Juliana Montagna Hartwig
NEUROTOXICIDADE INDUZIDA PELO CLORETO DE MANGANÊS: MODELO EXPERIMENTAL DE MANGANISMO
EM RATOS WISTAR
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Farina Coorientadores: Drª. Danúbia Bonfanti dos Santos de Godoi
Prof. Dr. Márcio Ferreira Dutra
Florianópolis 2016
AGRADECIMENTOS
Sempre a Deus, em primeiro lugar, pelas oportunidades que Ele me proporciona, pelas conquistas, mas também pelas falhas que cometi, mas que me permitiram aprender, amadurecer e ser uma pessoa melhor, pessoal e profissionalmente;
A meus pais e irmão, os quais são o apoio necessário para que eu decida sempre qual o melhor caminho seguir, e são também o meu fôlego nos momentos em que é preciso de um ar extra para respirar e relaxar; Ao meu orientador, o Professor Dr. Marcelo Farina, pela acolhida nestes 5 anos que estive no laboratório, desde os tempos de IC, que lecionou os seus ensinamentos, não somente didáticos, mas também para a vida, da melhor maneira possível;
À minha coorientadora, Drª Danúbia Bonfanti dos Santos de Godoi, que além de grande amiga, me ensinou a ser uma pessoa paciente e mais humilde, e demonstrou que sempre podemos contar com o próximo, estando perto ou longe;
Ao meu coorientador, Prof. Dr. Márcio Ferreira Dutra, pelo auxílio nos momentos de dúvida e à Profª Drª. Patrícia de Souza Brocardo, pelo empréstimo do vibrátomo, pelo auxílio nunca negado e pela amizade que se manterá;
Às companheiras de laboratório Dirleise Colle, que tive o privilégio de acompanhar durante a iniciação científica e obtive grandes instruções, e Viviane de Souza, que por pouco tempo foi minha IC, mas sua ajuda sempre foi de grande valia;
À Heloísa Ghizoni, Cinara Ludvig Gonçalves, Diones Caeran Bueno, Aline Aita Naime, Marina Ventura e Sthéfani Spricigo Portilho, Mariana Appel Hort, Alessandra Antunes do Santos e demais colegas de laboratório, pela amizade que temos e manteremos nos anos que seguirão, ademais, pela ajuda, que direta ou indiretamente, me auxiliaram no curso desde IC até este Mestrado e no desenvolvimento deste projeto;
Ao Prof. Dr. Rui Prediger, pelo empréstimo do rotarod e aos técnicos do LAMEB, por assessorarem na utilização dos equipamentos;
Aos colegas de corredor, pelas risadas, fofocas, bares e temakis pós expediente;
À CAPES, pelo fornecimento da bolsa, ao Programa de Pós-Graduação em Bioquímica e aos professores deste curso, pela experiência aqui adquirida..
RESUMO
O Manganês (Mn) é um metal essencial extremamente importante para os sistemas biológicos. Contudo, a exposição excessiva ao Mn causa toxicidade a diversos órgãos/sistemas, incluindo o sistema nervoso central (SNC). O excesso de Mn pode levar à síndrome conhecida como manganismo, uma condição neuropatológica em que alguns sintomas se assemelham a aqueles encontrados na doença de Parkinson (DP) idiopática. Apesar das similaridades entre ambas as condições, há eventos específicos relacionados à intoxicação por Mn, dentre os quais destaca-se perda neuronal e gliose no globo pálido (GP) e estriado. O objetivo deste estudo foi investigar os possíveis efeitos neurotóxicos da exposição ao MnCl2 em um modelo experimental em ratos Wistar de 3 meses de idade,
o qual baseou-se na administração de 4 injeções intraperitoneais de uma solução de MnCl2 (dose de 25 mg/kg), sendo administrada uma injeção
por dia nos dias 1, 3, 5 e 7. Além disso, objetivou-se avaliar a potencial reversibilidade desta toxicidade através da realização de testes comportamentais, bioquímicos e imunohistoquímicos 24 h imediatamente após a última exposição ao MnCl2 (dia 8), assim como
depois de um período de latência de 30 dias. Vinte e quatro h após a última exposição ao Mn, observou-se uma significativa redução no número de cruzamentos e levantadas no teste do campo aberto e um significativo aumento no número de resvaladas no teste do beam walking nos ratos tratados com MnCl2 quando comparados com animais do grupo controle.
Não houve diferença significativa entre os grupos nos níveis estriatais de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), tióis não-proteicos (NPSH), na atividade das enzimas antioxidantes glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD), nem na atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória mitocondrial. A imunorreatividade para a enzima tirosina hidroxilase (marcadora de neurônios catecolaminérgicos, TH) diminuiu significativamente no estriado dos animais expostos ao Mn 24 h após o tratamento, tendo sido normalizada após à latência de 30 dias. Os níveis da proteína ácida fibrilar glial (GFAP) foram significativamente aumentados apenas no globo pálido (GP) dos animais expostos ao Mn somente aos 30 dias após o tratamento. Não houve diferença na imunorreatividade para a enzima glutamato descarboxilase (marcadora de neurônios GABAérgicos, GAD 65). A reversão dos danos motores e da imunomarcação da TH revelam que há uma potencial reversibilidade que se segue após o término da exposição ao MnCl2. Conclui-se que o desenho experimental deste
levam ao manganismo, após uma intoxicação aguda por MnCl2. Ainda, a
gliose reativa (aumento da reatividade da GFAP) observada no GP aos 30 dias após a exposição sugere a existência de um processo reativo/inflamatório tardio, o qual poderia ser responsável por eventos neurodegenerativos tardios decorrentes da exposição ao Mn.
Palavras-chave: Cloreto de manganês. Neurotoxicidade. Manganismo. Estriado. Globo pálido.
ABSTRACT
Manganese (Mn) is an essential metal extremely important for biological systems. However, the exposure to excessive Mn causes toxicity to various organ/systems, including the central nervous system (CNS). Importantly, excessive exposure to Mn can lead to the syndrome known as manganism, a neuropathological condition whose symptoms are similar to those found in idiopathic Parkinson's disease (PD). Despite the similarities between both conditions, there are specific events linked only to Mn intoxication such as neuronal loss and gliosis in the globus pallidus (GP) and striatum. The aim of this study was to investigate the potential neurotoxic effects of exposure to MnCl2 in an experimental
model with adult (3 months) rats, based on the administration of 4 intraperitoneal injections of MnCl2 (dose of 25 mg/kg), being
administered at days 1, 3, 5 e 7. In addition, we aimed to evaluate the potential reversibility of such toxicity by using behavioral, biochemical and immunohistochemical tests 24 hours immediately after the last exposure to MnCl2 (at day 8), as well as after a 30 days latency period .
Twenty-four h after the last Mn injection, there was a significant reduction in the number of crossings and rearings in the open field test, as well as a significant increase in footslips in the beam walking test on rats treated with MnCl2 when compared to the control group. There were no
significant differences in the striatal levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS), nonprotein thiols (NPSH), in the activity of antioxidant enzymes glutathione reductase (GR), glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD), as well as in the activities of complex I and II of the mitochondrial respiratory chain. Tyrosine hydroxilase (a marker of catecholaminergic neurons, TH) immunoreactivity decreased in the striatum of Mn exposed rats at 24 h after treatment, but it returned to control levels after the latency period. The glial fibrillary acidic protein (GFAP) levels increased only in GP at 30 days after Mn exposure. There was no difference in the immunoreactivity for glutamate decarboxylase (a marker of GABAergic neurons, GAD 65). The absence of the motor impairment and changes in TH immunostaining at 30 days after Mn exposure revealed the reversibility of symptoms triggered by MnCl2 exposure. We conclude that
the experimental design of this study represents a useful strategy to study the mechanisms that lead to manganism, especially after an acute exposure to MnCl2. Moreover, the observed reactive gliosis (increased
occurrence of delayed reactive/inflammatory processes, which could be responsible for neurodegenerative events following Mn exposure.
