UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
SHEILA DE FÁTIMA PERECIN MENEGATI
DISCREPÂNCIAS ENTRE FENÓTIPOS E GENÓTIPOS: IMPLICAÇÃO NA SEGURANÇA TRANSFUSIONAL
CAMPINAS 2019
DISCREPÂNCIAS ENTRE FENÓTIPOS E GENÓTIPOS: IMPLICAÇÃO NA SEGURANÇA TRANSFUSIONAL
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências, na área de Clínica Médica.
ORIENTADOR (A): PROF (A). DR (A). LILIAN MARIA DE CASTILHO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA SHEILA DE FÁTIMA PERECIN MENEGATI
E ORIENTADA PELA PROF (A). DR (A). LILIAN MARIA DE CASTILHO.
CAMPINAS 2019
ORIENTADORA: PROF (A). DR (A). LILIAN MARIA DE CASTILHO
MEMBROS:
1. ProfªDrª Lilian Maria de Castilho
2. Profª Drª Carolina Bonet Bub
3. Dr. Wilson Baleoti Junior
Programa de Pós-graduação em Clínica Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontram-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
DEDICATÓRIA
A todos os profissionais da hemoterapia que dedicam parte de suas vidas compatibilizando vidas, para ajudar a salvar vidas!
Agradeço a Deus, pelas inúmeras bênçãos concedidas e por ter me dado forças para chegar até aqui.
Agradeço à minha orientadora Professora Doutora Lilian Castilho por me dar a oportunidade de ir muito mais além do que eu jamais imaginei que pudesse. Por dividir seus conhecimentos e estar sempre pronta para me receber. Meu crescimento profissional e até mesmo pessoal foi moldado por suas exigentes, porém suaves recomendações.
Aos membros da banca: Dra. Carolina Bonet Bub, Dr. Wilson Baleotti Junior, Dra. Nicola Amanda Conran Zorzetto, Dra. Carine Arnoni, pelo tempo dedicado, para a leitura e discussão deste trabalho.
À minha família, pelo seu apoio e palavras de coragem nos momentos que mais precisei, pela confiança e cuidado.
Ao meu grande amor Adriano, que sempre me apoiou, mesmo diante da minha ausência! Devo principalmente à você tudo que tenho me tornado. Obrigada pelo carinho e pela sua paciência.
Aos meus filhos amados Pedro e Júlia, razões pelas quais quero vencer, motivos pelos quais tento ser sempre forte. Vocês são a essência da minha vida!
Às amigas que a Unicamp me deu: Mayra, Devanira, que muito me incentivaram durante o desenvolvimento deste trabalho, obrigada pelas boas energias transmitidas e pelas orações!
E a Tamires, com quem compartilhei momentos de aprendizados e conversas, uma grande amiga que levarei em meu coração sempre.
Às amigas que foram chegando ao nosso laboratório e também fazem parte dessa fase da minha vida: Amal, Ianca e Maria Rita. Obrigada pelo companheirismo.
À uma grande amiga que me tornou a profissional que sou hoje! Você é parte disso Maria Teresa Fioravanti
À Laís Siqueira que me ajudou na organização desse trabalho
Aos meus alunos, queridos, pacientes e amáveis.
Em especial à minha grande amiga Laryeine Huhn, que passou horas acordada comigo calculando dados, fazendo planilhas e me dando forças. Um dia pensei em desistir e você não permitiu! Eu sou imensamente grata à você!
À todos os funcionários do Hemocentro e a todos aqueles que indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho. Muito obrigada!
As transfusões de hemocomponentes são práticas terapêuticas utilizadas para manutenção da qualidade de vida podendo também, ser considerado um recurso de extrema necessidade em alguns tratamentos e patologias. Dependendo da condição clínica do paciente, o mesmo pode ser submetido a vários eventos transfusionais ao longo da vida, tornando-o um receptor de repetição ou de transfusões crônicas. Essa condição expõe esse paciente a vários antígenos eritrocitários não próprios, fato que pode provocar uma resposta imune que pode ser tão agressiva quanto à própria patologia de base do paciente. Por isso, as transfusões devem ser criteriosamente indicadas e compatibilizadas, principalmente com relação aos antígenos eritrocitários, minimizando eventos de aloimunização. A compatibilidade transfusional para antígenos eritrocitários tem sido realizada utilizando a metodologia de hemaglutinação, desde meados do século XX, sendo considerado padrão ouro para identificação de antígenos eritrocitários. Contudo, nos últimos 20 anos, técnicas moleculares tem se mostrado ferramentas importantes para resolver limitações sorológicas na identificação de fenótipos. No entanto, quando há possibilidade de determinar um fenótipo por essas duas técnicas, percebe-se que discordâncias entre fenótipo e genótipo ocorrem com reações falso-positivas e falso-negativas em ambos os métodos. Resultados falso-negativos e falso-positivos apresentam impacto clínico negativo em doadores de sangue e pacientes e, portanto, todas as discordâncias/ discrepâncias encontradas devem ser investigadas e classificadas. Neste estudo, analisamos entre os anos de 2015 a 2017, 325 registros que apresentaram 390 resultados discrepantes entre testes sorológicos e moleculares numa rotina laboratorial. Esses registros envolveram 270 pacientes com 335 discordâncias e 55 doadores de sangue, apresentando uma discordância para cada doador. Entre os pacientes, encontramos alta prevalência de discordâncias/ discrepâncias (25,7%), confrontando resultados sorológicos e moleculares, em pacientes falciformes. As discordâncias/ discrepâncias identificadas em doadores representaram 14,1% do total identificadas. As principais razões que levaram às discordâncias/ discrepâncias foram transfusões recentes e limitações da fenotipagem. De maneira geral, as discordâncias/ discrepâncias classificadas como fenótipo falso positivo e fenótipo falso negativo, ocorreram principalmente em pacientes com transfusões recentes com 102 ocorrências e em indivíduos com variantes RH com 129 ocorrências em 390
9 ocorrências em 390 discordâncias identificadas. Apesar das limitações dos métodos de biologia molecular atualmente empregados, encontramos mais fenótipos falso-positivos e falso-negativos do que genótipos, demonstrando que a genotipagem é mais eficiente para definir os tipos sanguíneos, especialmente em pacientes dependentes de transfusão.
Palavras-chave: Discordâncias, fenótipo, genótipo, hemaglutinação, biologia molecular
Blood transfusions are useful therapeutic practices for the maintenance of the quality of life or considered as a resource for survival in certain pathologies. Depending on the clinical condition of the patient, he can receive several transfusions throughout life, becoming a polytransfused patient. This condition exposes this patient to several non-self-blood group antigens, a fact that can trigger an immune response that can be as aggressive as the patient's own underlying pathology. Therefore, transfusions should be carefully indicated and red blood cell (RBC) matched, minimizing alloimmunization events. RBC-matched units has been performed through serological tests since the middle of the 20th century, been considered gold standard for the identification of RBC phenotypes. However, in the last 20 years, molecular techniques have proved to be important tools for resolving serological limitations in the identification of phenotypes. However, when both methods are performed to determine RBC phenotype, disagreements in the results can occur. False-positive and false-negative reactions exist for serological and molecular antigen typing methods. If the predicted phenotype is inconsistent with the known antibodies or the serological phenotype, the disagreement must be investigated and classified. False-negative and false-positive results are clinically problematic in blood donors and patients. In this study, we investigated discrepant results between serology and molecular tests in patients and blood donors that occurred in daily molecular laboratory practice over a two-year period. Sickle cell disease (SCD) patients represented a large percentage of our cases of disagreements, but we also observed a high prevalence of disagreements between phenotypes and genotypes in blood donors. The main reasons that led to disagreements were recent transfusions and limitations of phenotyping. The disagreements classified as false positive/true negative genotype and false positive/true positive genotype occurred mainly in patients with recent transfusions and individuals with Rh variants, while those classified as true negative/false positive phenotype, involved null phenotypes due to silent genes. Despite the limitations of the molecular biology currently employed, we found more false-positive and false-negative phenotypes than genotypes, demonstrating that genotyping are more efficient in defining blood types, especially in transfusion-dependent patients.
