DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
EFEITO DA OVARIECTOMIA SOBRE O BALANÇO
AUTONÔMICO CARDÍACO DE RATAS
SUBMETIDAS À DESNUTRIÇÃO PROTEICA
Catalogação: sisbin@sisbin.ufop.br
F738e Fortes, Luis Henrique Santos.
Efeito da ovariectomia sobre o balanço autonômico cardíaco de ratas submetidas à desnutrição proteica [manuscrito] / Luis Henrique Santos Fortes. – 2010.
xxix, 119 f.: il., tabs., grafs.
Orientador: Prof. Dr. Luciano Gonçalves Fernandes.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.
Área de concentração: Bioquímica estrutural e Fisiológica.
1. Batimento cardíaco - Teses. 2. Desnutrição - Teses. 3. Rato como animal de laboratório - Teses. 4. Ovários - Cirurgia - Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS LABORATÓRIO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – NUPEB
EFEITO DA OVARIECTOMIA SOBRE O BALANÇO
AUTONÔMICO CARDÍACO DE RATAS SUBMETIDAS À
DESNUTRIÇÃO PROTEICA
AUTOR: Luís Henrique Santos Fortes
ORIENTADOR: Prof. Dr. Luciano Gonçalves Fernandes
Dissertação apresentada ao programa de Pós-Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção do título de Mestre, em Ciências Biológicas, área de concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
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“... Mestre como eu faço para me tornar sábio?
- É preciso fazer boas escolhas meu filho.
- Mas como faço para ter boas escolhas, mestre?
- Para fazer boas escolhas, é preciso experiência meu filho.
- E como adquirir experiência?
- Más escolhas, “filho”.
"O insucesso é apenas uma oportunidade para recomeçar de
novo com mais inteligência."
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A minha mãe, por toda luta para que eu pudesse
lutar por meus sonhos. Ao meu Pai por todo empenho e amor durante todo esse tempo.
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termo que o real significado pode ser muito mais complexo, ao mostrar uma gama de sentimentos envolvidos. Então, agradeço a:
A Deus, por ser tão generoso e me permitir viver e encontrar pessoas que tanto me fizeram crescer, e por estar sempre caminhado ao meu lado fazendo com que meus sonhos se tornem real.
A meus pais e melhores amigos, Isabel Santos Fortes e Eustáquio Omar Fortes, pelo grande amor, carinho e apoio fantástico durante todos esses anos de estudo. Sei que sempre continuarão me apoiando.
Aos meus irmãos Marcelo Santos Fortes e Isabela Santos Fortes pelo grande amizade, amor e carinho.
Ao meu amor, minha vida, minha namorada, minha amiga Thaylane Silveira de Oliveira, pelo grande carinho, amor e por tanto confiar em mim durante esses anos que estou longe de casa.
Ao meu primo André Lana, por ser o grande amigo que é, e ter estado sempre disposto a me ajudar quando necessitei.
Ao meu orientador Prof. Dr. Luciano Gonçalves Fernandez, pela amizade pelos ensinamentos, por aceitar fazer parte desse meu caminho me ajudando em momentos de dúvida.
Ao Prof. Dr . DeoclécioAlves Chianca Júnior, por abrir as portas do laboratório e me dar essa grande oportunidade.
Ao Prof. Leonardo Máximo Cardoso, pelos ensinamentos e grande ajuda nos momentos de dúvida.
À grande amiga Arlete Rita Penitente, por toda confiança que teve em mim, por acreditar que eu conseguiria mesmo quando eu mesmo achava o contrario, por abrir as portas de um novo caminho e por todo incentivo, muito obrigado.
Ao Professor MSc. Aureliano Claret da Cunha pela incondicional ajuda e paciência na hora que precisei e por sua amizade.
Ao Sr. Paulo Luciano “Seu Paulo”, por ser o grande amigo que é. Por quebrar tantas vezes meu “galho” quando precisei fugir do trabalho ou chegar atrasado.
Ao amigo e companheiro de UFOP Miltinho, que estava sempre lá, sempre ajudando com os animais.
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dúvidas.
Ao pessoal do LAPAC, Cássio e Adão, pela grande ajuda e atenção.
Aos amigos do LFC, Alisson, Alessandro, Aline Resende, Arthur, Fabiana,
Nathalia, Lílian, Manoel, Márcio, Tchalton, Gabriel, Marcela (Toc), Aline,
Alessandra e Vanessa pelos ótimos momentos de convivência.
À Fernanda (Baju) e à Mara (Maravilha) pela grande amizade, estavam sempre ali, prontas pra ajudar, sempre que precisava de alguma coisa. Muito obrigado por toda ajuda e pelos ótimos momentos durante esse tempo.
À Marcela Libertino pelo grande laço de amizade e pela imensa ajuda prestada.
Aos amigos do mestrado Ana Paula, Paula, Amanda, Sonaly, Karina. Aos professores e colegas do NUPEB pelo grande apoio.
Aos grandes amigos Leonardo (Tedy), Lawrence (Pantufa), Victor (Vivi), Guilherme (Guiguizudo) e Ricardo (Zé Mayer), por todo o companheirismo e amizade.
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1. INTRODUÇÃO ... 2
1.1 Desnutrição ... 2
1.2 Aspectos fisiológicos do ciclo reprodutivo feminino ... 6
1.3 Desnutrição e ciclo reprodutivo ... 9
1.4 Pós-menopausa e Hipertensão arterial ... 11
1.5 Variabilidade da Frequência Cardíaca ... 15
2. OBJETIVOS ... 22
2.1 Objetivo Geral ... 22
2.2 Objetivos específicos... 22
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 24
3.1 Modelo animal – desnutrição proteica ... 24
3.2 Composições das dietas ... 24
3.3 Protocolos para cirurgia de ovariectomia ... 26
3.4 Registros da pressão sistólica (PAS) e Frequência Cardíaca (FC) por Pletismografia de cauda. 26 3.5 Preparo e implante das cânulas arteriais, venosas e eletrodos para ECG ... 29
3.6 Registro da Pressão Arterial e do Eletrocardiograma (ECG) ... 32
3.7 Protocolo experimental: Avaliação do controle autonômico da frequência cardíaca. ... 33
3.8 Preparação das Drogas utilizadas ... 35
3.9 Coletas e analise das amostras para análise bioquímica e Hormonal. ... 36
3.10 Constatação do ciclo estral, coloração e captura das imagens ... 37
3.11 Análise dos dados ... 38
3.12 Análises da Frequência Cardíaca (FC) e Pressão Arterial Média (PAM) ... 38
3.13 Análise do Tônus autonômico cardíaco ... 39
3.14 Análise do Índice autonômico cardíaco (IAC) ... 40
3.15 Analise da variabilidade da Frequência Cardíaca no Domínio da Frequência. ... 40
3.16 Análise estatística ... 42
4. RESULTADOS ... 44
4.1 Efeito da ovariectomia e desnutrição sobre o peso corporal dos animais. ... 44
4.2 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre o acumulo de gordura intra-abdominal ... 45
4.3 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre a ciclicidade estral ... 46
4.4 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre os parâmetros bioquímicos e hormonais... 46
4.4.1 Lipídeos séricos ... 46
4.4.2 Proteínas séricas ... 48
4.4.3- Estradiol ... 50
4.5 Efeitos temporais da desnutrição e ovariectomia sobre pressão arterial Sistólica e frequência Cardíaca avaliada pelo método de Pletismografia de cauda ... 51
xii 4.7.2 Efeitos do bloqueio farmacológico do sistema nervoso simpático realizado com
Beta-bloqueador (metoprolol) sobre a PAM e FC ... 59
4.7.4 Avaliação do Índice Autonômico Cardíaco (IAC) ... 65
4.7.5 Análises do tônus autonômico cardíaco ... 66
4.7.6 Efeitos da ovariectomia e desnutrição sobre a razão entre as potências do espectro de FC ... 68
5. DISCUSSÃO. ... 70
6. LIMITAÇÕES DO ESTUDO ... 83
7. PERSPECTIVAS ... 85
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 89
xiii
xiv Figura 2- Variação hormonal do ciclo menstrual em mulheres (Buffet e Bouchard, 2001). ... 9
Figura 3- Exemplo de um segmento de intervalo de ondas sucessivas R-R. ... 20
