PROTOCOLO2AULAPRÁTICA

TRABALHO 2

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Determinação da actividade da ALT, dos níveis de ureia, bilirrubina e glucose num indivíduo em estudo

Introdução

Doença hepática

O fígado desempenha um papel fundamental no metabolismo de proteínas, hidratos de carbono e lípidos. Vias metabólicas como a glicólise e gluconeogénese, ciclo de Krebs, síntese e oxidação de ácidos gordos, síntese de corpos cetónicos, síntese e degradação de aminoácidos (incluindo ciclo da ureia) e os processos de fosforilação oxidativa ocorrem todas nos hepatócitos, sendo algumas destas vias específicas do fígado. As células hepáticas são ainda responsáveis pelo metabolismo, destoxificação e excreção de compostos quer endógenos, quer exógenos. A excreção de produtos finais do metabolismo, quer de nutrientes quer de toxinas, bem como de produtos como os sais biliares, ocorre na árvore biliar. Os testes bioquímicos de função hepática consistem em medições de parâmetros sanguíneos que permitem avaliar a existência, extensão e tipo de danificação hepática. Geralmente, recorre-se à medição de bilirrubina, transaminarecorre-ses, fosfatarecorre-se alcalina e proteínas plasmáticas.

Doença renal

A unidade funcional do rim é o nefrónio. Os rins regulam o volume de fluido extracelular, assim como a sua composição em electrólitos, para compensar as variações diárias de consumo/absorção de água e electrólitos. É nos nefrónios que se forma a urina, através da qual são excretados os produtos potencialmente tóxicos do metabolismo. As funções do rim incluem então:

- regulação dos níveis de água e balanço de electrólitos e ácido-base;

- excreção dos produtos do metabolismo: ureia, creatinina, ácido úrico, sulfato e fosfato. Os rins são também órgãos endócrinos, produzindo algumas hormonas (ex: vasopressina, hormonas reguladoras do metabolismo do cálcio).

A falha renal pode surgir como consequência de diversos problemas que afectam o rim e/ou a sua circulação. De uma forma geral, é indicada primariamente por uma subida crescente nas concentrações de ureia e creatina plasmáticas.

Glucose

A glucose é um monossacarídeo de fórmula molecular C6H12O6, sendo um composto de grande importância para o organismo, pois da sua oxidação completa resulta um ganho energético para a célula de 38 moléculas de ATP, utilizado no metabolismo celular.

A glucose encontra-se armazenada sob a forma de amido nas células vegetais e sob a forma de glicogénio nas células animais. Deste modo, a célula pode poupar a glicose armazenando-a na forma de glicogénio para posterior degradação e consequente produção energética.

Em condições aeróbicas, a glucose é oxidada a CO2 e H2O através de 3 passos: a glicólise (com formação de ácido pirúvico), o ciclo de Krebs e a cadeia transportadora de electrões. Em condições de anaerobiose, ocorre apenas a glicólise, produzindo-se lactato (nas células animais) e etanol nas leveduras (fermentação alcoólica).

O fígado é, em termos de utilização de glucose, o tecido menos egoísta do organismo, uma vez que armazena sob a forma de glicogénio a glucose que não utiliza, fornecendo-a a outros tecidos sempre que necessário, principalmente ao cérebro, que utiliza quase exclusivamente glucose como fonte energética.

A concentração de glucose no sangue é controlada por duas hormonas segregadas pelo pâncreas: a insulina e o glucagon.

Insulina

A insulina está associada ao metabolismo dos hidratos de carbono, proteínas e ácidos gordos. Segundos após a insulina se ligar aos receptores membranares das células dos músculos e do tecido adiposo (entre outros tipos de células), aumenta a permeabilidade à glucose.

A grande quantidade de glucose que entra nas células é rapidamente fosforilada e torna-se substrato para o metabolismo dos hidratos de carbono.

A secreção de insulina é normalizada por um mecanismo de feedback. Isto é, após o aumento de glucose no sangue, a concentração de insulina aumenta de forma a permitir o transporte dessa glucose para dentro do músculo, tecido adiposo e outras células, bem como a síntese de glicogénio no fígado. Diminuindo a concentração de glucose no sangue, a insulina retoma os seus valores basais.

Glucagon

O glucagon é uma hormona segregada pelas células  dos ilhéus de Langerhans do pâncreas, quando os níveis de glucose descem. As suas funções são basicamente opostas às da insulina. Os dois maiores efeitos do glucagon sobre a glicose são a glicogenólise e a gluconeogénese no fígado. Estes dois efeitos aumentam a quantidade de glucose disponível para os outros tecidos do corpo.

Tal como para a insulina, a concentração de glucose no sangue é o principal factor controlador da secreção de glucagon. Num estado de hipoglicémia, o glucagon é segregado em grande quantidade de forma a corrigir esta alteração. Dois outros factores podem estimular a libertação de glucagon: aminoácidos provenientes da dieta (os quais serão posteriormente convertidos em glucose) e exercício (evitando a hipoglicémia).