Keywords: Manganese chloride. Neurotoxicity. Manganism. Striatum. Globus pallidus.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Transporte do Mn para dentro do cérebro...20
Figura 2: Região afetada pela DP...23
Figura 3. Regiões afetadas pelos manganismo...25
Figura 4. Diagrama de Venn...26
Figura 5. Linha do tempo experimental...36
Figura 6. Efeitos do MnCl2 no peso corpóreo de ratos após 24 h e 30 dias de tratamento...43
Figura 7. Efeitos do MnCl2 no número de cruzamentos e de levantadas em ratos 24 h e 30 dias após tratamento... 44
Figura 8. Efeitos do MnCl2 no teste do beam walking em ratos 24 h e 30 dias após tratamento...46
Figura 9. Efeitos do MnCl2 nos níveis estriatais de TBARS de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...48
Figura 10. Efeitos da exposição do MnCl2 sobre a imunomarcação da TH no estriado de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...51/52 Figura 11. Efeitos da exposição ao MnCl2 sobre a imunomarcação da TH no GP de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...52/53 Figura 12. Efeitos da exposição do MnCl2 sobre a imunomarcação do GFAP no estriado de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...54
Figura 13. Efeitos da exposição ao MnCl2 sobre a imunomarcação do GFAP no GP de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...55 Figura 14. Efeitos da exposição ao MnCl2 sobre a imunomarcação do GAD no estriado e no GP de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...56/57
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Modelos experimentais encontrados na literatura...39 Tabela 2. Efeitos do MnCl2 no teste do rotarod em ratos 24 h e 30 dias após tratamento...45 Tabela 3. Efeitos do MnCl2 no teste do grid em ratos 24 h e 30 dias após tratamento...47 Tabela 4. Efeitos do MnCl2 nos níveis estriatais de NPSH 24 h e 30 dias após tratamento em ratos...48 Tabela 5. Efeitos do MnCl2 na atividade do complexo I e II estriatal em 24 h e 30 dias após tratamento em ratos...49 Tabela 6. Efeitos do MnCl2 na atividade da GR e GPx estriatais em 24 h e 30 dias após tratamento em ratos...50 Tabela 7. Efeitos do MnCl2 na atividade da SOD estriatal em 24 h e 30 dias após tratamento em ratos...51
Tabela 8.Efeitos da exposição do MnCl2 sobre a imunomarcação da GAD 65 no estriado e GP de ratos 24 h e 30 dias após o tratamento...56
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ATP: Adenosina trifosfato BHE: Barreira hematoencefálica DA: Dopamina
DAérgico: Dopaminérgico DP: Doença de Parkinson
DPI: Doença de Parkinson idiopática
DTNB: 5,5’-ditiobis-(2-Ácido Nitrobenzóico) EROs: Espécies reativas de oxigênio
GABA: Ácido gama-aminobutírico GABAérgico: Neurônio GABAérgico GAD 65: Glutamato descarboxilase 65 GFAP: Proteína glial fibrilar ácida GP: Globo pálido
GPx: Glutationa peroxidase GR: Glutationa redutase GSH: Glutationa reduzida GSSG: Glutationa oxidada
HEPES: Ácido N-2-Hidroxietilpiperazina-N'-2-Etanosulfônico I.p.: Intraperitoneal
MDA: Malondialdeído Mn: Manganês
MnCl2: Cloreto de manganês
MMT: Tricarbonil metilciclopentadienil de manganês NaCl: Cloreto de sódio
NADH: Dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NADPH: Nicotinamida adenina dinucleotídeo 2′-fosfato reduzido NPSH: Tióis não-protéicos
PBS: Tampão fosfato salina PFA: Paraformaldeído SNC: Sistema nervoso central
SNpc: Substância negra pars compacta SOD: Superóxido dismutase
TBA: Ácido 2-tiobarbitúrico
TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico Tf: Transferrina
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO ... 19
1.1 O MANGANÊS E SUA ATUAÇÃO NO ORGANISMO ... 19
1.2 EXPOSIÇÃO E TOXICIDADE CEREBRAL DO MN ... 20
1.3 DOENÇA DE PARKINSON ... 23
1.4 MANGANISMO ... 24
1.5 DP X MANGANISMO ... 26
1.6 MODELOS EXPERIMENTAIS COM MN ... 27
2. JUSTIFICATIVA ... 31 3. OBJETIVOS ... 33 3.1 OBJETIVO GERAL: ... 33 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ... 33 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 35 4.1 REAGENTES E ANTICORPOS ... 35
4.2 ANIMAIS E PROTOCOLO EXPERIMENTAL ... 35
4.3 ANÁLISES COMPORTAMENTAIS ... 36
4.4 PREPARAÇÃO TECIDUAL PARA ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 38
4.5 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO ... 38
4.6 TIÓIS NÃO-PROTÉICOS (NPSH) ... 38
4.7 ATIVIDADES DOS COMPLEXOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA ... 39
4.8 ENZIMAS ANTIOXIDANTES ... 39
4.9 PREPARAÇÃO DO TECIDO PARA AS ANÁLISES IMUNO-HISTOQUÍMICAS ... 40
4.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS ... 41
5. RESULTADOS ... 43
5.1 AVALIAÇÃO DO PESO CORPÓREO APÓS TRATAMENTO COM MNCL2 ... 43
5.2 AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL APÓS O TRATAMENTO COM MNCL2 ... 44
5.3 ANÁLISES BIOQUÍMICAS APÓS TRATAMENTO COM MNCL2 ... 47
5.4 ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA APÓS TRATAMENTO COM MNCL2 ... 49
5.5 ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES APÓS TRATAMENTO COM MNCL2 ... 50
5.6 IMUNO-HISTOQUÍMICA APÓS TRATAMENTO COM MNCL2 ... 51
6. DISCUSSÃO ... 59
7. CONCLUSÃO ... 65
1.INTRODUÇÃO
1.1 O MANGANÊS E SUA ATUAÇÃO NO ORGANISMO
O manganês (Mn) foi descoberto no século 18, por Carl Wilhelm Scheele (ANDRUSKA e RACETTE, 2015), e é o décimo segundo elemento mais comum na natureza (CHEN et al., 2015). É um elemento essencial extremamente importante para os sistemas biológicos, sendo requerido no crescimento normal, desenvolvimento e homeostase celular (ASCHNER et al., 2009), (CHTOUROU et al., 2010). De particular importância, no sistema nervoso central (SNC), o Mn atua como cofator de diversas enzimas, dentre elas estão a arginase, piruvato carboxilase (CHEN et al., 2015), superóxido dismutase, glutamina sintetase e outras envolvidas na síntese e metabolismo de neurotransmissores (GOLUB et al., 2005).
No que diz respeito ao seu metabolismo no organismo, sabe-se que apenas em torno de 5% da quantidade ingerida deste metal é absorvida, sendo o restante excretado nas fezes (ROTH, 2009). Andruska e Racette (ANDRUSKA e RACETTE, 2015) relataram que a porção de Mn absorvida, que não é utilizada no metabolismo enzimático, segue uma rota diferente, passando pelo metabolismo de primeira-passagem, tendo então, a bile como destino final.
Segundo Aschner e Aschner (ASCHNER e ASCHNER, 1991), após o consumo, pressupõe-se que o Mn seja absorvido e direcionado à circulação porta (Fig. 1), com estado de oxidação 2+. No plasma, o Mn2+ se ligaria à α2-macroglobulina ou albumina. Contudo, ainda no fígado, uma ínfima fração pode ser oxidada pela ceruloplasmina a Mn catiônico trivalente (Mn3+). Nesse estado, ele adentraria na circulação sistêmica,
conjugado à transferrina (Tf) plasmática.
Conjugados de Mn-Tf são internalizados pelos neurônios, lugar este que o complexo se dissocia (ASCHNER e ASCHNER, 1991). Os níveis de Mn no SNC são regulados por diversos mecanismos de transporte, dentre os quais destaca-se o sistema de Tf/receptor de Tf (CORDOVA et al., 2012). A neurotoxicidade do Mn está, presumivelmente, relacionada à disponibilidade de Mn3+ na circulação
sistêmica e a sua taxa de transporte através da barreira hematoencefálica (BHE) (ASCHNER e ASCHNER, 1991).
Em humanos, o Mn atravessa a BHE tanto nos adultos quanto nos fetos e crianças (ASCHNER e ASCHNER, 1991). Quando inalado, o Mn presente nos pulmões é absorvido e então direcionado à circulação sistêmica, esquivando-se do metabolismo de primeira-passagem. Assim,
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o Mn é transportado pelo sangue e atravessa, prontamente, a BHE (ANDRUSKA e RACETTE, 2015).
Estruturas encefálicas contêm, normalmente, uma pequena quantidade de Mn. Em altas concentrações, esse metal pode provocar doença cerebral irreversível, com distúrbios psicológicos e neurológicos proeminentes (ASCHNER e ASCHNER, 1991). Portanto, apesar de essencial, a exposição excessiva ao Mn pode causar toxicidade a diversos órgãos/sistemas (ROTH, 2009), incluindo o SNC (RAMA RAO et al., 2007). Fig. 1: Transporte do Mn para dentro do cérebro. Metabolismo proposto para o transporte de Mn2+ em mamíferos (as setas não estão em escala). Tf: transferrina. Adaptada de Aschner e Aschner (ASCHNER e ASCHNER, 1991).