Figura 4- Representação da janela de visualização do software Chart® durante um registro de medida indireta de FC e pressão arterial. A seta indica o primeiro pico de sinal após o desinflar da bomba. As linhas: representando o sinal pulso (A), inflar de inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) observa-se a interrupção do sinal de frequência cardíaca com o inflar da bomba. ... 28
Figura 5- Representação da janela de visualização do software Chart® durante um registro de medida indireta de FC e pressão arterial. As linhas representando; o sinal de pulso (A), inflar de inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) Período entre chaves e retângulo vermelho, demonstrando período tomado como Frequência cardíaca ... 29
Figura 6- Imagem representativa de um conector Rj45 ... 30
Figura 7- (A)Local de dissecação do trígono femoral e (B)Isolamento da artéria e veia femoral e inserção dos cateteres ... 31
Figura 8- Desenho esquemático do implante de eletrodos para aquisição dos sinais eletrocardiográficos. ... 32
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pressão arterial media (4º.). ... 33
Figura 10- Esquema dos protocolos experimentais adotados. ... 35
Figura 11- Imagem representativa da metodologia adotada para coleta de secreção vaginal utilizada pra confecção dos esfregaços. (a,b,c) com auxílio de uma pipeta de 20 µl preenchida com salina (NaCl 0,9%), a qual foi injetada dentro do canal vaginal e em seguida aspirado. (d) marcação na cauda dos animais para identificação de cada um durante todo o experimento. (e) lâminas confeccionadas da secreção aspirada e analisadas em microscópio óptico na objetiva de 40x. ... 38
Figura 12- Esquema demonstrativo do duplo bloqueio farmacológico com metil-atropina (A) e metoprolol (P) para obtenção da frequência cardíaca intrínseca (FCI), tono vagal (TV) e simpático (TS) cardíaco. ... 39
Figura 13- Imagem de exemplo da janela de análise de série batimento a batimento no domínio do tempo do software cardioseries V.1.0. ... 41
Figura 14- Figura representativa de um sinal simulado no domínio do tempo e sua transformação para o domínio da frequência. O sinal é composto de um componente oscilatório correspondente às Ondas de Mayer (0,5 Hz) e outro às Ondas de Hering (2 Hz). A transformação pela Transformada Rápida de Fourrier discrimina os dois principais componentes em frequência que constituem o sinal. ... 41
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abdominal em ratas, peso (g). Valores numéricos mostram média ± EPM. Barras seguidas de letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 45
Figura 17- Figura representativa de um esfregaço vaginal na fase cíclica do diestro, obtida em microscópio óptico com aumento de 40 x. (L) indica forte presença de leucócitos (Marcondes et al., 2002). ... 46
Figura 18- Efeito da ovariectomia e desnutrição sobre o lipidograma de ratas. Para cada fração lipídica em questão, médias seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 48
Figura 19- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre as concentrações das proteínas plasmáticas por grupos (mg/dL). Para cada fração proteica em questão, médias seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 49
Figura 20- Efeito da ovariectomia e da desnutrição sobre as concentrações plasmáticas de estradiol por grupos (pg/mL). Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 50
Figura 21- Figura ilustrativa do Efeito temporal da restrição proteica e ovariectomia sobre a PAS e frequência cárdica, aferidos durante cinco meses... 53
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sobre a FC (A) e PAM (B) dos grupos Controle (Sham e OVX), Desnutrido (Sham e OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 58
Figura 24- Efeitos do bloqueio farmacológico com 1-bloqueador (metoprolol) sobre a FC (A), e PAM (B) nos Grupos Controle (Sham e OVX), Desnutridos (Sham e OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 61
Figura 25- Efeito do duplo bloqueio farmacológico com anticolinérgico metil-atropina e 1-bloqueador metoprolol sobre a FC (A) e PAM (B) nos grupos controles (Sham e OVX) e desnutridos (Sham e OVX). Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 64
Figura 26- Efeito do duplo bloqueio farmacológico sobre o de variação da FC dos Grupos Controle (Sham e OVX), Desnutridos (Sham e OVX). Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 65
Figura 27- Índice Autonômico Cardíaco dos grupos controle (Sham e OVX) e desnutrido (Sham e OVX). Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 66
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Valores numéricos representam média ± EPM. Barras seguidas por letras diferentes apresentam diferença estatística pelo teste de Bonferroni para p< 0,05. ... 68
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dieta) ... 25
Tabela 2- Os valores representam média ± EPM da média por grupos experimentais. Lipoproteínas de baixa densidade (LDL), lipoproteína de alta densidade (HDL), colesterol total (CT), Triglicérides (TRIG), Lipoproteína de muito baixa densidade (VLDL). ... 47
Tabela 3- Valores médios ± EPM das concentrações séricas (g/dL) das Proteínas Plasmáticas por grupos. ... 49
Tabela 4- Valores médios ± EPM de FC (bpm), durante 5 meses pelo método de plestimografia de cauda por grupos experimentais. ... 52
Tabela 5- Valores médios ± EPM de PAS (mmHg), durante 5 meses pelo método de plestimografia de cauda por grupos experimentais. ... 52
Tabela 6- Parâmetros Cardiovasculares, FC (bpm) e PAM (mmHg), Os valores representam média ± EPM da média nos grupos controles e desnutridos na situação basal e após bloqueio farmacológico com metil-atropina. ... 57
Tabela 7- Parâmetros Cardiovasculares, FC (bpm) e PAM (mmHg) Os valores representam média ± EPM da média nos grupos controles e desnutridos na situação basal e após bloqueio farmacológico com metoprolol. ... 60
Tabela 8- Parâmetros Cardiovasculares, FC (bpm) e PAM (mmHg), Os valores representam média ± EPM da média nos grupos controles e desnutridos na situação basal e após duplo bloqueio farmacológico. ... 63
Tabela 9-Valores unitários de peso para cada animal ao final de 28 semanas (Gramas). ... 106
Tabela 10- Acumulo de Gordura intra-abdominal, valores por animal (Gramas) ... 106
Tabela 11- Concentrações plasmáticas de LDL (mg/dL). ... 107
Tabela 12- Concentrações plasmáticas de HDL (mg/dL). ... 107
xx Tabela 15- Concentrações séricas de lipoproteína de muita baixa densidade (VLDL) ... 108
Tabela 16- Concentrações séricas de Proteínas totais (g/dL). ... 108
Tabela 17- Concentrações séricas de albumina (g/dL) ... 109
Tabela 18- Concentrações séricas de globulina (g/dL). ... 109
Tabela 19- Valores de FC (BPM e PAS( mmHg), durante 5 meses pelo método de plestimografia de cauda ... 109
Tabela 20- Valores de FC (BPM e PAS( mmHg), durante 5 meses pelo método de plestimografia de cauda ... 110
Tabela 21- Valores de FC (BPM e PAS( mmHg), durante 5 meses pelo método de plestimografia de cauda ... 110
Tabela 22- Valores de FC (BPM e PAS( mmHg), durante 5 meses pelo método de plestimografia de cauda ... 111
Tabela 23- Níveis basais de PAM (mmHg) nos diferente grupos de estudo ... 111
Tabela 24- Níveis basais de FC (BPM) nos diferentes grupos de estudo. ... 112
Tabela 25- FC (BPM) antes e após administração de metil-atropina nos grupos controles. ... 112