Key words: disagreements, phenotype, genotype, hemagglutination, molecular biology
Figura 1: Alguns tipos de Reações Transfusionais ... 20 Figura 2: Sistemas de Grupos Sanguíneos e seus Cromossomos. ... 23 Figura 3: Representação do Teste de Aglutinação Direta, TAI e TAD ... 27 Figura 4: Planilha de Registros – Área de Registro da Solicitação de Genotipagem
... 44
Figura 5: Planilha de Registros – Área de Resultados da Genotipagem pela Técnica
de Microarray (HEA BEADCHIP). ... 45
Figura 6: Fluxograma Metodológico ... 34 Figura 7: Algoritmo para Resolução das Discordâncias entre Fenótipo e Genótipo. 79
Tabela 1: Alelos e SNPs presente no HEA BeadChipTM ... 41
Tabela 2: Variantes RHD Analisadas pelo RHD BeadChipTM ... 42
Tabela 3: Variantes RHCE Analisadas pelo RHCE BeadChipTM ... 43
Tabela 4: Comparação e perfil dos grupos de pacientes que apresentaram discordâncias de acordo com o diagnóstico ... 49
Tabela 5: Número de discordâncias analisadas em cada diagnóstico ... 49
Tabela 6: Análises moleculares utilizadas para resolução das discordâncias ... 51
Tabela 7: Tipos de discordâncias de acordo com o diagnóstico dos pacientes ... 53
Tabela 8: Classificação das discordâncias de acordo com o causa e motivo em pacientes ... 55
Tabela 9: Identificação dos tipos de discordâncias classificadas como: Fenótipo Falso Positivo/Genótipo Verdadeiro Negativo ... 57
Tabela 10: Identificação dos tipos de discordâncias classificadas como: Fenótipo Falso Negativo/Genótipo Verdadeiro Positivo em Pacientes ... 59
Tabela 11: Identificação dos tipos de discordâncias classificadas como: Fenótipo Verdadeiro Negativo/Genótipo Falso Positivo ... 63
Tabela 12: Quantificação das discordâncias por sistemas de grupos sanguíneos ... 65
Tabela 13: Quantificação das discordâncias transitórias com causa/motivo TR... 67
Tabela 14: Classificação das discordâncias em doadores - causa/motivo e sistemas envolvidos ... 70
Tabela 15: Classificação das discordâncias em doadores - causa/motivo e sistemas envolvidos ... 70
Sigla Descrição
AF Anemia Falciforme
AHAI Anemia Hemolítica Autoimune
ISBT International Society of Blood Transfusion
PCR Reação em cadeia da polimerase
PCR-AS Reação em cadeia da polimerase alelo específico
PCR-RFLP Reação em cadeia da polimerase com digestão enzimática
PCR-SSO Reação em Cadeia da Polimerase Sequência Específica de Oligonucleotídeos
DNA Ácido desoxirribonucleico
Ng Nanograma
HEA BeadChipTM Plataforma de microarray RHD BeadChipTM Plataforma de microarray RHCE BeadChipTM Plataforma de microarray
ABO Sistema ABO
MNS Sistema MNS
RH Sistema RH
LU Sistema Lutheran
KELL Sistema Kell
LE Sistema Lewis FY Sistema Duffy JK Sistema Kidd DI Sistema Diego DO Sistema Dombrock CO Sistema Colton GE Sistema Gerbich KX Sistema Kx XG Sistema Xg SC Sistema Scianna LW Sistema Lewis
GYPA Gene GYPA
GYPB Gene GYPB
GYPE Gene GYPE
RHD Gene RHD
RHCE Gene RHCE
RHAG Gene RHAG
LU Gene LU
KEL Gene KEL
XK Gene XK JK Gene JK LW Gene LW FY Gene FY JO Gene JO CO Gene CO DI Gene DI SC Gene SC HY Gene HY
FY-GATA Gene FY-GATA
FY265 Gene FY265
C Antígeno C C Antígeno c CW Antigeno CW CX Antígeno CX D Antígeno D E Antígeno E E Antígeno e
Fya Antígeno Fya
Fyb Antígeno Fyb
Jka Antígeno Jka
Jkb Antígeno Jkb
N Antígeno N
S Antígeno S
S Antígeno s
V Antígeno V
VS Antígeno VS
Crawford Antígeno Crawford
CEP Comitê de Ética em Pesquisa
CNS Conselho Nacional de Saúde
APC Célula apresentadora de antígenos
NH2 Grupo funcional das aminas
COOH Grupo funcional das carboxilas
TRALI Lesão pulmonar aguda associada à transfusão
PRIMERS Segmento de ácido nucleico iniciadores
SMD Síndrome mielodisplásica
DARC Duffy Antigen Receptor for Chemokines
HgbS Hemoglobin S
TR Transfusão Recente
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
Mm Milímetro Ml Mililitro µl Microlitro Pb Pares de base G Grama Ng Nanograma Pmol Picomol Nmol Nanomol
dH2O Água destilada
1. INTRODUÇÃO ... 19
1.1 Prática transfusional segura ... 19
1.2 Antígenos eritrocitários ... 21
1.3 Aloimunização eritrocitária ... 24
1.4 Determinação de antígenos eritrocitários ... 26
1.5 Discordâncias entre Fenótipos e Genótipos ... 29
2. OBJETIVOS ... 32
2.1. Objetivo Geral ... 32
2.2. Objetivos Específicos ... 32
3. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA ... 33
4 MATERIAIS E MÉTODOS... 34
4.1 Desenho do estudo ... 34
4.2. Amostras ... 35
4.2.1. Amostras de sangue de pacientes ... 35
4.2.2. Amostras de sangue de doadores voluntários de sangue ... 35
4.2.3. Critérios de inclusão ... 35
4.2.4. Critérios de exclusão ... 36
4.3. Materiais ... 36
4.3.1 Kit de Extração de DNA... 36
4.3.2 Água livre de nuclease ... 36
4.3.3 Etanol absoluto (CH3CH2OH) ... 36
4.3.4 Taq DNA Polimerase ... 37
4.3.5 DNTP 10mm ... 37
4.3.9 Enzimas de Restrição... 38
4.3.10 Gel de Agarose ... 38
4.3.11 Gel de Poliacrilamida 12% ... 38
4.3.12 Plataformas HEA BeadchipTM, RhCE BeadchipTM E Rhd BeadchipTM ... 38
4.3.13 Kit de Extração Qiaex II ... 39
4.3.14 Big Dye ... 39
4.3.15 Marcador de peso molecular Low Mass ... 39
4.4 Métodos ... 40
4.4.1. Extração de DNA ... 40
4.4.2. PCR – Reação em Cadeia da Polimerase ... 40
4.4.3. Análise de DNA em Microarray ... 40
4.4.4. Sequenciamento de DNA Genômico ... 43
4.4.5. Análise das discordâncias ... 43
5. RESULTADOS ... 47
5.1. Casuística ... 47
5.2. Classificação das discordâncias analisadas de acordo com o diagnóstico dos pacientes ... 47
5.3. Análises moleculares utilizadas e classificadas de acordo com as discordâncias ... 50
5.4. Classificação das discordâncias analisadas entre os pacientes com diferentes diagnósticos ... 52
5.5. Classificação das discordâncias analisadas de acordo com a Causa/Motivo em pacientes ... 54
5.6. Discordâncias classificadas como Fenótipo Falso Positivo – Genótipo Verdadeiro Negativo em pacientes ... 56
5.8. Discordâncias classificadas como Fenótipo Verdadeiro Negativo – Genótipo
Falso-Positivo em pacientes... 62
5.9. Discordâncias classificadas nos grupos de pacientes, de acordo com os sistemas de grupos sanguíneos envolvidos. ... 64
5.10 Discordâncias consideradas transitórias – Transfusão Recente (TR) ... 66
5.11 Discordâncias avaliadas em doadores ... 69
6. DISCUSSÃO ... 72
7. CONCLUSÕES ... 80
8. REFERÊNCIAS ... 81
9. APÊNDICES ... 86
9.1 Publicação ... 86
9.2. Tabela Geral Completa ... 91
10. ANEXOS ... 107
1. INTRODUÇÃO
1.1 Prática transfusional segura
De acordo com a Portaria nº 158, de 04 de fevereiro de 20161, uma citação no Art. 6º diz que a transfusão de sangue e seus componentes devem ser criteriosamente indicada e utilizada na medicina, considerando que toda transfusão traz em si um risco para o receptor.