1.2 EXPOSIÇÃO E TOXICIDADE CEREBRAL DO MN
Os seres humanos são expostos ao Mn pela via alimentar, através do uso de drogas que contêm Mn, como a efedrona (SIKK et al., 2011) e exposição respiratória (MARTINEZ-FINLEY et al., 2013). A absorção pulmonar e o transporte de partículas de Mn através do bulbo olfatório podem levar à deposição de Mn no estriado, além de conduzir a inflamação do epitélio nasal (ROTH, 2009).
Quimicamente, o Mn coexiste nas formas orgânica e inorgânica. Na forma inorgânica, ele é mais comum no ambiente, e é utilizado no branqueamento têxtil, na indústria de ferro, aço, e pilhas (BOUABID et al., 2015). Uma das formas mais importantes de exposição a este metal relaciona-se ao alto contato de mineradores com o mesmo, além de indústrias que produzem baterias, alumínio e soldagem (ASCHNER et al., 2009). Já na forma orgânica, o Mn está presente em fungicidas, a exemplo do Maneb, e em agentes de contraste na ressonância magnética (BOUABID et al., 2015).
No entanto, para o restante da população, o maior contato se dá pela ingestão de água de poço que possua elevados níveis de Mn e, possivelmente, pelo Mn liberado na atmosfera como resultante da adição de tricarbonil metilciclopentadienil de manganês (MMT) à gasolina (ASCHNER et al., 2009).
Ainda, a alimentação parenteral representa uma importante forma de exposição ao Mn, principalmente em recém-nascidos (ERIKSON et al., 2007). Neste contexto, salienta-se que os cérebros de neonatos ou que estão em desenvolvimento são os mais suscetíveis à toxicidade do Mn. Além do mais, a absorção intestinal do metal é maior na primeira semana de vida, decaindo constantemente com a idade. Tais fatores contribuem para um risco maior de neurotoxicidade para recém-nascidos quando expostos ao excesso do metal (MOLINA et al., 2011).
Rama Rao e cols. (RAMA RAO et al., 2007) demonstraram que a exposição excessiva ao Mn pode levar a efeitos prejudiciais ao SNC. A exposição a altos níveis de Mn pode ocasionar disfunção motora extrapiramidal e psiquiátrica severa, similar à encontrada na doença de Parkinson (DP) (HAMAI e BONDY, 2004).
O acúmulo desse metal no cérebro pode gerar sintomas característicos da doença, como irritabilidade, labilidade emocional e alucinações, sendo que estes aparecem meses antes das desordens do movimento (HAMAI e BONDY, 2004), tais como bradicinesia, rigidez (MA et al., 2015), tremor de repouso e instabilidade postural (GUILARTE, 2010). Esses quatro sintomas motores são típicos do parkinsonismo, e estão presentes em até 15% dos trabalhadores expostos ao Mn (RACETTE, 2014). Parkinsonismo, apesar de ser uma expressão clínica, delineia sintomas ligados à disfunção dos gânglios basais (CERSOSIMO e KOLLER, 2006).
O Mn possui afinidade por neuromelanina, pois esta é capaz de interagir com metais pesados (ZECCA et al., 2001). Desse modo, regiões que contêm neuromelanina e são ricas em neurônios dopaminérgicos (DAérgicos), como os gânglios basais e o globo pálido (GP) (LUCCHINI,
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MARTIN e DONEY, 2009), acumulam o Mn de forma bastante intensa quando comparadas a outras estruturas.
Alguns estudos indicam que a intoxicação por Mn resulta em perda neuronal e gliose estriatal e no GP (MORELLO et al., 2008). Isso está em conformidade com Eng e cols (ENG, GHIRNIKAR e LEE, 2000) e Peres e cols. (PERES et al., 2015), os quais afirmam que animais expostos ao Mn apresentam um aumento da expressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP), a qual relaciona-se diretamente com a ativação de astrócitos. Os astrócitos são células que, além de desempenhar inúmeras funções metabólicas e de suporte, ajudam a compor um sistema imune restrito ao SNC (CHIN-CHAN, NAVARRO-YEPES e QUINTANILLA-VEGA, 2015). Esse tipo celular merece destaque nos estudos referentes à exposição ao Mn visto que são alvos precoces da sua toxicidade (EXIL et al., 2014), devido a sua grande capacidade de acumular o metal (GONZALEZ et al., 2008).
Neurônios glutamatérgicos e GABAérgicos são outros tipos celulares que são dignos de estudos, visto que grande parte da demanda do metabolismo energético no SNC é voltado para a neurotransmissão excitatória e inibitória, respectivamente. Neste contexto, há evidências sugerindo que o prejuízo nos mecanismos dos movimentos com a exposição crônica ao Mn se daria pela alteração astroglial e no metabolismo neuronal associado aos neurônios glutamatérgicos e GABAérgicos (BAGGA e PATEL, 2012). De fato, pesquisas retrataram que o sistema GABAérgico estriatal também pode estar envolvido em déficits locomotores após a exposição ao Mn (YANG et al., 2011).
Alguns estudos indicam que, se houver um desajuste nas neurotransmissões glutamatérgicas e/ou GABAérgicas, esse pode ser um importante componente para que se explique a neurotoxicidade do Mn (BURTON et al., 2009). Tal qual afirma Burton e cols (BURTON et al., 2009), a exposição a longo prazo de roedores ao Mn modifica os níveis da glutamato descarboxilase (GAD), principal enzima que medeia a transformação de glutamato em ácido gama-aminobutírico (GABA). Ademais, estudos relataram ter identificado uma elevação substancial de GABA estriatal após a exposição ao Mn em roedores (YANG et al., 2011).
Uma organela alvo da ação do Mn é a mitocôndria. De fato, tanto em neurônios, principalmente DAérgicos, quanto em astrócitos, este metal é rapidamente internalizado nas mitocôndrias, onde pode ligar-se às proteínas da matriz mitocondrial. Deve-se enfatizar que o Mn interage com proteínas envolvidas na fosforilação oxidativa mitocondrial, causando alterações na síntese de ATP (BAGGA e PATEL, 2012). O Mn
também estimula diretamente a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), afetando, assim, a cadeia transportadora de elétrons (EVREN et al., 2015). Desta forma, o Mn afeta a função mitocondrial através da inibição de transdução de energia e da geração de radicais livres (ZHANG, FU e ZHOU, 2004).
Sabe-se que o estresse oxidativo é consequência do aumento da produção de EROs e, portanto, supõe-se que isso seja a base de toxicidade neuronal induzida por Mn (EXIL et al., 2014). Neste contexto, sugere-se que a neurodegeneração DAérgica decorrente da exposição ao Mn tenha o estresse oxidativo como uma das causas principais (MCMILLAN, 1999; MARTINEZ-FINLEY et al., 2013) .
1.3 DOENÇA DE PARKINSON
A DP é a doença neurológica mais comum na vida adulta quando se trata de desordens do movimento (GADOTH, 2002). Tal doença parece possuir diversos fatores desencadeantes, com destaque para os fatores ambientais (MARRAS e GOLDMAN, 2011), sendo a exposição ocupacional a certos metais um fator que parece contribuir para o desenvolvimento da DP idiopática (DPI). Dentre tais metais, o Mn presente na fumaça de indústrias de soldagem representa um risco para os trabalhadores que a aspiram (SRIRAM et al., 2015), aumentando o risco de desenvolvimento da doença.
Fig. 2: Região afetada pela DP. A principal área do cérebro afetada pela DP é a
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A DP afeta principalmente a área da substância nigra (SN) (fig. 2), região essa que possui conexões com o caudado e com o putâmen, e tem o GP como continuidade anatômica. Pode ser dividida em duas partes: a porção compacta, rica em neurônios DAérgicos, e também onde se encontra a neuromelanina; e a porção reticular, que concentra neurônios GABAérgicos. A SN faz conexões com o tálamo, e ambos utilizam o GABA como neurotransmissor principal (NOLTE, 2008).