Tabela 26- PAM antes e após administração de metil-atropina nos grupos controles. ... 113
Tabela 27- FC (BPM) antes e após administração de metil-atropina nos grupos desnutridos ... 113
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... 114
Tabela 30- PAM (mmHg) antes e após administração de metoprolol nos grupos controles ... 115
Tabela 31- FC (BPM) antes e após administração de metoprolol nos grupos desnutridos ... 115
Tabela 32- PAM (mmHg) antes e após administração de metoprolol nos grupos desnutridos ... 116
Tabela 33- FC (BPM) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos controles. ... 116
Tabela 34- PAM (mmHg) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos controles. ... 117
Tabela 35- FC (BPM) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos desnutridos. ... 117
Tabela 36- PAM (mmHg) antes e após duplo bloqueio farmacológico nos grupos desnutridos. ... 118
Tabela 37- LF e HF durante o período basal e razão LF/HF dos grupos controles. .. 118
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ONU Organização das Nações Unidas OMS Organização Mundial da Saúde LH Hormônio Luteinizante
FSH Hormônio folículo estimulante PRS Prolactina
GnRH Hormônio Liberador da Gonadotrofina IMC Índice de Massa Corporal
PA Pressão Arterial PAM Pressão Arterial Média PAS Pressão Arterial Sistólica FC Frequência Cardíaca ECG Eletrocardiograma Bpm Batimentos por minuto COL Colesterol Total TRIG Triglicérides
HDL Lipoproteína de alta densidade LDL Lipoproteína de baixa densidade VLDL Lipoproteína de muito baixa densidade ET-1 Endotelina 1
SNC Sistema Nervoso Central SNA Sistema Nervoso Autonômico OVX Ovariectomizado
Sham Cirurgia Fictícia SHAM Cirurgia Fictícia
COVX Controle ovariectomizado CSham Controle Sham
DSham Desnutrido Sham
DOVX Desnutrido ovariectomizado IL-1 Interleucina 1
IL-6 Interleucina 6
TNF- Fator de necrose tumoral alfa NO Oxido Nítrico
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ANG II Angiotensina II
VFC Variabilidade da Frequência Cardíaca IAC Índice Autonômico Cardíaco
Kg Quilogramas
g Gramas
cm Centímetros
mmHg Milímetros de mercúrio Kcal Quilocalorias
LF Low Frequency – Componente parassimpático do espectro da variabilidade da FC
HF High Frequency – Componente simpático do espectro da variabilidade da Frequência Cardíaca
UFOP Universidade Federal de Ouro Preto LFC Laboratório de Fisiologia Cardiovascular
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1.
INTRODUÇÃO
1.1
Desnutrição
Os efeitos da privação alimentar e da fome vêm sendo observados desde épocas remotas e sendo descritos através dos tempos. Em 1928, inquéritos realizados em diferentes países, pela antiga liga das nações, divulgaram relatórios sobre as condições alimentares no mundo demonstrando que mais de 2/3 da humanidade viviam em permanente estado de fome (Castro, 1965).
Em 1974, durante a realização da Conferencia mundial sobre Alimentação, realizado pela Food and Agriculture Organization (FAO), órgão pertencente às Nações Unidas (ONU), os governos participantes defenderam o direito inalienável de todo homem, mulher ou criança estarem livres do risco de fome e da desnutrição para o desenvolvimento de suas necessidades físicas e mentais, de acordo com o conceito de Segurança Alimentar. Com a proposta os governantes esperaram uma redução de 50% do número de desnutridos no mundo até 2015 (Domene et al., 2003).
Com bases em estudos nutricionais realizados em todos os continentes, Food and Agriculture Organization of the United Nations (FOOD, 2001), relatou que embora em termos percentuais, tenha havido decréscimo na incidência de desnutrição entre 1990 e 1999, em números absolutos 623,7 milhões de pessoas nesses continentes ainda são acometidas por essa carência nutricional.
Em 2002, no Segundo Fórum Mundial de Alimentação, constatou-se que o número de desnutridos diminui em 8 milhões a cada ano. Para alcançar os objetivos propostos pelos governantes em 1974, à taxa de redução deveria ser de pelo menos 22 milhões por ano. Dados como estes, mostram que todas as medidas tomadas até agora foram de pequeno impacto para a real diminuição do número de desnutridos no mundo (Domene et al., 2003).
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insegurança alimentar mesmo não sendo nova aparece como um problema que assombra diversas nações.
Em 2010, segundo a FAO, é observada uma queda em 98 milhões de pessoas desnutridas no mundo, significando 9,6% no total de subnutridos, em grande parte devido ao crescimento da economia em países em desenvolvimento. Mesmo assim o número de pessoas que sofre de alguma carência nutricional ainda é relativamente alto.
Mesmo com toda evolução no combate a fome e desnutrição, dados mostrados pela WHO em agosto de 2010, na resolução de Joannesburg, mostram com grande preocupação que a desnutrição continua a ser uma das principais causas de morte e incapacidade para as crianças: 1 em cada 3 mortes, e 20% dos anos perdidos de vida saudável são atribuíveis à desnutrição em todas as suas formas.
Desnutrição proteico-calórica é definida pela Organização Mundial da Saúde como uma síndrome multifatorial de condições patológicas decorrentes de um desequilíbrio pelo aporte alimentar insuficiente, transporte ou utilização de nutrientes (por exemplo, proteínas, iodo ou cálcio) por células do organismo para assegurar o crescimento e manutenção de funções especificas do organismo (Sawaya et al.,2003). Muitas vezes o inadequado aproveitamento biológico dos alimentos ingeridos é motivado por alguns tipos de doenças, em particular infecciosas e parasitarias bem como um quadro de síndrome de má absorção (Monteiro, 2003).
No ano de 2006 foi estabelecida uma nova definição para desnutrição, sendo caracterizada por uma condição fisiológica anormal causada por deficiência, excessos ou desequilíbrios na ingestão de calorias, proteínas ou outros nutrientes (ONU, 2006). Este novo conceito abrangerá não só a falta, mas também o excesso alimentar (Comitê Permanente de Nutrição – Ctherini Bertine, 2006), englobando com isso outro grande problema de saúde pública nos dias atuais, a obesidade.
Assim, existem três tipos básicos de alterações dietéticas: 1) diminuição da quantidade total de alimentos, ou seja, fome, também chamada de desnutrição calórica total. A nível severo, este tipo de desnutrição foi denominada marasmo; 2) alteração na composição dos alimentos consumidos, ou seja, alteração da qualidade da dieta. O que pode provocar um tipo de desnutrição severa, chamada kwashiorkor; 3) aumento na quantidade de alimento ingerido acima das necessidades para a sobrevivência do organismo, ou seja obesidade (Sawaya, 2003).
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em um primeiro momento, e mais tarde na carne, que é um tipo de alimento mais caro sendo extremamente raro na mesa de populações mais pobres, estas se alimentando principalmente a base de carboidratos, (Mendonça, 2003; Voltarelli et al., 2008). Em primeira instancia vê-se um quadro de fadiga, irritabilidade, letargia, incluindo diarreia, anemia e retardamento motor.Não tratada, a doença evolui, a imunidade do paciente cai e o corpo apresenta edema. Em quadros graves, pode ocorrer deficiência mental e morte.Mesmo tratada, a criança que teve kwashiorkor dificilmente atinge altura e peso normais (Mendonça, 2003).