A busca por segurança no uso de hemocomponentes tem sido foco em muitos países nas últimas décadas. A Organização Mundial de Saúde promove esforços para melhorar o acesso a transfusão segura em todo o mundo. Vários métodos têm sido empregados para reduzir os riscos relacionados a transfusões de hemocomponentes e melhorar a segurança dos produtos sanguíneos. São propostas algumas intervenções em todas as etapas do processo, desde a coleta da doação do sangue até o acompanhamento pré e pós transfusionais, em doadores e receptores, respectivamente2.
A transfusão sanguínea é um procedimento terapêutico importante e necessário em diversas situações patológicas, mas pode ser associado a sérios riscos com potenciais complicações, chamados “reações transfusionais”3.
As reações transfusionais podem ser consideradas imediatas (até 24 horas após a transfusão) ou tardias (após 24 horas da transfusão, até meses ou anos) e são classificadas de acordo com sua origem: não imune e imunes4. Exemplos de causas não imunes são: sobrecarga de ferro, sobrecarga circulatória toxicidade ao citrato, tromboembolismo pulmonar. Já, citações de reações de causa imune podem ser as reações alérgicas, TRALI, reações hemolíticas, entre outras5. A figura 1 demonstra tipos de reações transfusionais.
Figura 1: Alguns tipos de reações transfusionais
Adaptada de Castilho, Pellegrino e Reid6.
Algumas causas de hemólise podem ser equivocadamente atribuídas à transfusão, como em casos de temperatura alta, alteração de pressão osmótica ou agressão química. Contudo, reações hemolíticas ocorrem quando há incompatibilidade imunológica a partir de exposição previa à antígenos não próprios em eventos transfusionais ou em gestações7 e 8.
Elevado risco de hemólise existe em pacientes cuja doença de base provoque a necessidade de vários eventos transfusionais ao longo da vida, expondo-o à diversexpondo-os antígenexpondo-os eritrexpondo-ocitáriexpondo-os que seu sistema imune nãexpondo-o cexpondo-onhece. A respexpondo-osta imune nesse caso, chamada de aloimunização é caracterizada pela produção de anticorpos pelo receptor, direcionados contra eritrócitos dos doadores7.
A compatibilização transfusional para antígenos eritrocitários é extremamente importante para evitar ou ao menos minimizar os eventos de aloimunização, mas quando o paciente é exposto a diversos eventos transfusionais ao longo da vida, essa missão é quase impossível, visto que existe uma variabilidade enorme de antígenos eritrocitários entre indivíduos. Essa variabilidade tanto genética quanto de expressão dos antígenos se dá em função de diferentes mecanismos moleculares que dão origem a inúmeros polimorfismos resultando em centenas de antígenos eritrocitários8, 10.
Uma prática transfusional segura sob o aspecto imunohematológcio, então se define pela eficiência de adotar medidas que proporcionem a identificação correta dos antígenos eritrocitários, ou de anticorpos circulantes no receptor, para que ele receba uma unidade de sangue antígeno compatível, ou antígeno negativo para o anticorpo circulante6.
1.2 Antígenos eritrocitários
Os sistemas de grupos sanguíneos agrupam um ou mais antígenos controlados em um único locus gênico, ou por dois ou mais genes homólogos ligados, com pouca ou nenhuma recombinação observável entre eles9. Atualmente existem 326 antígenos eritrocitários, distribuídos em 39 sistemas de grupos sanguíneos, de acordo com a Sociedade Internacional de Transfusão Sanguínea (ISBT)9. Os antígenos que não pertencem a nenhum sistema são incluídos em uma das cinco coleções de grupos sanguíneos (série 201) ou na série 700 (antígenos de baixa frequência) ou na série 901 (antígenos de alta frequência), conforme os critérios padronizados pela ISBT9.
Os antígenos eritrocitários são herdados geneticamente e definidos por sequências específicas de aminoácidos que constituem uma proteína, por carboidratos ligados às proteínas ou a lipídios da membrana eritrocitária. A diversidade dos antígenos de grupos sanguíneos, como qualquer outro traço biológico, encontra-se a nível genético. Todos os antígenos de grupos sanguíneos são herdados pela herança autossômica dominante, com exceção dos sistemas Kx e Xg, os quais são codificados pelo cromossomo X. Embora o mecanismo de herança genética seja simples, a prevalência dos antígenos ou fenótipos em um sistema de grupo sanguíneo pode variar entre diferentes populações10, 11.
Pode-se citar como antígenos eritrocitários mais imunogênicos e, portanto, mais investigados em Imunohematologia os antígenos dos sistemas ABO, Rh, Kell, Kidd, Duffy, Diego, MNS. Esses são considerados mais imunogênicos pela capacidade de provocar resposta imune em indivíduos negativos quando expostos a eles, por isso recebem maior atenção na investigação imunohematológica, principalmente na prática transfusional12, 13.
Os mecanismos moleculares que levam a produção dos antígenos eritrocitários são variados e incluem: (1) polimorfismos de nucleotídeo único (SNP);
(2) deleção de gene; (3) deleção de nucleotídeo; (4) duplicação de genes; (5) conversão gênica ou rearranjos gênicos14,15 e 16.
Dentre os mecanismos moleculares envolvidos, o polimorfismo de um único nucleotídeo (SNP) é o mais comum como causa de variabilidade de antígenos. Com relação à deleção de gene, éxon ou nucleotídeos, relata-se na literatura a ocorrência destes mecanismos envolvendo antígenos dos sistemas ABO, MNS, Rh, Kell, Duffy, Dombrock. O mecanismo de inserção de nucleotídeos é mais relacionado com polimorfismos encontrados nos sistemas Rh e Colton; duplicação envolvendo éxon é mais relacionada ao sistema Gerbich; splicing alternativo é mais relacionado ao fenótipo S-s- e mecanismos de conversão gênica ou rearranjos são relacionados aos sistemas Rh e MNS17.
Sobre a síntese e expressão dos antígenos eritrocitários a partir dos mecanismos acima citados, podemos mencionar algumas particularidades referentes aos principais antígenos. A expressão dos antígenos do sistema ABO depende da atividade de glicosiltransferases específicas codificadas pelo gene ABO, localizado no cromossomo 9q34.1-34.218.
Os antígenos do sistema Rh são encontrados exclusivamente nas hemácias. São proteínas codificadas por um par de genes homólogos, RHD e RHCE. O gene RHD codifica o antígeno RhD e o gene RHCE, a produção de dois pares de antígenos antitéticos: C, c, E, e6. A expressão dos antígenos Rh na superfície dos eritrócitos depende da presença da glicoproteína Rh-associada (RhAG), produto do gene RHAG localizado no cromossomo 6.
O gene JK está localizado no locus 18q12.3 codifica a glicoproteína e expressa os antígenos do sistema Kidd6.
O gene FY está localizado no locus 1q22-q23, é responsável pela produção da glicoproteína Duffy, também chamada DARC (Duffy Antigen Receptor for Chemokines), que é expressa em células eritróides e não eritróides18 e 19.
O gene AQP-1, localizado no locus 7p14, codifica a proteína AQP1 que atravessa a membrana eritrocitária seis vezes, possui os domínios terminais (NH2 e COOH) intracelulares e expressa o polimorfismo do grupo sanguíneo Colton18.
As glicoforinas GPA e GPB são proteínas do tipo I, codificadas por genes homólogos, GYPA e GYPB, localizados no cromossomo 4. O alto nível de homologia entre GYPA e GYPB e o envolvimento de um terceiro gene, GYPE, aumentam as
chances de recombinações gênicas, gerando glicoforinas híbridas. A GPA expressa os antígenos M e N e a GPB expressa os antígenos S e s18, 20.
Os antígenos do sistema de grupo sanguíneo Lutheran estão expressos em duas proteínas (Lu e B-CAM), produtos do gene LU localizado no cromossomo 19 e que diferem entre si somente no tamanho do domínio citoplasmático18.
