UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
LARISSA BASTOS ELOY DA COSTA
ESTUDO DA EVOLUÇÃO DA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL GRAU 1 (NIC1), CORRELACIONADA À EXPRESSÃO DE P16INK4A, CITOQUERATINA 7
(CK7) E KI-67
CAMPINAS 2016
ESTUDO DA EVOLUÇÃO DA NEOPLASIA INTRAEPITELIAL CERVICAL GRAU 1 (NIC1), CORRELACIONADA À EXPRESSÃO DE P16INK4A, CITOQUERATINA 7
(CK7) E KI-67
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutora em Ciências Médicas, Área de Concentração de Anatomia Patológica.
ORIENTADORA: PROFA. DRA. LILIANA AP. LUCCI DE ÂNGELO ANDRADE
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA
ALUNA LARISSA BASTOS ELOY DA COSTA, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. LILIANA APARECIDA LUCCI DE ANGELO ANDRADE.
CAMPINAS 2016
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE [NÍVEL]
LARISSA BASTOS ELOY DA COSTA
ORIENTADORA: PROFA. DRA. LILIANA APARECIDA LUCCI DE ANGELO ANDRADE
MEMBROS:
1. PROFA. DRA. LILIANA APARECIDA LUCCI DE ANGELO ANDRADE
2. PROF. DR. JOÃO NORBERTO STÁVALE
3. PROF. DR. GUSTAVO RUBINO DE AZEVEDO FOCCHI
4. PROFA. DRA. CECÍLIA AMÉLIA FAZZIO ESCANHOELA
5. PROF. DR. LUIS OTÁVIO ZANATTA SARIAN
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Eloy Filho e Clara Bastos; à minha tia Fátima Bastos e aos meus irmãos Eloy Neto e Victor, com todo meu afeto.
À minha orientadora, Profa. Dra. Liliana Aparecida Lucci De Angelo Andrade, por todos os ensinamentos, pela competência e serenidade na realização deste trabalho e por traduzir o real significado de ser professor.
À minha coorientadora Dra. Renata De Marchi Triglia, pela amizade, empenho e incentivo na
realização deste trabalho e pelo exemplo de profissionalismo, humildade e competência nestes anos de convívio.
A Helymar C. Machado, pela fundamental contribuição nos cálculos estatísticos.
Ao Prof. Dr. André A. Schenka, pelas imprescindíveis orientações quanto à avaliação histomorfométrica.
À profa. Dra. Cecília Amélia Fazzio Escanhoela, por todos os ensinamentos, pela amizade e inestimável generosidade, mostrando-me que é possível conciliar eficiência e sensibilidade no exercício de nossa profissão.
A todos os professores do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da UNICAMP, por todos os ensinamentos, oportunidades, apoio e incentivo.
À Profa. Dra. Silvia M. M. Magalhães, pelos inestimáveis anos de iniciação científica sob sua orientação, e por despertar em mim o interesse pela Anatomia Patológica, tão apaixonante especialidade.
À minha prima Profa. Dra. Andréa Eloy e ao seu esposo Prof. Dr. Marcondes França Jr., pelo incentivo e colaboração na realização deste trabalho e pela amizade e acolhimento, em incontáveis momentos, desde que cheguei a esta cidade.
A todos os médicos patologistas e funcionários do Departamento de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da UNICAMP e do Laboratório de Citopatologia do CAISM/UNICAMP, pela amizade e respeito ao longo destes anos de convívio.
À Claudia Piaza, pela qualidade e solicitude na realização das reações imuno-histoquímicas deste trabalho.
Ao Adilson Piaza, pela qualidade na documentação das imagens histológicas deste trabalho.
O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão imuno-histoquímica de p16INK4a, CK7 e Ki-67 em biopsias de NIC 1, procurando encontrar diferenças de expressão entre casos que progrediram para NIC 2 ou 3, mantiveram o diagnóstico de NIC 1 ou regrediram espontaneamente. Metodologia: 66 pacientes com biopsias de NIC 1 foram estudadas. No seguimento, foram submetidas a uma segunda biopsia, mostrando: regressão de lesão em 28,7% dos casos, 37,9% mantiveram NIC 1 e 33,4% progrediram para NIC 2 ou NIC 3. Reações imuno-histoquímicas para estes três marcadores foram realizadas na primeira biopsia com diagnóstico de NIC1. A expressão imuno-histoquímica foi avaliada, nos três marcadores, através de métodos qualitativos e de histomorfometria, por meio do software IMAGEJ®, com cálculo da razão no número de células de NIC 1 com positividade para cada um dos marcadores. Testes de Qui-quadrado de Pearson, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis e Fisher foram utilizados para comparar os grupos (p≤0.05), sendo realizada, ainda, a análise das curvas ROC (Receiver Operating Characteristic), com o cálculo dos pontos de corte da razão de células de NIC 1 positivas para cada um dos marcadores, correlacionando-os com progressão de lesão. Resultados: A média da idade das pacientes que não progrediram para NIC 2 ou NIC 3 foi 27 anos, enquanto que daquelas que progrediram foi 33 anos (p=0.006). A avaliação qualitative mostrou uma tendência de associação entre a expressão destes marcadores e progressão, mas sem diferença significativa estatística. A análise das curvas ROC mostrou pontos de corte de 0,396, 0,345 e 0,026 para a razão de células positivas para p16INK4a, CK7 e Ki-67, respectivamente, associados à progressão de lesão (p=0,003, 0,03, e 0,002). Pelos resultados da análise multivariada, verificou-se que as razões p16INK4a, CK7 e Ki-67 foram selecionadas como sendo significativamente associadas
podem representar marcadores úteis, complementando a morfologia, para identificar lesões de NIC 1 que necessitam de seguimento mais cuidadoso ou condutas terapêuticas distintas.
The aim of this study was to evaluate p16INK4a, CK7 and Ki-67 immunoexpressions in CIN1 lesions looking for differences among cases that progress to CIN 2/3, maintain CIN1 or spontaneously regress. Methods: 66 CIN1 biopsies were studied. In the follow-up a second biopsy showed: 28.7% regression, 37.9% maintained CIN1 and 33.4% progressed to CIN2/3. Immunostaining for these three markers were performed only in the first biopsy. A qualitative evaluation method for immunoexpression was used, as well as studying the ratio of positive cells in CIN1 for each marker, using IMAGEJ® software. Pearson’s chi-square, Mann-Whitney, Kruskal-Wallis and Fisher tests were used to compare the groups (p≤0.05). A cutoff point was assessed through ROC (Receiver Operating Characteristic) curve positive cell ratio, for each marker, as progression predictors. Results: The mean age of patients without progression was 27 years and with progression 33 (p=0.006). The qualitative evaluation indicates a tendency of progression with the expression of the markers, but without statistical significance. However, in a quantitative method, the ROC curve analysis showed cutoff points of 0.396, 0.345 and 0.026 for p16INK4a, CK7 and Ki-67 ratios, respectively, as predictors of progression (p=0.003, 0.03, and 0.002). In a logistic regression analysis, p16INK4a, CK7 and Ki-67 positive cell ratio showed a significant correlation with progression (p=0.036, 0.012 and 0.006). Conclusion: p16INK4a, CK7 and Ki-67 may represent useful biomarkers that can identify CIN1 lesions that need particular attention, complementing morphology.
Keywords: HPV, p16INK4a, CK7, ki-67, cervical intraepithelial neoplasia, CIN progression.