Este tipo de desnutrição é considerado como forma mais letal de má nutrição e tem um papel muito importante em pelo menos metade das mortes anuais de crianças no mundo em desenvolvimento. Dados mostrados pela Organização mundial da saúde (OMS) em 2007 mostram que esta forma de desnutrição afeta uma em cada quatro crianças em todo o mundo: 150 milhões (26,7%) estão com baixo peso e 182 milhões (32,5 %) têm desenvolvimento retardado. Relata-se que 55% das mortes infantis em países em desenvolvimento estão associadas à desnutrição, sendo que 12,2 milhões de mortes anuais de crianças menores de 5 anos, 6,6 são causadas pela desnutrição. De acordo com a OMS, a alimentação inadequada de recém-nascidos e crianças são responsáveis por um terço dos casos de desnutrição (WHO, 2007). No Brasil a prevalência de desnutrição em crianças menores de 5 anos de idade, aferida pela proporção de crianças com déficit de crescimento, foi 7% em 2006 (Pesquisa Nacional de Demografia e Saúde, 2009).
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proteica é altamente prejudicial ao organismo, uma vez que as proteínas fornecem aminoácidos que regulam e cumprem funções fisiológicas e metabólicas no organismo.
Tendo por base que estudos sobre desnutrição proteica em humanos são mais observacionais do que experimentais, vê-se a necessidade da avaliação através de modelos animais controlados de acordo com a intensidade da desnutrição e o tempo de exposição (Giacomelli & Marçal-Natali, 1999). O rato, então, torna-se o modelo experimental mais utilizado nestes estudos devido às vantagens que apresenta, tais como fácil manejo, alta capacidade de adaptação aos diferentes protocolos de desnutrição, além de possuir metabolismo acelerado, sendo este, de alta relevância uma vez que permite investigações experimentais rápidas, principalmente daqueles distúrbios promovidos pela desnutrição apenas tardiamente no ser humano (Bello et al., 2005).
Existem hoje, varias metodologias pra induzir desnutrição em ratos. Alguns autores adotam o aumento do número de filhotes da ninhada durante o período de aleitamento, levando à competição pelo leite materno, diminuindo a disponibilidade de nutrientes para cada animal individualmente (Chase & MC Khann, 1969; Bell e Slotkin, 1988). Outro método utilizado é através da redução do conteúdo proteico oferecido à fêmea durante o período de amamentação dos filhotes (Pedrosa & Moraes Santos, 1987). Em outros trabalhos, essa desnutrição é promovida durante a gestação, com redução do teor de proteínas oferecido às fêmeas (Tonkiss et al., 1998). E ainda, com a diminuição do conteúdo proteico da dieta após o desmame (Benade et al., 1993).
Todas as metodologias citadas anteriormente são eficazes em promover um quadro de desnutrição em diferentes fases. No Laboratório de Fisiologia Cardiovascular (LFC) é adotado há alguns anos como modelo experimental para a desnutrição, a redução na oferta de proteínas após o desmame (Trópia et al., 2001; Oliveira et al., 2004; Bezerra, 2009).
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aprendizagem (Lucas et al., 1997; Lucas, 1998; Monteiro, 2003; Almeida e Mello, 2004).
Dados do LFC mostram um aumento do tônus vasomotor simpático em animais submetidos a um modelo de desnutrição proteica pós-desmame (Trópia et al., 2001). Os estudos ainda sob o mesmo modelo animal mostraram alterações nos valores basais de frequência cardíaca (FC) e pressão arterial média (PAM), além do aumento da variabilidade desses parâmetros, quando analisados em intervalos de noventa minutos, no domínio do tempo (Oliveira et al., 2004). Loss et al. (2007) demonstraram uma perturbação da homeostase cardiovascular decorrente da desnutrição. Nesse trabalho foram mostradas alterações no ganho do barorreflexo antes e após bloqueios autonômicos além de alteração no período de latência da resposta barorreflexa. Gomide
et al. (2007), relatou ainda que, existe uma importante interação entre o sistema renina-angiotensina e o sistema simpático vasomotor. Foi evidenciada uma hiperatividade do eixo renina-angiotensina na gênese da pressão arterial em animais desnutridos. Martins (2007) explanou através da análise da variabilidade da FC no domínio da frequência um aumento da atividade eferente simpática e redução da atividade eferente parassimpática após bloqueio autonômico em ratos submetidos à desnutrição proteica, sugerindo uma disfunção autonômica cardíaca nesses animais. Bezerra (2009) confirmou ainda que a desnutrição proteica pós-desmame promove prejuízos na regulação reflexa cardiopulmonar, com atenuação das respostas hipotensoras e bradicárdicas produzidas por administração de fenilbiguanida e, ainda, ratos desnutridos apresentam uma menor queda da atividade simpática após ativação do reflexo Bezold-Jarisch.
1.2
Aspectos fisiológicos do ciclo reprodutivo feminino
Os ratos (e todos os outros modelos animais) podem ser utilizados como uma poderosa ferramenta de estudo e com possibilidade de aplicação em representações humanas, contanto que, as diferenças anatômicas e fisiológicas do desenvolvimento biológico devam ser levadas em consideração (Quinn, 2005).
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(Sportiniz et al., 1999; Marcondes et al., 2001). Esses animais apresentam ciclo estral regular, que se caracteriza por mudanças morfológicas nos ovários, útero e vagina (Mendonça et al., 2002).
O ciclo estral tem a duração média de 4 a 5 dias e sendo caracterizado por quatro fases bem definidas: proestro, estro, metaestro e diestro, os quais podem ser determinados pelos tipos celulares observados por um esfregaço vaginal (Freeman, 1988; Marcondes et al., 2002).
Proestro é a fase onde os níveis de hormônios gonadotrópicos, Luteinizante (LH), Prolactina (PRL) e folículo estimulante (FSH), estão elevados e a estimulação do ovário é máxima, o que se traduz num aumento progressivo na produção dos estrógenos, fenômeno observado indiretamente pela proliferação do epitélio vaginal. Isso confere ao esfregaço um grande número de células nucleadas pequenas, poucas células cornificadas e tipos celulares intermediários, sendo característica dessa fase a ausência quase total de leucócitos, sendo que a ovulação ocorre na noite desse dia (Freeman, 1994). O estro corresponde à fase em que a fêmea está receptiva ao macho (Marcondes, 2002). Nessa fase é observado um aumento máximo no grau de cornificação do epitélio, o que reflete altos níveis estrogênicos, especialmente se comprados ao de progesterona. A grande maioria das células apresentam-se cornificadas e não se observa presença de células nucleadas ou de leucócitos, sendo esta fase pós-ovulatória. O metaestro e o diestro são fases não férteis do ciclo, caracterizadas pela presença predominante de leucócitos e muco (Marcondes et al., 2002).
Além dos tipos celulares, os níveis hormonais também podem ser responsáveis pela determinação da ciclicidade estral. Sendo observado durante a fase fértil níveis elevados de estradiol, progesterona, FSH e LH. Na fase não fértil estes hormônios encontram-se diminuídos, (Fink, 1988; Merrian e Silberstein, 2000; Buffet e Bouchard, 2001).
Apesar de não apresentar sangramento vaginal, os mecanismos neuroendócrinos envolvidos no processo reprodutivo assemelham-se muito ao da mulher. Sendo a menstruação um processo diferente.
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evento, a menopausa, por volta dos 45 a 50 anos, tendo uma duração média de 28 dias, com uma variação de 25 a 30 dias (Silberstein & Merriam, 2000).
O ciclo reprodutivo da mulher, diferentemente do que acontece em ratas, é composto por duas fases: Uma fase folicular e uma lútea. A primeira fase, folicular, dura em média 10 a 14 dias sendo caracterizado pela maturação de um folículo ovariano sob, estimulo do hormônio FSH. Assim, o folículo ovarino inicia secreção de estrógeno que tem um importante papel no estímulo da proliferação do endométrio. A segunda fase, lútea, dura de 12 a 14 dias. Nesta fase, sob concentrações máximas de estrógenos, tem-se a liberação de LH pela hipófise, terminando a maturação folicular com consequente ovulação, sendo marcante também nesta fase, altas concentrações de progesterona. (Goldmam et al., 2009). Uma vez o óvulo não sendo fecundado, o corpo lúteo regride em 9 a 11 dias. (Buffet & Bouchard, 1998). Após esta fase os níveis séricos de estradiol e progesterona diminuem consideravelmente acarretando na degeneração e descamação do endométrio provocando assim a hemorragia menstrual (Robert et al., 2007; Buffet & Bouchard, 2001) .
