A hemoglobina do
Pseudodoras
sp., um bagre da
América do Sul: isolamento, caracterização e estudos dos ligantes (*)
Joseph P. Martin (<); Hans J. Fyhn (*); Unni E. H. Fyhn (J
); Robert L. Garlick (3
); Robert W. Noble (4 ); Dennis A. Powers (s
)
Resumo
A hemoglobina do bagre da Amazônia Pseu-dodoras sp. foi isolada e caracterizada; ela com-preende um componente único. A composição da subunidade da hemoglobina é similar à de outras hemoglobinas de teleósteos. O peso molecular na-tivo aparente determinado pela filtração em gel é 66.000. O peso molecular aparente da subunidade é 14,300 por eletroforese de diodecil sulfato de sódio. A hemoglobina não polimeriza após a oxidação por ferricianeto de potássio. A hemoglobina não apre-senta efeito Root. Um pequeno efeito Bohr é evi-dente na hemoglobina livre de fosfato: A l°ü P i/j /A PH não é mais do que cerca de —0.1 a —0.2, e aumenta para A l°g p
y, / A p H = —0.4 na presença de 1 mM ATP. A cooperatividade determi-nada pelo n da equação de Hill é baixa, variando de 0.8 para 1.7, entre os pH 6.1 e 8.6. Os valores de P y2 das soluções de hemoglobina fracionada
são extremamente baixos, menos que 0,5mm Hg, em todos os valores de pH examinados entre 6,1 e 9,0. A alta afinidade do oxigênio é refletida princi-palmente na velocidade de combinação de CO, que se assemelha às encontradas nas mioglobinas e nas subunidades isoladas da hemoglobina humana. Tan-to a velocidade da combinação de CO quanTan-to a ve-locidade da dissociação de O, determinada por es-pectrofotometria de "stopped flow", são sensíveis ao pH e ao fosfato. Entre os pH 6,2 e 8,1, a velo-cidade de C OQ n aumenta cerca de 5 vezes na he-moglobina livre de fosfato. A adição de 1 mM ATP causa uma depressão na velocidade em todos os va-lores nos pH examinados. A velocidade de Oj^f di-minui 7 vezes, desde pH 6,0 ao pH 8,2, nas soluções de hemoglobina fracionada. A adição de 1 mM ATP induz uma diminuição de 10 vezes através da
mes-ma escala. Nos valores de pH abaixo de 6,0, ocor-re uma depocor-ressão na velocidade de 0 20f f na hemo-blobina fracionada o que indica um efeito Bohr ácido.
INTRODUÇÃO
O sangue de peixe geralmente contém múl-t i p l o s componenmúl-tes de h e m o g l o b i n a . Bonaven-tura et al. (1976), por meio de e l e t r o f o r e s e , avaliou aproximadamente 100 espécies de pei-xes aquáticos e m a r i n h o s . Dos peipei-xes exami-nados, menos de 5 % t i n h a m hemoglobina única no sangue (Bonaventura, comunicação pes-s o a l ) . Sharp (1973) epes-studou 31 epes-spéciepes-s de peixe na costa da C a l i f ó r n i a , entre as quais descobriu só 3 c o m hemoglobina ú n i c a .
Riggs (1970) s u g e r i u q u e a multiplicidade da hemoglobina deve ser f i s i o l o g i c a m e n t e van-tajoso para os p e i x e s . Numerosos investigado-res (Hashiomoto et al., 1960; Tan ef al., 1972; Gillen & Riggs, 1973; Tan & Noble, 1973; W e b e r & D e W i l d e , 1975; W e b e r et al., 1977; Garlick e f al., 1978) t e m dispendido esforços conside-ráveis para p u r i f i c a r e caracterizar hemoglobi-nas de peixes individuais de s i s t e m a s de com-ponentes m ú l t i p l o s , c o m a esperança de que os papéis f i s i o l ó g i c o s destas moléculas pos-sam ser deduzidas. Embora as 3 hemoglobinas da carpa pareçam ser f u n c i o n a l m e n t e idênticas
(Noble ef al., 1970; G i l l e n & Riggs, 1972), es-tudos c i n é t i c o s pormenorizados sobre a
hemo-( • ) _ Versão original inglesa publicada em Comp. Biochem Physiol. 62A hemo-(1). 1979.
