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ADRIANA CAROLINA MARQUES FERREIRA
SOLUÇÃO SALINA HIPERTÔNICA É FRRAMENTA ÚTIL PARA A
IDENTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA EM CULTURAS DAS VIAS
AERÍFERAS NA FIBROSE CÍSTICA?
CAMPINAS 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas
ADRIANA CAROLINA MARQUES FERREIRA
SOLUÇÃO SALINA HIPERTÔNICA É FERRAMENTA ÚTIL PARA A IDENTIFICAÇÃO MICROBIOLÓGICA EM CULTURAS DAS VIAS AERÍFERAS NA FIBROSE CÍSTICA?
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de concentração Saúde da Criança e do Adolescente.
Orientador: José Dirceu Ribeiro Co-orientador: Carlos Emílio Levy
CAMPINAS 2014
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA ADRIANA CAROLINA MARQUES FERREIRA E ORIENTADA PELO PROF. DR. JOSÉ DIRCEU RIBEIRO
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RESUMO
Introdução: A eficiente detecção de microrganismos nas vias aeríferas de pacientes com fibrose cística (FC) possibilita antibioticoterapia dirigida, melhor manejo ambulatorial e promove maior preservação da função pulmonar. Métodos para melhorar a identificação bacteriana estão em estudo, porém, não fica claro na literatura o papel da solução salina hipertônica (SSH) no auxílio da detecção desses microrganismos. Objetivo: Verificar a eficácia da SSH a 7% na identificação de microorganismos nas secreções das vias aeríferas em pacientes com FC e comparar com variáveis clinicas e laboratoriais.
Método: Incluídos 64 pacientes com FC, com coleta de escarro ou swab de secreção de orofaringe pré e após inalação com SSH-7%. A identificação bacteriana foi realizada pelas técnicas de rotina no laboratório de Microbiologia.
Resultados: Dos pacientes, 34(53,1%) eram do sexo feminino, com idade média de 12,11(±5,12). Do total de culturas microbiológicas realizadas (704 antes e após a SSH-7%), não houve diferença estatisticamente significante entre os resultados positivos, sendo 101 antes e 118 depois (OR=0,8319, IC=0,622-1,111). O mesmo foi observado para o número de espécies identificadas, sendo inicialmente identificados 7 microrganismos diferentes, e após a SSH-7% 11(p=0,1895), contudo houve aumento na identificação de 4(36,36%) espécies diferentes. Na análise semi-quantitativa e tipo de material (escarro ou swab) não houve diferença (p>0,05). No total foram obtidos após a SSH-7%, 25 resultados positivos que eram negativos e o contrário ocorreu para 9 pacientes. Não houve efeitos colaterais devido a SSH-7%.Conclusão: Apesar de não ocorrer diferença estatisticamente significativa, pode-se observar maior número de resultados positivos,detecção de maior número de patógenos e de espécies diferentes de microrganismos e aumento de amostras de escarro no lugar do swab após o uso da SSH-7%.
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Palavras chaves: Fibrose Cística. Microorganismos. Solução Salina Hipertônica. Diagnóstico.
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ABSTRACT
Introduction: The efficient detection of microorganisms in airways of cystic fibrosis (CF) patients allows targeted antibiotic therapy, better outpatient care and, consecutively, lung function preservation. Methods to improve bacteria identification have been studied. The role of hypertonic saline solution (HSS) in sputum collection, for bacteria identification, is not clear yet.
Aim: Verify the effectiveness of HSS in the identification of microorganisms in airway secretions in patients and compare with clinical and laboratory variables.
Methods: The study enrolled 64 CF patients, with a sputum sample or swab before and after inhalation with HSS 7%. Bacterial identification was performed by routine laboratory techniques in microbiology.
Results: Of the 64 patients, female: 34 (53.1%); mean age: 12.11 (±5.12) years. Of the total microbiological analysis performed (704 before and after of 7% HSS), there was no difference between positive results between the positive results, being, 101 before and 118 after (OR= 0.832, CI= 0.622-1.111). The same was observed for the number of microorganisms species, being initially identified 7 species and after, 11 species (p= 0.1895), an increase of four different species (36.36%). In semi-quantitative analysis, there was no difference (p> 0.05). After of 7% HSS, 25 new positive results were observed and the opposite occurred in nine patients. No collateral effects were observed due to 7% HSS. Conclusion: Although statistically significant difference does not occur, the 7% HSS allowed a greater number of microbiological identification in sputum from airways, as in absolute number and as different microorganisms’ species.
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SUMÁRIO
Resumo ... vii Abstract ... ix Dedicatória ... xv Agradecimentos...xvii Epígrafe... ..xixLista de Figuras ... xxi
Lista de Tabelas...xxiii
Lista de Abreviaturas, Siglas e Notações...xxv
Introdução...1
1. Fibrose Cística ... 1
1.2 Epidemiologia ... 2
1.3 Bases Genéticas da Doença ... 2
1.4 Manifestações Clínicas ... 7
1.5 Fisiopatologia da doença pulmonar ... 8
1.6 Infecção Pulmonar em Pacientes com Fibrose Cística ... 12
1.7 Correlação entre a microbiologia das vias aeríferas superiores e inferiores...16
2. Solução Salina Hipertônica ... 17
2.1 Segurança do uso da SSH ... 17
2.2 Indução de escarro e Higiene Brônquica ... 20
2.3 Importância da SSH no diagnóstico microbiológico na FC ... 22
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2.5 SSH na melhora da função pulmonar ... 25
2.6 SSH auxiliando na redução das exacerbações pulmonares ... 26
Objetivos ... 29 3. OBJETIVOS GERAIS ... 29 3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 29 Casuísticas e Métodos ... 31 4 Delineamento do Estudo... 31 4.1 População do Estudo ... 32 4.2 Critérios de Inclusão ... 33 4.3 Critérios de Exclusão ... 33
5 Processo de Diagnóstico da Fibrose Cística ... 33
5.1 Análise Genética ... 33
5.2 Teste de sódio-cloro no suor...34
6 Avaliação microbiológica do trato respiratório ... 34
6.1 Coleta de amostras ... 34
6.2 Escarro ... 35
6.3 Secreção de Orofaringe ... 35
7 Cultura ... 35
7.1 Incubação e avaliação do crescimento ... 36
7.2 Identificação dos microorganismos ... 37
7.2.1 Identificação fenotípica ... 37
7.2.2 Identificação fenotípica – Sistema Automatizado Vitek2 ... 40
7.2.2.1 Preparação do inoculo ... 41
xiii 9 Resultados ... 47 10 Discussão ... 59 11 Conclusão ... 65 12 Referências Bibliográficas ... 67 13 Anexos...77
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Dedico este trabalho aos meus pais Sônia e Aparecido, por terem me incentivado e acreditado em mim em todos os instantes.
Ao meu esposo Jonathan, pela compreensão das minhas ausências e por toda a colaboração desprendida.
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Agradecimentos
Ao Prof. Dr. José Dirceu Ribeiro por permitir o meu ingresso no Programa de Pós Graduação, pelo seu profissionalismo, por todos os momentos que trilhou comigo esse caminho não me deixando desistir, por sua participação, pela sua humildade e desprendimento em passar todo seu conhecimento sobre a Fibrose Cística, além de estar sempre à disposição para ensinar, coloco meu eterno agradecimento.
Ao Prof. Dr. Carlos Emílio Levy, por todo o seu desprendimento em ajudar, por todo o conhecimento, paciência, auxílio e companheirismo durante toda a pesquisa, por ajudar-me a conciliar os momentos difíceis com muita calma e ternura, além de todo seu profissionalismo e humildade, meu profundo agradecimento.
À Milena Antonelli Cohen, que coletou os dados iniciais do trabalho e na sua profunda humildade os cedeu para que concluísse a pesquisa.
Ao Fernando Marson, por toda a sua perseverança, auxílio, ensinamentos, por me ensinar a importância da pesquisa, por me fazer crer nos benefícios que podemos trazer aos pacientes com a pesquisa, por sua amizade, meu agradecimento.