Um normal funcionamento do ciclo menstrual requer uma coordenada atividade do hipotálamo com a secreção de hormônio liberador da gonadotrofina coriônica (GnRH); glândula Pituitária com a secreção dos hormônios glicoproteicos LH e FSH que por sua vez controlam o ovário na liberação dos hormônios como estradiol, progesterona, inibina e ativina e outros moduladores ovarianos, regulando assim, a maturação folicular, ovulação, formação do corpo lúteo (Silberstein & Merriam, 2000; Buffet e Bouchard, 2001) . Oscilações dos níveis hormonais em ratas e em mulheres são demonstradas nas Figuras 1 e 2.
9 Figura 2- Variação hormonal do ciclo menstrual em mulheres (Buffet e Bouchard, 2001).
Durante o ciclo estral de ratas, o hormônio estradiol é encontrado em altas concentrações atingindo um pico máximo durante o proestro, tornando a cair no final do estro, permanecendo em concentrações mínimas até o final do metaestro e diestro (Richard, 1986).
A progesterona pode ser encontrada em concentrações mais elevadas durante o metaestro, começando a diminuir até o diestro (Richard, 1986). Durante o proestro sua concentração diminui consideravelmente com a chegada da ovulação, ainda no estro, recupera o seu pico máximo, decaindo em seguida para começar a apresentar uma elevação dos níveis plasmáticos novamente entre o estro e o metaestro (Richard, 1986).
1.3
Desnutrição e ciclo reprodutivo
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puberdade. Como é um sinal muito evidente, muitos autores a considera como o fim da fase púbere (Trench & Santos, 2005)
Tanto em animais como em seres humanos vários são os fatores que exercem modulação sobre o inicio da fase púbere, tais como, mecanismos intrínsecos de oscilações hormonais, ações inibitórias de neurotransmissores do sistema nervoso central (SNC) sobre o funcionamento do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal bem como fatores extrínsecos, sendo o estado nutricional um fator importante para o desencadeamento púbere (Warren et al., 1983; Kaplowitz, 2008).
É bem conhecido na literatura que a puberdade de um indivíduo esta relacionada com a aquisição de determinada massa corporal como evidenciado pelo retardo púbere nos estados de desnutrição, como também, o ganho excessivo de peso com grande aumento no índice de massa corporal (IMC) podendo antecipar a puberdade em alguns anos (Lee et al, 2007). Tanto a desnutrição como uma redução severa no tecido adiposo parece estar relacionada com atraso da menarca ou mesmo em quadros de amenorreia observados em atletas de alto desempenho (Baker, 1985). Frisch et al. (1980; 1081) também observaram que uma diminuição moderada de peso bem como uma perda significativa da massa gordurosa pode atrasar a menarca em até 10 anos. Sob condições especiais de uso de medicamentos ou trauma, o início dos ciclos ovulatórios podem sofrer um atraso por mais de 20 anos (Feigelman et al., 1987).
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Alguns estudos mostram que o ciclo estral de ratas pode sofrer alterações de acordo com vários fatores: como idade, estação do ano, origem do animal bem como as condições alimentares (Mendonça et al., 2002). Uma menor ingestão alimentar prejudica a função reprodutiva em fêmeas de mamíferos. A ovulação natural do ciclo estral acaba não acontecendo, a puberdade é atrasada e os pesos dos ovários tornam-se diminuídos (Sue Lintern-Moore & Everitt, 1978).
Diversos estudos realizados em humanos e animais têm evidenciado que agressões nutricionais, independente do tipo, durante períodos sensíveis de desenvolvimento (fetal, neonatal ou infância) podem causar consequências posteriores através de um mecanismo conhecido como “programação epigenética” (Baker, 1985; Barker, 1993).
1.4
Pós-menopausa e Hipertensão arterial
O climatério é a fase da vida da mulher em que ocorre a transição do período reprodutivo, ou fértil, para o não reprodutivo, devido à diminuição dos hormônios sexuais produzidos pelos ovários. Já a menopausa, é basicamente a soma de duas palavras gregas, mês e fim, sendo definido como o último ciclo menstrual da mulher assim como a menarca é caracterizado como o primeiro (Trench & Santos, 2005). Nesta fase os ovários, naturalmente deixam de funcionar, e a produção de estrogênio pelas células foliculares dos ovários diminui, e consequentemente se produzem no organismo, diversas mudanças fisiológicas, algumas resultantes da cessação da função ovariana (OMS, 1996). Entretanto, a menopausa pode ser ainda resultante de ovariectomia bilateral cirúrgica, realizada na mulher ainda em idade fértil (Bassam, 1999).
A OMS considera que uma mulher encontra-se na pós-menopausa após ausência de menstruação durante 12 meses consecutivos, o que normalmente ocorre entre 45 e 50 anos (OMS, 1996). Atualmente, a maioria dos países ocidentais experimentou uma melhoria na atenção à saúde o que se traduz num aumento da expectativa de vida, com isso, espera-se que a mulher passe mais de um terço de sua vida na fase pós-menopausa (Botrel et al., 2000).
Mesmo com a melhora da atenção a saúde, a literatura mostra que as doenças cardiovasculares são uma das principais causas de óbito na sociedade moderna (Botrel
12
maior incidência após a menopausa, e principalmente em mulheres jovens com perda da função gonadal (Kannel et al., 1976; Reckelhoff, 2001).
Ao longo dos anos, muitos estudos têm mostrado diferenças sexo especificas na incidência de doenças cardiovasculares, e os estrógenos têm sido considerados os principais colaboradores para essa dissimilaridade (Fismam et al., 2002). Essas contendas são observáveis ainda no período pós-púbere persistindo durante adolescência e fase adulta (Himmelmann et al., 1994; Yong et al., 1993). Embora seja um ponto de muita discussão e controvérsia, muitos estudos têm demonstrado que em todos os grupos étnicos, homens apresentam um maior risco de doença renal e cardiovascular quando comparados com mulheres de mesma idade na pré-menopausa (Reckelhoff, 2001). Além disso, trabalhos utilizando-se da técnica de registro ambulatorial da pressão arterial por 24 horas têm mostrado que a PA é mais elevada nos indivíduos do sexo masculino do que feminino em idade pareada. Contudo, após a menopausa essa diferença é revertida, com a prevalência da elevação da PA sendo maior na mulher do que no homem de mesma idade (Wiinlberg et al., 1995; Khoury et al, 1992; Burt et al., 1995). Além disso, grandes estudos populacionais, como o estudo Framinghan mostram que o risco de infarto agudo do miocárdio é 2,6 vezes mais alto em mulheres pós-menopáusicas do que pré-menopáusicas (Kannel et al., 1976).
As razões para essas diferenças sexuais da PA ainda não estão muito bem esclarecidas. Muitos trabalhos têm sugerido, mas não provado, que os estrógenos são responsáveis pela menor PA em mulheres jovens. Dados sobre a flutuação da PA durante as fases do ciclo menstrual podem defender essa hipótese. Chapman et al.