Os antígenos do sistema de grupo sanguíneo Kell estão expressos na glicoproteína Kell, produto do gene KEL localizado no cromossomo 7. A glicoproteína Kell é expressa principalmente na linhagem eritróide e testículos e menor expressão no cérebro, tecidos linfoides e coração21, 22. A glicoproteína Dombrock expressa os antígenos do sistema Dombrock, resultado de uma mutação missense. O produto do gene está localizado no cromossomo 12p12.36, 20
Há ainda, o conhecimento de antígenos considerados de baixa e alta incidência. Antígenos de baixa incidência ocorrem em menos de 1% das populações estudadas, e antígenos de alta incidência ocorrem em mais de 90% das pessoas. Eles podem apresentar importância clínica transfusional, dependendo do contexto que se apresentam6.
Figura 2: Sistemas de grupos sanguíneos e seus cromossomos.
1.3 Aloimunização eritrocitária
Os antígenos eritrocitários apresentam grande importância na medicina transfusional devido ao fato de estarem presentes na porção externa da membrana eritrocitária. Desta forma, a ausência destes antígenos na membrana eritrocitária pode levar à aloimunização de um receptor, caso ele seja transfundido com concentrados de hemácias que expressem os antígenos em questão. Além disto, o alto grau de diversidade genética e a presença de recombinações gênicas podem levar a alterações qualitativas e quantitativas na expressão dos antígenos na membrana da hemácia, gerando fenótipos parciais e fracos que podem, também, estar associados à aloimunização23, 24.
Podemos afirmar que a aloimunização envolve o processo de reconhecimento do antígeno alogênico pelas células apresentadoras de antígeno (APCs), e a apresentação dos epítopos antigênicos por moléculas HLA de classe II para o receptor de célula T CD4+ (TCR). Então, a ativação de células T CD4+ e a posterior interação de células T e B, associados a liberação de citocinas que ativam as células B a se diferenciarem em células produtoras de anticorpos (plasmócitos), que secretam anticorpos específicos, caracterizam a resposta imune nessa situação25.
A exposição de um paciente a antígenos eritrocitários que estejam ausentes em suas hemácias (aloantígenos) durante transfusão sanguínea, transplante ou gestação podem levar a ativação de uma resposta imune humoral, que desencadeia a produção de anticorpos anti-eritrocitários. A aloimunização eritrocitária pode causar diminuição da sobrevida das hemácias transfundidas quando essas são incompatíveis, ou ainda, reação transfusional hemolítica (aguda ou tardia) e a síndrome de hiperhemólise que pode colocar a vida do paciente em risco. Além disso, a presença de aloanticorpos que muitas vezes está associada com a presença concomitante de autoanticorpos pode levar a atrasos na liberação da transfusão devido à complexidade dos testes para identificação dos anticorpos formados e a dificuldade de encontrar unidades compatíveis. Embora a aloimunização eritrocitária possa ocorrer naturalmente, a aloimunização mais frequente ocorre pelo resultado de transfusões e gestações incompatíveis26, 27.
Pacientes que recebem transfusão de sangue crônica, tais como os pacientes portadores de anemia falciforme, β-talassemia e síndrome mielodisplásica (SMD)
podem desenvolver anticorpos a uma centena de antígenos eritrocitários. Estes anticorpos permanecem na circulação e estão implicados em reações transfusionais hemolíticas e redução do número de bolsas de sangue compatíveis para futuras transfusões10, 23 e 28.
A presença de antígenos de baixa ou alta incidência também podem representar problemas de compatibilização em hemoterapia. Um exemplo é quando um doador apresenta um antígeno de baixa incidência e este tenha importância clínica transfusional. Nesse caso, é difícil utilizar essa bolsa com um receptor antígeno/compatível. Da mesma forma, antígenos de alta incidência, podem se tornar problemas nas agências transfusionais, quando há um receptor que apresente negativa a expressão desse antígeno. São situações que podem favorecer aloimunização, provocar a demora em se encontrar sangue compatível ou mesmo a incapacidade de assegurar uma transfusão segura podem trazer consequências graves para os pacientes e contribuir com a mortalidade6, 26, 28 e 29.
A taxa de aloimunização eritrocitária é identificada com frequência em pacientes que se encontram em regime de transfusão crônica. Estes pacientes, na maioria dos casos, desenvolvem anticorpos contra antígenos eritrocitários comuns, antígenos de alta incidência e variantes. Sendo assim, a transfusão de hemocomponentes, principalmente nesses casos, tem se tornado um desafio para os laboratórios de compatibilidade transfusional30, 27.
A aloimunização eritrocitária limita a disponibilidade de concentrados de hemácias compatíveis para futuras transfusões além de ser risco de hemólise tardia e de quadros graves de hiper-hemólise. A aloimunização pode estar relacionada aos seguintes fatores: idade do paciente, número de transfusões recebidas, doenças de base pré disponentes, diferenças antigênicas entre pacientes e doadores, doenças de base, expressão do HLA (antígeno de histocompatibilidade). Os antígenos mais frequentemente envolvidos na aloimunização são os antígenos dos grupos Rh, Kell, Kidd, Duffy, Diego e MNS12, 13 e 26. Dentre os aloanticorpos anti-eritrocitários, os dirigidos contra antígenos dos sistemas Rh, Kell, Duffy e Kidd possuem grande importância clínica, por reagirem a 37ºC e provocarem hemólise no receptor de sangue e no feto ou recém-nascido13.
Algumas condutas têm sido adotadas para evitar e/ou minimizar aloimunizações. A realização da fenotipagem ou genotipagem estendida para identificar os antígenos eritrocitários mais imunogênicos em doadores e receptores
tem sido utilizada como uma forma de transfundir um sangue mais compatível32. No entanto, discordâncias entre os resultados sorológicos e moleculares têm sido cada vez mais frequentes nas rotinas dos laboratórios de Imunohematologia. A resolução dessas discordâncias, em especial os casos de resultados falso-positivos, é de fundamental importância para a utilização segura dos protocolos de prevenção da aloimunização31, 32 e 33.
1.4 Determinação de antígenos eritrocitários
A determinação sorológica dos antígenos eritrocitários baseia-se em métodos de aglutinação direta e indireta (figura 3) e de acordo com a rotina ou demanda, não necessitam de equipamentos sofisticados. Trata-se de uma técnica simples e se efetuada corretamente, apresenta alta especificidade e sensibilidade, quando não envolve pesquisas mais complexas. Por isso, métodos sorológicos por hemaglutinação ainda são os testes considerados como “padrão” para a realização de identificação de antígenos em Imunohematologia7. Storry34 relata que após a introdução do teste de antiglobulina indireta, para identificar os anticorpos IgG in vitro pela adição de um anti-IgG, a segunda metade do século testemunhou uma explosão de novos antígenos e sistemas de grupos sanguíneos eritrocitários.
Contudo, quando há necessidade de investigação de expressões fracas, ou investigações prejudicadas por transfusões recentes, ou ainda, por condições de anemia hemolítica autoimune (AHAI), é necessário lançar mão de algumas ferramentas disponíveis, que auxiliam a identificação de antígenos ou anticorpos eirtocitários, por métodos de hemaglutinação, mas que tornam o processo de identificação mais demorado e custoso. Nesses casos, é necessária a utilização de reagentes potencializadores e enzimas específicas, antissoros de clones diferentes ou ensaios automatizados de aderência em fase sólida6, 7, 33 e 34.
Figura 3: Representação do teste de aglutinação direta, TAI e TAD
Extraído de Castilho, Pellegrino e Reid6
A técnica de hemaglutinação ainda pode ser influenciada por vários fatores, como as características dos anticorpos, a densidade antigênica, a localização do antígeno na membrana, bem como a distância do antígeno a partir da camada lipídica e as interações físicas6, 31 e 33. Além disto, a variabilidade genética na formação dos antígenos eritrocitários, principalmente em afrodescendentes, pode gerar antígenos raros e variantes que não são identificados por técnicas sorológicas.
A necessidade de utilizar potencializadores como: solução de baixa força iônica (LISS) ou polietinoglicol (PEG), ou ainda, a necessidade de tratamento das hemácias com enzimas para pesquisar antígenos resistentes, ou o uso de reagentes que reduzem as ligações de dissulfito, que desnaturam antígenos expressos em proteínas, são condições que tornam a investigação morosa e algumas técnicas podem levar a fraca expressão de alguns antígenos “in vitro”, dificultando a identificação desses, obrigando o setor de imunohematologia organizar rotinas
paralelas de investigação de antígenos e/ou anticorpos, com reagentes diferentes e diferentes clones de antissoros. Casos complexos em que a amostra apresenta múltiplos anticorpos, exigem ainda testes adicionais e a aplicação de várias técnicas6 e 34.