À Maria Angela Gonçalves Ribeiro, por estar presente em todos os momentos incentivando, ensinando, não se importando em dividir o conhecimento, meu muito obrigada.
À Denise da Silva Abonício, por repassar seu conhecimento, por permitir minha entrada no Laboratório de Microbiologia todas as vezes que tive dúvidas, por realizar as análises com toda atenção e cuidado.
A todos que me incentivaram, apoiaram e estiveram presentes durante esse período acadêmico e acreditaram em mim, em especial à Celize Cruz Bresciane Almeida e ao Dr. Armando Almeida Junior.
xix
“Que os vossos esforços desafiem as impossibilidades, lembrai-vos de que as grandes coisas do homem foram conquistadas do que parecia impossível.”
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Perspectiva de sobrevida dos pacientes com FC de 1987 a 2011...1
Figura 2: Alteração no Cromossomo 7...3
Figura 3: Classes de mutações da Fibrose Cística...6
Figura 4: Apresentação epitélio normal, com Fibrose Cística e com Fibrose Cística e uso de Solução Salina Hipertônica...9
Figura 5: Epitélio pulmonar com e sem o uso da SSH...10
Figura 6: Prevalência dos patógenos de acordo com a idade...15
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Mutações no gene CFTR dos pacientes com Fibrose Cística...44
Tabela 2. Bactérias isoladas na cultura de escarro e swab pré e após o uso de salina hipertônica a 7% em pacientes com fibrose cística...48 Tabela 3. Comparação semi-quantitativa para as bactérias isoladas na cultura de escarro e swab pré e pós o uso de salina hipertônica a 7% em pacientes com fibrose cística...50
Tabela 4. Pacientes com fibrose cística com resultado positivo antes e após o uso da salina hipertônica a 7%, e aumento em número de pacientes, bem como em porcentagem após o uso da salina...52
Tabela 5. Associação das variáveis: sexo, etnia e mutações no gene CFTR, com os valores do numero de isolados para as bactérias analisadas perante os diferentes grupos possíveis: mesmo resultado, positividade e negatividade...53 Tabela 6. Associação das variáveis: escores, espirometria, índice de massa corpórea e idade, com os valores do numero de isolados para as bactérias analisadas perante os diferentes grupos possíveis: mesmo resultado, positividade e negatividade...54
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
FC = Fibrose Cística
CFTR = cystic fibrosis transmembrane regulator cAMP = Adenosina monofosfato cíclico
DNA = ácido desoxirribonucleico RNA = ácido ribonucleico
ATP = adenosina trifosfato ORCC = canal de cloro ENaC- = canal de sódio NA+ = sódio
O2 = oxigênio
% = porcentagem
S.aureus = Staphylococcus aureus H. influenzae = Haemophylus influenzae P.aeruginosa = Pseudomonas aeruginosa
Complexo B. cepacia = Complexo Burkholderia cepacia NO = óxido nítrico
xxvi PO2 = Pressão de oxigênio
SSH = Solução Salina Hipertônica IL-6 = Interleucina 6
IL-8 = Interleucina 8 IL- 10 = Interleucina 10 NaCL= cloreto de sódio Log = logarítimo
FEV1 = volume expiratório forçado em 1 segundo
IMC = Índice de Massa Corpórea ml = mililitro
mg = miligrama
mEq/L = miliequivalente por litro min = minutos
kg = quilograma
L/min = litros por minuto HC = Hospital de Clínicas AS = Ágar Sangue
ACHOC = Ágar Chocolate MC = Ágar MacConkey
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BCSA = Burkholderia Cepacia Seletive Agar MAN = Ágar Manitol
Cl- = cloro
CO2 = Gás carbônico
pH = potencial hidrogeniônico
F508del = deleção do aminoácido fenilalanina na posição 508 N1303K = mutação no gene da proteína CFTR
W1282X = mutação no gene da proteína CFTR G85E = mutação no gene da proteína CFTR G91R = mutação no gene da proteína CFTR FCM = Faculdade de Ciências Médicas
Unicamp = Universidade Estadual de Campinas SK = Shwachman & Kulczycki
EB= Escore de Bhalla
FEF25-75% = fluxo expiratório forçado entre 25% e 75%
VEF1 = volume expiratório em 1 segundo
IC = Intervalo de confiança OR = odds ratio
xxviii MI = mutação identificada no gene CFTR MNI = mutação não identificada no gene CFTR
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INTRODUÇÃO
1. Fibrose Cística
A Fibrose Cística (FC) foi descrita pela primeira vez na década de 1930 por afetar crianças e levá-las à morte nos primeiros anos de vida. [Maya,2003; Ribeiro,2002] Devido aos avanços nos estudos em genética, imunologia, biologia molecular, desenvolvimento dos antibióticos e dos processos nutricionais a sobrevida desses indivíduos tem se tornado cada vez maior. [Maya, 2003]
Figura 1: Perspectiva de sobrevida dos pacientes com FC de 1987 a 2011. Fonte: US CFF Registry.
Fibrose Cística é uma doença genética complexa, autossômica recessiva que apresenta ampla variabilidade clínica principalmente na doença pulmonar, resultante de alterações do fator genético CFTR (cystic fibrosis transmembrane condutance) genes modificadores e ao ambiente. A alteração do fator genético afetará a função da CFTR proteína, que é a proteína responsável pela absorção de sódio através do canal, e pela cAMP, canal responsável pela excreção de cloro. [,Schwiebert, 1999; Zielenski,2000; Drumm, 2012; Knowles, 2012; Dorfman, 2012; Lima, 2012; Marson-ADRB2,2012; Marson-ACE,2012; Marson-TCFL, 2012; Marson-COX-2,2013;
24 28 32 36 40 24 28 32 36 40 1987-1991 1992-1996 1997-2001 2002-2006 2007-2011
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Mason-ADRA2A, 2013; Gould, 2010] Esta alteração iônica trará complicações pulmonares incluindo infecções, inflamações, obstruções e danos pulmonares severos; sendo o maior risco o paciente apresentar falência respiratória. [Rosenfeld, 2012; Morales, 1999] Também poderão apresentar insuficiência hepática com má digestão e absorção, levando a uma desnutrição, infertilidade masculina, diminuição da fertilidade feminina, obstrução intestinal e sinusite crônica. Seus sintomas aparecerão logo na primeira infância. [Morales, 1999]
1.2 Epidemiologia
Fibrose Cística é uma das desordens autossômicas mais comumente encontrada entre os caucasianos e descendentes de europeus, encontrada também, porém em menor quantidade em africanos e asiáticos, apresentando uma taxa de 1 para cada 2.500 nascidos vivos na Europa, no Brasil estima-se cerca de 1 para cada 10.000 nascidos vivos Hoje, estima-se que exista no mundo cerca de 80.000 pessoas portadoras da doença. [Cohen-Cymberknoh, 2011] [Lyczak,2002; Gibson, 2003; Dentice, 2012; Michon, 2014]
1.3 Bases Genéticas da Doença
Trata-se de uma doença genética autossômica recessiva a qual o gene da FC encontra-se no braço longo do cromossomo 7 no lócus q31, formada por 250 quilobases de DNA com 27 exons e codifica um RNA mensageiro de 6,5 quilobases que transcreve a proteína CFTR possuidora de 1.480 aminoácidos. [Rowe,2005; Ribeiro,2002; Gibson,2003] Essa proteína é sintetizada no núcleo da célula onde
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sofrerá fosforização e glicosilação pelas organelas citoplasmáticas. [Rowe,2005; Ribeiro,2002; Schwiebert, 1999]
Figura 2: Cromossomo 7, CFTR e suas relações com a membrana. Fonte: Rowe, 2005
Hoje já foram descritas 2.000 mutações sendo uma doença que leva a uma alteração da proteína CFTR que além de ser um regulador dos canais de cloro é também uma inibidora do transporte de sódio através do canal respectivo, responsável pelos canais de ATP, transporte intracelular de vesícula e inibição endógena dos canais de cloro e cálcio ativo; também está envolvida com a troca de bicarbonato-cloro.
