Realização: IES parceiras:
TÍTULO: MODULAÇÃO DO PERFIL DE LINFÓCITOS NA OBESIDADE CATEGORIA: EM ANDAMENTO
ÁREA: CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E SAÚDE SUBÁREA: Biomedicina
INSTITUIÇÃO: UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL - UNICSUL AUTOR(ES): MARIA JANAINA LEITE DE ARAÚJO
ORIENTADOR(ES): RENATA GORJÃO
COLABORADOR(ES): VINÍCIUS LEONARDO SOUSA DINIZ, DIEGO RIBEIRO DE SOUZA, MARIA ELIZABETH PEREIRA PASSOS, SANDRO MASSAO HIRABARA, RUI CURI, RENATA GORJÃO
RESUMO DO PROJETO
Na obesidade, há um aumento do tecido adiposo que ocasiona maior secreção de adipocinas pró-inflamatórias. Esse aumento de adipócitos e fatores pró-inflamatórios leva à inflamação crônica que está associada ao desequilíbrio do sistema imunológico e surgimento de patologias associadas. O aumento da leptina plasmática na obesidade resulta na polarização do linfócito T naïve (Th0) para células Th1 acompanhada de inibição das células T reguladoras (Treg). A diferenciação de linfócitos está associada a importantes mudanças metabólicas. O fluxo de metabólitos pela via glicolítica correlaciona-se com a diferenciação das células Th0 para Th1 e Th17, que apresentam atividade inflamatória. Nossa hipótese é de que, em pacientes obesos, ocorre a polarização de linfócitos para o perfil Th1 e Th17 acompanhada por aumento na atividade da via glicolítica. O objetivo deste estudo é avaliar as alterações que ocorrem no metabolismo de linfócitos em indivíduos obesos. Inicialmente foram recrutados 17 homens classificados como obesos, através da análise do índice de massa corporal (IMC) superior a 30 Kg/m2, com idade entre 18 a 50 anos.
Paralelamente, recrutamos 15 homens eutróficos (IMC <25 Kg/m2). Foram realizadas avaliações de composição corporal (análise por bioimpedância) para melhor caracterização do grupo. Em linfócitos, foram avaliados: perfil de resposta Th1, Th2 e Th17, dosagem de leptina e avaliação do consumo de glicose. O presente estudo possibilitará a determinação das alterações metabólicas no processo de diferenciação de linfócitos que podem estar relacionados com o perfil inflamatório observado em indivíduos obesos.
Palavras chave: Imunometabolismo, leptina, via glicolítica, β-oxidação, atividade enzimática, linfócitos Th
INTRODUÇÃO
A obesidade é caracterizada pelo excesso de tecido adiposo presente no organismo.
Geralmente, esta condição é resultado de um desequilíbrio entre consumo e gasto energético e pode ser desencadeada por interações de diversos fatores físicos, genéticos, metabólicos e endócrinos. Durante o desenvolvimento da obesidade,
ocorre o acúmulo progressivo de triglicerídeos nos adipócitos, que ocasiona a secreção de citocinas, adipocinas e outros fatores pró inflamatórios levando à uma condição de inflamação crônica de baixo grau (MANCINI, 2015).
A inflamação crônica de baixo grau está associada ao desequilíbrio do sistema imunológico, causando seu envelhecimento e degradação e alterando sua resposta a estímulos para ativação e inativação (PARISI et al., 2017). Uma importante adipocina envolvida neste processo é a leptina, sua produção é proporcional ao volume de células do tecido adiposo, portanto, o nível de leptina está muito relacionado com o grau de obesidade em modelos animais e em humanos (MARCHI-ALVES et al., 2010).
A leptina modula o sistema imune por meio de efeitos diretos nas respostas inata e adaptativa. Este quadro faz com que os leucócitos fiquem hipo ou hiper responsivos a estímulos diversos, o que favorece o desenvolvimento de doenças relacionadas com a inflamação (MATARESE et al., 2010).
A glicólise é uma via importante para a função das células T efetoras que está relacionada à produção de citocinas inflamatórias, principalmente o INF-gama e IL-2.
Já é bem descrito na literatura que a obesidade causa inúmeras alterações metabólicas no organismo, e que essas alterações metabólicas levam ao surgimento de patologias, entretanto, ainda não temos estudos que elucidem se a obesidade pode levar a alterações no metabolismo energético das células do sistema imune em humanos.
OBJETIVOS
Objetivo deste estudo é avaliar as alterações que ocorrem nas vias metabólicas de linfócitos de indivíduos obesos frente a estímulos para diferenciação.
METODOLOGIA
Coleta de Sangue e separação celular
O sangue foi coletado por punção venosa, em tubos a vácuo contendo anticoagulante EDTA (15 %). Foram coletados cerca 30 mL de sangue por indivíduo participante do estudo. Após a coleta, os tubos foram mantidos em gelo e em seguida foi realizada a separação celular.