This work was supported in part by the National Science Foundation under grant = PCM 75-06451 to the Scripps Institute of Oceonography for the supported of the Alpha Helix Program, and by the National Institutes of Health grant HLI 5460.
( 1 ) — Department of Zoology. Duke University Marine Laboratory, Beaufort, N . C . 28516. A predoctoral trainee sup-ported by the National Institutes of Health grant = GMO 7184 to Duke University.
( 2 ) Institute of Zoophysiology, University of Oslo, Bllndern, Oslo 3, Norway. ( 3 ) — Department of Zoology, University of Texas at Austin, Austin, Texas 78712.
( 4 ) — Department of Medicine and Biochemistry, Veterans Administration Hospital. SUNY at Buffalo, New York, 14215 Established Investigator of the American Heart Association.
globina de espécies de peixes de componente único são comparativamente r a r o s . Bonaven-tura ef a/., (1976) elucidaram as propriedades funcionais da hemoglobina de efeito Root do " s p o t " [Leiostomus xanthurus), mas nenhum outro estudo foi relatado.
As hemoglobinas de peixes podem forne-cer paradigmas valiosos para o controle alos-térico da afinidade ligante nas hemoglobinas dos m a m í f e r o s . Embora dois modelos padrões tenham sido propostos para esclarecer a
coo-peratividade da ligação de oxigênio (Monod ef a/., 1965), f o i provado ser difícil de obser-varem-se estes padrões estruturais de hemo-globina humana. Entretanto, pesquisadores são capazes de experimentos com as hemoglo-binas dos peixes o que f o i estabilizado em al-tos e baixos padrões de afinidade (Noble ef a/., 1970; Tan ef a/., 1972; 1973; Tan & No-ble, 1973; Bonaventura ef aí., 1976).
Este trabalho descreve um estudo f e i t o so-bre a hemoglobina isolada de um bagre da Ama-zônia, Pseudodoras sp. O sangue desta espécie contém um componente de hemoglobina. A
he-moglobina do peixe foi rapidamente purificada em grande quantidade. Pseudodoras sp. é uma espécie de bagre epibêntico e experiências fo-ram feitas para determinar se sua hemoglobina revela efeito Root. Observou-se também que as adaptações do peixe às exigências ambientais podem ser mais f a c i l m e n t e estudadas num sis-tema, em que as pressões de seleção são evi-denciadas por um componente de hemoglobina único.
MATERIAIS E MÉTODOS
ISOLAMENTO — Espécies de Pseudodoras
sp. foram coletadas em novembro e dezembro de 1976, durante uma expedição no R/V " A l p h a Helix", no rio Amazonas, aproximadamente 50 km acima do rio Solimões, em sua confluência com o rio Negro. Os bagres f o r a m apanhados com tarrafas e redes e foram transportados ao " A l p h a H e l i x " para e s t u d o . O sangue foi obtido por punção cardíaca e colocada em seringas heparinizadas de vidro (100 ul de heparina de sódio (5000 I . U / m l ) em 1,7% de NaCI por 5 ml de s a n g u e ) . Foram tomadas alíquotas em tubos capilares de 50 p l , e centrifugadas por 3
minutos em uma centrífuga de soro, para ava-liação de h e m a t ó c r i t o s . Os glóbulos vermelhos do sangue f o r a m levados 3 vezes em 10 volu-mes de solução de 1mM Tris ( r e f r i g e r a d o s ) , pH 8 , 0 . 1,7% de NaCI, e então lisadas em 3 volumes de 1 m M Tris, pH 8 , 0 por 1 hora, a 0 ° C Foi adicionado 1/10 do volume da solu-ção de NaCI iM ao hemolisado, e a mistura foi centrifugada a 28000Xg por 15 minutos para remover os fragmentos c e l u l a r e s . O sobrena-dante f o i então liberado de sal e fosfatos orgâ-nicos, através de uma coluna de 2 , 5 X 50 cm de resina de Sephadex G-25 equilibrada em 0,1 m M Tris, pH 8 , 5 . Posteriormente usou-se uma •coluna deionizadora com as seguintes resinas:
2 cm Dowex-50 W em forma de amônio; 2 cm Dowex-1 em forma de acetato, 20 cm B i o . Rad A 501-X8 (D) resina de " m i x e d b e d " . A hemo-globina purificada foi mantida a 5°C até à sua utilização. Uma amostra de e r i t r o c i t o s acon-dicionada f o i congelada a -70°C, transportada em gelo seco para Beaufort, N . C . e guardada a -20°C por 2 m e s e s . Em Beaufort, as células foram descongeladas, lisadas, e o peso mole-cular do derivado de carboxiemoglobina foi determinado pela filtração em gel.