FIGURA 1. NIC 1: hiperplasia da camada basal, com atipias leves, maturação epitelial preservada e com numerosos coilócitos nas camadas superficiais...22
FIGURA 2. NIC 2: atipia celular marcada e desarranjo arquitetural nos 2/3 profundos do epitélio, maturação presente com coilócitos nas camadas superficiais e figuras de mitose atípicas e altas no epitélio...23
FIGURA 3. NIC 3: atipias e mitoses em todas as camadas do epitélio, que mostra falta de maturação e menor número de coilócitos em relação ao NIC 2...23
FIGURA 4. Vias de oncogênese do HPV, levando à perda da regulação da progressão do ciclo celular através da ativação das quinases envolvidas na fosforilação de pRB e consequente acúmulo de p16INK4a.Brown CA et al, J oncol feb
(2012)...29
FIGURA 5. Expressão de p16INK4a :A) Considerada positiva, com reação “em bloco”, ou seja, forte e difusa, nuclear ou nuclear e citoplasmática, ocupando principalmente as camadas mais profundas do epitélio. B) Considerada negativa, com expressão fraca e de distribuição irregular ao longo do epitélio de NIC1...46
FIGURA 6. Contagem do número de células positivas para p16INK4a (em verde) e do número total de células por campo de médio aumento (20x), com software
IMAGEJ®, na área de NIC1...48
FIGURA 7. Análise da curva ROC para razão de p16INK4a, com cálculo do ponto de corte para este marcador, como preditor de progressão para NIC 2 ou 3 (área sob a curva: 0.596; P=0,206; IC95%: (0.446; 0.747); Ponto de Corte: razão p16INK4a ≥
FIGURA 8. Casos de NIC 1: (A) Com expressão imuno-histoquímica de CK7 no citoplasma. (B) Ausência de expressão de CK7...52
FIGURA 9. Contagem, na área de NIC1, do número de células positivas para CK7 (em vermelho) e do número total de células, por campo de médio aumento (20x), com uso do software IMAGEJ®...52
FIGURA 10. Análise da curva ROC para razão de CK7, com cálculo do ponto de corte para este marcador, como preditor de progressão para NIC 2 ou 3 (Área sob a curva: 0.632; P=0.082 IC95%: (0.479; 0.786) Ponto de Corte: razão CK7 ≥ 0.345)..54
FIGURA 11. Reação imuno-histoquímica para Ki-67 em NIC1: (A) com expressão nuclear acima do terço inferior do epitélio e (B) restrita ao terço inferior do epitélio com NIC 1...56
FIGURA 12. Contagem, na área de NIC1, do número de células positivas para Ki-67 (em verde) e do número total de células, por campo de médio aumento (20x), com uso do software IMAGEJ®...58
FIGURA 13. Análise da curva ROC para razão de Ki-67, com cálculo do ponto de corte para este marcador, como preditor de progressão para NIC2 ou 3 (Área sob a curva: 0,780; P<0.001 IC95%: (0,659; 0,901) Ponto de Corte: razão ki67 ≥ 0,026)..59
TABELA 1. Comparação da expressão de p16INK4a nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre os 3 grupos de evolução do diagnóstico (progressão para lesão de alto grau, permanência de NIC 1 e regressão de lesão)...47
TABELA 2.
Comparação da ausência de expressão de p16
INK4a nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre o grupo que progrediu e o grupo que não progrediu (permanência de NIC 1 e regressão de lesão)...47TABELA 3. Distribuição da razão de p16INK4a entre os 3 grupos, de acordo com o ponto de corte relacionado à progressão para NIC 2 ou 3, calculado através da análise da curva ROC...50
TABELA 4. Comparação da expressão de CK7 nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre os 3 grupos...52
TABELA 5. Distribuição da razão de CK7 entre os 3 grupos, de acordo com o ponto de corte relacionado à progressão para NIC 2 ou 3, calculado pela da análise da curva ROC...55
TABELA 6. Comparação da expressão de Ki-67 nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre os 3 grupos...57
TABELA 7. Comparação nos campos selecionados de NIC1 da razão de células positivas para Ki-67 dividida pelo ponto de corte da curva ROC entre os 3 grupos...60
GRÁFICO 1. Risco cumulativo entre biopsias por grupo...45
GRÁFICO 2. Box-and-whiskers-plots com a distribuição dos valores da razão de p16INK4a entre os pacientes que progrediram para NIC 2 ou 3, permaneceram com NIC 1 ou regrediram...49
GRÁFICO 3. Distribuição dos casos de NIC1 com razão de p16INK4a maior ou igual (coluna em vermelho) e menor (coluna em azul) que o ponto de corte (0,396) nos 3
grupos com diferente evolução
(p=0,003)...51
GRÁFICO 4. Box-and-whiskers-plots com a distribuição dos valores da razão de CK7 entre os pacientes que progrediram para NIC 2 ou 3, permaneceram com NIC 1 ou regrediram...54
GRÁFICO 5. Distribuição dos casos de NIC1 com razão de CK7 maior ou igual (coluna em vermelho) e menor (coluna em azul) que o ponto de corte (0,345) nos 3 grupos (p=0,03)...55
GRÁFICO 6. Box-and-whiskers-plots com a distribuição dos valores da razão de Ki-67 entre os pacientes que progrediram para NIC 2 ou 3, permaneceram com NIC 1 ou regrediram...58
GRÁFICO 7. Distribuição dos casos de NIC1 com razão de Ki-67 maior ou igual (coluna em vermelho) e menor (coluna em azul) que o ponto de corte (0,026) nos 3 grupos. (p=0,002)...60
AGR-2: Gradiente anterior 2
ASC-US: Atypical squamous cells of undetermined significance (células escamosas atípicas de significado indeterminado)
ASC-H: Atypical squamous cells – cannot rule out high grade (células escamosas atípicas que não permitem excluir lesão de alto grau)
AGC-SOE: Atypical glandular cells of undetermined significance (células glandulares atípicas de significado indeterminado)
AGC-NEO: Atypical glandular cells, favor neoplastic
CDK: Cyclin-dependent kinase (Quinase ciclina-dependente)
CEP: Comitê de ética em pesquisa
CK5/6: Citoqueratina 5/6
CK7: Citoqueratina 7
DAB: Diaminobenzidina
DAP: Departamento de Anatomia Patológica
DNA: Ácido desoxirribonucleico
EDTA: Ethylene diamine tetraceticacid (ácido etilenodiamino tetra-acético)
Fase G2: segunda fase de gap do ciclo celular
GDA: guanina deaminase
HIS: Hibridização in situ
HIV: Human Immunodeficiency Virus (vírus da imunodeficiência humana)
HPV: Human Papilloma Virus
INCA: Instituto Nacional do Câncer
JEC: Junção escamo-colunar
LAST:Lower Anogenital Squamous Terminology Standardization Project for HPV-Associated Lesions (projeto de padronização da terminologia das lesões anogenitais escamosas associadas ao HPV)
MMP7: matriz metaloproteinase 7
M: mitose
NIC: Neoplasia Intraepitelial Cervical
NIC1: Neoplasia Intraepitelial Cervical de grau 1
NIC2: Neoplasia Intraepitelial Cervical de grau 2
NIC3: Neoplasia Intraepitelial Cervical de grau 3
pRB: Proteína do Retinoblastoma
RNA: Ácido ribonucleico
ROC: Receiver Operating Characteristic curve
SAS: Statistical Analysis System
TIFF: Tagged Image File Format
UNICAMP: Universidade Estadual de Campinas
1. INTRODUÇÃO...19 2. OBJETIVOS...34 3. MATERIAL E MÉTODOS...35 3.1. Grupos de Estudo...35 3.2. Avaliação Histológica...35 3.3. Critérios de Exclusão...36 3.4. Reações imuno-histoquímicas...36
3.5. Análise da expressão imuno-histoquímica do marcador p16INK4a...38
3.5.1. Avaliação qualitativa...38
3.5.2.Avaliação quantitativa, através de histomorfometria...39
3.6. Análise da expressão imuno-histoquímica do marcador CK7...39
3.6.1. Avaliação qualitativa...39
3.6.2. Avaliação quantitativa, através de histomorfometria...40
3.7. Análise da expressão imuno-histoquímica do marcador Ki-67...40
3.7.1. Avaliação qualitativa...40
3.7.2. Avaliação quantitativa, através de histomorfometria...41
3.8. Análise estatística...41
3.8.1.Análise qualitativa...42
3.8.2. Análise quantitativa...42
3.9. Aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa...44
4. RESULTADOS...45
4.1. Expressão imuno-histoquímica de p16INK4a...46
4.1.1 Análise qualitativa...46
4.1.2 Análise quantitativa...48
4.2. Expressão imuno-histoquímica de CK7...52
4.3. Expressão imuno-histoquímica de Ki-67...56
4.3.1 Análise qualitativa...56
4.3.2 Análise quantitativa...57
4.4. Análise da relação dos marcadores entre si...61
5. DISCUSSÃO...62
6. CONCLUSÕES...72
6.1. Idade...72
6.2. Expressão de p16INK4a,CK7 e Ki-67...72
6.3. Análise dos marcadores entre si...72
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...74
9.ANEXOS...87
9.1. Anexo 1: Casos estudados através de reações imuno-histoquímicas para p16INK4a, CK7 e Ki-67, idade das pacientes e intervalo de tempo entre as biopsias...87
9.2. Anexo 2: Parecer consubstanciado do CEP – Plataforma Brasil – FCM/UNICAMP ...90
1. INTRODUÇÃO
De acordo com dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), o câncer de colo uterino é a quarta causa de câncer (528.000 novos casos por ano) e a quarta causa de morte por câncer em mulheres no mundo (266.000 mortes por ano) (1). A incidência do câncer cervical é aproximadamente cinco vezes maior nos países em desenvolvimento. No Brasil, é o terceiro tumor mais frequente em mulheres, sendo os primeiros lugares ocupados pelo câncer de mama e colorretal, respectivamente. Em nosso país, de acordo com os dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA), 16.340 novos casos foram registrados neste último ano (2). Os métodos de triagem, em especial o exame de Papanicolaou, têm contribuído para uma diminuição desta incidência, por permitir o diagnóstico em estágios iniciais e/ou assintomáticos da doença, associados à maior eficácia terapêutica (3).