A DP é assinalada pela perda de neurônios DAérgicos da via nigroestriatal, que é acompanhada por gliose (BATASSINI et al., 2015). A perda DAérgica desencadeia uma cascata de eventos que altera os circuitos nos gânglios basais, gerando a sintomatologia característica da doença. Os principais sintomas são tremores, bradicinesia e distúrbios de marcha (ORDONEZ-LIBRADO et al., 2010). Mas eles não estão restritos apenas à natureza motora, visto que sintomas não-motores também podem ocorrer, a exemplo de disfunções autonômicas (YALCIN et al., 2016). Além disso, segundo Melo, Barbosa e Caramelli, pacientes com DP têm menor facilidade para exercer testes cognitivos, independente da presença de demência (MELO, BARBOSA e CARAMELLI, 2007).
O principal tratamento medicamentoso empregado para pacientes com DP é a levodopa (precursora de DA), que demonstra ter efeitos positivos sobre complicações motoras (NAGASHIMA et al., 2016). Quando o tratamento é iniciado precocemente, o paciente com DP pode apresentar uma melhora abrupta nos sintomas. Contudo, conforme a progressão da doença, o processo patológico pode levar à incapacitação funcional mesmo com o tratamento medicamentoso (CARDOSO, 1995). A DP é a causa mais comum de parkinsonismo (CERSOSIMO e KOLLER, 2006), o que corrobora com Cardoso (CARDOSO, 1995), o qual cita que ela corresponde a cerca de 75% dos casos de síndrome parkinsoniana (parkinsonismo). Esses distúrbios de movimento inerentes à DP são progressivos e irreversíveis, repercutindo danos às estruturas neuronais. Visto isso, sugere-se um vínculo entre a exposição elevada ao Mn ambiental e o aumento do risco de sintomas do tipo parkinsonianos (MILATOVIC et al., 2009). Outra patologia que divide certas semelhanças com a DP é o manganismo.
1.4 MANGANISMO
A exposição ao Mn pode levar a uma síndrome bastante severa neurológica denominada manganismo (MICHALKE et al., 2015). Foi descrito pela primeira vez, em 1837, por James Couper. No Brasil, os primeiros relatos ocorreram em 1966, em uma indústria siderúrgica que
produzia aço-liga de Mn, na qual 17 trabalhadores se intoxicaram. O tratamento para intoxicação com Mn é feito por quelação com EDTA, concomitantemente com a levodopa.
Evidências indicam que o manganismo é grave e progressivo e, em grande parte, se assemelha com a DP (O'NEAL et al., 2014). Ele comumente ocorre após exposições ao Mn resultantes, principalmente, da inalação ocupacional exacerbada (ROBISON et al., 2015). Porém, essa condição também pode ocorrer após um grande consumo de água com altos níveis de Mn (HAMAI e BONDY, 2004).
Nessa síndrome, o acúmulo de Mn acontece, preferencialmente, no estriado e no GP (MILATOVIC et al., 2009) (fig. 3). O estriado, que é rico em neurônios DAérgicos e GABAérgicos, representa o principal núcleo de entrada das aferências que chegam aos gânglios da base e é responsável por controlar os movimentos grosseiros do corpo. Já o GP é rico em neurônios GABAérgicos. É dele e da SN que saem as principais eferências que se dirigem ao tálamo, assim, o GP e a SN representam os núcleos de saída das informações que transitam pelos gânglios da base (MA, 1997) (FIX, 2008).
Fig. 3: Regiões afetadas pelos manganismo. As principais áreas do cérebro
afetadas pelo manganismo são o estriado (núcleo caudado + putâmen) e o GP.
O manganismo está associado a distúrbios motores e psicológicos, além de ser caracterizada por sintomas do tipo parkinsonianos, mas de forma distinta da DP (BAGGA e PATEL, 2012). Sugere-se assim, um elo comum entre as duas doenças em questão, visto
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que os sintomas extrapiramidais associados ao manganismo muitas vezes se sobrepõem com os observados na DP (ROTH e EICHHORN, 2013).
1.5 DP X MANGANISMO
Além do manganismo e da DPI apresentarem alguns sintomas motores semelhantes (por exemplo: distonia, marcha lenta, rigidez e hipocinesia), as exposições crônicas aos altos níveis de Mn também podem causar disfunção psiquiátrica grave (HAMAI e BONDY, 2004). Além disso, a DP e a neurotoxicidade induzida pelo Mn têm em comum os danos mitocondriais e o estresse oxidativo (SIDORYK-WEGRZYNOWICZ e ASCHNER, 2013). O diferencial consiste em que, na DP, a neurodegeneração ocorre anteriormente na SN, enquanto que no manganismo é vista, inicialmente, no GP (WEISS, 2010).
Diferenças entre o manganismo e o parkinsonismo induzido por Mn estão representadas na fig. 4, a qual mostra que o manganismo se deve à intensa exposição aguda (por exemplo, na grandeza de 1 mg/m3 de
partículas inaláveis), ao passo que o parkinsonismo induzido por Mn (e a DPI está inclusa aqui) se dá principalmente pelo contato a longo prazo com o Mn, de maneira crônica, mas em pequenas doses (na ordem de 100 ng/m3 de partículas inaláveis de Mn) (LUCCHINI, MARTIN e DONEY,
2009).
Fig. 4: Diagrama de Venn. Mostra a ocorrência do manganismo, do
parkinsonismo induzido por Mn e condições mistas em função da intensidade de exposição e duração da exposição. Adaptado de Lucchini e cols. (LUCCHINI, MARTIN e DONEY, 2009)
Do ponto de vista anátomo-histopatológico, a DP é tipicamente caracterizada por uma perda seletiva de neurônios DAérgicos na substância nigra pars compacta (SNpc) e pela presença de corpos de Lewy (SIDORYK-WEGRZYNOWICZ e ASCHNER, 2013), que são inclusões citoplasmáticas eosinofílicas constituídas por estruturas de natureza proteica, características da DP. Por outro lado, o manganismo atinge regiões adicionais do cérebro, como estriado e GP (CHEN et al., 2015), além de não conter corpos de Lewy (SIDORYK-WEGRZYNOWICZ e ASCHNER, 2013). Além disso, conforme previamente mencionado, sabe-se que o Mn tem uma considerável afinidade pela neuromelanina encontrada nos neurônios DAérgicos (DESOLE et al., 1995).
Notavelmente, todas essas estruturas (estriado, GP e SNpc) apresentam quantidades significativas de DA, as quais estão sujeitas à autooxidação, originando espécies reativas hábeis a contribuir para com a degeneração de células DAérgicas (MARTINEZ-FINLEY et al., 2013). Um ponto interessante é o fato de que a denervação de DA corrobora com a formação de radical hidroxil (OH) em cérebros de ratos recém-nascidos (BALASZ et al., 2015), agravando o quadro de degeneração DAérgica.
Segundo Lucchini e cols. as estruturas relacionadas ao manganismo e ao parkinsonismo estão inter-relacionadas com outros componentes dos gânglios basais, tais quais o caudado e putâmen e o núcleo subtalâmico. O influxo de Mn pode ocorrer lentamente a doses muito baixas, mas o seu efluxo é mais vagaroso ainda, o que aumenta a neurotoxicidade do Mn no GP e SNpc (LUCCHINI, MARTIN e DONEY, 2009).
1.6 MODELOS EXPERIMENTAIS COM MN
Inúmeros modelos experimentais de exposição ao Mn têm sido importantes para elucidar mecanismos relacionados à neurotoxicidade induzida por este metal. Neste contexto, Zhang e cols demonstraram que o cloreto de manganês (MnCl2), que é um composto inorgânico utilizado
como modelo de toxidade DAérgica, causa redução da atividade dos complexos I, II, III e IV mitocondriais in vitro, sendo este efeito concentração-dependente. A inibição da atividade da cadeia respiratória mitocondrial causada pelo Mn foi acompanhada por um aumento considerável da produção EROs (tab. 1) (ZHANG, FU e ZHOU, 2004).
Em um estudo com camundongos, Ordoñez-Librado e cols observaram que a exposição a uma mistura inalatória que continha MnCl2
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e alterações motoras, demonstrando ser um modelo muito útil para se estudar eventos neurodegenerativos relacionados à DP (ORDONEZ-LIBRADO et al., 2010).
Outros trabalhos experimentais mostraram que os diferentes tempos e doses utilizados nos estudos podem gerar divergências nos resultados encontrados. Eles relatam que, após exposição subcrônica ao sulfato de Mn, as habilidades atléticas de ratos são significativamente afetadas, ao passo que, após exposição crônica ao Mn, na forma de MMT, as funções neurocomportamentais não mudam significativamente (SU et al., 2015).