ABREVIAÇÕES — Bis t r i s , bis (2
hidroxime-t i l ) mehidroxime-tano; Tris, Tris ( h i d r o x i m e hidroxime-t i l ) aminome-tano: ATP, adenosin t r i f o s f a t o ; EDTA, ácido etilenodiaminotetracético; I', constante da ve-locidade de combinação de 29
ordem para a ligação de monóxido de carbono k, constante de velocidade de dissociação de 1?
o r d e m ;
Pt/a, pressão parcial de oxigênio, na qual uma metade dos locais do grupo heme t o t a i s estão ocupados.
ELETROFORESE
cuida-dosamente a 560 m m , usando um analisador de gel G i l f o r d , anexado a um monocromador Beckman D U .
ESTUDOS DOS PESOS MOLECULARES
Experimentos de filtração em gel das solu-ções de hemoglobina reduzida e oxidada dos Pseudodoras sp. f o r a m feitos em uma coluna de 4B de Sefarose (2X 90 cm) em 0 , 0 5 M Tris, pH 7 , 5 , 1 m M EDTA, a 5°C, segundo Fyhn & Sullivan (1975). O peso molecular da hemo-globina carboxi f o i medida c o m uma outra re-sina, segundo M a r t i n et ai, ( 1 9 7 8 ) .
Pesos moleculares de cadeias de hemoglo-bina desnaturadas foram determinadas por ele-troforeses de dodecil sulfato de sódio ( S D S ) , segundo Weber & Osborn (1969), exceto a so-lução de incubação, que f o i 6 M em uréia, e 0,1 M em P -mercaptoetanol. Transferina hu-mana, albumina de soro bovino, ovalbumina, -quimotripsinógeno- A (pâncreas bovino) e mioglobina de cachalote de baleia f o r a m usa-dos como padrões de peso m o l e c u l a r . A mio-globina f o i obtida da Companhia Miles-Seravac. Todos os outros padrões f o r a m obtidos da Com-panhia Sigma C h e m i c a l .
ESTUDOS DO EQUILÍBRIO DE OXIGÊNIO
Todos os equilíbrios de oxigênio do sangue eram f e i t o s a 30°C, pelo método de Powers er ai, (1978), usando um analisador de disso-ciação de oxigênio "Hem-O-Scan" ( A m e r i c a n Instruments C o r p o r a t i o n ) . Os equilíbrios de oxigênio da hemoglobina purificada f o r a m exe-cutados a 20°C, como descritos por Riggs & Wolbach (1956). A s soluções de hemoglobina (60 u M ) foram levadas a uma intensidade for-ça-iônica de 0,05 nos tampões Tris e Bis-tris. Os valores de P t / s f o r a m determinados como uma função do p H . Os experimentos f o r a m f e i t o s em hemolisados fracionados, na presen-ça e na ausência de I m M ATP.