Na década de 70, zur Hausen comprovou a associação entre o câncer de colo uterino e a infecção pelo Papilomavírus humano (HPV) (4). Entretanto, outros vinte anos foram necessários para a comunidade científica consolidar o HPV como principal agente etiológico envolvido no desenvolvimento deste tipo de neoplasia, concedendo ao Dr. zur Hausen o prêmio Nobel de Medicina em 2008. O HPV é um vírus epiteliotrópico da família Papillomaviridae, constituído por DNA de dupla fita de cerca de 8.000 pares de bases nitrogenadas, medindo aproximadamente 50 nanômetros, desprovido de envelope, porém envolvido por um capsídeo de estrutura icosaédrica, dividido em duas regiões, L1 e L2. Este vírus está diretamente envolvido na patogênese do câncer de colo uterino, sendo detectado em praticamente todas as lesões pré-invasivas e carcinomas cervicais (5, 6, 7). São descritos mais de 100 subtipos de HPV, os quais
apresentam potenciais oncogênicos distintos, sendo classificados genericamente em duas grandes categorias: baixo risco e alto risco para desenvolvimento de neoplasias invasoras.
As neoplasias intraepiteliais cervicais (NIC) são definidas como um espectro de alterações no epitélio escamoso que ocorrem predominantemente na zona de transformação cervical, causadas pelo HPV (8). Seu papel como lesões precursoras do carcinoma epidermoide do colo uterino está muito bem estabelecido (9) e sua existência foi primeiramente reconhecida por Sir John Williams, em 1886 (apud 10).
Cullen, em 1900 (apud 10), descreveu as características histológicas destas lesões e notou que apresentavam vários aspectos morfológicos semelhantes ao carcinoma invasor. Broders introduziu o termo “carcinoma in
situ“ e Pemberton e Smith (apud 10) foram os primeiros a verificar uma relação
temporal entre carcinoma in situ e o aparecimento de lesões invasoras. Com o passar do tempo, numerosos estudos com longos períodos de acompanhamento foram realizados, consolidando a importância das NIC no desenvolvimento do carcinoma epidermoide cervical (10).
Desde então, diversas terminologias e classificações vêm sendo empregadas. A partir dos estudos sobre ploidia nestas lesões, Richart RM et al, em 1973 (apud 10), propuseram a terminologia de Neoplasia Intraepitelial Cervical, classificando-as em NIC 1, 2 e 3, correspondendo, respectivamente, à antiga terminologia de displasia leve, moderada e grave ou carcinoma in situ.
A denominação Neoplasia Intraepitelial Cervical ou, por outros autores, Neoplasia Escamosa Cervical (do inglês cervical squamous neoplasia ou
squamous intraepithelial lesion), tornou-se universalmente utilizada. Com
estudos sobre o comportamento e história natural destas lesões, a partir da década de 90, foi proposto um sistema de classificação citológica binário (sistema de Bethesda) (11), onde tanto as NIC1 quanto os condilomas corresponderiam à lesão intraepitelial de baixo grau e as NIC2 e 3 às lesões intraepiteliais de alto grau, sendo utilizado especialmente por citopatologistas. Este sistema binário também separa as neoplasias intraepiteliais nas quais o vírus encontra-se na sua forma epissomal ou extra-cromossômica (lesão de baixo grau) daquelas nas quais o vírus encontra-se integrado ao genoma celular (de alto grau). As lesões de baixo grau geralmente são acompanhadas clinicamente, enquanto que as de alto grau devem ser tratadas com conização (12).
As NIC compreendem um espectro de lesões, de acordo com seu grau de comprometimento epitelial e características citológicas, compartilhando entre si etiologia e história natural (13). As alterações morfológicas atualmente utilizadas para a classificação histológica das NIC, que será empregada neste trabalho, seguem o conceito mais recente da Organização Mundial de Saúde (14):
1.1.1: Neoplasia Intraepitelial cervical de Grau 1 (NIC 1 ou Lesão
intraepitelial escamosa de Baixo Grau): observa-se, em grau variado, acantose
epitelial, hiperplasia das camadas basal e parabasal, e maturação epitelial preservada. Nas camadas mais superiores, são verificadas as atipias
coilocitóticas, caracterizadas por células com núcleos grandes e
hipercromáticos, de contornos irregulares, halos claros perinucleares e, por vezes, binucleação. As figuras de mitose se atêm às camadas basais, sendo
raras na camada intermediária do epitélio e ausentes nas superiores (Figura 1).
1.1.2: Neoplasia Intraepitelial cervical de Grau 2 (NIC 2 ou Lesão
intraepitelial escamosa de Alto Grau): nota-se maturação ainda preservada,
com coilócitos nas camadas superficiais do epitélio, porém na metade ou 2/3 inferiores do epitélio, as células exibem núcleos basaloides atípicos e hipercromáticos, ora bizarros, com perda da polaridade celular, além de figuras de mitose frequentes, eventualmente atípicas, não mais restritas à camada basal (Figura 2).
1.1.3: Neoplasia Intraepitelial cervical de Grau 3 (NIC 3 ou Lesão
intraepitelial escamosa de Alto Grau): este diagnóstico é permitido quando as
células basaloides e imaturas atingem o terço superior do epitélio. A maturação epitelial está prejudicada, o que se associa à rara presença de coilócitos. As figuras de mitose são numerosas e presentes em qualquer altura do epitélio (Figura 3).
Figura 1: NIC 1: hiperplasia das camadas mais profundas do epitélio, com atipias leves,
Figura 2: NIC 2: atipia celular marcada e desarranjo arquitetural nos 2/3 profundos do epitélio,
maturação presente com coilócitos nas camadas superficiais e figuras de mitose atípicas e altas no epitélio.
Figura 3: NIC 3: atipias e mitoses em todas as camadas do epitélio, que mostra falta
A infecção pelo HPV é mais prevalente em mulheres jovens e adolescentes, provavelmente devido à falha de resposta imunológica pela não exposição prévia ao vírus, somando-se ainda fatores biológicos: o processo de metaplasia escamosa na zona de transformação cervical ocorre durante a puberdade, não havendo, assim, elemento “protetor” às células basais epiteliais (15). Por outro lado, o grupo de mulheres mais velhas, na faixa dos 30 a 40 anos, se associa à infecção viral persistente e, por conseguinte, é mais susceptível à progressão da lesão de NIC (16).
Os intervalos de tempo adotados na literatura para progressão, persistência da lesão e regressão são muito variados e, em muitos casos, torna-se difícil esta afirmação e a comparação de diferentes trabalhos. Song SH et al (17), adotaram como conceito de NIC persistente aqueles casos com acompanhamento por mais de 24 meses, e que apresentavam o mesmo grau de NIC como diagnóstico. Entretanto, outros autores usam outros períodos de seguimento. No estudo de Omori M et al (18), as pacientes foram acompanhadas por, no mínimo 4 meses (intervalo entre biópsias), enquanto que Nappi L et al (19) seguiram os casos por 36 meses.
