An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393
AVALIAÇÃO DA PERDA ÓSSEA PERIODONTAL EM
RATOS POR MEIO DOS MÉTODOS RADIOGRÁFICO E
MORFOMÉTRICO
Evaluation of periodontal bone loss in rats for radiographic and morphometric methods
Daniela Martins de Souza1, Fernanda de Almeida Prado2, Marcela de Almeida Prado2, Rosilene Fernandes da Rocha3, Yasmin
Rodarte Carvalho4
1 Professora Assistente Doutora – FUNVIC-FAPI, Faculdade de Pindamonhangaba, Pindamonhangaba, SP. 2 Graduada em Odontologia pela UNESP, SJ dos Campos, SP.
3 Professora Adjunta – UNESP, Universidade Estadual Paulista, SJ dos Campos, SP 4 Professora Titular – UNESP, Universidade Estadual Paulista, SJ dos Campos, SP
Recebimento: 11/04/11 - Correção: 16/05/11 - Aceite: 22/06/11
RESUMO
O presente estudo se propôs a avaliar morfometricamete (região da ligadura ou hemiarco) e radiograficamente (suporte ósseo periodontal) a perda óssea na periodontite experimental em ratos. Ligaduras de algodão foram posicionadas em torno do segundo molar maxilar e primeiro molar mandibular direitos em 14 ratas fêmeas (Wistar). Os molares contralaterais serviram como controle intragrupo. Após quatro semanas os ratos foram sacrificados e suas mandíbulas e maxilas foram removidas. Os espécimes foram radiografados e posteriormente dissecados, corados e fotografados. As alterações do suporte ósseo periodontal (SOP) foram avaliadas nas radiografias do 1° molar mandibular, 1° e 2° molares maxilares. Nas imagens a reabsorção óssea foi avaliada pelas alterações das medidas da distância da junção esmalte-cemento até a crista óssea alveolar nas raízes do dente, considerando hemiarco ou apenas a região da ligadura, por face livre. Verificou-se que não ocorreram diferenças estatísticas entre as alterações de SOP nos diferentes dentes. A reabsorção óssea foi significativamente maior na vestibular da maxila considerando tanto a região da ligadura em relação ao hemiarco quanto em relação às demais localizações (palatina da maxila e lingual da mandíbula). Conclui-se que o SOP expressa o percentual de alteração ósConclui-sea independente do dente avaliado e que a análiConclui-se morfométrica deve ser na região envolvida com a ligadura e não no hemiarco, sendo a vestibular da maxila a região onde se verificou a maior perda óssea em periodontite induzida em ratos.
UNITERMOS: Estudos experimentais, Metodologia, Doença periodontal, Ratos. R Periodontia 2011; 21:67-73.
INTRODUÇÃO
As periodontites são caracterizadas pela inflamação e progressiva destruição dos tecidos de suporte do dente incluindo as fibras do ligamento periodontal, tecido ósseo alveolar e o tecido gengival (Kinane, 2001).
Em periodontia, modelos animais têm sido utilizados para compreensão dos fenômenos envolvidos no processo de etiopatogenia da doença (Weinberg & Bral, 1999) e para avaliar modalidades de tratamento (Anbinder et al., 2007). Além disso, são empregados para verificar a influência de fatores/indicadores de risco como a nicotina (Bosco et al., 2007), diabete (Holzhausen et al., 2004) e álcool (Irie et
al., 2008; Souza et al., 2009) na progressão da doença periodontal.
A indução da doença periodontal em animais pode ser obtida por meio de vários métodos, entre os quais se verifica a colocação de ligadura de algodão ao redor da coroa dentária do segundo molar maxilar (Cavagni et al., 2005; Anbinder et al., 2006; Bain et al., 2009; Souza & Rocha 2009; Rego et al., 2010) ou do primeiro molar mandibular (Nassar et al., 2005; Souza et al., 2006; Bosco et al., 2007; Bezerra et al., 2008).