CINÉTICAS DE LIGANTES
Todas as medidas cinéticas f o r a m f e i t a s com um aparelho de "stopped f l o w " do tipo original-mente descrito por Gibson & Milnes ( 1 9 6 4 ) . Em todos os casos, a força iônica da solução f i n a l , depois de misturada, foi de 0 , 0 5 , e quan-do ATP f o i usaquan-do, sua concentração depois
apresentadas são aos mínimos quadrantes para os primeiros 6 5 % das reações observadas. As cinéticas da dissociação de oxigênio foram medidas pelo processo de variação do p H , des-c r i t o por Noble er ai, 1970. A hemoglobina oxigenada em 1mM Tris, pH 8 , 0 f o i misturada em uma solução de d i t i o n i t o , em um tampão de força iônica de 0 , 1 no pH desejado. A concen-tração de hemoglobina final foi de aproximada-mente 30 u M em equivalentes heme, e a rea-ção f o i seguida em 540 e 560 m m .
A s cinéticas da combinação de monóxido de carbono com a hemoglobina desoxigenada f o r a m medidas misturando soluções de hemo-globina desoxigenada em tampões de força iônica de 0 . 1 ao pH desejado, com uma solução contendo uma concentração conhecida, apro-ximadamente 85 u M , de monóxido de carbono dissolvido na água. Depois de misturada, a concentração de hemoglobina f o i de aproxima-damente 3 u M em equivalentes h e m e . A rea-ção foi seguida a 420 e 435 m m .
TAMPÕES
Os tampões usados nas cinéticas e nos experimentos de equilíbrio foram todos de for-ça iônica final u n i f o r m e (1 = 0,05). Tampões Tris f o r a m usados em experimentos acima do pH 7 , 0 , enquanto que os tampões Bis-Tris fo-ram usados em experimentos abaixo do pH 7,0.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os hematócritos dos indivíduos Pseudodo-ras sp. de peso 180 e 640 gramas f o r a m 3 0 % e 3 1 % r e s p e c t i v a m e n t e . A eletroforese dos 3 hemolisados revelaram um componente de he-moglobina ú n i c o . A migração da hehe-moglobina nos geis de disco, em comparação com a he-moglobina humana é mostrada na f i g . 1 . De-pois de 3 semanas de armazenagem a 5°C, a mobilidade do componente da hemoglobina permaneceu constante, e nenhuma heteroge-neidade de carga f o i detectada.
Sepha-rose. A hemoglobina CO t e m u m peso molecu-lar aparente de 66,000, de acordo c o m a posi-ção de eluiposi-ção nos experimentos da filtraposi-ção gel. A hemoglobina elui levemente, antes da hemoglobina dos " s p o t " , que é conhecida como tetramérica (SMW= 4 . 6 S ) , como determinada pela velocidade de centrifugação de sedimen-tação, sob condições de colunas específicas. O peso molecular aparente das cadeias de he-moglobina desnaturada do Pseudodoras s p . de-terminada pela eletroforese de gel SDS f o i 14,300, que é aproximado do obtido pelas ca-deias humanas (14,600).
Pig. 1 — Gel de disco em poliacrilamida de um hemolisado do Pseudodoras sp. (esquerda) e de um homem (direita). A banda mais anódica em ambos os geis é a albumina de soro bovino. O ânodo é o que está na parte inferior da figura.
A curva de equilíbrio de oxigênio do san-gue do Pseudodoras é apresentada na f i g . 2 . A pH 7 , 6 , e a 30°C, no glóbulo v e r m e l h o do sangue, o Pi/2 é 11.0 m m Hg, enquanto que sob condições de 5 , 6 % C 02, ela muda para 1 3 , 6
mm Hg, indfbando u m pequeno efeito Bohr. O formato da curva de ligação denota uma coo-peratividade do o x i g ê n i o . Os experimentos de
equilíbrio do oxigênio nos hemolisados fracio-nados c o m 1mM ATP e sem ele ( f i g . 3) f o r a m f e i t o s a 2 0 ° C O P1/2 e m pH 7 , 6 da
hemoglobi-na fraciohemoglobi-nada é 0 , 2 5 m m H g , enquanto que a hemoglobina fracionada mais 1 m M ATP, em pH 7 , 5 4 é de 0 , 5 6 m m H g . O efeito Bohr dos hemolisados fracionada, A log P i / * / A p H , parece ser entre -0,1 e -02. Bunn & Riggs (1978) usando uma técnica para focalizar o ponto i s o e l é t r i c o , colaboraram para este resul-tado. O efeito Bohr, A log P 1 / 2 / A pH aumenta para - 0 , 4 na presença de 1 m M ATP, entre pH 7,0 e 9 , 0 , mas o valor aumenta para cerca de 1,6 na escala de pH 6 , 5 - 7 , 0 . O P1/2 varia 2 , 5 vezes entre pH 6 , 5 e 9 , 0 nos hemolisados fra-cionada, e quase 30 vezes depois das adições de ATP. Como se poderia esperar de um po-liânio, o ATP exerce u m grande efeito nos
va-lores de pH mais b a i x o s .