(1997), em um estudo de mudanças hemodinâmicas associadas com o ciclo menstrual mostrou uma menor PA durante a fase lútea, que é a fase de concentrações mais elevada de estradiol, do que durante a fase folicular. Entretanto, observações opostas também já foram relatadas, com uma elevação da PA durante a fase lútea (Dunne et al., 1991). Durante o período gestacional tanto estradiol quanto progesterona encontram-se elevados, apresentando taxas séricas de 50 até 100 vezes os níveis basais de mulheres não gravidas e a pressão arterial encontra-se diminuída durante esse período (August, 1990).
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(Aloysio, 1999). Mulheres na pós-menopausa apresentam uma elevação significativa dos níveis séricos de colesterol total (CT), triglicérides (TRIG), lipoproteína de baixa densidade (LDL colesterol) e uma diminuição da fração lipoproteína de alta densidade (HDL colesterol) (Stevenson et al., 1993). A prevalência dessa síndrome metabólica leva a um perfil lipídico mais aterogênico com aumento da oxidação de LDL’s levando ao aparecimento de obesidade central (intra-abdominal) (Carr, 2003). A terapia de reposição hormonal tem sido empregada, e é capaz de reverter essas alterações (Grodstein, 1996). O declínio da função ovariana após a menopausa está associado com o aumento espontâneo de moléculas pró-inflamatórias como a interleucína 1 e 6 (IL-1, IL-6 ) e fator de necrose tumoral alfa (TNF- ) (Pfeilschifter et al., 2002).
Outras linhas de pesquisa levam em consideração as alterações provocadas diretamente sobre o sistema vascular (Koh, 2002; Tostes, 2003). Trabalhos mostram que a menopausa esta associada ao dano endotelial e atenuação da vasodilatação dependente do endotélio (Kublickiene et al., 2005). A diminuição dos níveis de óxido nítrico (NO) tem sido observada, visto que o estradiol através de receptores específicos no endotélio e célula muscular lisa tem uma ação modulatória sobre a síntese de NO. A disfunção endotelial e redução do NO pode também estimular a síntese e liberação de endotelina (ET-1), resultando em um aumento do tônus vasoconstrictor, estimulando a liberação e atividade de fatores de crescimento, resultando na hiperplasia da musculatura lisa e migração dentro da íntima resultando no aumento das moléculas pró-inflamatórias (Liuzzo, 1994; Koh, 2002). O estradiol é capaz de atenuar vasoconstricção dependente de ET-1 em artérias coronárias in vitro e in vivo, (Tostes et al., 2003). Outros trabalhos têm também demonstrado que o estrógeno pode modular a ação da ET-1 através da expressão gênica de seus receptores e em contrapartida mulheres tratadas com reposição hormonal apresentaram diminuição dos níveis séricos de ET-1 e seus receptores (Saitta et al., 2001).
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angiotensina (ECA), em Angiotensina II, que é um agente vasoconstrictor e induz a proliferação da vasculatura. Com isso, há de se pensar que haveria um aumento de resistência vascular periférica com consequente elevação da PA. Pesquisadores acreditam que é através deste mecanismo que alguns anticoncepcionais podem causar elevação da PA. Em contrapartida, alguns ensaios mais recentes, fazendo uso de novas tecnologias, como radioimunoensaio, apresentam dados diferentes, mostrando que em mulheres os níveis de renina são inferiores quando comparados com homens, e em mulheres na pré-menopausa ou pós-menopausa que recebem Terapia de Reposição Hormonal (TRH) os níveis de renina diminuem consideravelmente quando comparados com mulheres pré- e pós menopáusicas que não receberam o tratamento, ( Schunkert et al., 1997). Outro fato a se considerar é que o estrógeno é capaz de suprimir a atividade da ECA, com isso promovendo uma significante redução nos níveis de Ang II (Schunkert et al., 1997; Fischer et al, 2002). Tanto em animais como em seres humanos a deficiência estrogênica pode levar a um aumento na expressão de receptores do tipo AT1, (Laborde et al, 2004; Harrisson-Bernard et al., 2003). Harrison-Bernade et al. (2003) e Labord et al. (2004) mostraram em um experimento com ratas OVX, que a diminuição de estradiol circulante promoveu uma maior expressão de receptores AT1. Em contrapartida, o tratamento com TRH é eficaz em promover a diminuição na expressão desses receptores em diferentes tecidos, como vasos, rins, adrenal e aumento nas ações da Angiotensina (1-7). A Ang (1-7) apresenta efeitos opostos dos das Ang II, promovendo uma vasodilatação dependente do NO e também facilitando o reflexo pressoreceptor (Ferrario et al., 1997). Brosnihan et al.(1999) em um estudo com ratas OVX, observou que em tratamento preventivo com TRH houve uma redução de atividade da ECA acompanhado de uma queda nos níveis de Ang II com um subsequente aumento nos níveis de Ang (1-7).
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quando comparados com animais que receberam veículo, mostrando uma inibição da atividade simpática promovida pelo estradiol. Mulheres sob TRH na pós-menopausa apresentam uma diminuição na frequência de disparo de um nervo simpático, constituindo outro mecanismo de efeitos benéficos do estradiol (Vongpatanasin et al., 2001). A deficiência de estradiol promove ainda um aumento da sensibilidade simpática barorreflexa (Minson et al., 2000).
Os hormônios sexuais femininos, principalmente os estrógenos, apresentam inúmeros efeitos sobre o sistema cardiovascular, podendo conferir cardioproteção. Considerando essa proteção conferida pelo estradiol, há de se destacar que a sua redução, seja no período pós-menopausa, por outros motivos de supressão hormonal ou decorrentes de um estado nutricional inadequado, pode significar um grande aumento na incidência de patologias cardiovasculares.
1.5
Variabilidade da Frequência Cardíaca
Na prática clínica são utilizados diversos marcadores para estimar as condições de saúde de um indivíduo bem como estimar o risco de acontecimentos cardiovasculares através de reflexos gerais e específicos.
Com avanço dos tempos e o desenvolvimento de novas tecnologias temos testemunhado o reconhecimento e a importante relação entre o sistema nervoso autonômico e mortalidade decorrentes de eventos cardiovasculares, incluindo morte súbita (Task Force, 1996).
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exercem ações opostas em outras situações como em relação às glândulas salivares e o musculo ciliar.
O coração então, esta sob influência direta dos dois sistemas, simpático (por todo o miocárdio) e parassimpático (para o nodo sinusal, miocárdio atrial, e nódulo atrioventricular) (Rabe, 2007). Esta modulação simpática e parassimpática é fortemente influenciada por informações oriundas dos barorreceptores, quimiorreceptores, sistema respiratório, sistema vasomotor sistema termorregulador e do sistema renina angiotensina aldosterona. Com isso, é possível aceitar que o coração não funciona de uma forma regular em seus batimentos, e, portanto alterações na FC, definidas como Variabilidade da Frequência cardíaca (VFC), dentro de um padrão de normalidade, indicam habilidade do coração em responder a múltiplos estímulos fisiológicos bem como compensar desordens induzidas por doenças (Rejandra, 2006: Vanderlei, 2009; Marães, 2010).
Um dos primeiros estudos contendo informações de que o sistema cardiovascular, ao ser modulado pelo sistema simpático e parassimpático, era capaz de modificar a VFC, foi observado no sofrimento fetal à concomitância de distúrbios nos intervalos R-R entre batimentos cardíacos (Hon & Lee, 1965; Gaziano e Freeman, 1977). Vários estudos na literatura demonstram haver uma importante associação entre diminuição da VFC e morte súbita, como também foi mostrado em pacientes pós-infartados haver uma forte diminuição da VFC (Wolf et al., 1978). Nos últimos anos tem surgido na literatura uma significante correlação entre o risco de desenvolver arritmias letais e sinais de aumento da atividade simpática e, ou diminuição da atividade parassimpática. Assim, a VFC constitui um potente e independente indicador de mortalidade cardiovascular. Todas essas observações encorajam pesquisadores a desenvolverem novos marcadores quantitativos da atividade autonômica (Task Force, 1996).
utilizando-17
se drogas que interfiram direta ou indiretamente sobre a atividade do SNA, (Hainsworth, 1990; Castro, 1992).
