. A coloração de ambos atingiram resultados esperados e significativos para a literatura.

Quanto ao pH, o pré-tratamento com peróxido de hidrogênio resultou valores entre 3,8 a 3,91, trazendo aspectos ácidos para a realização do pré-tratamento. O experimento com peróxido de hidrogênio alcalino, alcançou a faixa entre 11,44 a 11,49, valores aproximados que refletem características básicas ao pré-tratamento e corresponde aos valores esperados da

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38 Resultados e discussão

literatura.

Ambos os testes foram realizados para avaliar a efetividade da deslignificação provocada pelo pré-tratamento. O intuito foi demonstrar o impacto gerado pelo pré-tratamento alcalino e qual variação teria quanto ao pré-tratamento apenas com peróxido de hidrogênio. Porém, devido à pandemia provocada pelo COVID-19, não foi possível realizar testes de quantificação da celulose no resíduo pré-tratado.

5.3 Produção da celulase – FES

De acordo com Rocha (2018), que teve o estudo baseado em produção de pectinase, avaliou a produção de celulase total como resultado adicional. Na figura 7, extraído da literatura, a variação entre 48 e 96 horas apontam para um possível crescimento da curva nesse intervalo, no que se pode inferir a investigação de que o ponto máximo esteja próximo a 72 horas.

Mesmo que a leitura dos resultados na pesquisa não contemplem o esperado no tempo de fermentação de 72 horas, a leitura da curva da atividade enzimática mostra a possibilidade através do seu comportamento.

Figura 7. Cinética do cultivo utilizando resíduo de acerola por FES.

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Com o objetivo de investigar o comportamento nesse ponto, foi realizado experimentos para a leitura do cultivo da celulase no tempo de fermentação de 72 horas.

Os demais períodos de fermentação não foram possíveis de serem obtidos a leitura uma vez que os experimentos tiveram que ser interrompidos pois o LEB/UFRN foi interditado devido a pandemia provocada pelo vírus SARS-CoV2, ou seja, pela doença COVID-19. Figura 8. Cultivo de celulases total no 3º dia da cinética por FES pelo T. reesei.

Analisando as amostras coletadas em 72 horas em fermentação, foram obtidos valores de até 1,08 FPU/g. De acordo com a litertura, analisando outros resíduos agroindustriais, como a cana-de-açúcar, é possível quantificar até 20 FPU/g em 24 horas (GUILHERME, 2014). Biomassas diferentes trará resultados quantitativos celulolíticos diferentes, porém, ambas apresentarão características celulolíticas capazes de produzir etanol, o desafio será avaliar a rentabilidade de produção.

Para resíduos que não possuem valores expressivos de rentabilidade, o mesmo pode passar pelo processo de pré-tratamento. Possibilitando maior rendimento de celulose alcançada pelo microrganismo na biomassa, podendo gerar altos rendimentos, segundo os autores Rabelo et al. (2014) e LI et al (2016) rendimentos que chegam até 92,5% nas biomassas, o que possibilita termos resultados mais significativos do resíduo de acerola. Devido à pandemia provocada pelo COVID-19, não foi possível realizar testes de quantificação da celulose no resíduo pré-tratado. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 72 Fp ase (FP U/g ) Tempo de fermentação (h)

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40 Conclusão

6. CONCLUSÕES

Observou-se que as caracteríticas físico-químicas atigiram os valores esperados pela literatura, o que confere que o resíduo agroindustrial utilizado possui adequadas condições de manuseio para a pesquisa.

Verificou-se que o microrganismo Trichoderma reesei apresentou adequado crescimento e aspectos macroscópicos esperados durante as etapas de produção, o que forneceu condições adequadas para produzir celulases.

Avaliou-se a produção de celulases tornando possível produzí-las a partir do resíduo agroindustrial estudado. O que fornece possibilidades para o trabalho em produção de celulases a partir do resíduo de acerola e a possibilidade em utilizar o resíduo para a produção de etanol. Verificou-se a efetividade do resíduo pré-tratado e o processo de SSF sendo eficiente para a produção do etanol.

Portanto, neste presente trabalho, foi possível avaliar e projetar o potencial da produção de celulases e etanol celulósico a partir do resíduo agroindustrial de acerola.

É perceptível que dados iniciais da pesquisa demonstrem a viabilidade de produção de celulases e obtenção de etanol a partir do resíduo de acerola. O que traz efetividade a proposta estudada, e propostas para futuros trabalhos como: quantificação das celulase no resíduo não pré-tratado e pré-tratado e suas comparações de rendimento, produção de etanol com resíduo pré-tratado e não pré-tratado e suas comparações de rendimento e avaliação dos processos de fermentação alcoólica (Sacarificação e fermentação simultânea ou Sacarifação e fermentação semi-simultânea) com o resíduo de acerola e sua efetividade.

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Referência

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