Identificação fenotípica

Primeiramente foram realizadas avaliações macroscópicas das colônias isoladas a partir de uma colônia pura com 24 a 48 horas de incubação. Para as avaliações microscópicas foram realizados esfregaços com coloração de Gram, onde foram visualizadas características morfológicas e tintoriais. Além dessas avaliações, foram também identificadas características do metabolismo bacteriano como proteólise, metabolização de carboidratos, aminoácidos e outros nutrientes do meio de cultura e modificações de pH que auxiliaram na identificação preliminar.

Para realização de uma triagem inicial dos microorganismos isolados, todos os bacilos Gram Negativos foram submetidos a uma avaliação de citocromo-oxidase. Esta prova utiliza alguns corantes, como um exemplo o que substitui o oxigênio como aceptor artificial de elétrons. Quando encontra-se reduzido, o corante é incolor, porém quando há citocromo-oxidase e oxigênio atmosférico a fenilenodiamina é oxidada e forma azul-de-indofenol.

Para testar a atividade da oxidase utilizou-se a solução N-N-N- Tetrametylparaphenilenediamine dihydrochloride em papel de filtro. Para controle positivo, utilizou-se a cepa ATCC 27853 –Pseudomonas aeruginosa. Foram consideradas positivas quando ocorreram até 10 segundos, fracamento positivas

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quando ocorreram entre 10 e 30 segundos, ou negativas quando não ocorreu qualquer reação após 30 segundos.

Os citocromos são hemoproteínas que possuem ferro em sua forma e atuam como último elemento de ligação na cadeia respiratória aeróbia, transferindo elétrons ao oxigênio, formando água. Já o sistema citocromo é encontrado em microorganismos microaerófilos, anaeróbios facultativos e aeróbios.

Logo em seguida todos os bacilos Gram Negativos foram submetidos à prova de oxidação-fermentação de Hugh e Leifson para que fosse feita a seleção de microorganismos não fermentadores de glicose. Todos os microorganismos sacarolíticos degradam a glicose através de via fermentativa ou oxidativa, sendo o produto final da fermentação os ácidos mistos que podem ser detectados por provas de fermentação convencionais, e são relativamente fortes. Todavia os ácidos formados na degradação oxidativa da glicose são fracos, e para fazer a sua detecção é necessário um meio mais sensível como o de oxidação-fermentação de Hugh e Leifson, chamado de meio OF; e que difere dos utilizados para fermentação nos seguintes aspectos:

- a concentração de peptona está reduzida de 1% para 0,2%. - a concentração de carboidrato está aumentada de 0,5% para 1%.

- a concentração de Agar está reduzida de 1,5% para 0,3% formando o meio semi-sólido.

No caso, uma baixa relação proteína/carboidrato e a formação de aminas alcalinas que neutralizam as pequenas quantidades de ácidos fracos que podem ser formados a partir do metabolismo oxidativo diminuem. A quantidade relativamente elevada de carboidratos serve para aumentar a quantidade de ácido que pode ser formado. Já a consistência semi-sólida do Agar permite que os ácidos formados na superfície difundam-se através do meio, o que facilita a visualização da viragem do

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indicador de ph (azul de bromotimol), que em meio alcalino fica com coloração azul e em meio ácido com coloração amarela.

Para que o teste fosse realizado, selecionou-se as colônias com auxílio de uma agulha bacteriológica, e inoculou-as através de uma picada em profundidade nos tubos de OF glicose sem o uso e com o uso de vaselina. Todas as culturas foram incubadas em estufa bacteriológica sem CO2 à uma temperatura de 36 +- 1 C, durante um período de 24 a 72 horas. A cada 24 horas a leitura era realizada e as culturas que apresentavam resultados negativos em 72 horas, eram mantidas por 7 dias na estufa. Quando não houve reação no tubo contendo vaselina, o microorganismo foi considerado um não-fermentador de glicose. Foram considerados OF-Glicose positivos, quando houve reação no tubo sem vaselina com alteração do ph e consequente alteração da coloração do meio para amarelo. Quando após 7 dias de incubação não houve reação no tubo sem vaselina ou alcalinização do meio, com consequente alteração da coloração para azul, forma considerados negativos. Como controle positivo foram utilizadas cepas ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa e, como controle negativo, foram utilizadas cepas ATCC 25922 de Escherichia coli.

A avaliação da motilidade foi realizada através de exame direto sem coloração. Eventualmente foi utilizado TSB para cultura, para que fosse assegurada a obtenção de bactérias viáveis, aplicando 1 a 2 gotas de caldo de crescimento bacteriano por 16 a 24 horas a 30 C, sobre uma lâmina de vidro e coberta com uma lamínula, e assim os microorganismos foram visualizados ao microscópio. Quando houve a presença de bactérias cruzando o campo em diferentes direções ou girando em torno dela mesma, foram considerados com motilidade positiva. Com motilidade negativa foram considerados quando houve a presença de movimentos vibratórios fracos, ou movimento browniano (movimento em uma única direção, devido ao movimento do líquido entre a lâmina e a lamínula). Para controle negativo foram utilizadas cepas ATCC17978 de Acinetobacter baumannil; já para controle positivo foram utilizadas cepas ATCC27853 de Pseudomonas aeruginosa.

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Para a triagem inicial, foi fundamental a prova de sensibilidade à polimixina B ou colistina. Foram preparadas suspensões na escala 0,50 do padrão de McFarland, em cerca de 3,0 ml de solução salina estéril, a 0,85%. Os inóculos foram semeados em ágar Muller Hinton, e foi colocado o disco de Polimixina B (300 u) ou e-Teste r. As culturas foram incubadas em estufa bacteriológica, à uma temperatura de 36+-1C, sem CO2, por um período de 24 horas. Logo após este período era realizada a leitura e medição dos halos de inibição de crescimento e os resultados foram comparados com os padrões estabelecidos pelo CSLI vigente. Para controle de qualidade foi utilizada cepa ATCC 24516 de Burkholderia cepacia.

Logo os bacilos gram negativos não fermentadores de glicose e resistentes à polimixina foram submetidos aos demais testes, conforme quadro abaixo. Todas as técnicas e os resultados foram realizados e interpretados, conforme descrito anteriormente. Utilizou-se cepas ATCC para controles positivos e negativos.