A cooperatividade entre as cadeias refleti-da em n é geralmente baixa e é dependente do pH ( f i g . 3 ) . Em pH 6 , 1 , o valor n para os he-molisados fracionado é menor do que uma uni-dade. Entre o pH 6 , 7 e 8 , 6 , n obtém seu valor máximo de aproximadamente 1,7, e depois disso declina até pH 9 , 0 n = 1,0. A presença de 1 m M ATP não causa aumento consistente ou diminuição no valor de n, acima da escala do pH examinado.
A velocidade de dissociação de oxigênio da hemoglobina é mostrada c o m o uma função do pH, c o m 1 m M ATP ou s e m e l e , na f i g . 4 . A dependência do pH observado é a da hemoglo-bina c o m u m efeito Bohr n o r m a l . 1 m M ATP aumenta a velocidade desta reação em todos os valores de pH abaixo de 8 , 2 , e isto aumenta a variação total para mais de 10 vezes.
A s constantes de velocidade de 2a
Pig. 2 — A curva de oxigenação do sangue do Pseudodoras no pH 7.6 a 30°C. Curva 1 ( — ) e Curva 2 ( ) representam a oxigenação contínua na ausência e na presença de 5.6% de CO, respectivamente.
Embora estes resultados cinéticos indi-quem um efeito Bohr normal entre pH 6 , 0 e 8,0 eles sugerem um efeito Bohr ácido ou reverso, abaixo do pH 6 , 0 . Na ausência do ATP, isto é manifestado primariamente na velocidade de dissociação de o x i g ê n i o . Na presença do ATP, são vistas, em ambas as constantes de veloci-dade, mas o efeito e m cada uma é m e n o r .
As constantes de velocidade para a reação com monóxido de carbono sâo as mais inco-m u n s . Eles são inco-muito inco-maiores do que são as normalmente encontradas por molécu-las de hemoglobina não m o d i f i c a d a s . A veloci-dade observada no pH 8 , 0 aproxima-se da encontrada por mioglobinas e subunidades iso-ladas da hemoglobina n o r m a l .
Como afirmado a n t e r i o r m e n t e , Pseudodo-ras s p . difere da maioria dos peixes por pos-suir u m único componente de h e m o g l o b i n a . A simplicidade deste sistema de hemoglobina pode r e f l e t i r a constância do ambiente f í s i c o e a natureza das exigências fisiológicas dos p e i x e s . Fyhn er al-, (1978) observaram que os hemolisados c o m uma hemoglobina única foram mais comuns entre os peixes do alto r i o Amazonas, do que entre os peixes das re-giões temperadas. A baixa variação de certos
parâmetros físicos na Amazônia (isto é, a tem-peratura da água oscila menos que 2°C anual-m e n t e ) , e a diversidade de espécies de peixe não confrontada e a especialização do habitat na bacia Amazônica podem, em parte, explicar suas observações.
A s hemoglobinas de Pseudodoras s p . f o -ram cromatografadas como um tetrámetro es-t á v e l . Ela não se associa sob condições oxidi-zantes, nem se dissocia e m d í m e r o s .