Há décadas, a determinação da distância da junção cemento-esmalte até a crista óssea (JCE-CO) vem sendo
empregada para avaliar o nível ósseo alveolar em crânios macerados de ratos, permitindo quantificar o total de tecido ósseo destruído durante o período experimental (Crawford et al., 1978; Klausen et al., 1989; Tatakis & Guglielmoni 2000; Bjornsson et al., 2003; Kuhr et al., 2004). Este é o método de escolha para mensurações morfométricas de perda óssea periodontal em maxilares dissecados de ratos (Klausen, 1991). No entanto, a avaliação morfométrica não é capaz de detectar defeitos intra-ósseos. Para tanto, um método radiográfico complementar foi proposto por Klausen et al.(1989) no qual se obtém o percentual de suporte ósseo existente no elemento dentário. Este método foi empregado em radiografias de molares localizados na maxila, mensurando o aspecto distal
do 1° e 2° molares (Bjornsson et al., 2003) e na mandíbula
avaliando o aspecto distal do 1° molar (Souza et al., 2006). O presente estudo se propôs a avaliar a alteração óssea alveolar decorrente da indução de periodontite experimental em ratos, por meio de avaliação radiográfica e morfométrica na mandíbula e maxila.
MATERIAL E MÉTODO Amostra
Para este trabalho foram utilizadas 14 ratas fêmeas (Rattus norvegicus, variação albinus, Wistar) com aproximadamente quatro meses de idade, pesando em torno de 300 gramas. As ratas foram mantidas em gaiolas em temperatura ambiente e receberam dietas à base de ração sólida (Guabi Nutrilabor - Mogiana Alimentos-Campinas, SP, Brasil) e água ambas fornecidas livremente. O presente estudo foi realizado de acordo com os Princípios Éticos na Experimentação Animal e obteve aprovação pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
FOSJC/UNESP, com o protocolo no. 046/2004-PA/CEP.
Indução da Doença Periodontal
Os animais foram anestesiados com uma mistura de 13 mg/kg de cloridrato xilasina 2% (Rompum - Bayer - São Paulo, SP, Brasil) com 33mg/kg de cetamina base (Francotar - Virbac - Roseira, SP, Brasil) por via intramuscular. Para a indução da doença periodontal, ligaduras com fio de algodão (Coats-Corrente - São Paulo, SP, Brasil) foram posicionadas ao redor da região cervical dos 1osmolares inferiores e dos 2os molares superiores ambos do lado direito, deixando o lado esquerdo sem ligadura para servir como controle.
As ligaduras foram mantidas por 4 semanas (28 dias), após os animais foram novamente anestesiados e sacrificados por decapitação. As mandíbulas e maxilas foram removidas e separadas em direta e esquerda, sendo as peças fixadas em formol a 10%.
Análise radiográfica do suporte ósseo periodontal (SOP)
As hemimandíbulas e hemimaxilas foram radiografadas pelo Sistema de Imagem Radigráfica Intra-oral Digital RVG® (RadioVisioGraphy – Trofhy radiology inc. – Marietta / USA), o qual emprega Dispositivos de Carga Acoplada (sensor-CCD) para captura direta das imagens. As tomadas radiográficas foram realizadas utilizando aparelho de raios-X digital Gendex 765DC® (Gendex, Dentsply, Internacional, USA) com 65 kv, 7 mA e tempo de exposição de 0,08 s. O sensor CCD foi fixado em uma mesa e o cilindro posicionado com distância focal de 30 cm. As hemimandíbulas, com a face lingual e as hemimaxilas com a face vestibular voltadas para o cilindro de raios-X, foram fixadas na porção central do sensor com auxilio de cera utilidade. O sensor apresentou relação de paralelismo com as faces livres dos dentes e de perpendicularismo com as faces oclusais.
Nas radiografias digitais, foram considerados três pontos no molar selecionado: ápice da raiz distal (A), ponta da cúspide distal (C) e o fundo do defeito ósseo na distal do dente (B). O ápice radicular foi definido como o ponto mais apical do dente. O fundo do defeito representou a posição mais apical do tecido ósseo proximal. Foram mensuradas as distâncias lineares entre os pontos AC e AB (Figura 1).
Então o suporte ósseo periodontal (SOP) foi calculado pela fórmula: SOP=AB/AC x 100 (Klausen et al., 1989).