Inicialmente os tubos foram centrifugados, e o plasma foi separado. Para a separação de linfócitos, foi utilizado o reagente Histopaque® 1077. Posteriormente,
as células mononucleares foram incubadas em garrafas de cultura por uma hora, a 37°C. Nesta etapa os monócitos aderem à garrafa e os linfócitos permanecem no sobrenadante. Após a obtenção dos linfócitos, nós realizamos a contagem na câmara de Neubauer e congelamos no freezer a -80ºC em SFB + 10% de DMSO.
Dosagem de leptina
O experimento de dosagem de leptina foi realizado através do método de ELISA. Foi adicionado o anticorpo de captura em cada poço e a placa foi incubada por 12h, à temperatura ambiente. No dia seguinte, foi realizada a curva padrão de leptina e a adição da amostra, a placa foi incubada, e depois foi adicionado o anticorpo de detecção conjugado com a enzima peroxidase. Posteriormente, foi adicionada uma solução de substrato da enzima que se liga ao anticorpo conjugado à leptina para a sua detecção, a placa foi incubada novamente, adicionamos a solução Stop e, por fim, foi realizada a análise da absorbância a 450 nm.
Avaliação de captação de glicose
Para a avaliação da captação de glicose a placa foi preparada com meio RPMI para a ressuspensão das células e após isso foi adicionado o estímulo de PMA + ionomicina. A placa foi mantida em cultura por 12h. No dia seguinte, após centrifugação, os linfócitos foram incubados com 2-NBDG (análogo da glicose) durante 60 min. Posteriormente, as células foram analisadas através do citômetro de fluxo BD-Accuri. Foram registrados 10.000 eventos em FL-1.
RESULTADOS PRELIMINARES Casuística
Iniciamos o estudo com 36 voluntários. Destes, 4 amostras foram retiradas do estudo por baixo rendimento celular. De acordo com a caracterização pelo IMC, baseado nas diretrizes da Organização Mundial de Saúde (OMS), entre os 32 voluntários, 15 foram caracterizados como eutróficos (IMC menor que 25 Kg/m2) e 17 como obesos (IMC maior que 30 Kg/m2). Dos 17 voluntários obesos, 6 não possuem doenças crônicas, como diabetes e dislipidemias, 11 apresentam resistência à insulina, e destes, 4 apresentam hipertrigliceridemia. Dos 15 voluntários eutróficos, 5 possuem resistência à insulina e 2 apresentam hipertrigliceridemia.
Dosagem de leptina
Em relação à concentração plasmática de leptina, observamos que os indivíduos obesos apresentaram níveis de leptina 3,9 vezes maiores quando comparados aos voluntários eutróficos.
Figura 1. Concentração plasmática de leptina no grupo de obesos e eutróficos.
A concentração de leptina foi determinada no plasma sanguíneo de indivíduos eutróficos e obesos. Os valores estão apresentados como média ± Desvio padrão da média. Obesos, n= 19. Eutróficos, n= 17. *P<0,001 versus eutrófico.
Avaliação da porcentagem de células Th1, Th2 e Th17
No grupo obeso, foram observadas maiores porcentagens de células Th1 e Th17 quando comparado com o grupo eutrófico na presença de estímulo. Na condição basal, não observamos diferenças significativas. Na avaliação da porcentagem de células de perfil Th2, não foram observadas diferenças significativas.
Figura 2. Avaliação da porcentagem de células com perfil Th1 (CD4+ e INF-+), Th2 (CD4+ e IL4+) e Th17 (CD4+ e IL17+). Os dados foram obtidos através de análise realizada no citômetro de fluxo BD-Accuri em FL3 e FL1 (Th1), FL3 e FL4 (Th2) e FL3 e FL2 (Th17). Foram analisados 20 mil eventos por aquisição. Os dados estão apresentados como média ± D.P. (desvio padrão). N= 15 para obesos e N=12 para eutróficos.
Ensaio de captação de glicose por linfócitos
Para este parâmetro, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos obesos e eutróficos, tanto no estado basal como na condição estimulada.
Figura 3. Avaliação da captação de glicose. A análise da fluorescência foi realizada no citômetro de fluxo BD-Accuri em FL1. Foram analisados 30 mil eventos por aquisição. Os dados estão apresentados como média ± D.P. (Desvio padrão). N= 15 para obesos e N=12 para eutróficos
FONTES CONSULTADAS
ABELLA, V., et al. Leptin in the interplay of inflammation, metabolism and immune system disorders. Nature, 2017
BATRA, A. et al., Leptin: A Critical Regulator of CD4+ T-cell Polarization in Vitro and in Vivo. Endocrinology. v.151, n.1, p.56–62, 2010.
MATARESE, G., et al. Regulatory T cells in obesity: the leptin connection. Trends Mol Med. v.16, n.6, p.247-56, 2010.
PARISI, M. M., et al. "Immunosenescence Induced by Plasma from Individuals with Obesity Caused Cell Signaling Dysfunction and Inflammation." Obesity (Silver Spring) 25(9): 1523-1531, 2017
VEGA-CÁRDENAS, Mariela et al. Increased levels of adipose tissue-resident Th17 cells in obesity associated with miR-326. Immunol Lett, v. 211, p. 60-67, 2019.