Em 20°, a hemoglobina fracionada revela um baixo P i / j para a ligação de oxigênio (me-nos do que 1mm Hg e m todos os valores de pH e x a m i n a d o s ) , e um efeito Bohr muito pequeno. A adição de 1mM ATP aumenta substancial-mente o efeito 3ohr; mas o p i /2 permanece
relativamente baixo, nunca excedendo de 4 , 6 mm H g . Em contraste, todo o sangue em pH 7 , 6 e 30°C t e m u m p i /2 de 11mm H g . O
verme-lho, de um f o s f a t o orgânico, que é mais efetivo do que ATP. Isaacks ef al. (1977) descobri-ram o inositol pentafosfato nos eritrocitos de outra espécie de peixe amazônico (Arapaima gigas). Tan & Noble (1973) demonstraram com inositol hexafosfato e Torracca ef al. (1977) o mostraram, para o t r i f o s f a t o da guanosine, que estes são moduladores mais efetivos da liga-ção de oxigênio da hemoglobina do que o ATP, em algumas espécies de p e i x e .
Fig. 3 — Diagramas de (Log p Vi e (n) da
hemo-globina do Pseudodoras em vários valores do pH na condição fracionada (O) e fracionada + lmM ATP ( • ) .
A constante de velocidade de 2a
ordem para a associação de monóxido de carbono c o m a hemoglobina, colabora nos resultados de equilíbrio. Ela excede daquelas conhecidas por outras hemoglobinas de peixe por
aproximada-mente uma ordem de magnitude ( i . e . carpa, Noble ef al., 1970; " s p o t " , Bonaventura ef al.,
1976; Mylossoma sp., M a r t i n ef al., 1978) e se assemelha aos valores obtidos por subuni-dades de hemoglobina isoladas e m i o g l o b i n a s .
o
CD CO
IOO
-5.0 6.0 7.0 8.0
pH
Fig. 4 — A relação entre o pH e a constante de
dissociação de 1.« ordem (k) da oxiemoglobina do
Pseudodoras. As condições são descritas no texto. O hemolisado fracionado + lmM ATP ( • ) .
PH
Outras características notáveis da hemo-globina do Pseudodoras são seu pequeno efei-t o Bohr, e a ausência de um efeiefei-to Rooefei-t. Riggs
(1970) apontou que a magnitude do e f e i t o Bohr na hemoglobina dos peixes é freqüentemente proporcional ao nível de atividades dos mes-m o s . Os dados sobre a hemes-moglobina do Pseu-dodoras são c o n s i s t e n t e s , com a generalização de que Pseudodoras é um bagre epibêntico
e, como um s i l u r i f o r m e , é geralmente menos ativo do que peixe de outra v e l o c i d a d e . Conse-qüentemente, um grande e f e i t o Bohr pode não ser exigido para f a c i l i t a r a descarga de oxigê-nio aos t e c i d o s . Embora Pseudodoras possua bexiga natatória, não t e m comumente presente rete mirable. (Bridge & Haddon, 1893), que e
o sistema m u l t i p l i c a d o r contracorrente, no qual a hemoglobina libera o o x i g ê n i o para entrar na bexiga natatória. Em adição, Pseudodoras não t e m um rete coróide (Farmer e í al., 1978), a estrutura responsável pela entrega de oxigê-nio para o o l h o . A ausência destas trocas ana-tômicas impediram uma hemoglobina com efeito Root.
O ATP e H + afetam tanto as velocidades C 0O n quanto a de 02 Of f da hemoglobina dos
Pseudodoras. Isto é s i m i l a r aos efeitos destes agentes em outras hemoglobinas de p e i x e s . A magnitude destas mudanças cinéticas entre pH 5 , 1 e 8 , 7 , esclarece adequadamente a mu-dança de aproximadamente 30 vezes no p i/ 2
dos hemolisados fracionados na presença de 1mM ATP. Os dados de equilíbrio sugerem um efeito Bohr ácido num pH baixo, s i m i l a r ao observado na hemoglobina da truta 3 (Salmo galrdneri) (Lau e í al., 1975). O comportamen-t o das conscomportamen-tancomportamen-tes COon e 020ff, abaixo do pH 6,0 na hemoglobina do Pseudodoras sustenta os dados de e q u i l í b r i o . Entretanto, o pH no qual o efeito Bohr aparece p r i m e i r a m e n t e , é mais alto no equilíbrio do que nos experimen-t o s cinéexperimen-ticos, isexperimen-to possivelmenexperimen-te como uma conseqüência das diferenças no comportamen-t o de ligancomportamen-tes do CO e 02.