Uma das maneiras de se avaliar o balanço autonômico cardíaco é através de bloqueio farmacológico do sistema nervoso simpático e parassimpático. Ao se induzir essa situação obtém-se a frequência intrínseca do coração, essa, determinada pela velocidade de despolarização do nodo sinoatrial, ou também chamada de ondas de intervalo R-R. A Figura 3 mostra um exemplo de um intervalo R-R. Quando a influência vagal é predominante para o coração, a frequência cardíaca é menor que a frequência cardíaca intrínseca. Já quando a fração simpática prevalece, o que é observado é uma elevação da Frequência cardíaca, apresentando-se em valores mais altos que a Frequência cárdica intrínseca (Goldberger, 1999).
Goldberger (1999) propôs um índice para avaliar o balanço autonômico simpático-parassimpático. Este índice (Vagal-simphathetic Effect), também conhecido como Índice Autonômico Cardíaco (IAC), é definido como a razão entre o intervalo R-R basal (antes do bloqueio farmacológico) e o intervalo R-R-R-R intrínseco (após bloqueio farmacológico). Valores de IAC que presentam-se maiores de 1 mostram a existência de um predomínio de atividade vagal sobre o coração, e valores que se mostrem inferiores a 1 caracterizam um predomínio de atividade simpática. Para que o índice seja amplamente aceito é necessário que obedeça a alguns critérios: 1) o índice deve variar amplamente e similarmente entre indivíduo em resposta a diferentes estímulos autonômicos; 2) indivíduos submetidos às mesmas condições autonômicas devem apresentar uma variabilidade mínima do índice entre si; 3) a resposta do índice às várias condições autonômicas devem refletir alterações do estado fisiológico e ter uma interpretação significativa. Este deve fornecer ainda, informações do efeito resultante do sistema nervoso simpático e parassimpático (Goldberger, 1999). Apesar de ser uma ótima maneira de se estimar o balanço autonômico, essa metodologia torna-se limitada na prática clínica, por haver a necessidade da realização de bloqueios farmacológicos do SNA.
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inotropismo, e vasoconstricção periférica cujo, resultado em pacientes saudáveis, é um discreto aumento da PAM e diastólica, e pouca ou nenhuma alteração na PAS (Wieling
et al., 1985; Montano et al., 1994; Bootsma et al., 1994).
Outra metodologia utilizada para avaliar o balanço autonômico é a manobra de Valsalva. Esta foi inicialmente descrita como uma forma de expelir pus do ouvido médio para nasofaringe através da realização de um esforço respiratório contra uma resistência fixa ou fossas nasais e boca fechadas (Nishimura & Tajik, 1985). Esta manobra provoca uma sequência de respostas hemodinâmicas que, por sua vez induzem flutuações da atividade autonômica para o coração e vasos sanguíneos, mediadas pelo sistema barorrefexo arterial (Elisberg et al. , 1953; Liang & Liu, 2006).
As possibilidades oferecidas por novas técnicas computadorizadas para quantificar pequenas oscilações das variáveis cardiovasculares (batimento a batimento), em particular a um eletrocardiograma (intervalo R-R) aumentam a visão de que essas oscilações rítmicas poderiam gerar alguns discernimentos dentro dos mecanismos regulatórios neurais que operam em organismos íntegros, os quais estão submetidos a grandes variações na vida cotidiana.
Avanços na bioengenharia e no processamento de sinais biológicos têm permitido inúmeras possibilidades de novos procedimentos terapêuticos não invasivos, bem como o aumento da capacidade de diagnóstico, especialmente na área cardiovascular (Ribeiro, 1992; 2005).
Nos últimos anos, a análise da variabilidade de frequência cardíaca tem trazido possibilidades reais de observação e compreensão dos mecanismos extrínsecos do controle do ritmo cardíaco em situações fisiológicas e patológicas (Ribeiro, 1992; 2005).
Existem várias metodologias para analisar a VFC. Uma dessas metodologias e a análise da VFC no domínio da frequência. Os fenômenos que apresentam certo grau de ritmicidade podem ser caracterizados por meio da obtenção do espectro de potência das ondas senoidais nas frequências que compõem os ritmos, no domínio do tempo. Com isso, para executar esse procedimento, vê-se necessário transformar os ritmos do domínio do tempo para o domínio da frequência através de procedimentos matemáticos. A transformada rápida de Furrier (FFT) torna-se uma excelente ferramenta para obtenção da densidade espectral da potência (Rajendra et al., 2006).
19
patológicas e sua relação com outros sistemas que também interferem na VFC, (Rajendra et al., 2006).
Fazendo uso da FFT, Akselhold et al., (1981) provaram que a análise espectral da VFC poderia ser utilizada como um método quantitativo para avaliar flutuações na FC. A densidade espectral pode ser obtida por meio da análise de sucessivas séries de intervalos R-R obtidos a partir de um sinal eletrocardiográfico. Esse espectro de potência, geralmente é dividido em três principais regiões: Banda de muito baixa frequência (VLF) 0,0033 Hz a 0,04 Hz; Banda de baixa frequência (Low frequency- LF) de 0,04 a 0,15 Hz expressa a intensidade de modulação simpática sobre o coração; bandas de alta frequência (High frequency- HF) 0,15 a 0,4 Hz, que são devidas à modulação vagal sobre o nódulo sinoatrial. Já em ratos estes componentes espectrais são encontrados em frequências diferentes que variam de 0,20 a 0,75 Hz (LF) e 0,75 a 2,5 Hz (HF) (Dias da Silva et al., 2001).
A normalização dos dados é frequentemente utilizada para minimizar a influência da banda de muito baixa frequência. Essa normalização pode ser realizada através da razão entre as potências de cada um dos componentes HF e LF pelo espectro total da potência, subtraindo o VLF e multiplicando o valor resultante por 100 (Malliani, 1999). Em palavras mais simples, é feito o cálculo percentual de cada componente em relação ao espectro total.
A variabilidade da FC representa um dos mais promissores marcadores da atividade autonômica. A importância clínica deste parâmetro no domínio da frequência tornou-se evidente no fim da década de 1980 quando ficou confirmado que a variabilidade da frequência cardíaca era um forte e independente fator de prognóstico de mortalidade após infarto agudo do miocárdio (Task Force, 1996).
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Figura 3- Exemplo de um segmento de intervalo de ondas sucessivas R-R.
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2.
OBJETIVOS
2.1
Objetivo Geral
Avaliar o efeito da desnutrição e ovariectomia sobre o balanço autonômico cardíaco em ratas.
2.2
Objetivos específicos
• Avaliar temporalmente os valores de PAS e FC
•
Avaliar os níveis basais de pressão arterial e frequência cardíaca, antes da ovariectomia e por 4 meses após o processo cirúrgico.•
Avaliar a participação do componente simpático sobre a manutenção dos níveis basais de frequência cardíaca de ratas controle e desnutridas após privação dos hormônios estrogênicos.•
Avaliar a participação do componente parassimpático sobre a manutenção dos níveis basais de frequência cardíaca de ratas controle e desnutridas após privação dos hormônios estrogênicos.• Avaliar o perfil lipídico e proteico em ratas desnutridas
• Avaliar o ganho de peso e acúmulo de gordura intra-abdominal dos animais após ovariectomia.