O sistema de análise de imagem Image Tool v.3.0 (UTHSCSA, San Antonio, TX, USA) foi empregado para as medições lineares, sendo realizadas por um examinador treinado e desconhecedor dos grupos experimentais. A média das três medidas foi empregada para expressar o SOP em cada animal. Valores médios maiores de SOP indicaram menor destruição óssea periodontal por grupo. As mensurações foram realizadas no aspecto distal do 1o molar inferior e do 1o e 2o molares superiores.
Figura 1: Nas radiografias digitais, foram considerados três pontos no molar selecionado: ápice da raiz distal (A), ponta da cúspide distal (C) e o fundo do defeito ósseo na distal do dente (B). Foram mensuradas as distâncias lineares entre os pontos AC e AB. Então o suporte ósseo periodontal (SOP) foi calculado pela fórmula: SOP=AB/AC x 100
An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393 Análise morfométrica da perda óssea alveolar Os espécimes foram dissecados de forma cuidadosa para não danificar as peças. O procedimento incluiu: imersão em solução de hipoclorito de sódio 1% por quatro horas e remoção mecânica de todos os remanescentes de tecido mole. Posteriormente, todas as peças foram coradas com azul de metileno (1g/100ml) por 1 minuto para demarcar a junção esmalte-cemento (JEC).
Os espécimes foram observados em lupa estereoscópica, sendo posicionados de forma que ocorresse a sobreposição das cúspides vestibular e lingual, não havendo a possibilidade de visualização da superfície oclusal. A imagem captada da lupa foi digitalizada por câmera fotográfica por vestibular e palatina na hemimaxila e apenas por lingual na hemimandíbula, visto que o ramo mandibular encobria a área de análise quando o espécime estava na posição determinada.
O método de Crawford, Taubaman e Smith (1978) foi utilizado para medir a perda óssea vertical. Nas imagens digitais foram realizadas medidas lineares no centro de cada raiz seguindo seu longo eixo, da JEC à CO. As mensurações foram obtidas, de acordo com o número de raízes na face considerada, sendo três medidas para o 1o molar e duas para o 2o e 3o molares.
As mensurações foram avaliadas de duas formas: envolvendo todos os molares do hemiarco e somente o local de colocação da ligadura (1o molar inferior ou 2o molar superior) na face estabelecida (Figura 2, 3 e 4).
As mensurações foram realizadas por meio do programa Image Tool v.3.0 (UTHSCSA, San Antonio, TX,USA) por um examinador treinado e desconhecedor dos grupos experimentais. A media de três medidas foi utilizada para expressar a perda óssea por animal.
Análise Estatística
Previamente a análise estatística, todas as medições foram realizadas por um examinador principal com intervalo de 7 dias e por um examinador secundário. A reprodutibilidade das medidas interexaminador e intraexaminador foi avaliada por meio do coeficiente de correlação de Pearson e teste t pareado (p<0,05).
No presente trabalho todos os dados foram expressos em média e desvio padrão e as diferenças estatísticas foram analisadas ao nível de significância de 5%.
O teste t pareado foi empregado para comparação entre os grupos com e sem ligadura para a análise radiográfica e morfométrica para confirmar se a ligadura induziu periodontite nos ratos.
Na análise radiográfica, para cada localização verificou-se a alteração óssea ocorrida subtraindo a perda óssea gerada
pela ligadura dos respectivos dentes sem ligadura (alteração óssea: sem ligadura – com ligadura) e os valores foram submetidos à análise de variância (ANOVA ONE-WAY e post hoc Tukey).
Na análise morfométrica, aplicou-se o teste t pareado entre os dados obtidos por hemiarco e região da ligadura. Aplicou-se a análise de variância (ANOVA, Tukey) nos valores
Figura 2: A perda óssea vertical na maxila por vestibular foi obtida pela média das distâncias lineares da junção esmalte-cemento (JEC) à crista óssea (CO) localizadas no centro de cada raiz seguindo seu longo eixo. As mensurações para hemiarco consideraram as sete medidas dos três molares e a mensuração da região de ligadura considerou as medidas do 2° molar (linhas mais espessas).
Figura 3: A perda óssea vertical na maxila por palatina foi obtida pela média das distâncias lineares da junção esmalte-cemento (JEC) à crista óssea (CO) localizadas no centro de cada raiz seguindo seu longo eixo. As mensurações para hemiarco consideraram as sete medidas dos três molares e a mensuração da região de ligadura considerou as medidas do 2° molar (linhas mais espessas).