Por isso, podemos afirmar que limitações dos testes sorológicos relacionados à técnica dizem respeito à necessidade de antissoros com especificidades para determinados antígenos, sendo que para muitos clinicamente relevantes, não existem antissoros comercialmente disponíveis; a limitação em testar múltiplos antígenos de uma só vez, o alto custo do antissoro específico; além disso, testes sorológicos são trabalhosos e requerem um profissional experiente para obter resultados consistentes para interpretar resultados, as vezes subjetivo, do teste de aglutinação14 e 34.
Assim, a utilização das ferramentas de biologia molecular tem sido fundamental para a inserção de novas metodologias na rotina laboratorial da Imunohematologia, contribuindo para o aumento da segurança e eficácia transfusional de pacientes politransfundidos, pois os procedimentos de genotipagem de grupos sanguíneos podem suprir as deficiências das técnicas de hemaglutinação e podem prever antígenos a partir da identificação do genótipo6.
O recurso da genotipagem para identificação de fenótipos pode ser efetivo em diversas situações, como na pesquisa de antígenos RhD em mulheres grávidas (para efeito da correta profilaxia com RhIG – Imunoglobulina Rh) quando essas apresentam um fenótipo D fraco, e a identificação fenotípica por métodos sorológicos é, de maneira geral inconclusiva ou limitada, pela ausência de antissoros específicos. Com testes moleculares é possível identificar, por exemplo, D fracos tipos 1, 2 ou 3 e diferenciá-los de outras variantes com risco de aloimunização. Essa análise gera economia em termos de cronograma de acompanhamento das gestantes e profilaxia de RhIG. Além disso, com a possibilidade de identificação desses e de outros antígenos variantes, hemocomponentes mais compatíveis podem ser transfundidos para pacientes que apresentam variantes do antígeno RhD35.
Esses testes incluem técnicas de PCR desenvolvidas “in house” e, plataformas de microarray que podem detectar diversos alelos de grupos sanguíneos em um mesmo ensaio, incluindo variantes alélicas, ou ainda, sequenciamento do gene ou parte dele, para possibilitar a investigação de mutações que possam justificar uma
expressão diferente do antígeno, ou mesmo a ausência dele na membrana do eritrócito31, 15.
Embora a genotipagem possa complementar a investigação sorológica, o genótipo de um indivíduo pode não se correlacionar com o fenótipo. Isso ocorre devido situações que influenciam na expressão do antígeno e nesses casos a genotipagem detecta a presença de um gene que a proteína não é expressa na superfície das hemácias. Estas discordâncias, também chamadas de discrepâncias entre fenótipo e genótipo são atribuídas a alterações no gene que afetam sua transcrição (mutação de ponto em elementos reguladores, mutação em sítios de splice, stop codon prematuro), ausência da proteína de interação necessária para a expressão do antígeno na superfície da hemácia, crossing over e outros rearranjos gênicos36, 37.
As principais dificuldades ocorrem com variantes de antígenos que apresentam mutações em locais distintos dos genes e que não são incorporadas nas plataformas de genotipagem atualmente utilizadas10 e 31. Nestas situações, a técnica mais indicada para a identificação do problema é o sequenciamento completo do gene envolvido33.
A capacidade de deduzir o fenótipo de grupo sanguíneo de um indivíduo, a partir de sua sequência de DNA, não é um conceito novo. Estamos vivenciando o momento da ciência em que as bases moleculares da maioria dos antígenos de grupos sanguíneos são conhecidas e, portanto, testes genéticos têm sido utilizados para ajudar a selecionar o sangue mais compatível para a transfusão de sangue. Em contrapartida, somos frequentemente surpreendidos por novos padrões de polimorfismos que levam a resultados discrepantes entre diferentes metodologias, tornando algumas vezes necessária a utilização de uma combinação de técnicas moleculares38, 39e 40.
1.5 Discordâncias/ Discrepâncias entre fenótipos e genótipos
Na última década houve um aumento no desenvolvimento e disponibilidade de testes moleculares para a identificação de alelos de grupos sanguíneos40. Por isso, essas técnicas estão sendo cada vez mais incorporadas à rotina da medicina transfusional, principalmente para os pacientes politransfundidos41, 42.
No entanto, é importante lembrar que a genotipagem é utilizada apenas para deduzir um fenótipo, que por diversas razões pode não ter sido efetivamente
definido na fenotipagem sorológica. Assim, os testes de diagnóstico molecular, como qualquer outro ensaio, podem produzir resultados falso-positivos e falso-negativos43, 44. Embora exista um uso sistemático de controles positivos e negativos na realização das técnicas e a implementação de programas de testes de proficiência na análise molecular, a ocorrência da maioria dos erros de genotipagem é difícil de prever, tanto para os usuários dos testes como para os fabricantes dos ensaios, pois podem ocorrer eventos como alelos silenciosos ou que apresentam mutações no sítio de ligação com o primer34.
É comum se dizer, apesar de ser uma afirmativa equivocada, que a fenotipagem é o “padrão ouro”, ou ainda, dar toda a credibilidade do resultado para a genotipagem. Na verdade, resultados falso-positivos e falso-negativos podem ocorrem em ambos os métodos. Contudo, os testes moleculares já são superiores em muitos aspectos à fenotipagem tradicional e resolvem os problemas de limitações e confiabilidade às vezes encontrados com antissoros e falsos resultados produzidos por fraca expressão antigênica ou reatividade cruzada20.
A prática de interação das técnicas sorológicas e moleculares tem se tornado cada vez mais frequente. Isso favorece que resultados discrepantes entre as metodologias sejam observados e investigados. Além de falhas de equipamentos e interferências de fatores humanos que, definitivamente, não devem ser negligenciadas, quatro possíveis combinações de discordâncias podem ser identificadas: fenótipo falso negativo - genótipo positivo verdadeiro; fenótipo falso positivo - genótipo negativo verdadeiro; fenótipo negativo verdadeiro – genótipo falso positivo e fenótipo positivo verdadeiro – genótipo falso negativo44, 45, 34.
Resultados sorológicos falso-negativos podem ocorrer pela não detecção de antígenos de baixa expressão, antígenos raros e variantes enquanto resultados moleculares falso-negativos ocorrem devido a mutações na região de transcrição do gene ou no sítio de ligação do primer que não estão contempladas nos testes ou plataformas de genotipagens. Estes resultados são mais problemáticos em doadores de sangue porque podem induzir a aloimunização em pacientes negativos para os antígenos em questão. Os resultados sorológicos falso-positivos podem ocorrer pela presença de teste direto da antiglobulina positivo46, transfusões recentes, poliaglutinação e reagentes que levam a reações cruzadas enquanto os resultados moleculares falso-positivos ocorrem pela presença de genes com alterações em outras regiões diferentes da investigada e que silenciam a expressão dos antígenos
na membrana e, por interações entre proteínas necessárias para a expressão de um antígeno. Estes resultados são mais relevantes em receptores de sangue47, 34 que podem se aloimunizar aos antígenos que na verdade não possuem.
Vários estudos demonstram as divergências que podem existir na comparação de resultados entre fenotipagem e genotipagem. Em um estudo de Kulkani et al., 201848, os autores relatam que foram realizados testes sorológicos e moleculares para os antígenos C, c, D, E, e, Fya, Fyb, Jka, Jkb, K, k, M, N, S, s em 200 pacientes talassêmicos e em 100 doadores do grupo “O”. Os resultados moleculares foram concordantes com o fenótipo sorológico em apenas 23% dos pacientes para cinco pares de antígenos antitéticos pertencentes a quatro sistemas de grupos sanguíneos (Rh, Duffy, Kell e Kidd). Outros estudos mostram discordâncias entre fenótipos e genótipos, na investigação de variantes Rh devido a limitação da fenotipagem49.
Diante das evidências relatadas na literatura em diversos estudos, fica claro que a resolução das discordâncias sorológicas e moleculares, além de proporcionar a seleção correta do sangue para receptores de sangue, pode ainda contribuir na identificação de novos alelos e antígenos de grupos sanguíneos6 e 40.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Este trabalho teve como objetivo geral evidenciar, quantificar e resolver discordâncias/ discrepâncias na tipagem eritrocitária entre os resultados sorológicos e moleculares, de pacientes que recebem transfusões de sangue e doadores de sangue, com a finalidade de aumentar a segurança transfusional.