O tratamento agudo com MnCl2 em roedores levou a um acúmulo
de Mn no cérebro de 200 a 500%, dependendo da região (HAZELL et al., 2006). Em ratos, Huang e cols. relataram haver, além de danos cerebrais, danos hepáticos após a exposição subcrônica ao MnCl2 (HUANG et al.,
2011). Já em análises prévias, tem-se achado que a exposição subcrônica ao MnCl2 pode resultar em atenuação da atividade da glutationa
peroxidase (GPx) no estriado de ratos (ZHANG, FU e ZHOU, 2004). Enfim, seja aguda ou crônica, a exposição excessiva ao Mn leva a danos irreversíveis do SNC (LAZRISHVILI et al., 2009).
Um estudo com peixes zebra (zebrafish) tratados com Mn demonstrou reversibilidade no que diz respeito à quantidade de TH no telencéfalo (região responsável pelas funções motoras voluntárias) após a descontinuidade da exposição ao Mn. No entanto, dados de modelos animais de mamíferos com reversibilidade ainda são escassos. A maior parte dos estudos envolvendo toxicidade do Mn aponta apenas para danos DAérgicos (BAKTHAVATSALAM et al., 2014). Contudo, nenhum estudo examinou, até hoje, a possibilidade de alteração do sistema GABAérgico após exposição aguda a Mn (YANG et al., 2011).
Com base nos relatos anteriores, nota-se que os estudos para se avaliar a intoxicação por Mn são feitos principalmente em animais. De fato, casos de manganismo para se estudar a neuropatologia a partir de autópsias em humanos são escassos. Ainda, ressalta-se que período exato do início do manganismo é de difícil detecção, e a sua evolução parece ser gradual. Sabe-se que se a exposição ao Mn for contínua, a síndrome tende a piorar, contudo, se o paciente for removido do local de exposição, espera-se que a síndrome seja freada, mas não curada (KOMPOLITI, 2010).
2. JUSTIFICATIVA
O Mn é um metal essencial para mamíferos. Contudo, inúmeras evidências têm apontado para este elemento como um possível toxicante ambiental/ocupacional ligado à patogenia da DPI, quando os indivíduos são expostos de forma crônica, e ao manganismo, de forma aguda. Embora o GP seja particularmente suscetível aos efeitos tóxicos do Mn e esteja envolvido nas duas patologias (DPI e manganismo), os mecanismos relacionados a tal suscetibilidade são desconhecidos. Além disso, deve-se ressaltar que a DP é considerada a segunda patologia neurodegenerativa mais comum no mundo e que o número de trabalhadores de indústrias com manganismo é bastante elevado.
O SNC é bastante complexo, sendo que diferentes tipos de células e estruturas interagem para a manutenção de suas atividades fisiológicas. Além disso, as substâncias presentes no sangue podem ou não atingir o SNC, dependendo de suas capacidades de atravessar a BHE. Desta forma, a existência de um modelo animal padrão para se estudar os processos patológicos e os tratamentos terapêuticos contra tais processos se mostra de grande importância.
Considerando os aspectos acima mencionados, este projeto teve como objetivo investigar os efeitos da exposição ao MnCl2 na potencial
ocorrência de alterações no SNC e sua relação com a neurotoxicidade no estriado e GP em ratos machos Wistar, baseando-se em um modelo experimental de Santos e cols. (SANTOS, D. et al., 2012). Apesar de o manganismo ser irreversível, os estudos após a remoção do paciente a partir do local de exposição são exíguos. Assim, pretendeu-se avaliar também a possível reversibilidade dos efeitos da exposição ao Mn, através da realização de testes comportamentais, bioquímicos e imuno-histoquímica em diferentes momentos (24 h e 30 dias após a exposição ao Mn).
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL:
Investigar a possível ocorrência de efeitos neurotóxicos (comportamentais, bioquímicos e histológicos) decorrentes da exposição de ratos Wistar machos ao MnCl2, explorando a possibilidade de reversão
desta neurotoxicidade após um período de 30 dias de latência (sem exposição).
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
(i) Investigar a possível ocorrência de prejuízos comportamentais induzidos pela exposição de ratos ao MnCl2, avaliados 24 h após a exposição, através dos testes
do campo aberto, rotarod, teste do beam walking e grid; (ii) Investigar a possível ocorrência de alterações bioquímicas
induzidas pela exposição de ratos ao MnCl2, avaliadas 24 h
após a exposição, através da medida da atividade estriatal de complexos (I e II) da cadeia respiratória e de enzimas antioxidantes [glutationa redutase (GR), GPx e SOD], bem como marcadores de estresse oxidativo [reativos ao ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS)] e níveis de tióis não-protéicos (NPSH);
(iii) Investigar a possível ocorrência de alterações histológicas induzidas pela exposição de ratos ao MnCl2, avaliadas 24 h
após a exposição, através da medida dos níveis de tirosina hidroxilase (TH), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e glutamato descarboxilase (GAD) no estriado e no GP; (iv) Investigar a possível reversão de efeitos neurotóxicos
decorrentes da exposição ao Mn através da medida de parâmetros comportamentais, bioquímicos e histológicos (mencionados nos itens i, ii e iii) após um período de latência de 30 dias (sem exposição).
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 REAGENTES E ANTICORPOS
Cloreto de Manganês tetrahidratado (MnCl2·4H2O; 99.99%),
5,5'-ditiobis-(2-Ácido Nitrobenzóico) (DTNB), nicotinamida adenina dinucleotídeo 2′-fosfato reduzido (NADPH), glutationa oxidada (GSSG), GR, GPx, ácido 2-tiobarbiturico (TBA) e fenol Folin-Ciocalteu foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA). Anticorpo policlonal rabbit anti-proteína glial fibrilar ácida (GFAP: Dako, Z0334, 1:500, feito em coelho), anticorpo anti-tirosina hidroxilase (TH: US biological, T9237-13, 1:500, feito em cabra), anticorpo policlonal anti-glutamato decarboxilase (GAD) 65 (GAD 65: Chemicon, 1:2000, feito em coelho), anti-rabbit IgG biotinilado (Vector, BA-1000), soro de cabra (Gibco, 16210-044), xilol (Synth, X1001.01.BJ) e Entellan (Merck, UN 1866). Todos os outros reagentes foram adquiridos de fornecedores locais.
4.2 ANIMAIS E PROTOCOLO EXPERIMENTAL
Ratos Wistar machos (3 meses de idade) foram adquiridos do biotério central da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC, Florianópolis, Brasil). Os animais foram mantidos em gaiolas com temperatura controlada (21±2ºC), e ciclo de luz 12 h claro/escuro. Eles tinham acesso livre à agua e ração. Os experimentos e procedimentos foram realizados de acordo com o comitê de ética para uso de animais da UFSC (CEUA/UFSC PP00765).
Os ratos foram divididos em 2 grupos, 1 grupo controle e 1 grupo tratado com MnCl2. Os animais controles receberam injeção
intraperitoneal (i.p.) de salina (NaCl 0,9%) e o grupo de animais tratados receberam MnCl2 25 mg/kg/dia, quatro vezes, em intervalos de 48 horas.
Vinte e quarto horas após a última injeção, os grupos foram submetidos aos testes comportamentais, conforme descritos posteriormente. No dia seguinte, os animais foram eutanasiados e utilizados da seguinte maneira: o grupo de animais tratados com MnCl2 foi dividido em 2 subgrupos – 1
grupo foi utilizado para os testes bioquímicos e outro grupo de animais para as análises imuno-histoquímicas. O mesmo foi feito com o grupo controle. Além disso, o protocolo experimental foi repetido e as análises comportamentais e bioquímicas foram realizadas 30 dias após a última injeção, avaliando-se os mesmos parâmetros.
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O protocolo experimental foi repetido 3 vezes, portanto, a fim de reduzir o viés das diferenças entre os diferentes protocolos, cada resultado foi expresso após ter sido utilizada uma constante distinta, com o intuito de minimizar os erros experimentais.
- 1º experimento: comportamento e imuno-histoquímica antes da latência (15 animais, no total);
- 2º experimento: comportamento, ensaios bioquímicos (complexos mitocondriais, enzimas antioxidantes e parâmetros de estresse oxidativo) antes e após a latência (totalizando 30 ratos)
- 3º experimento: comportamento, ensaios bioquímicos antes da latência (com o intuído de ampliar o n amostral) e imuno-histoquímica após a latência (30 animais foram empregados).
Fig. 5. Linha do tempo experimental.