Embora muitos detalhes ainda devam ser esclarecidos, dados recentes sugerem que a entrada do HPV na célula hospedeira é iniciada através de ligação do capsídeo viral maduro a proteoglicanas heparan-sulfato situadas na membrana basal. Esta interação leva à quebra de proteínas L2 virais, induzindo a alterações conformacionais no capsídeo. Após esta ruptura proteolítica, o capsídeo do HPV interage com receptores de superfície celular ainda pouco estabelecidos, dando início à endocitose (20). A integração de sequências de HPV de alto risco ao genoma da célula hospedeira é considerada um evento
importante para a progressão de lesões de baixo grau, por causar ruptura do gene E2, e consequente superexpressão dos oncogenes virais E6 e E7 dos HPV de alto risco, os quais codificam as principais proteínas relacionadas à fase de transformação da infecção viral, tendo sua expressão aumentada após haver integração do genoma viral ao genoma da célula hospedeira nas lesões intraepiteliais de alto grau e no câncer do colo uterino. Estas proteínas interferem na função normal de proteínas codificadas por genes supressores tumorais, como p53 e proteína do retinoblastoma (pRb) (21).
A história natural das neoplasias intraepiteliais cervicais é extremamente variável, e apenas a presença de certo tipo viral não é suficiente para sua progressão, regressão ou persistência (22). Isto é corroborado pelo fato de que alta porcentagem das lesões intraepiteliais de baixo grau são positivas para HPV de alto risco oncogênico (80%) e, mesmo assim, a maioria regride espontaneamente (23, 24). Há uma prevalência significativa do HPV de alto risco entre os diferentes graus de NIC e cerca de 80% das mulheres entram em contato com este vírus durante a vida, entretanto, apenas cerca de 10% dos casos de NIC1 progride para lesões de alto grau (25). É possível, então, considerar o câncer de colo de útero como uma rara complicação da infecção pelo HPV (26). Dessa forma, a infecção pelo HPV é considerada um evento necessário, porém não suficiente para a progressão de NIC (27). O sistema imunológico desempenha um papel importante na eliminação e integração do HPV ao genoma da célula hospedeira (28, 29). Além disso, alguns fatores de risco podem tornar estas pacientes mais susceptíveis ao desenvolvimento de lesões de alto grau, sendo os principais: infecção persistente pelo mesmo tipo de HPV (especialmente pelo HPV16); tipo de HPV (18% das pacientes com
HPV16 desenvolvem NIC de alto grau); status viral da lesão (vírus integrado ou na forma epissomal) (30). Ademais, outros fatores como tabagismo e fatores hormonais, relacionados ao número de gestações e uso de contraceptivos orais, podem ter influência nos mecanismos de progressão para lesões invasoras, por auxiliarem a integração do DNA do HPV ao genoma do hospedeiro. Castellsague e Munoz (31) comentam que o número de gestações pode, provavelmente, aumentar o risco de desenvolvimento de carcinoma invasor por manter a zona de transformação na ectocérvice por mais tempo, facilitando a exposição direta ao HPV de alto risco. Estes autores também reforçam que carcinógenos relacionados ao tabaco podem exercer danos ao DNA, ao interferirem diretamente no ciclo celular. Assim, a exposição ao tabaco pode afetar a habilidade da célula hospedeira de construir uma resposta imune local eficiente contra infecções virais, uma vez que tem sido mostrado que o tabagismo reduz o número de células de Langerhans e outros mediadores imunológicos (31). Outro fator que tem sido relacionado à progressão de lesões cervicais relacionadas ao HPV é o uso prolongado de contraceptivos orais. Moodley et al (32) mostraram que o estradiol parece estimular a transcrição dos oncogenes virais E6 e E7 do HPV 16 em linhagens celulares integradas a este HPV de alto risco. Uma vez que sequências codificadoras dos oncogenes E6 e E7 estão relacionadas ao potencial oncogênico do HPV 16, o efeito estrogênico na transcrição destes genes virais parece ter relevância biológica na transformação maligna de células cervicais infectadas por este HPV de alto risco. Além disso, pacientes com sorologia positiva para HIV apresentam maior prevalência de lesões cervicais pré-malignas. Em um estudo de caso controle sobre câncer de colo uterino (33), pacientes HIV-positivas apresentaram risco 5
vezes maior de ter infecção por HPV de alto risco quando comparadas a pacientes HIV-negativas; e mulheres infectadas tanto por HIV-1 quanto por HPV de alto risco apresentaram risco 40 vezes maior de desenvolver lesões intraepiteliais cervicais quando comparadas a pacientes que não estavam infectadas por nenhum destes vírus. A diminuição de linfócitos CD4 em pacientes HIV positivas poderia resultar em uma resposta imune debilitada às oncoproteínas virais E6 e E7 (34).
A Hibridização in situ (HIS) pode identificar a integração do HPV e, segundo Cooper el al (35), o padrão pontilhado da reação, consistente com sinal discreto no núcleo representa HPV integrado ao genoma celular, enquanto o padrão difuso da reação representa HPV epissomal. Desta forma, a detecção de um padrão puntiforme representa um marcador que identifica lesões cervicais que merecem intervenção clínica. Para o patologista, a HIS é um método excelente, pois identifica a presença do vírus, seu tipo e o local que ocupa na célula, sem a destruição da morfologia. Em publicação do nosso grupo de pesquisa (36), foi observado que a HIS esteve relacionada à progressão da NIC 1 para NIC 2 ou 3, quando havia o padrão puntiforme de reação expresso em células basais, o que pode indicar o prognóstico da NIC1.
O gene supressor tumoral p16 (CDKN2A) é um membro da classe INK4 de inibidores do ciclo celular e está situado no cromossomo 9p21. A proteína p16 (p16INK4a) liga-se a quinases ciclina-dependentes 4 e 6 e mantém pRB em seu estado hipofosforilado que, por sua vez, liga-se ao fator de transcrição E2F e impede a progressão do ciclo celular(37). Klaes et al (38) demonstraram um significativo aumento na produção de p16INK4, uma proteína supressora
infecções pelos subtipos virais de alto risco HPV 16 e 18 estão associadas a 99% de todos os carcinomas cervicais. As oncoproteínas produzidas pelos genes virais E6 e E7 são cruciais para iniciação e manutenção dos fenótipos malignos e a expressão, tanto de E6 quanto de E7, é suficiente para imortalizar ceratinócitos basais e parabasais cervicais. Além disso, E6 e E7 se ligam e, consequentemente, degradam, p53 e a proteína do retinoblastoma (pRB), respectivamente, abolindo, assim, duas importantes vias supressoras tumorais. Em condições normais, a proteína p53 mantém o ciclo celular em fases G0/G1 ou em apoptose, em resposta a danos no DNA. De modo semelhante, pRB também exerce um controle na manutenção do ciclo celular em fases G0/G1, ao formar um complexo com o fator de transcrição E2F, moderando a transcrição de genes da fase S do ciclo celular. A formação do complexo pRb-E2F depende do nível de fosforilação de pRB, que, quando fosforilada por ciclina D1-CDK4 e seus complexos, libera o fator de transcrição E2F para ativar a progressão do ciclo celular às fases G1/S. Em células normais, a atividade de CDK4 é finamente regulada por p16INK4a. A oncoproteína viral E7, entretanto,
mimetiza a inativação de pRB (seja por mutações/deleções gênicas ou por aumento da expressão de CDK4), ou seja, a ação de E7 leva a aumento da atividade de CDK4 e consequente fosforilação imatura de pRB. Como a expressão de p16INK4a é controlada de acordo com os níveis de pRB, uma
função reduzida ou ausente desta proteína resulta em aumento dos níveis de p16INK4a. Assim, a inativação de pRB, através da ação de E7, resulta em
Figura 4: Vias de oncogênese do HPV, levando à perda da regulação da progressão do ciclo
celular através da ativação das quinases envolvidas na fosforilação de pRB e consequente acúmulo de p16INK4a.Brown CA et al, J oncol feb (2012).