2.2. Objetivos Específicos
Avaliar a ocorrência de discordâncias entre fenótipos e genótipos numa rotina laboratorial;
Identificar quais técnicas são mais eficientes para resolver discordâncias/ discrepâncias na tipagem eritrocitária;
Identificar as causas/motivos de discordâncias/ discrepâncias entre fenótipos e genótipos;
Identificar em quais condições clínicas ocorrem mais discordâncias/ discrepâbcias entre fenótipos e genótipos;
3. ASPECTOS ÉTICOS DA PESQUISA
Este estudo foi aprovado em 20/02/2017 pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, Parecer nº 1.934.262 (Anexo I), conforme previsto na resolução no 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS). Todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, previamente aprovado pelo CEP.
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 DESENHO DO ESTUDO
A presente pesquisa foi desenvolvida por meio de levantamento de dados retroativos e com análises em campo (laboratório), após aprovação do comitê de ética em pesquisa. A figura 4 mostra como a pesquisa foi organizada.
Figura 4: Fluxograma metodológico
4.2. AMOSTRAS
4.2.1. Amostras de sangue de pacientes
Após consentimento informado, foram analisadas amostras de sangue anticoaguladas com EDTA, de pacientes atendidos no ambulatório de Hematologia do Hemocentro da Unicamp, submetidos à transfusão de sangue e que na fenotipagem sorológica, apresentaram prováveis variantes Rh, sugeridas pelas fenotipagens RhD e RhCE, discordâncias entre fenótipos e genótipos ou suspeitas de fenótipos raros, no período de janeiro de 2015 a dezembro de 2017, com análises retrospectivas e em tempo real.
4.2.2. Amostras de sangue de doadores voluntários de sangue
Após consentimento informado, foram analisadas amostras de sangue, anticoaguladas com EDTA, de doadores voluntários de sangue atendidos no Hemocentro da Unicamp, que na tipagem sorológica apresentaram prováveis variantes de antígenos eritrocitários clinicamente significantes sugeridas pela fenotipagem, fenótipos e genótipos discrepantes ou suspeitas de fenótipos raros, no período de 2015 a dezembro de 2017, com análises retrospectivas e em tempo real.
4.2.3. Critérios de Inclusão
Registros de doadores de sangue com resultados de tipagem sorológica discrepante, tipagem sorológica duvidosa ou discordâncias entre os resultados da fenotipagem e genotipagem eritrocitária. Registros de pacientes acompanhados no ambulatório de Hematologia do Hemocentro da Unicamp que receberam transfusões no Hemocentro e que apresentaram suspeita de variantes Rh ou discordâncias entre os resultados da fenotipagem e genotipagem eritrocitária.
Registros de doadores e pacientes que concordaram com os termos de consentimento livre e esclarecido.
Os registros dos participantes voluntários (pacientes e doadores) cuja ficha de solicitação de genotipagem foi encaminhada ao nosso laboratório, só foram
incluídos em nossa pesquisa quando continham as seguintes informações: patologia, resultados da investigação de anticorpos, resultados de fenotipagem, relato de transfusões recentes (com data e quantidade transfundida) e o motivo de solicitação da genotipagem.
4.2.4. Critérios de Exclusão
Registros de doadores ou pacientes que apresentaram ausência de informações com relação à tipagem sorológica ou fenotipagem eritrocitária, registros duplicados pela solicitação de novas coletas em função de qualidade ruim de material para análise molecular.
4.3. MATERIAIS
4.3.1 Kit de extração de DNA
Para a extração do DNA do sangue periférico foi utilizado o kit comercial QIAamp DNA Blood Mini Kit da empresa Qiagen® (Qiagen, Valencia, CA, USA). Estão inclusos neste kit os reagentes: Buffer AL, Buffer AW1, Buffer AW2, proteinase K e os materiais: colunas de sílica e tubos de lise.
4.3.2 Água livre de nuclease
A água livre de nuclease (Applied Biosystems®, Foster City, CA, EUA) foi utilizada na etapa final da extração de DNA, na reconstituição dos primers e nas reações de PCR.
4.3.3 Etanol absoluto (CH3CH2OH)
O etanol absoluto (P.A) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) foi utilizado na preparação dos reagentes de extração de DNA e no protocolo de sequenciamento de DNA.
4.3.4 Taq DNA Polimerase
A enzima Taq DNA polimerase (Invitrogen®, Carisbad, CA, EUA) foi utilizada nas Reações em Cadeia da Polimerase Alelo Específica (AS), PCR-multiplex, Análise dos Fragmentos da Digestão Enzimática dos Produtos da Reação em Cadeia da Polimerase (do inglês - restriction fragment length polymorphism – sigla: PCR-RFPL), e Reação em Cadeia da Polimerase Sequência Específica de Oligonucleotídeos (do inglês - sequence specific oligonucleotide – sigla: PCR-SSO). O kit incluía 5 unidades/μL da enzima, 1mL de tampão 10X (200mM Tris-HCL (pH8.4) e 500mM de KCl e 1mL de MgCl2 50mM.
Para a técnica de microarray HEA BeadChipTM (Human Erythrocyte Antigen, BioArray Solutions, Immucor, Warren, NJ, EUA) foi utilizada a enzima Taq polimerase Platinum (Invitrogen®). O kit incluía 5 unidades/μL da enzima, 1mL de tampão 10X (200mM Tris-HCL (pH8.4) e 500mM de KCl e 1mL de MgCl2 50mM.
4.3.5 dNTP 10Mm
As dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) adquiridas da empresa Invitrogen®, foram utilizadas nas técnicas de PCR convencional na concentração de 10mM.
4.3.6 Primers
Os primers utilizados na análise molecular dos grupos sanguíneos estão descritos nos protocolos de genotipagem. Todos os primers foram adquiridos da empresa Invitrogen®.
4.3.7 Marcador de peso molecular
Marcador de peso molecular de 100pb (Invitrogen®) foi utilizado nas corridas de eletroforese para análise do tamanho dos fragmentos de DNA.
4.3.8 Tampão Tris-EDTA-Borato (TEB) 10X
Tampão utilizado no preparo do gel de agarose e na corrida de eletroforese. Foi preparado dissolvendo-se 108g de Tris (Sigma-Aldrich®), 55g de ácido bórico (Sigma-Aldrich®) e 40mL de EDTA 0,5M pH 8.0 (Sigma-Aldrich®) em quantidade de água destilada (dH2O) suficiente para 1000mL.
4.3.9 Enzimas de restrição
As enzimas de restrição utilizadas neste trabalho foram adquiridas das empresas New England Biolab® (Beverly, MA, EUA) e MBI Fermentas® (Amherst, NY, EUA) e foram utilizadas para digestão dos produtos de PCR de acordo com o polimorfismo estudado, seguindo protocolo interno do laboratório.
4.3.10 Gel de agarose
A solução de agarose foi preparada em TEB 1X de acordo com a concentração específica de cada protocolo (1%, 2% ou 3%). Esta solução era aquecida em forno micro-ondas, durante 1 minuto e, após resfriamento, adicionou-se 50μL de brometo de etídio (Invitrogen®).
4.3.11 Gel de poliacrilamida 12%
A solução de poliacrilamida foi preparada misturando 23,3mL de acrilamida 40% (Gibco BRL®, Gaithersburg, MD, EUA); 8,8mL de TEB 10X, 55mL de água destilada, 363μL de persulfato de amônio 10% (Gibco BRL®) e 16μL de TEMED (Gibco BRL®). Esta solução foi dispensada em uma placa de vidro, previamente preparada, para que ocorresse a sua polimerização.
4.3.12 Plataformas HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM
As plataformas de microarray HEA BeadChipTM, RHCE BeadChipTM e RHD BeadChipTM foram adquiridas da empresa BioArray Solutions (Immucor. NJ,
USA) e foram utilizadas para a genotipagem eritrocitária estendida dos grupos sanguíneos e para a pesquisa de variantes nos genes RHCE e RHD, respectivamente.