4.3 ANÁLISES COMPORTAMENTAIS
4.3.1 Campo aberto
A atividade locomotora e exploratória foi avaliada em um aparato de campo aberto, que consistia em bacia circular azul, na qual 8 quadrantes foram desenhados no chão (diâmetro = 44 cm; altura = 22 cm). Cada rato era colocado no centro do campo aberto, e o resultado foi expresso pelo número de quadrantes cruzados pelas quatro patas e pelo número de levantadas sobre as patas traseiras foram registrados (COLLE et al., 2013). Cada animal permanecia no aparato por 6 minutos.
4.3.2 Rotarod
Este teste avalia a integridade do sistema motor. O rotarod consiste em um eixo giratório de 30 cm de comprimento e 3 cm de diâmetro, que é dividido por discos de 24 cm de diâmetro em 4 compartimentos. Os resultados foram apresentados em segundos, pela
latência da primeira queda do rato, e pelo número total de quedas que foram registradas. O tempo de avaliação (teto) era de 4 minutos (COLLE et al., 2013). A velocidade constante utilizada foi de 7 rpm, como previamente descrito por Mizoguchi e cols (MIZOGUCHI et al., 2002). Antes da administração de MnCl2, os animais receberam uma sessão de
treinamento para se aclimatarem com o aparelho (COLLE et al., 2013).
4.3.3 Teste do beam walking
Nesse teste, é avaliado o sistema extrapiramidal, ramo do sistema motor que é incumbido pela coordenação dos movimentos. Avaliou-se o tempo que o animal leva para atravessar a viga de madeira de uma
extremidade à outra. O número de resvaladas das patas durante o percurso
e o tempo total (em segundos) para atravessar a viga foram registrados. Essa viga possuía 120 cm de comprimento e fora fixada entre duas bancadas, a uma altura de 60 cm do chão. Uma caixa de isopor com maravalha foi colocada na outra extremidade da viga como abrigo, para os animais de alocarem, na qual permaneciam por alguns minutos até a próxima tentativa (SCHALLERT, 2002). Foram dadas três tentativas para cada animal, com intervalo de 1 minuto entre cada uma delas. Os animais receberam uma sessão de treinamento para se acostumarem com o aparato e aprenderem a tarefa antes do tratamento.
4.3.4 Teste do grid
O teste do grid avalia rigidez muscular (HAUBER, LUTZ e MUNKLE, 1998). O rato é colocado verticalmente em uma tela com largura de 34 cm, 49 cm de comprimento, 6 cm de altura e espaçamento de 0,4 cm entre cada grade. A inversão da grade ocorreu a uma distância de 30 cm acima de uma caixa contendo maravalha, para que em caso de queda evitasse alguma lesão. É medida a capacidade de sustentação dos animais nesta grade. O tempo para mover as quatro patas é registrada (DHANUSHKODI et al., 2013), até haver a queda do animal. Cada rato teve 10 tentativas, com intervalo de 1 minuto entre cada uma, e ele fora mantido invertido por até 30 segundos, para que fosse possível determinar o maior tempo de permanência. O maior tempo atingido pelo animal foi empregado no cálculo da porcentagem de tempo, registrado como o maior tempo/30 s × 100 (MOHANASUNDARI et al., 2006).
38
4.4 PREPARAÇÃO TECIDUAL PARA ANÁLISES BIOQUÍMICAS
Vinte e quatro horas após os testes comportamentais, os animais foram eutanasiados por decapitação, o cérebro foi removido e o estriado foi dissecado. O estriado de um dos hemisférios foi homogeneizado (1:10 m/v) em tampão HEPES (20 mM, pH 7.0), e então, centrifugado a 16,000 x g a 4 °C por 20 minutos. O sobrenadante obtido foi usado para determinação de atividade enzimática, quantificação dos níveis de NPSH e TBARS. Já o estriado proveniente do hemisfério restante, foi homogeneizado em tampão fosfato (pH 7,4), que continha 0,3 M de sacarose, 5 mM de MOPS, 1 mM de EGTA e 0,1% de albumina. Esses homogenatos foram centrifugados a 1000 x g por 10 minutos a 4 ºC, e o sobrenadante foi destinado à determinação da atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória mitocondrial. Todos os experimentos bioquímicos foram corrigidos pelos níveis de proteínas, medido pelo método de Lowry (LOWRY et al., 1951).
4.5 DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE SUBSTÂNCIAS REATIVAS AO ÁCIDO TIOBARBITÚRICO
Os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi determinado baseado no método descrito por Ohkawa e cols (OHKAWA, OHISHI e YAGI, 1979). Este procedimento avalia a os níveis de peroxidação lipídica. Para dar continuidade, as amostras foram incubadas a 100˚C por 60 minutos em meio ácido, contendo sulfato de dodecil sódico a 0,45% e 0,67 % de ácido tiobarbitúrico. Após centrifugação, o produto foi lido, obtendo-se o resultado em nmol de MDA/mg de proteína. Este experimento fundamenta-se em avaliar a formação de malondialdeído (MDA), produto final de peroxidação lipídica, o qual reage com o ácido tiobarbitúrico, originando um composto que pode ser mensurado, em espectrofotômetro, a 532 nm, tendo o MDA como padrão.
4.6 TIÓIS NÃO-PROTÉICOS (NPSH)
Os níveis de NPSH são representados, em quase toda a totalidade, pela GSH, e para isso, foram determinados os seus níveis, utilizando-se de um ensaio colorimétrico reportado por Ellman (ELLMAN, 1959). Para tanto, às amostras, foi acrescentada uma solução de ácido tricloroacético (10%), e foram submetidas à centrifugação de 5000 x g durante 10 minutos a 4
ºC. No sobrenadante, até então ácido, foi adicionado uma solução de tampão TFK 1 M para neutralização e o conteúdo de NPSH foi mensurado, espectrofotometricamente, pela redução do DTNB a 412 nm,
utilizando-se GSH para uma curva padrão, onde os resultados foram expressos em nmol de NPSH/mg de proteína.
4.7 ATIVIDADES DOS COMPLEXOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA
O método para medir a atividade do complexo I através da redução do ferrocianeto dependente de NADH foi padronizada por Cassina e Radi (CASSINA e RADI, 1996), e inclui algumas alterações realizadas por Latini e cols (LATINI et al., 2005). No que diz respeito à medição da atividade do complexo II, o experimento foi baseado no protocolo determinado por Fischer e cols (FISCHER et al., 1985). A atividade do complexo I foi mensurada através da redução do ferricianeto, espectrofotometricamente, a 420 nm, sendo esta reação, dependente de NADH. No que tange à atividade do complexo II, essa foi investigada através da taxa de absorção do succinato-2,6-diclorofenol indofenol (DCIP) a 600 nm. As atividades de ambos os complexos da cadeia respiratória foram calculadas como nmol/min/ mg proteína.
4.8 ENZIMAS ANTIOXIDANTES
A atividade da GR foi determinada segundo previamente descrito por Carlberg e Mannervik, (CARLBERG e MANNERVIK, 1985), enquanto que a atividade da glutationa peroxidase (GPx) foi determinada baseando-se em protocolo desenvolvido por Wendel (WENDEL, 1981), o qual preconizava que a enzima GPx catalisa a redução de H2O2,
utilizando-se da glutationa reduzida (GSH) como substrato, gerando glutationa oxidada (GSSG). Esse produto será reduzido pela GR com o consumo de NADPH, que foi medido por intermédio da leitura em espectrofotômetro em 340 nm. A atividade da GPx foi expressa em nmol de NADPH oxidado/min/mg de proteína. A GR encarrega-se de reduzir a GSSG gerada anteriormente a GSH, através do consumo de NADPH. Essa reação é medida indireta e espectrofotometricamente a 340 nm, e sua a atividade foi expressa em nmol de NADPH oxidado/min/mg de proteína.
O homogenato estriatal também foi usado para determinar a atividade da superóxido dismutase (SOD), seguindo o protocolo de Misra e Fridovich (MISRA e FRIDOVICH, 1972). Através da adição de
40
amostras de tecidos (0; 2,5; 5; 10 and 20 μL) contendo SOD, essas amostras inibem a autooxidação da epinefrina. A taxa de inibição foi monitorada por 3 minutos. A unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima necessária para produzir 50% de inibição. Cada amostra possuía 5 pontos a serem lidos, e as absorbâncias iniciais foram subtraídas das finais, resultando em um delta, que foi empregado para se obter uma reta, e através da sua equação, chegar ao valor da atividade em U SOD/mg proteína.