Embora muitos estudos mostrem níveis elevados de p16INK4a em NIC 2 e
NIC 3, há apenas alguns relatos associando este marcador a NIC 1 (39). Do ponto de vista imuno-histoquímico, a reação é considerada positiva para p16INK4a (40) quando há expressão “em bloco”, ou seja, marcação nuclear e
citoplasmática de forte intensidade, em toda a extensão da lesão. O papel de p16INK4a como ferramenta diagnóstica tem sido recomendado (39), com o
intuito de diferenciar NIC 2 e 3 de lesões que as mimetizam, como a metaplasia escamosa imatura do epitélio endocervical, por exemplo, nas quais a expressão de p16INK4a é negativa. O aumento da expressão de p16INK4a tem
sido relacionado à interferência de oncoproteínas virais envolvidas diretamente no controle do ciclo celular. Logo, um aumento na expressão
indireto de desequilíbrio no ciclo celular por integração do HPV de alto risco e aumento da transcrição dos oncogenes E6 e E7, levando à hipótese de que estes casos teriam maior risco para progressão para lesão de alto grau.
Microtraumas e abrasões na mucosa cervical a tornam mais sensíveis à infecção pelo HPV. Além disso, sabe-se que o câncer cervical e seus precursores desenvolvem-se principalmente na junção escamo-colunar (JEC) (41, 42). Herfs e Crum, em estudos recentes (3, 20, 43, 44), descreveram que, em estágios iniciais do desenvolvimento fetal humano (aproximadamente 16 semanas), a vagina e o colo uterino estão completamente cobertos por um epitélio mülleriano indiferenciado que expressa alguns marcadores como CK7, gradiente anterior 2 (AGR2), guanina deaminase (GDA), matriz metaloproteinase 7 (MMP7) e CD63. Da décima sétima à décima oitava semanas, uma indução de marcadores escamosos iniciais, CK5/6 e p63, é observada na maioria das células müllerianas. Este recém-formado epitélio basal escamoso ainda expressa os marcadores primitivos, sendo finalmente esfoliado alguns meses após o nascimento, com exceção de algumas poucas células residuais localizadas na junção escamo-colunar. Em mulheres adultas, estudos de imuno-histoquímica têm demonstrado que esta população celular cuboidal residual específica da JEC apresenta um painel de expressão gênica diferente dos epitélios ectocervicais e endocervicais adjacentes, e este perfil de expressão gênica se conserva em NIC 3, carcinomas invasores e adenocarcinomas, levando à hipótese de que estas lesões poderiam se originar a partir da infecção e integração de HPV de alto rico ao genoma destas células. Este perfil de expressão gênica foi então denominado “JEC-específico”. Estas descobertas levantam a possibilidade de que lesões de NIC 1 que expressarem
este imunofenótipo poderiam estar mais propensas à progressão para lesões de alto grau. A partir desta teoria, os autores passaram a classificar as NIC1 em juncionais, quando havia expressão destes marcadores, e ectocervicais (ou juncionais negativas) quando esta expressão não é observada. De acordo com estes autores, NIC1 diagnosticadas após tratamento com conização tendem a ser negativas para estes marcadores juncionais. Isto sugere que a remoção desta população celular específica da junção escamo-colunar cervical poderia reduzir o risco de desenvolvimento de lesões precursoras com potencial biológico mais agressivo. Dessa forma, a ideia de identificar as NIC1 que expressem esses biomarcadores poderia selecionar as pacientes que teriam maior risco para progredir para lesão de alto grau e que deveriam ser submetidas a retirada da JEC e, consequentemente, desta população celular específica. Dentre os biomarcadores mencionados, a CK7 é o mais comumente utilizado na rotina diagnóstica de anatomia patológica em imuno-histoquímica, sendo um marcador mais viável do ponto de vista comercial, inclusive. Assim, selecionamos este marcador, dentre os demais, a fim de tornar o presente estudo com maior aplicabilidade prática.
Um dos marcadores dos processos neoplásicos é a proliferação celular descontrolada. O antígeno Ki-67 é uma proteína de meia-vida curta expressa durante as fases G1, S, e G2 e M do ciclo celular, mas não na fase G0. Seu clone mais utilizado em imuno-histoquímica é o MIB-1, um anticorpo monoclonal, resistente ao uso em materiais parafinados (45). Este anticorpo é uma proteína nuclear associada à transcrição de RNA e à progressão do ciclo celular, sendo um importante marcador de proliferação celular, tendo sido aplicado de forma quantitativa e qualitativa em tumores de diversos locais,
inclusive no colo uterino. A infecção pelo HPV de alto risco, principalmente dos tipos 16 e 18, está associada a um aumento na atividade proliferativa do epitélio escamoso, sendo a expressão de Ki-67 maior nestes casos do que em lesões desprovidas da presença viral (46). Entretanto, diferentemente do p16INK4a, pode haver aumento de expressão de Ki-67 nas células basais de
lesões proliferativas benignas. Nestes processos benignos, porém, esta expressão tende a ser restrita às camadas basal e parabasal do epitélio ectocervical. Por outro lado, de modo semelhante ao p16INK4a, Ki-67 também
tem sua expressão aumentada em lesões de alto grau, podendo ocupar toda a espessura do epitélio em NIC2, NIC3, carcinomas escamosos invasores e adenocarcinomas (47). Além disso, a densidade nuclear nas camadas basais do epitélio, quando avaliada por métodos quantitativos, é diretamente proporcional ao grau da NIC (48). Em NIC 2 e NIC 3, são frequentes núcleos positivos no terço superior do epitélio e, nas NIC 3, a expressão de Ki67 pode ser até 2,5 vezes maior que nas NIC1, segundo alguns autores (45).
Embasados em todos estes conhecimentos, nossa hipótese de trabalho é que as expressões de p16INK4a, CK7 e Ki67 em biópsias de NIC1 poderiam
ser indicadores que apontariam para a evolução ou progressão da lesão de NIC1, sendo uma ferramenta importante para o melhor seguimento das pacientes.
JUSTIFICATIVA
Diversos estudos têm sido desenvolvidos na tentativa de se encontrar um método que não só detecte a infecção pelo HPV, mas também identifique, direta ou indiretamente, as pacientes com maior risco de desenvolver lesões de alto grau. Infelizmente, critérios morfológicos obtidos em colorações histopatológicas de rotina (hematoxilina-eosina) não são suficientes para distinguir as NIC 1 que irão regredir ou persistir, daquelas que irão apresentar um desfecho desfavorável, com evolução para lesão de alto grau. Dessa maneira, este projeto busca conhecer melhor as lesões de NIC 1 e sua evolução, em estudo com material de biopsia, procurando fornecer mais informações práticas e relevantes para o prognóstico, selecionando as pacientes que merecem seguimento mais cuidadoso.
2. OBJETIVOS
Geral: Avaliar a expressão de p16INK4a, CK7 e Ki-67 em biópsias de NIC 1, procurando estabelecer um perfil imuno-histoquímico preditor de progressão.
Específicos:
1. Avaliar a expressão de p16INK4a, Ki-67 e CK7 na primeira biopsia com
diagnóstico de NIC1 de mulheres que, no seguimento, foram submetidas a uma outra biopsia, buscando identificar diferenças na expressão destes marcadores em três grupos com diferente evolução, ou seja: a) nos casos que progrediram para NIC 2 ou NIC 3, b) nos mantiveram o diagnóstico de NIC 1, c) nos que regrediram espontaneamente;
2. Comparar as médias de idade das pacientes com diagnóstico de NIC1 entre os 3 grupos com diferente evolução;
3. Comparar a expressão imuno-histoquímica destes marcadores entre si na avaliação da progressão da lesão de NIC1.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Grupos de estudo
Foi realizado um estudo retrospectivo através de levantamento dos arquivos de biopsia do Departamento de Anatomia Patológica (DAP) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) no período de 2001 a 2006.