Estas plataformas utilizam kits que contém todos os reagentes necessários para a execução da técnica, incluindo: lâminas de vidro com chips de DNA (sondas de oligonucleotídeos específicas ao polimorfismo estudado) com capacidade para 8 ou 96 amostras, PCR-Mix (contendo primers, dNTPs e tampão) e as enzima ExoSAPIT, Lambda Exonuclease e Thermo Sequenase, provenientes da empresa Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, EUA).
Nos Kits de RHCE e RHD também estão inclusos a enzima Hot Start Taq DNA polimerase (BioArray Solutions).
4.3.13 Kit de extração Qiaex II
Este Kit foi adquirido da Empresa Qiagen® e foi utilizado na extração e purificação do DNA contido em gel de agarose para subsequente reação de sequenciamento de DNA
4.3.14 Big Dye
O reagente Big Dye (BD Half-term, GenPark, Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA, EUA) foi utilizado nas reações de sequenciamento de DNA.
4.3.15 Marcador de peso Molecular Low Mass
O marcador de peso molecular Low Mass (Invitrogen®) foi utilizado na análise do peso molecular dos fragmentos designados para sequenciamento.
4.4 MÉTODOS
4.4.1. Extração de DNA
Os DNAs utilizados nas pesquisas foram extraídos de leucócitos de sangue periférico utilizando-se o Kit QIAmp (Qiagen®, Chatsworth, CA), de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. As concentrações de todos os DNAs preparados foram analisadas pela medida da densidade ótica em espectrofotômetro a 260 nm (Nanodrop).
4.4.2. PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
A técnica de PCR-AS (Alelo Específico) foi utilizada para pesquisa dos genes RHD, RHDΨ e alelos RHCE*C/c e a técnica de PCR-RFLP (Restrição do tamanho dos fragmentos de polimorfismos) analisou os alelos RHCE*E/e. PCR-AS é uma técnica em que se identifica mutações ou polimorfismos conhecidos pelo desenho de primers. PCR-RFLP é uma técnica em que utiliza enzimas de restrição que cortam o DNA em sequências específicas, gerando fragmentos de diferentes tamanhos que são separados e visualizados em forma de bandas7.
A reação em cadeia da Polimerase (PCR), utiliza 200 ng de DNA, 50 pmol de cada primer, 2 nmol de cada dNTP, 1,0 U de Taq DNA polimerase e tampão em um volume final de 50 l. Os ciclos de amplificação para os polimorfismos analisados utilizam o protocolo: desnaturação a 95ºC por 15 minutos; 35 ciclos de 20 segundos a 94ºC; 20 segundos a 62ºC; 20 segundos a 72ºC e uma extensão de 10 minutos a 72ºC em um termo ciclador Verity (Applied Biosystems (Foster City, CA)).
Os produtos de PCR amplificados foram analisados após corrida de eletroforese em gel de agarose a 2% ou gel de poliacrilamida a 8%.
4.4.3. Análise de DNA em microarray
A genotipagem, para doadores e pacientes, foi realizada pela técnica de microarray utilizando-se o Kit BeadChip Human Erythrocyte Antigen (“HEA”), contendo
sondas com sequências específicas dos genes (conforme tabela 1) RHCE, FY (incluindo FY-GATA e FY265), DO (incluindo HY e JO), CO, DI, SC, GYPA, GYPB (incluindo marcadores que permitem a identificação dos fenótipos U-negativo e U variante), LU, KEL, JK, LW e uma mutação associada com hemoglobinopatia (HgbS) (BioArray Solutions, Warren, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante.
A genotipagem para as variantes RhD e RhCE também foi realizada pela técnica BeadChip.
Para a investigação de variantes RHD, utilizou-se o kit RHD BeadChip, contendo polimorfismos específicos para determinação destas variantes, conforme tabela 2.
A identificação dos alelos RHCE variantes foi realizada com a utilização da plataforma RHCE BeadChipTM (BioArray Solutions, Immucor) que permite a detecção de 25 polimorfismos associados com alterações dos antígenos C (RH2), c (RH4), E (RH3), e (RH5), CW (RH8), CX (RH9), V (RH10), VS (RH20), e Crawford (RH43). Com este método podemos identificar os alelos RHCE variantes: ceRT, ceAR, ceMO, ceRA, ceVG, ceEK, ceBI, CeMA, ceSL, CeVA, ceTI, ceFV, DHAR, E tipo I/II/III/IV, EKH, ceS, (C)ceS, ceS(340,378) e 48C, conforme tabela 3.
Estes ensaios foram realizados de acordo com o recomendado pelo fabricante (Bioarray Solutions Ltda., Warren, NJ, USA) e para leitura de cada BeadChip, utilizou-se o sistema de imagem equipado com fluorescência óptica fornecido pela empresa.
Tabela 1: Alelos e SNPs presentes no HEA BeadChipTM
SISTEMA DE GRUPO SANGUÍNEO ALELOS SNPS
C/c 307 C>T 109 Ins Rh E/e 676 G>C VS 733 C>G V 1006 G>T K/k 698 T>C Kell Jsa/Jsb 1910 C>T Kpa/Kpb 961 C>T (continuação)
Fya/Fyb 125 G>A
Duffy GATA (Silencing FY) -33 T>C Fyx[Fy(b+w)] 265 C>T Kidd Jka/Jkb 838 G>A M/N 59 C>T S/s 143 T>C MNS Silencing S Ex5 230 C>T Silencing S Int5 g>t Diego Dib/Dia 2561 C>T
Lutheran Lua/Lub 230 A>G
Doa/Dob 793 A>G Dombrock Hy+/Hy- 323 G>T Jo(a+)/Jo(a-) 350 C>T Landsteiner-Wiener LWa/LWb 308 A>G Colton Coa/Cob 134 C>T Scianna Sc1/Sc2 169 G>A Hemoglobin S HgbS 173A>T
Tabela 2: Variantes RHD analisadas pelo RHD BeadChipTM D fraco tipo: 1, 1.1, 2, 3, 4.0, 4.1, 4.2/DAR, 4.3, 5, 11, 14, 15, 17, 25, 29, 34, 40, 47, 51
D negativo: RHDΨ; W16X; D-CE(3-7)-D; D-CE(4-7)-D; (C)dceS; DCE(3-9)-D; CE(1-3)-D(4- 10);
rG; RHD(Y269X)
Del: 1227 G>A; IVS3+1G>A; M295I
D Parcial: DAR/ D fraco 4.2; DIIIa (DIII tipo 5), DIII tipo 4,6; DIIIc; DIVa; DIVa -2; DIV tipo 3, 4, 5; DIVb; DV tipo 1,2,3 (DBS-0),4,5(DHK),6,7,8,9; DVI tipo 1,2,3,4; DNB; DHMi; DUC-2;
DAU 1,2,3,4,5; DBT 1,2; DCS 1, 2; DOL; DOL-3; DFR; DFR -2; DTO; DBS-0,1,2.
Tabela 3: Variantes RHCE analisadas pelo RHCE BeadChipTM
4.4.4. Sequenciamento de DNA genômico
Todas as amostras em que não foi possível caracterizar o genótipo pelas técnicas de “microarray” foram sequenciadas por sequenciamento direto do DNA genômico. As análises sequenciais foram realizadas nos produtos de PCR amplificados do DNA genômico que apresentaram discordância com a fenotipagem ou características diferentes das esperadas e das amostras que apresentaram variantes Rh. Eventualmente, alguns polimorfismos detectados pela tecnologia microarray, também foram confirmados por sequenciamento. Produtos de PCR foram eluídos do gel de agarose a 1%, utilizando-se o Kit de extração (Qiaex II, Qiagen, Valencia, CA), purificados e sequenciados diretamente em ambas direções com o reagente Big Dye BD Half-term, GenPak, Perkin Elmer Biosystems, em um sequenciador automático.
4.4.5. Análise das discordâncias
Rotineiramente, todos os dados informados na ficha de solicitação da genotipagem são registrados em nosso laboratório em uma planilha de registros de pacientes (figura 5), bem como todas a informações referente à diagnóstico, resultados de investigação sorológica para anticorpos e antígenos eritrocitários, relato de eventos de transfusões recentes (realizadas em até 3 meses) e a descrição do motivo da solicitação de genotipagem.