Figura 4: A perda óssea vertical na mandíbula por lingual foi obtida pela média das distâncias lineares da junção esmalte-cemento (JEC) à crista óssea (CO) localizadas no centro de cada raiz seguindo seu longo eixo. As mensurações para hemiarco consideraram as sete medidas dos três molares e a mensuração da região de ligadura considerou as medidas do 1° molar (linhas mais espessas).
obtidos nas diferentes localizações (mandíbula por lingual; maxila vestibular e palatina) considerando hemiarco ou a região da ligadura.
RESULTADOS
Análise radiográfica do suporte ósseo periodontal Quanto à reprodutibilidade das medidas do percentual de SOP, observou-se coeficiente de correlação intraexaminador de 99% (r= 0,9993) e interexaminador de 98% (r= 0,9897). Além disso, não foi observado erro entre as medidas intra-examinador (p=0,0610) e interintra-examinador (p= 0,0808).
A Tabela 1 apresenta os percentuais médios e desvio-padrão obtidos na análise radiográfica e observa-se que o SOP nos grupos com ligadura foi significativamente inferior que o observado nos grupos sem ligadura (p<0,05). Além disso, verificou-se que nas alterações percentuais do SOP (sem ligadura – com ligadura) não houve diferença estatística (p= 0,7249) entre os locais avaliados.
Análise morfométrica de distância linear no hemiarco e região da ligadura
Para a reprodutibilidade das medidas lineares de perda óssea observou-se coeficiente de correlação intraexaminador de 99% (r= 0,9986) e interexaminador de 99% (r= 0,9966). Além disso, não foi observado erro entre as medidas intraexaminador (p= 0,3273) e interexaminador (p=0,0915).
As médias e desvio padrão referentes às medidas lineares de perda óssea alveolar (mm) por hemiarco e região da ligadura estão apresentadas na Tabela 2, na qual observa-se que com a inserção da ligadura a perda óssea foi significativamente maior que na ausência de ligadura (p<0,05), tanto quando avaliado o hemiarco (3 molares) como quando avaliado a região intimamente envolvida com a indução de periodontite.
A alteração óssea (com ligadura – sem ligadura) da distância da JCE à crista óssea alveolar, considerando o hemiarco e a região da ligadura, pode ser observada na Tabela 3. Verificou-se que não houve diferença estatística entre a avaliação do hemiarco e região diretamente envolvida com
média E dESvio Padrão do SoP (%) na PrESEnça (lig), auSência dE ligadura (SEm lig) E conSidErando Sua altEração (SEm lig-lig). % ligadura (lig) % sem ligadura (sem lig) p* (sem lig – lig)% alteração
Maxila 1 o molar 42,81 (5,53) 51,62 (3,26) 0,0202 9,28 (5,50) a**
Maxila 2 o molar 44,99 (6,13) 55,80 (1,11) 0,0052 10,81 (6,68) a
Mandíbula 1o molar 52,18 (3,39) 61,34 (2,10) 0,0025 9,16 (4,86) a
*Teste t pareado (p<0,05). **Médias seguidas por letras distintas diferem estatisticamente entre si (ANOVA e Tukey; p<0,05).
tabela 1
tabela 2
média E dESvio Padrão daS mEdidaS linEarES (mm) mEnSuradaS no hEmiarco ou rEgião da ligadura na PrESEnça ou auSência dE ligadura.
Com ligadura Sem ligadura p*
Hemiarco Maxila vestibular 0,71 (0,03) 0,46 (0,02) 0,0016 Maxila palatal 0,80 (0,12) 0,53 (0,05) 0,0000 Mandíbula lingual 1,04 (0,08) 0,81 (0,06) 0,0008 Região da ligadura Maxila vestibular 0,94 (0,18) 0,34 (0,07) 0,0012 Maxila palatal 0,77 (0,08) 0,44 (0,04) 0,0000 Mandíbula lingual 0,78 (0,13) 0,59 (0,06) 0,0097 * Teste t pareado (p<0,05).