4.9 PREPARAÇÃO DO TECIDO PARA AS ANÁLISES IMUNO-HISTOQUÍMICAS
Vinte e quarto horas após o fim dos testes comportamentais, os ratos foram eutanasiados por overdose anestésica (hidrato de cloral 40% i.p.) e perfundidos transcardialmente com 300 mL de salina, seguido por 200-250 mL de paraformaldeído (PFA) 4% a 4 ºC, diluído em tampão fosfato salina (PBS) 0,1 M (PFA/PBS), pH 7,4. Os animais foram decapitados e o cérebro foi removido, permanecendo em imersão em PFA 4% para fixar por 4 horas. Depois disso, essa solução foi trocada por PBS contendo sacarose a 30% a 4 °C.
Os tecidos foram cortados em fatias com cortes de 20 μm de espessura (estriado e GP) em um vibrátomo, com solução antifúngica (0,1 M PBS + azida 0,5%) e estocada a 4 ºC, até que fossem utilizados. Os cortes foram permeabilizados com tampão de lavação contendo 3% de Triton X-100 em PBS 0,1M. As peroxidases endógenas foram bloqueadas com H2O2 a 0,3% e os sítios não específicos foram bloqueados com soro
de cabra 5%, ambos diluídos em tampão de lavagem (coloca os reagentes entre parênteses).
Posteriormente às etapas de lavação, as fatias foram incubadas com anticorpo primário (diluído em tampão de lavagem com 0,02% timerosal) por aproximadamente 18 h a 4 ºC (TH 1:500); GFAP (1:500) e GAD 65 (1:2000). Os anticorpos ligados foram visualizados utilizando-se anticorpo utilizando-secundário biotinilado (1/250; Vectastain), padrão peroxidase-avidina-biotina (1/125; kit Vectastain Elite ABC; Boehringer, Mannheim, Alemanha), e 3,3-diaminobenzidina (DAB, Sigma-Aldrich). Todos os tecidos foram analisados por microscopia óptica (Olympus). A densidade óptica (DO) da TH, GFAP e do GAD 65 no estriado e no GP foi mensurada calculando-se a área desenhada à mão livre, no programa ImageJ software (http://imagej.net/Welcome).
4.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
As diferenças estatísticas foram avaliadas através da análise do teste t não pareado (two tailed), para todos os experimentos. Os dados foram representados com média ± E.P.M e diferenças foram consideradas significativas quando p<0,05. As análises estatísticas e os gráficos foram feitos utilizando-se o programa GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
5. RESULTADOS
5.1 AVALIAÇÃO DO PESO CORPÓREO APÓS TRATAMENTO COM MNCL2
5.1.1 Animais tratados com MnCl2 apresentam peso corporal
diminuído transcorridas 24 h do final do tratamento
Ratos machos Wistar com 3 meses de idade foram pesados antes do início do tratamento, 24 h após à quarta e última injeção e 30 dias após a finalização do tratamento (Fig. 6). Os grupos foram randomicamente separados antes do tratamento e não apresentaram diferenças significativas em relação aos pesos corpóreos (fig 6A, p= 0,8698). Vinte e quatro h após o término do tratamento, os animais tratados com MnCl2
tiveram um significativo declínio no peso corpóreo (fig. 6B, p< 0,001) em relação ao seu grupo controle. Transcorridos 30 dias do tratamento, não se observou diferença significativa entre os grupos (fig. 6C, p= 0,9386), sugerindo uma recuperação do peso corporal perdido em função do tratamento com Mn. Salienta-se que todos os grupos tiveram livre acesso à água e comida durante todo o período de tratamento e latência.
Fig. 6. Efeitos do MnCl2 no peso corpóreo de ratos após 24 h e 30 dias de
tratamento. Efeito do MnCl2 sobre o peso corporal dos ratos (A) antes do tratamento (n= 21-24), (B) 24 h após a última injeção (n= 21-24) e (C) 30 dias após o término do tratamento (n= 14-16). Os dados estão apresentados em gramas
Controle MnCl2 0 100 200 300 A P e s o ( g ) Controle MnCl2 0 100 200 300 *** B P e s o ( g ) Controle MnCl2 0 100 200 300 400 C P e s o ( g )
44
(g) e expressos como média ± EPM. Para análise estatística, foi utilizado teste t não pareado; *** p<0,001 comparado com o grupo controle.
5.2 AVALIAÇÃO COMPORTAMENTAL APÓS O TRATAMENTO COM MNCL2
5.2.1 Tratamento agudo com MnCl2 reduz o número de cruzamentos
e levantadas em ratos 24 h após o tratamento
Com o intuito de examinar a capacidade locomotora dos animais, avaliou-se o número de cruzamentos através do teste do campo aberto (fig. 7A e B). Para investigar a capacidade exploratória, avaliou-se o número de levantadas (fig. 7C e D) com as 2 patas dianteiras. O tratamento com MnCl2 diminuiu significativamente o número de
cruzamentos transcorridas 24 h do final do tratamento (fig. 7A, p= 0,0003), embora esse efeito não tenha sido observado após o período de latência (fig. 7B, p= 0,5766). Além disso, o efeito do tratamento com MnCl2 também causou uma diminuição significativa no número de
levantadas transcorridas 24 h da última injeção (fig. 7C, p= 0,0004), embora esse efeito não tenha sido observado após o período de latência (fig. 7D, p= 0,1098).
Fig. 7. Efeitos do MnCl2 no número de cruzamentos e de levantadas em ratos
24 h e 30 dias após tratamento. As atividades locomotora (A e B) e exploratória
(C e D) foram avaliadas no teste de campo aberto. Os animais foram avaliados
Controle MnCl2 0 5 10 15 20 *** A Nú m e ro d e c ru z a m e n to s Controle MnCl2 0 5 10 15 20 B Nú m e ro d e c ru z a m e n to s Controle MnCl2 0 5 10 15 *** C Nú m e ro d e l e v a n ta d a s Controle MnCl2 0 5 10 15 D Nú m e ro d e l e v a n ta d a s
em (A e C) 24 h após a última injeção (n= 21-24) e (B e D) 30 dias após o término do tratamento (n= 14-16). A capacidade locomotora foi quantificada como número de cruzamentos, enquanto que a atividade exploratória foi dada como número total de levantadas. Os dados estão expressos como média ± EPM. Para análise estatística, foi utilizado o teste t não pareado; ***p<0,001 diferente do grupo controle.
5.2.2 Tratamento agudo de MnCl2 não causa prejuízo da
performance motora em ratos
O teste do rotarod foi realizado para averiguar a performance motora dos animais; foram avaliados o tempo que o rato levou para ter a 1ª queda da barra rotatória, ou seja, a latência da 1ª queda (tab. 2A e C), e o número total de quedas (tab. 2B e D). Em relação ao tempo da 1ª queda, não houve diferenças significativas entre os grupos tanto 24 h após o tratamento (tab. 2A, p= 0,4414), quanto após a latência (tab. 2B, p= 0,9009). Além disso, em relação ao número de quedas, também não houve diferenças significativas entre os grupos tanto 24 h após o tratamento (tab. 2C, p= 0,1095) quanto após a latência (tab. 2D, p= 0,2693).
Tab. 2. Efeitos do MnCl2 no teste do rotarod em ratos 24 h e 30 dias após
tratamento. A latência da 1ª queda, expressa em segundos, e o número de quedas
no rotarod foram avaliados em (A e C) 24 h após a última injeção (n= 20-24) e (B e D) 30 dias após o término do tratamento (n= 14-16). Os resultados foram expressos como a média ± EPM.
Grupos
Latência da 1ª queda
(s) Número de quedas
Após o tratamento A) 24 h B) 30 dias C) 24 h D) 30 dias
Controle 106,5 ± 22,45 66,29 ± 12,77 1,422 ± 0,2543 3,500 ± 0,7135 MnCl2 84,00 ± 18,61 63,64 ± 16,44 2,223 ± 0,3934 5,232 ± 1,292
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5.2.3 MnCl2 aumenta o número de resvaladas em ratos 24 h após
tratamento
O beam walking é um teste comportamental que avalia a coordenação do sistema motor. Neste estudo, avaliou-se o tempo que o rato levou para atravessar a viga (fig. 8A e B) e o número de resvaladas das patas durante o percurso (fig. 8C e D). O grupo tratado com MnCl2
não apresentou alterações significativas em relação ao grupo controle no que diz respeito ao tempo de travessia 24 h após a finalização do tratamento (fig. 8A; p= 0,6054), nem 30 dias após à latência (fig. 8B; p= 0,4858).