23
24
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1
Modelo animal – desnutrição proteica
Para a realização deste trabalho foram utilizadas ratas Fischer, fornecidas pelo Laboratório de nutrição experimental da escola de Nutrição, UFOP-MG. Os procedimentos experimentais seguiram os critérios de ética em experimentação animal, aprovados pela comissão de ética da instituição no protocolo 2009/10. Após período de reprodução foram mantidas em um biotério próprio anexo ao Laboratório de Fisiologia Cardiovascular com todos os procedimentos seguindo também as normas recomendadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Após o desmame, realizado com 28 dias, 56 fêmeas foram divididas em quatro grupos experimentais: Controle Sham (CSham) e Controle OVX (COVX), que passaram a receber uma dieta comercial Labcil/Socil® contendo 15% de proteína, e grupos Desnutridos Sham (DSham) e Desnutridos OVX (DOVX), que receberam dieta experimental de desnutrição contendo 6% de proteína durante 55 dias, para que os animais pudessem ser considerados adultos jovens, onde teve início o experimento, prorrogando-se a dieta por mais 28 semanas, totalizando 279 dias ou 40 semanas de experimento, com animais controle pesando entre 190 e 200 gramas e animais desnutridos pesando ente 80 e 90 gramas. Os animais foram mantidos durante todo experimento em regime de temperatura controlada (23±°1C) e ciclo de 12 horas claro e 12 horas escuro e com livre acesso à agua e comida.
3.2 Composições das dietas
25 Tabela 1- Composição química da dieta para desnutrição experimental (g/100g de dieta)
Ingredientes Desnutrido
Proteína (Caseína) 6
Amido de milho 79
Óleo de soja 8
Mistura de sais¹ 5
Mistura de vitaminas2 1
Fibra (celulose) 1
Teor calórico 422 Kcal
1 Mistura de sais minerais ( g/kg de mistura): NaCl – 139,3/ KI – 0,79/ MgSO4.7H2O- 57,3/ CaCO3- 381,4 / MnSO4.H2O – 4,01 / FeSO4.7H2O – 27,0 / ZnSO4.7H2O – 0,548 / CuSO4.5H2O – 0,477 / CoCl2.6H2O – 0,023 / KH2PO4 – 389,0.
2 Mistura de Vitaminas (g/Kg de Mistura): Acetato de retinol 2.000.000 IU / Colecalciferol – 200.000IU / Ácido p-aminobenzóico – 10,00 / I-Inositol – 10,00 / Niacina – 4,00 / Pantotenato de cálcio – 4,00 / Riboflavina – 0,80 / Tiamina HCL – 0,50 / Ácido fólico – 0,20 / Biotina – 0,04 / Vitamina B12 – 0,003 / Sacarose – q.s.p 1000 / Colina - 200,0 / -Tocoferol – 10.000IU
Devido à natureza do animal, apresentando dentes que apresentam a característica de crescer intermitentemente, destinados a roer, neste trabalho optou-se em alterar a forma que a ração desnutrida que foi dada aos animais, da forma de pó, para o formato de pellets. Com isso esperava-se melhor alimentação dos animais e com menor perda de peso durante o tempo de tratamento.
26
3.3 Protocolos para cirurgia de ovariectomia
Para a realização da cirurgia de ovariectomia dos animais, estes com aproximadamente 85 dias de vida, foram utilizados Ketamina [0,1ml/100g de peso, via intraperitoneal (IP), (Vetbrands, São Paulo, Brasil)] e xilasina [0,02ml/100g de peso, via IP (Agener União, São Paulo, Brasil)] na concentração (ketamina: 80mg/kg ; Xilazina: 7mg/kg). Os flancos direito e esquerdo foram tricotomizados e assepsiados. Com o animal em decúbito lateral, fez-se uma pequena incisão através da pele e da musculatura abdominal entre o bordo superior da coxa e a última costela. Através desse orifício, o ovário foi identificado e exteriorizado. Realizou-se um ponto de ligadura das tubas uterinas e artérias ováricas, a fim de evitar sangramentos excessivos, e então foi realizado a remoção dos ovários. As tubas uterinas forram reposicionadas dentro do abdome, e realizada a sutura local. Os animais foram transferidos para uma gaiola individual sobre uma manta térmica para minimizar os efeitos hipotérmicos provocados pelo anestésico.
3.4 Registros da pressão sistólica (PAS) e Frequência Cardíaca (FC)
por Pletismografia de cauda.
Para tal procedimento, após a realização do esfregaço vaginal para constatação da fase estral em que o animal se encontrava (Proestro, fase escolhida para registros) os animais foram colocados dentro de um tubo cilíndrico de acrílico, contendo frestas para ventilação do animal, onde permaneciam por alguns minutos para adaptação ao novo ambiente. Passado o período de adaptação, as ratas foram aquecidas e ventiladas adequadamente para o registro de PAS e FC.
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sinal captado foi enviado a um amplificador de sinais, RTBP 2000 Rat Tail Blood Pressure System For Rats and Mice (Kent Scientific Corporation) e conectado a um conversor analógico digital PowerLab/400 (ADInstruments, Austrália). A comunicação de dados entre o PowerLab e o computador se dá através de um cabo conectado a uma placa SCSI onde o software Chart for Windows® gerava os registros de pulso, pressão da bomba e frequência cardíaca a partir dos dados enviados pelo amplificador de sinais e conversor analógico digital. Após início do registro, quando o sinal se tornava constante, sem interrupções, era retirado o aquecimento do animal, com o intuito de evitar um superaquecimento.
Utilizando-se a pletismografia de cauda para o registro de pressão arterial sistólica, após o inflar do manguito de borracha adicionado à cauda, tem-se a perda dos sinais de pulso de FC, e concomitantemente, com o desinflar do manguito observa-se o retorno dos sinais de pulso de FC, como pode ser observada a Figura 3 e Figura 4. Diante disso, tem-se como PAS, o primeiro sinal (pico) ocorrido após o ciclo de inflar e desinflar do manguito.
Para análise da PAS, foram tomados dez valores de primeiro sinal (Figura 4) após o ciclo inflar/desinflar e considerado como valor relativo à PAS a média desses valores. Para os valores de FC foram adquiridos dez intervalos de dez segundos entre os ciclos inflar desinflar (Figura 5), e obteve-se a média desses valores, considerando então este valor médio como o valor relativo à FC.
28 Figura 4- Representação da janela de visualização do software Chart® durante um registro de medida indireta de FC e pressão arterial. A seta indica o primeiro pico de sinal após o desinflar da bomba. As linhas: representando o sinal pulso (A), inflar de inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) observa-se a interrupção do sinal de frequência cardíaca com o inflar da bomba.
A
B
29 Figura 5- Representação da janela de visualização do software Chart® durante um registro de medida indireta de FC e pressão arterial. As linhas representando; o sinal de pulso (A), inflar de inflar e desinflar da bomba, (B) e na linha (C) Período entre chaves e retângulo vermelho, demonstrando período tomado como Frequência cardíaca
3.5 Preparo e implante das cânulas arteriais, venosas e eletrodos para
ECG
Para preparação das cânulas destinadas ao implante femoral, foi utilizado tubos de Polietileno PE-50 (Clai Adams, Parsipanny, NJ, EUA), soldados a tubos de polietileno PE-10 (mesmo fabricante), com dimensões ajustadas de acordo com o tamanho do animal. Antes do procedimento de implante das cânulas, estas foram lavadas com solução de salina e preenchidas com solução de salina+heparina (125 U.I.), para evitar a posterior formação de trombos no interior das cânulas vindo assim a prejudicar o sinal de registro. A extremidade livre do PE-50 foi obstruída com um pino de metal. Terminado o preparo das cânulas, os animais foram anestesiados com isoflurano (na proporção de 2 a 2,5%/2L de O2, por via aérea). Após a tricotomia da região inguinal e parede anterior externa do tórax realizou-se a assepsia dessas regiões. Através de uma pequena incisão na região inguinal, o trígono femoral foi exposto (Figuras 7 A e B), os vasos femorais identificados e separados do nervo femoral. Após a
A
B