Os valores n obtidos da análise dos dados de equilíbrio, v a r i a m como uma função do p H . A cooperatividade máxima é adquirida na ex-tensão do pH f i s i o l ó g i c o , como na hemoglobina da carpa (Noble ef al., 1970); n d i m i n u i acima do pH 8 , 6 e abaixo do pH 6 , 7 . O ATP não a l
-tera significativamente este padrão. No pH 6 , 1 , a cooperatividade cai abaixo da unidade, indicando talvez as diferenças das afinidades ligantes entre as cadeias cc e 0 .
Concluindo, a hemoglobina do Pseudodoras compartilha muitas das características dos l i -gantes das hemoglobinas do e f e i t o Root (por exemplo as da carpa, t r u t a e " s p o t " ) embora ela não tenha um efeito Root. Comparações estruturais pormenorizadas entre estas hemo-globinas podem, todavia, elucidar-nos com res-peito à base e s t r u t u r a l do e f e i t o Root nas he-moglobinas de p e i x e .
AGRADECIMENTOS
Gostaríamos de agradecer aos o f i c i a i s e à tripulação do " A l p h a H e l i x " , por sua coopera-ção e camaradagem durante este cruzeiro. Gostaríamos de expressar t a m b é m nossos agradecimentos ao Governo brasileiro por per-mitir-nos trabalhar nas águas do rio Amazonas. Hans J . Fyhn e Unni E. H . Fyhn agradecem o auxílio do " N o r w e g i a n Research Council for Science and t h e H u m a n i t i e s " (Conselho No-rueguês de Pesquisas pare Ciências e Huma-nidades) . A ajuda adicional f o i dada por NSF DEB 76-19877 (para D. A . PoweYs), a Socieda-de Geográfica Nacional (The National Geogra-phic Society) (para D. A . P o w e r s ) ; ajuda NSF-PCM-06719, e auxílio NIH-GM 21314 (para A . R i g g s ) .
SUMMARY
The hemoglobin of the Amazonian Catfish Pseu-dodoras sp. was isolated and characterized; it comprises a single component. The hemoglobin's subunit composition is similar to that of other teleost hemoglobins. The apparent native molecu-lar weight as determined by gel filtration is 66,000. The apparent subunit molecular weight is 14,300 by sodium dodecyl sulfate electrophoresis. The hemo-globin does not polymerize after oxidation by po-tassium ferricyanide. The hemoglobin lacks a Root effect. A small Bohr effects is evident in the
phosphate free hemoglobin: A log p Va /APH is no
more than about —0.1 to —0.2 and increases to
A 1°K Vi / A PH = —0.4 in the presence of 1 mM
ATP. The cooperativity, as determined by n of the
between pH 6.1 and 8.6. The p ,/ 2 values of stripped
hemoglobin solutions are extremely low, less than 0.5 mm Hg at all pH values examined between pH 6.Tand 9.0. The high oxygen affinity is reflected primarily in the CO combination rate with resembles that found in myoglobins and* isolated subunits of human hemoglobin. Both the CO combination rate
and the 02 dissociation rate determined by stopped
flow spectrophotometry are pH and phosphate
sensitive. Between pH 6.2 and 8.1 the C OQ n rate
increases about 5-fold in the phosphate-free hemo-globin. Addition of 1 mM ATP causes a depression
in the rate at all pH values examined. The 0J o f f rate
decreases 7-fold going from pH 6.0 to 8.2 is stripped hemoglobin solutions. Addition of 1 mM ATP inducesa ten-fold decrease over the same range. At
pH values below 6.0 a depression in the 02 o f f rate
occurs in the stripped hemoglobin, indicative of an acid Bohr effect.
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