Entretanto, no que se refere ao número de resvaladas, houve um aumento significativo deste no grupo MnCl2 comparado ao grupo controle
transcorridas 24 h dos tratamentos (fig. 8C; p= 0,0135). Este evento não foi observado após o período de latência (fig. 8D; p= 0,6558). Aos animais que apresentaram acinesia durante o percurso e não o completaram, foi atribuído o valor máximo para o percurso, que era de 60 segundos (valor teto).
Fig. 8. Efeitos do MnCl2 no teste do beam walking em ratos 24 h e 30 dias
após tratamento. O equilíbrio dos animais foi avaliado por meio do teste do
beam walking. Os animais foram avaliados em (A e C) 24 h após a última injeção
(n= 21-24) e (B e D) 30 dias após o término do tratamento (n= 14-16). O (A e B) tempo para percorrer a viga de uma extremidade à outra, expresso em segundos, assim como (C e D) o número de resvaladas dado pelas patas dos ratos, foram
Controle MnCl2 0 10 20 30 40 B T e m p o ( s ) Controle MnCl2 0 10 20 30 40 A T e m p o ( s ) Controle MnCl2 0 2 4 6 * C Nú m e ro d e r e s v a la d a s Controle MnCl2 0 2 4 6 D Nú m e ro d e r e s v a la d a s
contabilizados. Os dados estão expressos como a média ± EPM. Para as análises estatísticas, foi utilizado o teste t não pareado; *p<0,05 diferente do grupo controle.
5.2.4 MnCl2 não danifica o tônus muscular nos ratos
Para finalizar a avaliação comportamental, foi realizado o teste do grid, que avalia rigidez muscular. Neste teste, é averiguado se o rato tem a capacidade de aguentar o próprio peso, agarrado a uma grade invertida, através da quantificação do tempo de latência para a queda. Não houve diferenças significativas entre o grupo Mn e o controle nem 24 h depois da última injeção (tab. 3A; p= 0,5677), nem após 30 dias de latência (tab. 3B; p= 0,5806).
Tab. 3. Efeitos do MnCl2 no teste do grid em ratos 24 h e 30 dias após
tratamento. A rigidez muscular foi avaliada por meio do teste do grid. Foi
registrado o tempo de sustentação dos ratos, até haver sua queda, com teto de 30 segundos. Os animais foram avaliados em (A) 24 h após a última injeção (n= 21-24) e (B) 30 dias após o término do tratamento (n= 14-16). Os dados foram calculados segundo a fórmula “maior tempo/30 s × 100” estão expressos em segundos. Esses resultados são apresentados como a média ± EPM. Para as análises estatísticas foi utilizado o teste t não pareado.
5.3 ANÁLISES BIOQUÍMICAS APÓS TRATAMENTO COM MNCL2
5.3.1 MnCl2 não altera os níveis estriatais de TBARS em ratos
Para verificar se o tratamento com MnCl2 altera a peroxidação
lipídica estriatal, foram mensurados os níveis de TBARS, como mostra a fig. 9. Não houve diferenças significativas entre o grupo MnCl2 e o
Grupos Tempo da queda (s)
Após o tratamento A) 24 h B) 30 dias
Controle 22,71 ± 2,116 17,86 ± 2,035 MnCl2 21,19 ± 1,657 19,93 ± 2,967
48
controle em ambos os tempos testados, 24 h (fig. 9A; p= 0,2140) e 30 dias (fig. 9B; p= 0,1609) após o tratamento.
Fig. 9. Efeitos do MnCl2 nos níveis estriatais de TBARS de ratos 24 h e 30
dias após o tratamento. A peroxidação lipídica estriatal foi verificada pelo
método do TBARS em (A) 24 h (n= 14-16) após a última injeção e (B) 30 dias (n= 7-8) após o término do tratamento. Os dados estão expressos como a média ± EPM. A estatística foi realizada utilizando o teste t não pareado.
5.3.2 MnCl2 não altera os níveis estriatais de NPSH em ratos
O tratamento com MnCl2 não foi capaz de alterar os níveis de
NPSH em 24 h após a última injeção (tab. 4A, p= 0,0738), bem como após 30 dias decorridos do tratamento (tab. 4B, p= 0,3919).
Grupos NPSH (nmol SH/mg proteína)
Após o tratamento A) 24 h B) 30 dias
Controle 28,26 ± 1,648 20,40 ± 1,459 MnCl2 32,52 ± 1,585 22,09 ± 1,254
Tab. 4. Efeitos do MnCl2 nos níveis estriatais de NPSH 24 h e 30 dias após
tratamento em ratos. Os níveis de tióis não-protéicos foram averiguados em (A)
24 h após a última injeção (n= 14-16) e (B) 30 dias após o término do tratamento (n= 7-8). Esses resultados são apresentados como a média ± EPM. Análises estatísticas foram realizadas utilizando teste t não pareado.
Controle MnCl2 0 5 10 15 A n m o lM DA /m g p ro te ín a Controle MnCl2 0 5 10 15 B n m o lM DA /m g p ro te ín a
Avaliou-se as atividades das enzimas séricas aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) (geralmente utilizadas como marcadoras de função hepática), assim como os níveis de ureia e creatinina (geralmente utilizadas como marcadoras de função renal) para ver se o tratamento com MnCl2 estaria causando efeitos
sistêmicos. Não foram observadas diferenças entre os grupos para esses parâmetros (dados não mostrados).
5.4 ATIVIDADE DOS COMPLEXOS DA CADEIA RESPIRATÓRIA
APÓS TRATAMENTO COM MNCL2
5.4.1 MnCl2 não altera atividade dos complexos I e II estriatais em
ratos.
A tabela 5 apresenta as atividades dos complexos mitocondriais I e II no estriado dos animais. A atividade de ambos os complexos não foi significativamente alterada, tanto em 24 h (tab. 5A; p= 0,6204) ou 30 dias (tab. 5B; p= 0,7621) após o tratamento para o complexo I, assim como em 24 h (tab. 5C; p= 0,9709) ou 30 dias (tab. 5D; p= 0,1068) após a exposição para o complexo II.
Tab. 5. Efeitos do MnCl2 na atividade do complexo I e II estriatal em 24 h e
30 dias após tratamento em ratos. A atividade dos (A e B) complexo I e (C e
D) complexo II foi medida em (A e C) 24 h após a última injeção (n= 13-16) e (B e D) 30 dias após o término do tratamento (n= 7-8). Os dados estão expressos como a média ± EPM. Análises estatísticas foram realizadas utilizando teste t não pareado.
Grupos Após o tratamento Complexo I (Atividade NADH nmol/min/mg) Complexo II (nmol/min/ mg proteina) A) 24 h B) 30 dias C) 24 h D) 30 dias Controle 84,61 ± 7,586 101,2 ± 7,480 1,976 ± 0,2128 1,876 ± 0,2544 MnCl2 89,77 ± 6,968 98,37 ± 5,506 1,967 ± 0,1241 2,333 ± 0,1085
50
5.5 ATIVIDADE DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES APÓS
TRATAMENTO COM MNCL2
5.5.1 Atividade da GR e GPx
A atividade de da enzima GR estriatal não foi significativamente alterada tanto em 24 h (tab. 6A; p= 0,3783) quanto em 30 dias (tab. 6B; p= 0,6954) após o tratamento. Similarmente, a atividade de da enzima GPx estriatal não foi significativamente alterada tanto em 24 h (tab. 6C; p= 0,1943) quanto em 30 dias (tab. 6D; p= 0,0593) após o tratamento.
Tab. 6. Efeitos do MnCl2 na atividade da GR e GPx estriatais em 24 h e 30
dias após tratamento em ratos. A atividade das enzimas antioxidantes (A e B)
GR e (C e D) GPx foi medida (A e C) 24 h após a última injeção (n= 14-16) e (B e D) 30 dias após o término do tratamento (n= 7-8). Os dados estão expressos como a média ± EPM. Análises estatísticas foram realizadas utilizando teste t não pareado.
5.5.2 MnCl2 não altera a atividade da SOD em ratos
Dentre os peróxidos existentes no meio celular, o peróxido de hidrogênio (H2O2) é o principal, e sua decomposição decorre da ação da
enzima SOD. A atividade desta enzima foi medida e está explicitada na tabela abaixo. Não houve diferença significativa entre os grupos no que se refere à atividade da SOD, nem 24 h após tratamento (tab. 7A, p= 0,9004), nem 30 dias (tab. 7B; p= 0,1743).