A primeira mutação encontrada e mais comumente diagnosticada é a F508del. [Rowe,2005] Nesta mutação há a exclusão de três pares de bases que
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codificam a fenilalanina da posição 508 da proteína CFTR. Outras mutações causando alterações clínicas severas também podem ser encontradas, como a N1303K, W1282X, G85E e G91R são alguns exemplos. (Rowe,2005; Gibson,2003)
A mutação F508del é responsável por 70% dos alelos da FC em pessoas da raça branca. Alguns estudos sugerem que, devem-se ao fato desses indivíduos terem tido uma maior resistência à diarréia causada pela cólera, ou até mesmo apresentarem uma maior proteção contra a asma brônquica, porém nada com grande comprovação cientifica. [Gibson,2003; Zielenski, 2000]
Para facilitar a categorização, as alterações foram divididas em 6 classes de desregulação da secreção de cloro. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
Classe I A - há uma ausência total da CFTR devido a uma terminação precoce do RNA (códon), devido a uma falta da biossíntese. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
Classe I B- há uma ausência total da CFTR devido a um erro na fase de leitura por uma falha na biossíntese, levando a uma adição, instabilidade, truncamento ou deleção ( não expressão da proteína) de um ou até dois pares de base. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
Classe II- a proteína CFTR é sintetizada, porém sofre uma degradação prematura por não passar pelo processo de maturação e migração para a membrana, é normalmente uma mutação missense. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
Classe III- a proteína CFTR é mal regulada por não responder a estimulação do cAMP pelo ATP, levando a uma alteração na regulação. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
Classe IV- a condução e a seletividade iônica através do canal de cloro são alteradas. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
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Classe V – devido ao erro na síntese da proteína CFTR, há uma diminuição na quantidade de canais de cloro. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
Classe VI - a síntese da proteína CFTR é reduzida afetando a sua estabilidade. [Reeves, 2012; Zielenski, 2000]
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1.4 Manifestações Clínicas
Por se tratar de uma doença sistêmica, vários órgãos poderão ser afetados pela alteração da CFTR. No pâncreas poderá ocorrer obstrução dos ductos por um espessamento da secreção pancreática impedindo a liberação de enzimas no duodeno gerando insuficiência, o que resultará em fibrose crônica e até mesmo uma substituição gordurosa da glândula pancreática e consequentemente a um quadro de mal nutrição.[Zielenski,2000,Cohen-Cymberknoh, 2011,Ribeiro,2002, Morales, 1999] A insuficiência pancreática está presente em 75% dos pacientes ao nascer, de 80 a 85% dos pacientes no final do primeiro ano de vida e 90% dos pacientes adultos. [Ribeiro, 2002]
Uma das manifestações que também pode ser encontrada em pacientes com FC é a diabetes. Cerca de 40% dos pacientes adultos, 25% dos adolescentes e 9% das crianças podem apresentar diabetes e está relacionada com o rápido declínio da função pulmonar. Assim como o refluxo gastroesofágico que está presente em 6,4 a 20% dos casos, pode ser agravado em caso de tosse crônica, hiperinsuflação pulmonar entre outros fatores. [Ribeiro, 2002]
Pode-se encontrar em 10% dos pacientes com FC uma obstrução intestinal na porção terminal do íleo por um espessamento do mecônio, o iíleo meconial, presente de 15 a 20% dos casos de fibrose cística. [Rowe, 2005; Zielenski, 2000; Ribeiro, 2002] Em alguns pacientes podemos encontrar uma obstrução das vias biliares diminuindo o seu fluxo normal devido a um aumento da espessura dos sais biliares levando a danos hepáticos severos, chegando até mesmo a uma cirrose hepática. [Rowe, 2005; Zielenski,2000]
Homens nascidos com FC frequentemente são inférteis devido a obstrução dos canais deferentes, levando a uma involução dos ductos de wolffian e outras estruturas associadas causando azoospermia, porém apresentam potencia sexual e
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espermatogênese preservadas . [Rowe,2005] Também podemos encontrar pacientes do sexo feminino com diminuição da fertilidade. [Morales, 1999]
Uma das mais severas manifestações na FC é a pulmonar, a qual caracteriza-se pela retenção de muco, favorecendo assim processos inflamatórios e infecciosos, consequentemente danos pulmonares e como ultimo estágio falência respiratória. [Subbarao, 2007]
1.5 Fisiopatologia da doença pulmonar
Para um bom funcionamento das vias aeríferas é necessário um adequado volume de líquido na superfície periciliar, para que assim uma boa higiene brônquica possa ser realizada. O volume deste líquido é regulado pelo transporte de íons realizado através do epitélio pela proteína CFTR, modulador da absorção de sódio e secreção de cloro. (Elkins 2006,Ekins, 2006; Rowe, 2005]
A CFTR dos pacientes com FC não realiza uma perfeita secreção de cloro e inibição de sódio, causando uma alteração dos íons, e consequentemente, de água. [Elkins, 2006; Rosenfeld, 2012; Elkins, 2006]
Ocorrerá uma limitação em secretar Cl- através do canal de cloro (ORCC) regulado pela cAMP e ao mesmo tempo um excesso de absorção de Na+ através do ENaC-, levando a uma diminuição da água existente ao redor dos cílios por um excesso de absorção de água pelas células, e como consequência uma queda do transporte do muco pelos mesmos devido a uma desidratação da superfície aérea. [Henke 2007; Elkins,2006, 5,Dentice, 2012; Elkins, 2006; Barboza, 2010; Reeves, 2012; Rowe, 2005; Boucher, 2007] Uma das mais importantes variáveis para um eficiente clearance mucociliar é a perfeita hidratação da secreção. [Boucher,2007]
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Figura 4: Modelo de infecção pela Pseudomonas aeruginosa. a-) epitélio normal, com
batimento periciliar e presença de muco normais. b-) epitélio de paciente com FC apresentando ausência de transporte de muco e consequentemente seu acumulo sobre os cílios; influxo de Na+ e Cl- com consequente influxo de água para equilíbrio hidroeletrolítico, gerando desidratação no muco. c-) acúmulo de muco e diminuição dos valores de PO2. d-) Infecção pela P. aeruginosa através de sua atividade
flagelar. e-) P.aeruginosa adaptada a hipóxia vai criando colônias. f-) Macrocôlonias resistentes aos sistemas de defesas, incluindo os neutrófilos, formando massas mucopurulentas. Fonte: Boucher, 2004.
O muco possui uma consistência de 98% de água e somente 1% de sal e 1% de macromoléculas. Quando há uma diminuição na quantidade de água do muco, este
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se tornará um material adesivo e com muita viscoelasticidade e consequentemente uma maior aderência à parede das vias aeríferas. [Boucher,2007] Este muco também torna-se mais adesivo devido a um enriquecimento do muco dos pacientes com FC de polieletrólitos aniônicos incluindo DNA produzidos pela colonização de bactérias e pela lise de células inflamatórias. [Reeves,2012]
A diminuição do transporte do muco para as vias aeríferas superiores leva a uma pré-disposição ao acúmulo de secreção em vias aeríferas inferiores, formando placas aderidas às paredes gerando obstrução das vias aeríferas, além de um meio propício ao desenvolvimento de processos inflamatórios recorrentes e infecções bacterianas, aumentando ainda mais a produção de secreção formando um ciclo- vicioso. [Henke,2010; Rosenfeld, 2011; Elkins, 2006, 11, Barboza, 2011;Boucher, 2007]
Figura 5: a-) epitélio sem alteração; b-) alteração dos canais de cloro causando retenção de muco e “achatamento” dos cílios; c-) uso da solução salina hipertônica promovendo uma hidratação do liquido periciliar. Fonte: Reeves, 2012
A colonização por agentes oportunistas, dentre eles, bactérias e fungos, é marcador evolutivo da doença. Hoje cerca de 80 a 95% dos pacientes com FC apresentam doença pulmonar causada por infecções bacterianas crônicas e processos inflamatórios nas vias aeríferas. [ Scheicher, 2003; Ho, 2004, Maya, 2004; Bilton, 2011; Hansen, 2012] Neste contexto, quanto mais precoce e precisa for a identificação do
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microorganismo, melhor será o tratamento e o ganho de qualidade e expectativa de vida.