De um total de 1130 casos de NIC1 deste período, foram selecionadas todas as pacientes que apresentaram duas citologias cérvico-vaginais prévias com o diagnóstico de lesão intraepitelial escamosa de baixo grau, com base na 2ª edição do Sistema Bethesda para citologia de colo uterino (11), no intervalo de pelo menos 06 meses e que, após o segundo diagnóstico citológico, foram submetidas à biopsia de áreas anormais (vistas durante exame colposcópico) ou conização. Por terem apresentado uma biopsia com diagnóstico de NIC1, estas pacientes foram submetidas a nova biopsia, no intervalo mínimo de 06 meses, de acordo com as recomendações da Organização Mundial de Saúde (OMS) (49). De acordo com o diagnóstico no segundo procedimento, foram divididas em três grupos:
- Casos que continuaram com o diagnóstico de NIC1;
- Casos que apresentaram progressão da lesão (NIC2 ou 3); - Casos que regrediram.
Em todos os casos, apenas o material da primeira biopsia foi submetido ao estudo imuno-histoquímico.
3.2 - Avaliação histológica
Os diagnósticos de todos os casos foram revistos por três patologistas (LBEC, RDMT e LALAA), sendo selecionados aqueles que apresentavam lesão
de NIC1, de acordo com os critérios da OMS (14).
3.3 - Critérios de exclusão
1- Pacientes com diagnóstico (citológico ou histológico) prévio de NIC2 ou NIC3, ASC-US (células escamosas atípicas de significado indeterminado) e
ASC-H (células escamosas atípicas, não se podendo excluir lesão de alto
grau), SOE (células glandulares atípicas, sem outra especificação),
AGC-NEO (células glandulares atípicas, favorecendo neoplasia), adenocarcinoma in situ, adenocarcinoma invasor ou carcinoma invasor;
2- Pacientes gestantes;
3- Pacientes com sorologia positiva para HIV; 4- Pacientes sob terapia imunossupressora;
5- Lesão muito focal que desapareceu nos cortes seriados; 6- Materiais com artefatos técnicos ou problemas de má fixação.
3.4 - Reações imuno-histoquímicas
As reações imuno-histoquímicas para p16INK4a, o marcador de proliferação celular Ki67 e CK7 foram realizadas no Laboratório de Imuno-histoquímica (DAP/UNICAMP) em todos os casos.
Os materiais, previamente fixados em formalina 10% e emblocados em parafina, foram submetidos a cortes histológicos de 4 micrômetros de espessura, os quais foram alocados em lâminas silanizadas, depois desparafinizadas com 3 banhos de xilol à temperatura ambiente. Após, as lâminas foram banhadas em três álcoois absolutos, um álcool 80% e um álcool 50% para hidratação progressiva. Foram, então, lavadas em água corrente por
três minutos e passadas em água destilada.
Para inibição da peroxidase endógena, as lâminas passaram por banhos de 5 minutos cada, em solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) à temperatura ambiente e novamente lavadas em água corrente por 3 minutos e passadas em água destilada.
A recuperação antigênica foi realizada com a imersão das lâminas em tampão Tris-EDTA 0,05M pH 8,9, durante 30 minutos, a cerca de 95ºC, em panela de vapor, com esfriamento subsequente por 15 minutos para os anticorpos CK7 (clone OV-TL12/30, Dako, Glostrup, Denmark, diluição 1:100) e Ki-67 (clone MIB1, DAKO, diluição 1:50). Para p16INK4a foi utilizada a solução tampão do kit CINtec p16INK4a (CINtec p16INK4a Histology Kit, clone E6H4 mtm Laboratories AG, Heidelberg, Germany). Após, foram lavadas em água
corrente e água destilada.
Os anticorpos primários foram gotejados sobre os respectivos preparados histológicos nas diluições supracitadas, e as lâminas incubadas em estufa a 37ºC por 30 minutos. Após, foram incubadas por 16-20 horas (overnight) a 4ºC em câmara úmida.
Posteriormente, foram lavadas três vezes em solução tampão PBS (phosphate buffer saline), pH 7,4, à temperatura ambiente. As lâminas foram então incubadas por uma hora a 37ºC com um coquetel de polímeros marcado com peroxidase, sendo utilizado, para CK7 e Ki-67 o sistema de detecção
Advance (DAKO), e, após, novamente imersas em PBS. Conforme citado
anteriormente, para p16INK4a foi utilizada a solução tampão do kit CINtec
p16INK4a (CINtec p16INK4a Histology Kit, clone E6H4 mtmLaboratories AG,
A coloração foi realizada com Kit DAB (diamino-benzidina) - Dako REF - 3468 – cromógeno marrom por 5 minutos a 37ºC. O material foi lavado em água corrente, contra-corado com hematoxilina de Mayer, desidratado (três banhos de álcool etílico e três de xilol) e as lamínulas coladas com resina de Entellan®.
Além dos casos do grupo de estudo, para controle das reações imuno-histoquímicas para p16INK4a e CK7, foram selecionados um caso de carcinoma epidermoide invasor e um caso de adenocarcinoma endocervical, para os quais é considerada a positividade de reação se houver expressão difusa destes marcadores nestas neoplasias, conforme os padrões de expressão descritos a seguir. Para Ki67, foi selecionado como controle o colo uterino de peça de histerectomia por doença miomatosa de paciente em idade reprodutiva e sem história prévia de lesões, no qual a positividade de reação ocorre apenas na camada basal do epitélio ectocervical.
3.5 - Análise da expressão imuno-histoquímica do marcador p16INK4a
3.5.1 Interpretação qualitativa
Inicialmente, foi realizada uma análise baseada na simples leitura da reação de p16INK4a, a qual denominaremos de interpretação qualitativa. Três patologistas (LBEC, RDMT e LALAA) avaliaram esta expressão, ao microscópio de coobservação, sendo considerada positiva a reação “em bloco”, ou seja, expressão forte e difusa, nuclear, ou nuclear e citoplasmática, em toda a extensão do terço inferior do epitélio displásico (camadas basal e parabasal), de acordo com critérios de estudos recentes (37, 39, 40). A camada basal considerada foi aquela adjacente à membrana basal, e a camada parabasal,
definida como logo acima da basal. Os dados foram tabulados para análise estatística subsequente.
3.5.2 Análise morfológica quantitativa, através de histomorfometria
A interpretação da expressão de p16INK4a por imuno-histoquímica
também foi realizada através de um método quantitativo, com o cálculo da razão entre o número de células positivas para p16INK4a e o número total de
células da área de NIC1. Células com expressão nuclear, ou nuclear e citoplasmática foram consideradas positivas.
Foram fotografados em cada lâmina da reação imuno-histoquímica de p16INK4a, três campos de médio aumento (20x), com câmera digital Nikon,
modelo 995, em arquivo TIFF, sem artefatos técnicos, cada um contendo o maior número de células de NIC1 por campo.
Através do software IMAGEJ® (50), em cada imagem histológica de NIC1, foram feitas as contagens do número de células positivas para p16INK4a e o número total de células da área de NIC1 por campo, com o objetivo de se obter a razão de células positivas para p16INK4a a qual denominaremos razão de p16INK4a ao longo deste trabalho. Os dados foram tabulados para análise estatística subsequente.
3.6 - Análise da expressão imuno-histoquímica do marcador CK7
3.6.1Interpretação qualitativa da reação imuno-histoquímica
Inicialmente, foi realizada uma análise baseada na simples leitura da reação de CK7, a qual denominaremos de interpretação qualitativa da expressão de CK7. Três patologistas (LBEC, RDMT e LALAA) avaliaram esta expressão, ao microscópio de coobservação, sendo considerada positiva a
reação quando foi observada expressão citoplasmática difusa na porção basal, parabasal ou mais alta do epitélio com NIC1, de acordo com estudos recentes (40). Os dados foram tabulados para análise estatística subsequente.
3.6.2Análise morfológica quantitativa, através de histomorfometria
A interpretação da expressão de CK7 por imuno-histoquímica também foi realizada através de um método quantitativo, com o cálculo da razão entre o número de células positivas para CK7 e o número total de células da área de NIC1. Células com expressão citoplasmática foram consideradas positivas. Foram fotografados em cada lâmina da reação imuno-histoquímica de CK7, três campos de médio aumento (20x), com câmera digital Nikon, modelo 995, em arquivo TIFF, sem artefatos técnicos, as áreas de NIC1.