Patologias implicadas

A diabetes mellitus resulta de uma diminuição da secreção de insulina pelas células  do pâncreas. Esta patologia é normalmente hereditária, mas a obesidade tem, nestes casos, um papel não menos importante. As células  tornam-se menos sensíveis aos níveis de glucose no sangue e, deste modo, a insulina não é segregada quando é necessária. As concentrações de glucose de um diabético variam entre 300 e 1200 mg/dl.

O hiperinsulinismo é mais raro que a diabetes e consiste num aumento da produção de insulina. Deve fornecer-se glucose a estes pacientes para evitar um estado de hipoglicémia.

Objectivo

Neste trabalho, será estudado um paciente, no qual serão analisados diferentes parâmetros bioquímicos, tais como: transaminases (ALT), ureia, bilirrubina e glucose. Neste contexto, a presente aula, tem como objectivo inferir o estado clínico do paciente.

Procedimento experimental

1. Recolha das amostras sanguíneas (já efectuada)

Recolher 3 ml de sangue total de um indivíduo saudável (plasma1) e do indivíduo em estudo (plasma 2). Centrifugar imediatamente todos os soros a 3000 rpm, 5 minutos.

2.

A - Determinação dos níveis plasmáticos de transaminases

A alanina transaminase (ALT) catalisa a reacção:

L-alanina + -cetoglutarato piruvato + L-glutamato

Piruvato + NADH + H+ _{L-Lactato + NAD}+

1. Para cuvetes de quartzo, pipetar os reagentes de acordo com a tabela seguinte. De notar

que as amostras de plasma são duas.

Amostra (µl) Branco (µl)

Plasma 100

-Água - 100

Reagente 1 1000 1000

2. Misturar cuidadosamente e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. 3. Adicionar 100 µl de reagente 2 a cada cuvete.

4. Misturar cuidadosamente e incubar durante 1 minuto à temperatura ambiente. 5. Determinar as absorvâncias a 340 nm, e repetir a leitura após 1, 2 e 3 minutos. 6. Calcular a Abs/min.

B - Determinação dos níveis plasmáticos de bilirrubina

1. Identificar 4 tubos de ensaio (plasma 1, plasma 2, branco 1 e branco 2) e pipetar os

reagentes de acordo com a tabela que se segue:

Amostra Branco Reagente R1 (µl) 200 200 Reagente R2 (gotas) 1 -NaCl 9 g/l (ml) - 2,0 Reagente R3 (ml) 2,0 -Plasma 1 ou 2 (µl) 200 200

2.

3. Ler a densidade óptica a 540 nm.

C - Determinação dos níveis plasmáticos de ureia

1. Identificar 4 tubos de ensaio (plasma 1, plasma 2, padrão e branco). Pipetar, para

cada um deles, os reagentes de acordo com a tabela seguinte:

Amostra Padrão Branco

Reagente R1 (ml) 1,0 1,0 1,0

Plasma 1 ou 2 (µl) 10 -

-Padrão (µl) - 10

-Água (µl) - - 10

2. Incubar 10 minutos à temperatura ambiente.

3. Adicionar, a cada tubo de ensaio, 1 ml de reagente R2. 4. Incubar 10 minutos à temperatura ambiente.

5. Ler a absorvância a 580 nm.

D - Determinação dos níveis plasmáticos de glucose

glucose + O2 ácido glucónico + H2O2

H2O2 + fenol + amino-4-antipirina quinonoimina + 4 H2O Este método utiliza a glucose oxidase (GOD) e uma reacção colorimétrica catalisada pela enzima peroxidase (HPOD). A glucose é oxidada a D-gluconato, com consequente formação de uma quantidade equimolar de peróxido de hidrogénio. Na presença de peroxidase, a 4-aminoantipirina (4AAP) e o fenol são acoplados oxidativamente pelo peróxido de hidrogénio, formando uma substância corada – a quinonoimina.

1. Identificar 4 tubos de ensaio (plasma 1, plasma 2, branco 1 padrão) e pipetar os

reagentes de acordo com a tabela que se segue:

Amostra Padrão Branco

Plasma (µl) 10 - -Água (µl) - - 10 Padrão (µl) - 10 -Reag. Coloração (ml) 1.0 1.0 1.0 2. Agitar as misturas. GOD HPOD

4. Ler a D.O. das soluções a 510 nm.

Resultados e Discussão

1. Calcule as concentrações dos diversos parâmetros bioquímicos estudados nas amostras

analisadas, tendo em conta as seguintes fórmulas:  ALT (U/l) = Abs/min 1905

 [Bilirrubina] (mg/dl) = (Absamostra – Absbranco)  17,5  [Ureia] (mg/dl) = (Absamostra/Abspadrão) 50

 [Glucose] (mg/dl) = (Absamostra  100) / Abspadrão

2. Justifique e caracterize, em termos bioquímicos, o paciente em estudo, esclarecendo

a proveniência metabólica dos parâmetros analisados. Utilize como controlo os valores encontrados para a amostra referente ao indivíduo saudável.