Cerca de 90% das causas de morte em pacientes com Fibrose Cística estão relacionadas com a colonização bacteriana, infecção pulmonar crônica, gerando uma sequência de episódios de pneumonias, atelectasias, bronquiectasias, bronquioloectasias, hipertensão pulmonar, hipertrofia de ventrículo direito, falência cardiorrespiratória e morte. [Boucher, 2007, Pezzulo, 2011; Morales, 1999; Gibson, 2003]
A infecção das vias aeríferas resulta em migração de grande quantidade de neutrófilos, que quando degenerados uma grande quantidade de proteases, elastases e outras enzimas proteolíticas são liberadas, levando a um dano no epitélio, e consequentemente resulta em um clearance mucociliar anormal. (Henke,2007; Elkins, 2006; Rosenfeld, 2012; Barboza, 2010; Boucher, 2007] Os neutrófilos também possuem uma grande quantidade de DNA nuclear e actina do citoesqueleto, e ambos aumentam a viscosidade do muco. [Elkins, 2006] Também são encontrados nas vias aeríferas desses pacientes, grande quantidade de interleucina-8, interleucina-6, fator de necrose tumoral alfa, leucotrina B4. [Rowe, 2005]
O muco do paciente com fibrose cística é muito rico em elementos essenciais para a sobrevivência da bactéria, fazendo com que ocorra uma rápida proliferação por todo o campo pulmonar. [Boucher. 2007]
Novos estudos realizados investigaram a hipótese de que a combinação da baixa quantidade de O2 no epitélio de um paciente com FC, com a longa distância existente para a difusão de O2 causada pelas placas de muco formadas nas superfícies aeríferas, geraria hipóxia e até mesmo anóxia do muco dos espaços interluminais. Esse meio favoreceria o crescimento de bactérias anaeróbias, principalmente a Pseudomonas aeruginosa, que cresce com muita facilidade em meios com baixa quantidade de O2, o que poderia explicar a discrepância da baixa resposta clínica desses pacientes à antibioticoterapia. [Boucher, 2007]
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1.6 Infecção Pulmonar em Pacientes com Fibrose Cística
Hoje, cerca de 80 a 95% dos pacientes com FC resultam em falência respiratória causada por infecções bacterianas crônicas e processos inflamatórios nas vias aeríferas. [Lyczak, 2002]
Todos os bebês com FC nascem com os pulmões estéreis, porém com os passar do tempo com acúmulo de muco, inalação frequente de microorganismos e a deficiência de higiene brônquica, faz com que frequentemente esses pacientes sejam colonizados e/ou infectados logo na primeira infância com microorganismos como Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, que tratam-se de microorganismos benignos quando encontrados em vias aeríferas superiores ou no próprio nariz, porém quando encontram-se em vias aeríferas inferiores podem levar a um dano epitelial e criar ambientes propícios a uma infecção com P. aeruginosa. [Lyczak, 2002; Boucher, 2007; Taylor, 2006; Logan, 2010] Portanto quanto mais cedo for feita a identificação do microorganismo, mais rápido pode ser feito o tratamento adequado. [Ho,2004]
Normalmente os pacientes com FC adquirem o S. aureus ( 42%) e o H. influenzae (19%) como já dito logo na primeira infância, já a P. aeruginosa é adquirida mais tardiamente , quando esses pacientes encontram-se adultos jovens, com uma prevalência de 80%. [Barth, 2005; Gibson,2003; Lyczak,2002; Logan, 2010] A idade da aquisição da P. aeruginosa vai determinar o prognóstico de vida desse paciente, que normalmente adquire a forma não mucóide e depois a mucóide. Longos períodos de colonização com a P.aeruginosa geralmente resultam em infecções com 1 ou 2 genótipos. As infecções crônicas estão sempre associadas com declínio da função pulmonar e aumento da morbidade e mortalidade do indivíduo [Logan, 2010; Aanaes, 2013]
Infecções crônicas com P. aeruginosa podem resultar em dificuldade no tratamento com antibióticos causados por aumento da resistência aos mesmos, assim
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como uma queda da função pulmonar e aumento das hospitalizações. [Ho, 2004] Estudos mostram que os valores de PO2 do muco dos pacientes com FC apresentam
valores sempre muito baixos. A P. aeruginosa possui uma enorme capacidade de crescimento em ambientes com valores de O2 baixos por se tratar de uma bactéria
anaeróbica, o que dificulta e muito a resposta clínica dos pacientes com FC aos antibióticos, por possuírem um ambiente propicio ao seu desenvolvimento. [Boucher, 2007; Rogers,2009]
Algumas hipóteses foram levantadas por GIBSON, 2003 para auxiliar na explicação da associação da P. aeruginosa com os pulmões de pacientes com FC. A primeira hipótese diz respeito a uma afinidade da bactéria com os receptores nas vias aeríferas dos pacientes com FC. Um estudo mostrou que as células epiteliais desses pacientes possuem uma maior aderência à bactéria P. aeruginosa do que em células do grupo controle, sendo o grau de aderência muito maior em raspados nasais de pacientes F508del homozigotos, comparados com os pacientes heterozigotos ou com outras mutações.
Uma segunda hipótese se deve a CFTR servir como um receptor para a P. aeruginosa, fazendo uma pseudo -ligação nas vias aeríferas para posteriormente realizar uma fagocitose e liberação por descamação, acreditando assim que este seja o mecanismo inicial para a infecção endobronquial. [Gibson,2003]
Uma terceira hipótese seria imunidade nata do indivíduo as respostas de defesa com uma persistência de infecções bacterianas. Células epiteliais secretam peptídeos e proteínas que matam um largo espectro de bactérias e podem até mesmo modular a resposta inflamatória do hospedeiro. Não existe nenhuma evidencia clara de que em pacientes com FC haja um defeito na produção desses peptídeos e dessas proteínas, porém alguns relatos sugerem a diminuição da concentração de proteína mannose-binding lectin que trata-se de uma proteína responsável pela auto-imunidade do individuo, e os pacientes que possuem diminuição da concentração dessa proteína com FC podem apresentar queda da função pulmonar e consequentemente da
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sobrevida, desde que sejam colonizados por P. aeruginosa e Complexo B. cepacia.[Gibson, 2003]
Sabe-se hoje que o oxido nítrico (NO) possui uma ação antibacteriana inespecífica nas vias aeríferas. O fato da produção do NO encontrar-se diminuído nos pacientes com FC, devido a uma atividade reduzida da NOS-2 (nitric oxide synthase), enzima responsável pela sua produção, compromete assim a habilidade do individuo de eliminar bactérias, promovendo assim um meio propício a infecções. [Barth, 2005]
Sabemos que nas ultimas décadas, a antibioticoterapia tem avançado muito, melhorando assim o prognóstico dos pacientes com FC. S. aureus e H. influenza são bactérias consideradas patogênicas que aparecem normalmente na primeira infância. O S. aureus gera um processo inflamatório crônico facilitando assim o aparecimento da P.aeruginosa. Este aparecimento também pode estar relacionado com o uso de antibióticos para combater o S. aureus, porém estudos ainda precisam ser realizados para comprovar este dado. [Lyczak,2002, Saiman, 2003]
A P. aeruginosa é comumente encontrada em ambientes domésticos incluindo as plantas, na água ou superfícies úmida, especialmente mornas, contendo material orgânico. As contaminações cruzadas entre pacientes colonizados cronicamente também podem ocorrer durante um evento social, provavelmente ocorrem durante a tosse através de aerosóis. [Cohen-Cymberknh, 2011]