Através do software IMAGEJ®, em cada imagem histológica de NIC1, foram feitas as contagens do número de células positivas para CK7 e o número total de células da área de NIC1 por campo, com o objetivo de se obter a razão de células positivas para CK7, a qual denominaremos razão de CK7 ao longo deste trabalho. Os dados foram tabulados para análise estatística subsequente.
3.7- Análise da expressão imuno-histoquímica do marcador Ki67
3.7.1Interpretação qualitativa
Inicialmente, foi realizada uma análise baseada na simples leitura da reação de Ki67, a qual denominaremos de interpretação qualitativa da expressão de Ki67. Com avaliação ao microscópio de coobservação, 3 patologistas (LBEC, RDMT e LALAA), classificaram esta expressão
imuno-histoquímica em:
- positividade até a camada parabasal do epitélio com NIC1; - positividade acima da camada parabasal do epitélio com NIC1.
Os dados tabulados para análise estatística subsequente.
3.7.2Análise morfológica quantitativa, através de histomorfometria
A interpretação da expressão de Ki67 por imuno-histoquímica também foi realizada através de um método quantitativo, com o cálculo da razão entre o número de células positivas para Ki67 e o número total de células da área de NIC1. Células com imunoexpressão nuclear foram consideradas positivas.
Foram fotografados em cada lâmina da reação imuno-histoquímica de Ki67, três campos de médio aumento (20x), com câmera digital Nikon, modelo 995, em arquivo TIFF, sem artefatos técnicos, as áreas de NIC1.
Através do software IMAGEJ®, em cada imagem histológica digitalizada, foram feitas as contagens do número de células Ki67 positivas e o número total de células da área de NIC1 por campo, com o objetivo de se obter a razão de células Ki67 positivas, a qual denominaremos razão de Ki67 ao longo deste trabalho. Os dados foram tabulados para análise estatística subsequente.
3.8- Análise estatística
A análise estatística dos resultados foi realizada com a colaboração de um profissional estatístico (HCM).
Para descrever o perfil da amostra segundo as variáveis em estudo foram feitas tabelas de frequência com valores de frequência absoluta (n) e relativa (%) das variáveis categóricas.
A análise descritiva das variáveis numéricas (idade e intervalo de tempo entre as biopsias) entre os três grupos foi realizada através de média, desvio-padrão, mediana, valores mínimos e máximos. Foram testados quanto à distribuição normal através dos testes de Shapiro-Wilk e Kolmogorv-Smirnov, e quando esta não ocorreu, foram realizados testes não paramétricos para os valores médios e medianos. As comparações das variáveis numéricas entre os três grupos foram feitas através do teste de Kruskal-Wallis; e entre progressão e não-progressão através do teste de Mann-Whitney.
No que diz respeito ao intervalo de tempo entre a primeira e a segunda biopsia (em meses), foi realizada ainda a análise de sobrevida por Kaplan-Meier para estudar o risco cumulativo entre as biópsias por grupo.
3.8.1) análise qualitativa
A partir da positividade de p16INK4a, CK7 e Ki67 em cada caso de NIC1, foram feitas tabelas de frequência com valores de frequência absoluta (n) e relativa (%) e sua distribuição entre os grupos.
Para comparação das frequências de positividade e negatividade de cada marcador entre os grupos (progressão para NIC 2 ou 3, permanência de NIC1 e regressão; ou progressão e ausência de progressão), foi utilizado o teste Qui-quadrado de Pearson.
3.8.2) análise quantitativa
Em relação ao método quantitativo de avaliação imuno-histoquímica, a razão entre o número de células positivas, de acordo com o padrão da reação de cada marcador, e o número total de células no epitélio de NIC1 por campo
foi calculada em cada caso. O valor médio entre os três campos fotografados em cada caso foi calculado, obtendo-se, assim, a razão do número de células positivas para p16INK4a, CK7 e Ki-67 em cada caso de NIC1. A análise descritiva das razões do número de células positivas para cada marcador, entre os três grupos, foi realizada através de média, desvio-padrão, mediana, valores mínimos e máximos. Os valores médios absolutos foram comparados entre os três grupos, utilizando o teste de Kruskal-Wallis; e entre progressão e não-progressão através do teste de Mann-Whitney. A partir daí, foi realizada a análise da curva ROC (Receiver Operating Characteristic curve) para avaliar um ponto de corte para a razão de células positivas para p16INK4a, CK7 e Ki-67 como preditores de progressão para NIC 2 ou 3. Uma vez calculado o ponto de corte, foi feita a comparação da porcentagem de casos que apresentam razão de p16INK4a, de CK7 e de Ki-67 maior/igual ou menor que seus respectivos pontos de corte, entre os três grupos.
Os dados foram analisados, para cada marcador, em relação à significância, através do teste de Qui-quadrado de Pearson, para sensibilidade, especificidade, Valor Preditivo Positivo (VPP) e Valor Preditivo Negativo (VPN), considerando progressão para NIC 2 e 3.
Além disso, para analisar a relação conjunta dos três marcadores com os três grupos, foi utilizada a análise de regressão logística multivariada, com critério Stepwise de seleção de variáveis.
O nível de significância adotado para os testes estatísticos foi de 5% (p<0.05).
Para análise estatística foi utilizado programa computacional The SAS
2002-2008, Cary, NC, USA.
3.9 APROVAÇÃO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
O presente projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP – Plataforma Brasil, sob o protocolo número 138.571. Por se tratar de trabalho retrospectivo em material biológico parafinado de arquivo, foi dispensada a utilização do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
4. RESULTADOS
Dos 74 casos que preencheram os critérios de inclusão e exclusão, oito foram excluídos devido à escassez de material após desbaste dos blocos de parafina. Foram então estudados 66 casos de NIC1, que na segunda biópsia do seguimento apresentaram: a) progressão para NIC2 ou NIC3: 22 (33,4%), b) manutenção do diagnóstico de NIC1: 25 (37,9%), c) não apresentaram lesão e foram considerados como regressão: 19 (28,7%).
A idade variou de 17 a 72 anos, com a média de 29 anos. A média de idade dos casos que não evoluíram (regrediram ou permaneceram com NIC1) foi de 27 anos, enquanto que daqueles com progressão para NIC2 ou 3 foi de 33 anos, dado estatisticamente significante (p=0,006 – teste de Mann-Whitney). O gráfico1 apresenta o risco cumulativo para o intervalo de tempo (meses) entre as biopsias entre os três grupos:
O intervalo de tempo entre as coletas não se relacionou com regressão de lesão ou progressão para NIC2 ou 3 (p=0,223) e variou de 6 a 42 meses, com a média de 9 meses.
4.1. Expressão imuno-histoquímica de p16INK4a 4.1.1. Análise qualitativa
A figura 5, a seguir, exemplifica a expressão imuno-histoquímica de p16INK4a em casos considerados positivo e negativo, respectivamente.
Figura 5: Expressão de p16INK4a :A) Considerada positiva, com reação “em bloco”, ou seja, forte
e difusa, nuclear ou nuclear e citoplasmática, ocupando principalmente as camadas mais profundas do epitélio. B) Considerada negativa, com expressão fraca e de distribuição irregular ao longo do epitélio de NIC1.
A distribuição da expressão de p16INK4a nos três grupos do estudo está apresentada na Tabela 1, a seguir:
Tabela 1: Comparação da expressão de p16INK4a nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre os três grupos de evolução do diagnóstico.
Progressão para NIC 2 ou 3 Permanência de NIC 1 Regressão Positividade para p16INK4a n (%) n=10 (45,4%) n=8 (32%) n=3 (15,8%) Teste de Qui-quadrado; p=0,126
Embora sem diferença significativa (p=0,126), os casos de NIC1 com expressão para p16INK4a estiveram mais frequentemente relacionados à progressão para NIC2 ou 3, tendo sido observada uma porcentagem de casos positivos para p16INK4a maior nos casos de NIC1 que progrediram para NIC2 ou 3 (45,4%), em relação aos casos que mantiveram o diagnóstico e que regrediram espontaneamente (32% e 15,8%, respectivamente).