Crawford; VS; V; (C)ceCF; (C)ceS-1, 2, 3; 16C; ce; Ce; cE; CE; ce variant-1, 2; ceAR; ceAR CF; ceBI; ceEK; ceFV; CeMA; ceMO; ceRA; ceRT; ceS (340)-1, 1.1, 2, 2.1; ceS (697) (ceCF)-1, 1.1, 2, 2.1; ceS (748)-1, 1.1, 2, 2.1; ceS-1, 1.1, 2, 2.1; ceSL; ceTI type 2; ceTI-1, 2; CeVA; CeVG; CW-1, 2; CX-1, 2; DHAR-1, 2; E type I, III (EFM), IV; EKH; rN
Figura 5: Planilha de Registros – área de registro da solicitação de genotipagem
A presença dessas informações foi considerada essencial para nosso estudo, visto que foram utilizadas na comparação com os resultados da genotipagem para identificação e interpretação das discordâncias.
Os resultados dos testes de genotipagem realizados em nosso laboratório, também são rotineiramente inseridos em outro campo na mesma planilha (figura 6), onde relatamos o genótipo identificado para cada gene. Então, após análise criteriosa, fazemos a dedução do fenótipo, a partir dos resultados do fenótipo sorológico. A partir daí, efetuamos as comparações entre os resultados do fenótipo deduzido, com o fenótipo informado. Na presença de discordâncias, realizamos contato com o setor de Imunohematologia, para confirmação do fenótipo informado (rechecagem de informações). Os casos que mesmo após esta rechecagem continuaram a apresentar discordâncias entre fenótipos e genótipos foram então incluídos em nosso estudo.
Figura 6: Planilha de Registros – área de resultados da genotipagem pela técnica
de Microarray (HEA BeadChip).
Nossa pesquisa envolveu uma análise de dados retrospectiva e prospectiva realizada em nossos registros a partir de janeiro de 2015, aprovada pelo Comitê de ética da FCM, UNICAMP.
Nesse período foram analisados 734 registros, desses, 282 foram excluídos por falta de informações na ficha de solicitação de genotipagem. Portanto, foram analisados 452 registros quanto à presença ou não de discordâncias. Após análise comparativa e interpretativa das informações, 127 registros foram considerados sem discordâncias e 325 com discordâncias/ discrepâncias.
Esse número passou então a ser nosso foco de estudo. Esses registros foram divididos de acordo com o diagnóstico/ patologia, de acordo com a informação obtida na ficha de solicitação de genotipagem. Nesta casuística, foram incluídos também doadores de sangue, cujos resultados foram analisados separadamente.
4.4.6. Classificação das discordâncias/ discrepâncias e Análise estatística
Todas as discordâncias/ discrepâncias identificadas foram classificadas de acordo com as resoluções das mesmas em: (1) fenótipo falso positivo – genótipo verdadeiro negativo; (2) fenótipo falso negativo – genótipo verdadeiro positivo; (3) fenótipo verdadeiro negativo – genótipo falso positivo e (4) fenótipo verdadeiro positivo – genótipo falso negativo. Essa última mencionada não foi identificada em nossa pesquisa.
Após a organização dos registros em grupos e a devida identificação e classificação das discordâncias/ discrepâncias, foi realizada a análise estatística dos dados encontrados.
A análise estatística foi realizada utilizando o teste qui quadrado ou χ² um teste estatístico aplicado a dados categóricos para avaliar quão provável é que, qualquer diferença observada aconteça ao acaso, não pode ser utilizada para valores menores que 5. Trata-se de uma das distribuições mais utilizadas em estatística inferencial, é adequado para amostras não pareadas. Também foi utilizado o Teste Exato de Fischer para dados quantitativos menores que 5 e que pudessem ser avaliados de forma contingenciada. Esse teste é adequado para analisar valores pequenos, contingenciados (2x2), contudo, também é válido para todos os tamanhos de amostras.
5. RESULTADOS
5.1. Casuística
Foram analisados 734 registros de genotipagens realizadas no Laboratório de Biologia Molecular de Grupos Sanguíneos da Unicamp. Os registros são referentes ao período de janeiro de 2015 a dezembro de 2017. Como o levantamento e análises foram realizados entre março de 2017 e dezembro de 2018, os dados de 2015 até março de 2017 são apenas de caráter retroativo, com levantamento dos dados sorológicos e moleculares registrados em nosso laboratório. A partir de março de 2017, após aprovação do CEP- FCM da Unicamp, nós participamos da realização dos testes moleculares, bem como da análise dos dados informados.
Os casos estudados foram avaliados correlacionando resultados da genotipagem com as informações sorológicas fornecidas pelo laboratório de Imunohematologia, como a fenotipagem eritrocitária e os relatos da presença de anticorpos na investigação imunohematológica. Estes casos são de pacientes e doadores de sangue que foram encaminhados ao laboratório de biologia molecular por apresentarem resultados sorológicos raros, inconclusivos ou por limitações da técnica de hemaglutinação que impossibilitaram a identificação fenotípica.
Dos 734 registros analisados, 282 foram excluídos por falta de informações, configurando 452 registros como instrumentos da pesquisa. Desses 452, 325 (270 pacientes e 55 doadores) apresentaram discordâncias/ discrepâncias entre fenótipos e genótipos e se tornaram foco das análises desta pesquisa. Alguns pacientes apresentaram mais de uma discordância, então, o número de discordâncias identificadas nesses, foi de 335, totalizando 390 quando somadas as 55 identificadas em doadores.
5.2. Classificação das discordâncias analisadas de acordo com o diagnóstico dos pacientes
Os pacientes que apresentaram discordâncias entre fenótipo e genótipo foram agrupados e organizados de acordo com o diagnóstico. Entre os grupos de pacientes estudados, classificamos 168 registros como “outras patologias”, que se
refere à registros de pacientes em que a patologia não foi relatada ou pacientes que apresentaram patologias diversas como: fraturas, condições oncológicas, infecções, condições crônicas, entre outras como apresentado na tabela 4.
Vale ressaltar que 27 desses registros, se referem à condições relacionadas à distúrbios hematológicos, entre eles, 5 registros de Leucemias crônicas e agudas, 2 registros de Síndromes Mielodisplásicas e 2 Mieloproliferativas, além de 5 registros de Mieloma Múltiplo. Também entre os 168 registros referidos como “outras patologias”, 36 se referem à pacientes relatados como “oncológico”. Tanto as condições hematológicas, quanto as oncológicas, faz desses pacientes, potenciais candidatos a transfusões crônicas. Outro dado importante, é que algumas patologias de base oncológicas, podem prejudicar a expressão do antígeno na membrana do eritrócito, dificultando então sua correta identificação.
Entre os grupos analisados separamos o grupo de doadores, pelo fato de serem considerados indivíduos saudáveis. A avaliação desse grupo foi feita de maneira individual e será apresentada mais adiante.
Na tabela 5 encontram-se as informações referentes ao número de discordâncias analisadas em pacientes para cada diagnóstico, demonstrando que em alguns registros foram identificadas mais que uma discordância por paciente, totalizando assim 335 discordâncias/ discrepâncias. Os resultados discrepantes foram mais frequentes em pacientes falciformes quando comparados individualmente com outros grupos de pacientes.
Tabela 4: Comparação e perfil dos grupos de pacientes que apresentaram discordâncias de acordo com o diagnóstico
^= ≤0.05 (AF> Talassemia>AHAI) p-valor ≤0.05 - Teste qui quadrado AF: Anemia Falciforme
AHAI: Anemia Hemolítica Autoimune
OUTRAS PATOLOGIAS: Diversas patologias ou não relatadas (%): Porcentagem
Tabela 5: Número de discordâncias analisadas em cada diagnóstico
DIAGNÓSTICO AF TALASSEMIAS AHAI OUTRAS PATOLOGIAS TOTAL p-valor
DISCORDÂNCIAS 86 21 22 206* 335 <0.0001
(%) 25,7 6,3 6,6 61,5 100
*p-valor ≤0.05 - Teste qui quadrado
GRUPO DE INDIVÍDUOS AF TALASSEMIAS AHAI OUTRAS PATOLOGIAS TOTAL p - valor
QUANTIDADE 69^ 20 13 168* 270 <0.0001
(%) 25,5 7,4 4,9 62,2 100,0