O Complexo B. cepacia também afeta cerca de 3-4% dos pacientes com FC e possui uma alta habilidade em realizar infecções cruzadas e causar a Síndrome Cepacia, caracterizada por um repentino declínio clínico, deterioração da pulmonar, bacteremia, pneumonia necrotizante, leucocitose e alta mortalidade. [Hansen, 2010]
Recentemente o aparecimento de novos patógenos em pacientes com FC tem chamado a atenção da Microbiologia como a Stenotrophomonas maltophilia, que trata-se de uma bactéria gram-negativa não fermentadora e tem sido isolada mais frequentemente em infecções nosocomiais em pacientes sem a FC. Acromobacter
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xylosidans, bactéria gram-negativa, também tem sido encontrada em cerca de 7% dos pacientes com FC, porém é mais frequente em pacientes imunodeprimidos sem FC. Estudos recentes tem mostrado que paciente com A. xylosidans apresentam um mais rápido declínio da função pulmonar comparados com pacientes sem essa bactéria, inclusive a comparando com o declínio causado pela P.aeruginosa [Barth, 2005, Cohen-Cymberknh, 2011, Hansen, 2010]
Aspergillus fumigatus trata-se de um fungo frequentemente encontrado nas vias respiratórias de pacientes com FC, podendo levar a uma grande variedade clínica desde uma asma alérgica a uma aspergilose broncopulmoar., porém ainda somente as infecções por P. aeruginosa e B. cepacia ainda estão relacionadas ao mau prognóstico devido a um acelerado declínio da função pulmonar. [Barth, 2005, Cohen-Cymberknh, 2011, Hansen, 2010]
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Figura 6: Prevalência dos patógenos de acordo com a idade. Fonte: Simmonds NJ. Cystic
fibrosis in the 21st century. Respiratory Medicine 2010;24:85-962
1.7 Correlação entre a microbiologia das vias aeríferas
superiores e inferiores
A coleta de amostra de escarro tem sido muito usada como diagnóstico microbiológico de vias aeríferas inferiores em pacientes com a FC mais avançada e/ou capazes de expectorarem, o que diversos estudos já vêm mostrando a correlação bacteriológica entre o escarro e as vias aeríferas inferiores. [Taylor, 2006]
Também muito frequentemente tem-se usado a cultura de orofaringe para realização de diagnósticos microbiológicos em crianças muito novas ou até mesmo em crianças de mais idade, porém, não expectoradoras. Este tipo de coleta microbiológica realizada de forma não invasiva, faz com que coletas de maior complexidade e custo sejam evitadas, como a broncoscopia, que trata-se de um procedimento invasivo levando o paciente a certos riscos. [Elkins, 2006; Taylor, 2006]
Ramsey et al em 2001 comparou a cultura de orofaringe de 26 crianças não expectorantes ao seu próprio lavado broncoalveolar. Demonstrou-se que a cultura de orofaringe apresentou uma especificidade de 90% para S. aureus e P. aeruginosa e uma sensibilidade de 46% para P. aeruginosa e 77% para S. aureus
Assim também Rosenfeld et al em 1999 realizou em estudo prospectivo onde avaliou a cultura de orofaringe em relação ao lavado broncoalveolar de 141 crianças menores de 5 anos. Neste estudo percebeu-se que quando a cultura de orofaringe é negativo, o isolamento de nas vias aeríferas inferiores é pouco provável, porém quando
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essa for positiva, não se pode afirmar com tanta certeza que a P.aeruginosa estará presente nas vias aeríferas inferiores.
Taylor em 2006 realizou uma comparação entre amostras de aspiração de nasofaringe com swab de orofaringe em 47 pacientes entre 6 meses e 10 anos incapazes de expectorarem espontaneamente. Concluiu-se que a aspiração de nasofaringe não é garantia de melhor detecção de patógenos quando comparado com o swab de orofaringe.
2. Solução Salina Hipertônica
Os primeiros estudos com SSH nas vias aeríferas surgiram em 1981 com indução de escarro em pacientes infectados pelo vírus HIV para diagnóstico de pneumonia causada pela bactéria Pneumocystis carinii, e desde então diversos estudos tem sido realizados para verificar os seus benefícios que vão desde a higiene brônquica, melhora da função pulmonar, entre outros que serão descritos abaixo. [Scheicher, 2003 ;Kussek, 2006]
2.1 Segurança do uso da SSH
Salina Hipertônica é uma solução estéril oriunda de sal e água, administrada em forma de inalação normalmente em volumes que variam de 3 a 10 ml. [Sand, 2012] As concentrações de solução que podem ser usadas na inalação variam de 0,9% a 7%. Para concentrações hipertônicas que são definidas como aquelas que possuem uma concentração osmótica maior que a concentração fisiológica (0,9% NaCl), os valores podem alterar de 3% a 7% de concentração, podendo muitas vezes iniciar a inalação
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com valores baixos e finalizar com valores altos.[Reeves, 2012, Heijerman, 2009; Williams, 2010]
Os consensos padronizam as inalações por um período de 15 a 20 minutos. [Subbarao,2007; Ho, 2004] Inalações acima de 10% podem causar broncoespasmo, principalmente naqueles pacientes que apresentam hiperresponsividade brônquica. [Kussek,2006; Aitken,2003]
Possui a vantagem de não necessitar de colaboração do paciente, pois a inalação é realizada com o volume corrente habitual e não com volumes pulmonares maiores. [Kussek, 2006] A administração da SSH é feita em crianças menores através de máscaras faciais, entretanto quando a criança for maior ou intolerante ao uso da máscara facial, e possuir habilidade e entendimento poderá ser feita através de um bocal com uso de um clipe nasal. [Rand, 2012]
A SSH pode causar broncoconstrição em alguns pacientes, por motivos ainda desconhecidos, porém acredita-se que estejam envolvidos com a ativação de mastócitos das vias aeríferas. Sendo assim, os consensos recomendam o uso de broncodilatadores através de β2 agonistas para prevenir episódios de broncoconstrição, principalmente porque o quanto uma inalação com SSH pode causar de broncoconstrição é inestimável. A broncoconstrição execessiva, quando ocorre, normalmente apresenta-se após poucos minutos de inalação. Normalmente o Salbutamol é o broncodilatador escolhido em 200-400 µg em 2-4 puffs dosimetrados. Estudos mostraram que o uso de doses maiores de broncodilatadores não apresentam maior efetividade contra a broncoconstrição que pode ser causada pela SSH. [Paggiaro,2002]
Trata-se de uma técnica comprovadamente segura, não invasiva e com custos hospitalares baixos, principalmente se comparados com a broncoscopia. [Ho,2004; Suri, 2003]
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No que diz respeito à segurança da técnica, alguns estudos realizados mostraram não haver riscos aos pacientes com FC quando esses realizavam inalação com SSH, demonstrando assim ser uma técnica aceitável e segura. [Rosenfeld, 2011; De Boeck, 2000] Segundo Rosenfeld et al a inalação com 7% de SSH é um método seguro para crianças com FC com idade muito baixa, o que comprovou através de seu estudo multicêntrico.
A tosse é um sintoma muito comum apresentado pelos pacientes que realizam a inalação. Porém esse mecanismo também pode facilitar a retirada de secreção, pois promove um estresse no muco fazendo com que as suas placas se desloquem das paredes brônquicas, e assim sua saída se torna facilitada. [Elkins,2006; Reeves,2012]
Estudos de meta-análise mostraram que o uso regular da inalação com SSH pode provocar intolerância através da tosse em 3% dos pacientes e outros sintomas de intolerância em 8% dos pacientes. [Bye, 2007]
No estudo de Ho et al de 2004, onde 43 crianças realizaram inalação a 6% de SSH para verificação microbiológica, 2 crianças tiveram que ser excluídas da pesquisa por apresentarem vômito intenso após a inalação.