Foi também analisada a falta da expressão de p16INK4a entre o grupo que progrediu para NIC2 ou 3 e o grupo que não progrediu (considerado como permanência de NIC1 e regressão de lesão), como demonstrado na Tabela 2: Tabela 2: Comparação da ausência de expressão de p16INK4a nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre o grupo que progrediu e o grupo que não progrediu (permanência de NIC1 e regressão de lesão).
Progressão para NIC2 ou 3 Não-progressão Negatividade para
p16INK4a n (%)
n=12 (54,6%) n=33 (75%)
Embora também sem diferença estatística significativa (p=0,093), os casos de NIC1 sem expressão de p16INK4a estiveram mais relacionados à ausência de progressão, tendo sido observada uma porcentagem de casos negativos para p16INK4a maior nos casos de NIC1 que não progrediram (75%), em relação aos que casos progrediram (54,6%).
4.1.2. Análise quantitativa
A figura 6 exemplifica a análise quantitativa (histomorfométrica) da expressão de p16INK4a, com cálculo da razão do número de células positivas para este marcador, por campo de epitélio com NIC1, através do software
IMAGEJ®:
Figura 6: Contagem do número de células positivas para p16INK4a (em verde) e do número total
de células por campo de médio aumento (20x), com software IMAGEJ®, na área de NIC1.
Como não houve distribuição normal através dos testes de Shapiro-Wilk e Kolmogorv-Smirnov, foram realizados testes não-paramétricos (Mann-Whitney e Kruskal-Wallis). A média geral da razão de p16INK4a foi 0,29. A média da razão de p16INK4a nos casos que regrediram foi 0,03; enquanto que naqueles com progressão para NIC2 ou 3 foi 0,40; dado estatisticamente
significante (p<0,001 – teste de Kruskal-Wallis).
O gráfico 2, a seguir, mostra a distribuição dos valores de razão de p16INK4a entre os 3 grupos:
Gráfico 2. Box-and-whiskers-plots com a distribuição dos valores da razão de p16INK4a entre os
pacientes que progrediram para NIC 2 ou 3, permaneceram com NIC 1 ou regrediram (p<0,001).
Em relação à análise histomorfométrica, a Figura 7 apresenta os resultados da análise da curva ROC (Receiver Operating Characteristic curve) para avaliar um ponto de corte para a razão de p16INK4a como preditor de progressão da doença. O cálculo deste ponto de corte permite pôr em evidência o valor para o qual existe maior otimização da sensibilidade em função da especificidade relacionada à progressão para NIC2 ou NIC3.
Figura 7: Análise da curva ROC para razão de p16INK4a, com cálculo do ponto de corte para
este marcador, como preditor de progressão para NIC 2 ou 3 (área sob a curva: 0,596; P=0,206; IC95%: (0,446; 0,747); Ponto de Corte: razão p16INK4a ≥ 0,396)
A análise da curva ROC mostrou um ponto de corte para a razão de células que expressaram p16INK4a ≥ 0,396 como preditor de progressão de lesão (Figura 7).
A Tabela 3 e o gráfico 3, a seguir, apresentam a comparação da razão de células positivas para p16INK4a, de acordo com o ponto de corte da curva ROC entre os três grupos:
Tabela 3: Distribuição da razão de p16INK4a entre os três grupos, de acordo com o ponto de corte relacionado à progressão para NIC2 ou 3, calculado através da análise da curva ROC. Ponto de corte (curva ROC) Progressão para NIC2 ou 3 Permanência de NIC1 Regressão <0,396 n=10 (45,4%) n=15 (60%) n=18 (94,8%) ≥0,396 n=12 (54,5%) n= 10 (40%) n=1 (5,2%) Teste de Qui-quadrado: p=0,003
Gráfico 3: Distribuição dos casos de NIC1 com razão de p16INK4a maior ou igual (coluna em
vermelho) e menor (coluna em azul) que o ponto de corte (0,396) nos três grupos com diferente evolução.
Pelos resultados, verificou-se diferença significativa entre os três grupos para a razão de p16INK4a (maior frequência de casos com razão de p16INK4a
≥ 0,396 nos casos que evoluíram com progressão para NIC 2 ou 3 e maior frequência de casos com razão de p16INK4a< 0,396 nos casos que regrediram).
Considerando progressão para NIC2 ou 3, os valores de sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo para expressão de p16INK4a foram 54,55%, 75%, 52,17% e 76,74%, respectivamente.
4.2. Expressão imuno-histoquímica de CK7
4.2.1. Análise qualitativa
A figura 8, a seguir, exemplifica a expressão imuno-histoquímica de CK7 em casos considerados positivo e negativo, respectivamente.
Figura 8: Caso de NIC1: (A) Com expressão imuno-histoquímica de CK7 no citoplasma. (B) Ausência de expressão de CK7.
A distribuição da expressão de CK7 nos três grupos está apresentada na Tabela 4, a seguir:
Tabela 4: Comparação da expressão de CK7 nos casos de NIC1, na primeira biopsia, entre os 3 grupos. Progressão para NIC 2 ou 3 Regressão Permanência de NIC 1 Positividade para CK7: n (%) n=12 (54,5%) n=8 (42,1%) n=10 (40%) Teste de Qui-quadrado: p=0,571
Embora também sem diferença significativa (p=0,571), os casos de NIC1 com expressão para CK7 estiveram mais relacionados à progressão para NIC2 ou 3, tendo sido observada uma porcentagem de casos positivos para CK7 maior nos casos de NIC1 que progrediram para NIC2 ou 3 (54,5%), em relação aos casos que mantiveram o diagnóstico e que regrediram espontaneamente (40% e 42,11%, respectivamente).
4.2.2. Análise quantitativa
A Figura 9 exemplifica a análise quantitativa (histomorfométrica) da expressão de CK7, com cálculo da razão do número de células positivas para este marcador, por campo de epitélio com NIC1, através do software
IMAGEJ®:
Figura 9: Contagem, na área de NIC1, do número de células positivas para CK7 (em vermelho)
e do número total de células, por campo de médio aumento (20x), com uso do software IMAGEJ®.
A média geral da razão de CK7 foi 0,15. A média da razão de células positivas para CK7 nos casos que não progrediram foi 0,11; enquanto que naqueles com progressão para NIC2 ou 3 foi 0,25, entretanto, embora com maior frequência, não houve diferença estatística significativa (p= 0,055 – teste de Mann-Whitney).
O gráfico 4, a seguir, mostra a distribuição dos valores de razão de CK7 entre os 3 grupos:
Gráfico 4. Box-and-whiskers-plots com a distribuição dos valores da razão de CK7 entre os
pacientes que progrediram para NIC 2 ou 3, permaneceram com NIC 1 ou regressão (p=0,055).
Em relação à análise histomorfométrica, a Figura 10 apresenta os resultados da análise da curva ROC (Receiver Operating Characteristic curve) para avaliar um ponto de corte para a razão de CK7 como preditor de progressão para NIC 2 ou 3.
Figura 10: Análise da curva ROC para razão de CK7, com cálculo do ponto de corte para este marcador, como preditor de progressão para NIC 2 ou 3 (Área sob a curva: 0,632; P=0,082 IC95%: (0,479; 0,786) Ponto de Corte: razão CK7 ≥ 0,345)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Regressão Permanência Progressão Grupos R az ão c k7
A análise da curva ROC mostrou um ponto de corte para a razão de células que expressaram CK7 ≥ 0,345 como preditor de progressão de lesão (Figura 10).
A Tabela 5 e o gráfico 4 apresentam a comparação da razão de células positivas para CK7 de acordo com o ponto de corte da curva ROC entre os três grupos:
Tabela 5: Distribuição da razão de CK7 entre os três grupos, de acordo com o ponto de corte relacionado à progressão para NIC2 ou 3, calculado pela da análise da curva ROC. Ponto de corte (curva ROC) Progressão para NIC2 ou 3 Permanência de NIC1 Regressão <0,345 ≥0,345 n=13 (59,9%) n=9 (40,9%) n=17 (89,47%) n=3 (10,5%) n=22 (88%) n=3 (12%) Teste de Qui-quadrado: p=0,030 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Permanência Regressão Progressão R az ão c k7 (% ) Grupos >=0.345 <0.345
Gráfico 5: Distribuição dos casos de NIC1 com razão de CK7 maior ou igual (coluna em