Alguns pacientes podem apresentar broncoconstrição após o uso de SSH, um dos sintomas mais comum a ser encontrado, mesmo naqueles pacientes que não apresentam junto com a FC histórico de asma, assim como opressão no tórax e desconforto faríngeo, porém apenas 8% dos pacientes apresentam intolerância à inalação. [Elkins, 2006Dentice, 2012, Rand, 2012; Furnari,2012]
Mesmo sabendo da sua segurança há um risco de causar broncoconstrição. Para minimizar esse risco aconselha-se um pré-tratamento com o uso de um medicamento beta 2 agonista (broncodilatador) . [Scheicher,2003,Elkins,2006,Ho, 2004]
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2.2 Indução de escarro e Higiene Brônquica
Outra empregabilidade da SSH está relacionada à indução do escarro. A indução do escarro com SSH é um método seguro, barato, com o mínimo desconforto ao paciente, principalmente àqueles que não possuem habilidade para expectoração, trazendo secreções de vias aeríferas centrais, apresentando assim diversas vantagens em relação a outras técnica como a broncoscopia que trata-se de um método invasivo, desconfortável, caro e necessário sedação, onde muitas vezes a secreção colhida pode misturar-se com o sangue de algum sangramento que possa ter ocorrido durante o procedimento, e assim contaminar a amostra. [Scheicher,2003; Elkins,2006,De Boeck,2000,Subbarao,2007]
O escarro é uma amostra muito utilizada para diagnóstico microbiológico e marcadores inflamatórios em pacientes com FC. Porém sabe-se que muitos desses são incapazes de escarrarem uma quantidade de secreção suficiente para a realização da análise. Um estudo comparou em 10 pacientes com FC as técnicas de escarro espontâneo, escarro induzido e lavado brônquico. A indução do escarro foi preferida por causar menos desconforto nos pacientes em relação ao lavado, e rendeu uma amostra com a mesma quantidade de células inflamatórias e patógenos. [Scheicher,2003] Em outro estudo com 41 crianças feito por Ho et al, apenas 4 eram capazes de escarrarem antes da inalação com SSH, após a inalação 19 conseguiram colher a amostra.
O aumento na quantidade de escarro produzida por esses pacientes após o uso da SSH, deve-se ao fato de a inalação alterar a osmolaridade do trato respiratório, causando uma hiperosmolaridade do fluido que reveste este trato, levando a uma liberação de mediadores que de forma direta ou indireta provocam a contração da musculatura lisa e consequentemente uma maior saída de secreção pulmonar. [Scheicher,2003;Elkins, 2006; De Boeck, 2000;Aitken, 2003; Suri, 2003]
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A eficiência do clearance mucociliar está relacionada com uma boa hidratação da superfície da via aérea, a sua deficiência leva a um baixo clearance mucociliar promovendo a formação de placas de muco, criando um meio propicio a infecções bacterianas. [Elkins, 2006,24;Scheicher, 2003; Donaldson, 2006) Estudos também mostraram que o uso da SSH hidrata a superfície das vias aeríferas durante um certo período,porém em um período mais prolongado em pacientes com FC do que em pacientes saudáveis, o que pode ser mantido por várias horas. [Donaldson,2006, Rand, 2012]) Um deles realizado com inalação a 7% mostrou um aumento em cerca de quatro vezes a altura do liquido da superfície das vias aeríferas em pessoas sem doença pulmonar prévia, porém este aumento ocorre por um curto período de tempo, retornando aos valores normais em no máximo 10 minutos. Nos pacientes com FC o efeito é muito maior e mais duradouro, pois o efeito osmótico do sal adicionado pela inalação trará os mesmos benefícios, devido a água atravessar livremente o epitélio pelos estímulos osmóticos, porém como a CFTR não tem seu funcionamento normal, o transporte ativo de íons para a regularização osmótica será muito mais demorado do que nos pacientes sem FC. Este aumento na hidratação do muco torna suas propriedades reológicas muito mais favoráveis a depuração mucociliar, que ocorrerá mais rapidamente em vias aeríferas maiores do que em vias aeríferas menores.[Elkins, 2006,Bye, 2007; Rogers, 2007; Williams, 2010]
A solução salina hipertônica apresenta melhora do clearance mucociliar não somente por promover uma hidratação das vias aeríferas, mas também do muco deixando – o mais fluido e assim facilitando sua saída, alterando sua reologia e estimulando a tosse, [Rand,2012; Levin, 2006] além de promover uma elevação do volume de liquido da superfície da via aérea de forma sustentada. [Levin, 2006]
A SSH possui a capacidade de dissociar o DNA da proteína do muco, e essa dissociação aumenta de acordo com a concentração da salina. Em um estudo realizado com radioerosol demonstrou-se que a SSH a 7 % acelerou o clearance mucociliar comparado com o grupo controle que realizou inalação com solução salina a 0,9%. Em outro estudo onde 10 adultos com FC inalaram SSH a 3%, 7% e 12% e foram
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comparados com sujeitos que realizaram inalação com salina a 0,9%, o clearance foi muito maior após a inalação com SSH e proporcionalmente a concentração da hipertônica. [Elkins, 2006]
No estudo de De Boeck et al, com 19 pacientes com média de idade de 8,6 anos não produtores de escarro inalaram solução salina em diversas concentrações comprovou-se o mesmo que a pesquisa anterior que quanto maior a concentração da SSH, maior a saída de escarro do paciente com FC.
Riedler em 1996 realizou um estudo com 10 adolescentes com FC, através da inalação de SSH a 6% por 10 minutos, porém seguido de uma sessão de Fisioterapia. Demonstrou-se que a média da quantidade de escarro expectorado após o uso da SSH comparada com a isotônica, foi significantemente maior ( p= 0,006).
Em contrapartida no estudo de Laube de 2011 com 12 crianças com FC que inalaram SSH a 3% e 7% comparadas com crianças sem a FC, encontrou uma melhora do clearance mucociliar nas crianças com FC em relação as outras crianças, porém não em todas, o que sugere que a SSH somente traz benefícios aquelas crianças com baixos valores de clearance mucociliar.
2.3
SSH
auxiliando
na
diminuição
dos
marcadores
inflamatórios
Em 1992 foi realizado o primeiro estudo com SSH para avaliar a resposta inflamatória de pacientes com asma. Hoje esse procedimento é definido como seguro por ser não invasivo, além de fornecer informações inflamatórias de vias aeríferas baixas. [Scheicher,2003] Em um trabalho de Suri et al de 2003, os pacientes realizaram a coleta do escarro antes e após a inalação com SSH, e os marcadores inflamatórios apresentaram uma queda nas amostras nas amostras após a inalação com SSH.
23
Estudos realizados para verificar no escarro de pacientes com FC após 48 semanas de uso contínuo de SSH, se os níveis de Interleucinas, IL-6, IL-8, IL-10 e fator de necrose tumoral estariam aumentado após esse período, demonstrando assim se o uso prolongado de SSH provocaria algum processo inflamatório pulmonar. Nenhuma diferença foi encontrada, porém neste estudo realizado por Elkins et al em 2006 não comparou os valores pré administração da nebulização, com os valores encontrados pós nebulização. Já um trabalho realizado por Aitken et al em 2003, verificou valores de IL-8 e neutrófilos após a nebulização durante 20 minutos de SSH. Neste estudo, os valores de neutrófilos caíram (89+-5% para 86+-4%; p=0,03), já as concentrações de IL-8 não apresentaram alterações. [Reeves,2012]
Elkins et al também nos mostrou que mesmo com o uso prolongado de SSH a 7% durante 48 semanas, a hipertônica não aumentou os valores dos marcadores inflamatórios com IL-8 e citocinas demonstrando não induzir a um processo infamatório nas vias aeríferas dos pacientes com FC.
Reeves em 2011 investigou os efeitos antiinflamatorios da SSH no tratamento de pacientes com FC com foco nos valores de IL-8 mensurados através de lavado broncoalveolar. Concluiu que os glicosaminoglicanos possuem habilidade de influenciar o perfil das quimiocinas pulmonares dos pacientes com FC e estabilizarem os valores de IL-8, que possuem a função de promover a ativação e a quimiotaxia dos neutrófilos. Os pacientes que realizam inalação com SSH desestabilizam essa interação entre os glicosaminoglicanos e a IL-8, deixando-a suscetível a degradação realizada pelos agentes proteolíticos e consequentemente facilitando a resolução da inflamação.
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2.4 SSH na melhora da função pulmonar
Alguns estudos nos últimos anos tem procurado mostrar os benefícios do uso continuo ou por alguns períodos da SSH, para a função pulmonar de pacientes com FC. Em um estudo recente, porém realizado com pacientes adultos com idade média de 32, e associado com Fisioterapia Respiratória, realizou inalação com 6% de SSH durante 3 dias 3 vezes ao dia, sendo que em um dos dias realizava-se inalação antes da terapia respiratória, em outro dia durante e por ultimo após a terapia.Encontrou-se uma diferença, porém não estatisticamente significante em relação ao FEV1 e
capacidade vital forçada, aumentando-as após duas horas da terapia. Sendo assim nenhuma diferença foi encontrado no que diz respeito em qual momento da terapia a inalação deverá ser realizada. [Dentice, 2012]
Em um estudo realizado por Eng et al, o qual randomizaram 52 pacientes adultos e crianças com FC que realizaram 2 inalações com SSH a 6% duas vezes ao dia durante 2 semanas. Ao final do período os valores de FEV1 nos pacientes que
realizaram SSH melhoraram 15+-16%, enquanto no grupo controle, o valor foi de 3+-13% apenas.
Grupta et al em 2012 realizou um estudo duplo cego com 31 crianças, onde inalaram 3% e 7% de SSH durante 28 dias. Realizou-se espirometria no 14º e 28º dias, onde concluiu-se que os valores de FEV1 foram maiores nos pacientes que realizaram inalação com 3% do que com os que inalaram 7%. Mostrando assim o benefício da SSH na função pulmonar de pacientes com FC.
Em contrapartida Suri et al em 2003, realizou inalação a 7% de SSH em crianças de 5 a 18 anos, e encontraram queda dos valores de FEV1 em 64% dos
pacientes, e surpreendentemente em 2 pacientes a queda ultrapassou os 15% devido a severas broncoconstrições.
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Resultados parecidos foram encontrados no estudo realizado por Elkins et al em 2006 com 164 pacientes com no máximo 6 anos de idade, realizou-se inalação com solução isotônica 0,9% e um grupo e no outro 7% de SSH por 48 semanas, ao final não percebeu-se um aumento significativo nos valores preditivos para melhora da função pulmonar, porém uma diminuição das exacerbações, do uso de antibióticos para as exacerbações no grupo que fez uso da SSH, o que já leva a uma melhora, ou melhor, a uma prevenção da função pulmonar.
2.5 SSH auxiliando na redução das exacerbações pulmonares
As pesquisas tem mostrado uma diminuição na quantidade e duração das exacerbações pulmonares em pacientes que utilizaram SSH por um longo período, observados claramente pela diminuição de sinais e sintomas de exacerbações e pela quantidade de antibióticos utilizados no período. [Elkins, 2006] O mesmo afirma Dmello, 2011, após estudo retrospectivo com 424 pacientes, onde demonstrou que as exacerbações pulmonares permaneceram bem reduzidas em pacientes com FC durante o uso da SSH, independente da gravidade pulmonar.
Rosenfeld et al desenvolveu um estudo para verificar se o uso prolongado de SSH a 7% comparado com SS a 0,9% diminuiria os quadros de exacerbações pulmonares em pacientes com FC de 4 a 29 meses de idade. Porém nenhuma diferença foi encontrada entre os grupos no que diz respeito à exacerbação do quadro respiratório durante essas 48 semanas. Assim como no estudo de Elkins et al que randomizou um grupo de 164 pacientes, onde também comparou os efeitos da SSH a 7% com o grupo controle que realizou a inalação com SS a 0,9% durante igualmente 48 semanas. Do grupo que realizou a inalação com SSH o absenteísmo a escola ou ao trabalho foi de 7 dias comparado com 24 dias do grupo da solução salina (p<0.001).
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2.6 Importância da SSH no diagnóstico microbiológico na FC
A inalação com SSH melhora a quantidade e qualidade da amostra do escarro, porém para Elkins e Bye não existem evidências no que diz respeito a melhorar a detecção de patógenos. Assim como Subbarao et al em 2007 também não encontrou diferenças microbiológicas entre antes e após a inalação de 7% de SSH em crianças acima de 3 meses que não se encontravam em exacerbação respiratória.
Em um estudo realizado em 2004 por Ho et al com 41 pacientes com FC pré e pós inalação com SSH a 6%, encontrou-se em 25 pacientes a mesma cultura independente da inalação, sendo que em 16 nenhum crescimento microbiológico ocorreu nem antes nem após a inalação. Em contrapartida, em 16 pacientes, culturas diferentes foram observadas nas amostras. Desses, em 9 pacientes 1 patógeno foi acrescido após a inalação com SSH, em 3 pacientes 2 patógenos foram adicionados.
Em 1 dos pacientes foram isolados patógenos diferentes antes e após a inalação com SSH, e em 3 pacientes o patógeno foi encontrado somente antes da inalação. Mostrando dessa forma, que salina pode sim promover informações adicionais na identificação microbiológica de pacientes com FC.
No estudo de Boeck et al também foi verificado a microbiologia das amostras de aspiração de nasofaringe que apresentaram uma certa quantidade de secreção possibilitando a aspiração após a inalação com SS dos 19 pacientes com FC participantes. Em 7 pacientes foi isolado P. aeruginosa, em 9 pacientes S. aureus e em 3 pacientes H. influenzae. O que nos mostra uma certa importância da inalação da SSH para diagnóstico microbiológico em pacientes que não são capazes de escarrar, por nos fornecer amostra microbiológica na qual os pacientes incapazes de escarrarem não poderiam fornecer, e assim não ser capaz de se administrar a antibioticoterapia adequada.
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Em contrapartida Subbarao (2007) não encontrou diferença na microbiologia em seus 13 pacientes que realizaram swab pré e pós inalação com SSH a 7%.
No que diz respeito a aquisição de bactérias durante o uso prolongado da SSH, Elkins et al mostrou em seu estudo realizado por 48 semanas que não houve diferença na aquisição de P. aeruginosa, S. aureus, B. cepacia, S. mantophilia, Candida albicans, espécies de aspergilus e H. influenzae, entre o grupo estudo que inalou SSH a 7% e o grupo controle que inalou solução salina a 0,9%.
Entretanto, no estudo de Suri et al, 2 bactérias foram isoladas nos pacientes somente após a inalação com SSH a 7%, que não haviam sido identificadas na coleta de amostra com escarro espontâneo, sendo elas P. aeruginosa e S. aureus.
Já no que diz respeito a quanto tempo após a inalação com SSH deve-se realizar a coleta da amostra, Aitken et al em 2003, realizou inalação com 3% de SSH e coletou amostras de escarro nos minutos 0, 4,8, 16 e 20 após a inalação, e a média quantitativa da contagem microbiológica de P. aeruginosa não mucoide e S. aureus diminuiu ao longo dos 20 minutos por meio de log.
Um estudo realizado in vitro para avaliar a atividade da SSH em colônias de P.aeruginosas, mostrou que em 85 amostras de 34 pacientes 6% de SSH já é capaz de inibir o crescimento bacteriano quando isolado. A morte bacteriana já foi observada em uso de 4% de SSH; além de possuir um efeito bactericida em 90% das amostras isoladas. A SSH teve efeitos sobre o biofilme bacteriano, onde foi capaz de alterar a formação do biofilme de biomassa. [ Michon, 2014]
Sendo assim, entendemos a necessidade de verificar se o uso de 7% de SSH auxiliaria na identificação microbiológica, pois como pudemos verificar a literatura ainda é muito controversa, e dessa forma estabelecermos um padrão de coleta de amostras de secreção em nosso Ambulatório.
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OBJETIVOS
3. OBJETIVOS GERAIS
Verificar a eficácia da SSH a 7% na identificação de microorganismos nas secreções das vias aeríferas em pacientes com FC e comparar com variáveis clinicas e laboratoriais.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Verificar se a coleta de secreção, das vias aeríferas, de pacientes com FC, por swab ou escarro espontâneo, é modificada após a inalação com SSH a 7%
2. Verificar se a inalação com SSH é capaz de aumentar qualitativamente microoganismos nas secreções das vias aeríferas de pacientes com FC.
3. Verificar se a inalação com SSH é capaz de aumentar semi-quantitativamente microoganismos nas secreções das vias aeríferas de pacientes com FC.
4. Avaliar os aspectos microbiológicos de coleta de secreção das vias respiratórias e comparar com as seguintes variáveis: Idade, IMC, variáveis de espirometria, escore de Schwachman e escore de Bhalla.
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CASUÍSTICA E MÉTODOS
4. Delineamento do Estudo
Foi realizado um estudo prospectivo de corte transversal, não controlado e não randomizado com 64 pacientes em acompanhamento no Ambulatório de Fibrose Cística do Hospital de Clínicas da Universidade Estadual de Campinas (Unicamp). Todos os pacientes incluídos no estudo possuíam diagnóstico de FC por dois testes de cloro no suor com valores superiores a 60 mEq/L [Gibson, 1959] e/ou duas mutações identificadas no gene CFTR. Nenhum dos pacientes estava em processo de exacerbação pulmonar e fazendo uso de antibioticoterapia.
O estudo baseou-se na coleta de escarro e/ou secreção de orofaringe antes e após a inalação com SSH a 7% de concentração. Para que fosse obtido 7% de concentração foi utilizado 3,5 ml de soro fisiológico a 10% de concentração e 1,5 ml de água destilada, totalizando 5 ml de SSH a 7%
Os pacientes vinham para a consulta de rotina no Ambulatório, realizavam a coleta de secreção de trato respiratório. Os que possuíam habilidade de emissão espontânea de escarro o faziam em frasco seco, estéril e de rosca (J. Prolab®, Paraná, Brasil); já os pacientes que não conseguiam lhes eram solicitada tosse espontânea, e as amostras de secreção de orofaringe eram coletadas pelo “swab” estéril (Copan, Itália).
Logo após esta primeira coleta o paciente realizava inalação com Broncodilatador prescrito pelo médico participante do estudo, utilizando –se de 1 gota (0,25 mg) de bromidrato de fenoterol para cada 3kg de peso corporal até o máximo de 5 gotas (1,25 mg), e em menores de 5 anos, 10 gotas (0,125 mg) de brometo de ipratrópio ou 20 gotas (0,250 mg)para maiores de 5 anos.
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Em seguida o paciente realizava inalação do SSH 7% durante três minutos. Todas as inalações foram realizadas com uso de oxigênio de fluxo continuo a 3L/min com os pacientes sentados e incentivados a respirarem em volume corrente, de forma tranquila, pela boca [Suri, 2003]. As inalações foram feitas com máscara (NS®, São Paulo, Brasil) e as coletas realizadas pela pesquisadora com formação em Fisioterapia.
Novamente se o paciente apresentasse tosse produtiva e capacidade de emissão de escarro lhe era solicitado que o fizesse no frasco estéril; caso contrário era realizada a coleta de secreção de orofaringe por meio do “swab” após tosse solicitada.
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP pelo protocolo (067/2006).
4.1 População do Estudo
Participaram do estudo pacientes frequentadores do Ambulatório de Fibrose Cística do HC/Unicamp que tinham entre 2 e 26 anos de idade com diagnóstico comprovado de FC.
Todos os pacientes menores de 18 anos foram autorizados a participar da pesquisa pelos pais através de assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, já os maiores de idade liam o Termo e decidiam sobre a participação, estando a pesquisadora o tempo todo disponível para esclarecer as dúvidas.
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4.2 Critérios de Inclusão
Foram incluídos no estudo, pacientes frequentadores do Ambulatório de Fibrose Cística do HC/Unicamp, que tivessem entre 2 e 26 anos de idade, com diagnóstico comprovado de Fibrose Cística pela identificação de duas mutações para o gene que codifica a proteína CFTR e/ou no mínimo dois testes de suor (sódio-cloro) positivos (60 mEq/L). [Gibson, 1959] A coleta de secreção já é de rotina em nosso serviço em todas as consultas dos pacientes.
4.3 Critérios de Exclusão
Foram excluídos do estudo pacientes que não preenchessem os critérios de inclusão ou que estivessem com processo de exacerbação clínica dos sinais e sintomas respiratórios, identificados através de diagnóstico médico.
5. Processo de Diagnóstico da Fibrose Cística
5.1 Análise Genética
O diagnóstico da Fibrose Cística foi realizado pelo Laboratório de Genética Molecular da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp. Para a confirmação do diagnóstico foram pesquisadas as seis mutações mais frequentes que são: F508del, G542X, N1303K,G551D,R553X e R1162X. A detecção da mutação F508del foi realizada através do método PCR e análise em gel de poliacrilamida 8%, modificada por
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Rommens e col. (1990). Para as demais mutações foi utilizada a técnica de PCR associada à digestão enzimático-específica.
5.2 Teste de sódio-cloro no suor
O teste de suor é feito pelo Laboratório de Gastropediatria da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, através do método de análise iônica quantitativa de suor, conhecido como iontoforese, estimulado pela pilocarpina, com análise de Na+ por fotometria de chama e de CL- por titulometria. O resultado do teste era considerado positivo quando a concentração de cloro era maior do que 60 mEq/l. A diferença entre a concentração de cloro e sódio não poderia ultrapassar 20 mEq/l e a relação NA+/CL- maior que 1. Para que o teste fosse validado como positivo e o diagnóstico confirmado, foram necessários no mínimo dois testes positivos.
6. Avaliação microbiológica do trato respiratório
A avaliação microbiológica do trato respiratório foi realizada através de amostras de escarro e/ou secreção de orofaringe dos pacientes. Cada um dos pacientes apresentaram duas amostras: uma antes e outra após a inalação com a SSH.
6.1 Coleta das amostras
As amostras foram coletadas pela própria pesquisadora no Ambulatório de Fibrose Cística durante as consultas de rotina dos pacientes.
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6.2 Escarro
Quando os pacientes apresentavam capacidade de realizar expectoração, o escarro era coletado em frasco seco, estéril e de rosca. Logo após as coletas as amostras foram mantidas refrigeradas por um período máximo de 4 horas em temperaturas entre 2 º e -8º, até o processamento pelo Laboratório de Microbiologia do Hospital de Clínicas –Unicamp.
6.3
Secreção de Orofaringe
Quando os pacientes não apresentavam habilidades para escarrar, era solicitado que tossissem espontaneamente e a secreção era “pescada” com a utilização de um swab estéril. Logo após a coleta o swab era colocado em um meio de transporte (Stuart) para que houvesse a preservação da amostra e assim garantir a viabilidade de microorganismos. As amostras eram mantidas refrigeradas em temperaturas entre 2 º e -8º por um período máximo de 4 horas até o processamento pelo Laboratório de Microbiologia do Hospital de Clínicas -Unicamp.
7. Cultura
Uma alçada de escarro foi semeada com o auxílio de uma alça calibrada de níquel-cromo (10ul) por método semi-quantitativo (técnica de esgotamento) nos seguintes meios de cultura: Ágar Sangue (AS), Ágar Chocolate (ACHOC), Ágar MacConkey (MC), Burkholderia Cepacia Seletive Agar (BCSA) e Ágar Manitol (MAN).
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Para as amostras de secreção de orofaringe, a semeadura foi realizada através de método semi-quantitativo rolando-se o “swab” em um dos quadrantes da placa e em seguida com auxílio de uma alça de níquel-cromo.
Figura 7: método semi-quantitativo. Fonte: Baron, 1996
7.1 Incubação e avaliação do crescimento
Todas as culturas foram incubadas em uma estufa bacteriológica a uma temperatura de 36 +- 1 C por um período de 24 a 72 horas. Ágar Sangue e Ágar Chocolate foram incubadas com CO2 e Ágar MacConkey, Ágar Manitol e Burkholderia
Cepacia Seletive Agar sem o CO2. Se durante o período de 24 a 72 horas não houvese
crescimento bacteriano, as placas de BCSA e MC foram mantidas na estufa por até 7 dias.