An official publication of the Brazilian Society of Periodontology ISSN-0103-9393 tabela 3
média E dESvio Padrão doS valorES dE altEração linEar (com ligadura-SEm ligadura) Em mm
Localização Hemiarco Região da ligadura p*
Maxila Vestibular 0,26 (0,05) a** 0,60 (0,10) A*** 0,0000
Maxila Palatal 0,27 (0,08) a 0,34 (0,06) B 0,1421
Mandíbula Lingual 0,23 (0,06) a 0,18 (0,09) C 0,4060
p=0,380 p=0,0000
* Teste t pareado (p<0,05). ** Letras minúsculas para análise intergrupo na coluna Hemiarco (ANOVA, Tukey; p<0,05). *** Letras maiúsculas para análise intergrupo na coluna Região da ligadura (ANOVA, Tukey; p<0,05)
a ligadura, seja para maxila no aspecto palatino (p= 0,1421) e mandíbula no aspecto lingual (p= 0,4060). Entretanto, na maxila no aspecto vestibular houve maior perda óssea na região da ligadura (p= 0,0000) que em seu hemiarco.
Considerando a avaliação do hemiarco, observou-se que as alterações ósseas não diferiram significantemente entre os locais analisados (p<0,05).
Avaliando-se a região diretamente envolvida na inserção da ligadura, verificou-se perda óssea significantemente maior na maxila por vestibular que por palatina. A análise na mandíbula no aspecto lingual apresentou menor perda óssea em relação a ambas.
DISCUSSÃO
As análises morfométrica e radiográfica representam recursos de avaliação empregados para mensurar alterações ósseas alveolares em ratos. Entretanto, permanece a dúvida de como eles se comportam associadas aos diferentes dentes, tábuas ósseas alveolares e regiões de mensuração.
Estudo da análise morfométrica (Kuhr, et al. 2004) verificou que a presença de ligadura de algodão causa perda óssea alveolar, que é detectada morfometricamente após 15 dias de sua colocação e subsequentemente ocorre progressãomais leve da perda óssea até o sexagésimo dia.
Fernandes et al. (2007) compararam a avaliação
histometrica e morfométrica da altura óssea alveolar associada a periodontite induzida por ligadura em ratos, e verificaram que não houve diferença significativa entre as medidas.
O presente estudo realizou analise morfométrica linear que é empregada para mensuração de perda óssea alveolar (Cavaghi et al., 2005; Souza et al., 2009; Souza & Rocha, 2009), assim como a medida de área (Anbinder et al., 2006),
visto que ambos apresentam elevada correlação (Liberman et al., 2011) e não apresentam diferença estatística entre os valores obtidos (Souza et al., 2010).
Com relação ao período de permanência da ligadura, estudos realizados em ratos demonstram que o período aproximado a 30 dias é adequado para a indução da doença periodontal, tanto na maxila quanto na mandíbula (Cavagni et al., 2005; Anbinder et al., 2006; Souza et al., 2009). Igualmente em nosso estudo, os métodos de análise empregados foram capazes de comprovar a indução de periodontite, tanto na maxila quanto na mandíbula, em decorrência da inserção e permanência da ligadura de algodão por 28 dias.
O presente estudo avaliou o SOP em três dentes (1º e 2º molares maxilares e 1º molar mandibular) a fim de identificar se um deles deve ser eleito como dente de escolha para o método. Pode-se verificar que a alteração percentual ocorrida no SOP devido à ligadura comportou-se da mesma forma nos três dentes, indicando que a avaliação pode ser realizado em qualquer deles sem prejudicar os resultados dos estudos.
O componente ósseo do periodonto dos ratos pode ser alterado tanto pelo processo de remodelamento fisiológico quanto pela indução de doença periodontal. Desta forma, é fundamental que todos os ratos utilizados em trabalhos de periodontite experimental tenham a mesma idade, a fim de evitar interferência do processo fisiológico de remodelamento ósseo (Klausen, 1991). Como parte do processo de destruição periodontal, observa-se o aumento da distância entre a junção cemento-esmalte e a crista óssea alveolar (Kinane, 2001), o que foi avaliado nesse trabalho.
O presente estudo considerou o efeito da ligadura sobre os ossos maxilares e mandibulares, uma vez que verificou a alteração óssea relacionando o valor obtido na presença da ligadura (efeitos da indução da periodontite e processo
de remodelação óssea) com o valor obtido na ausência de ligadura (remodelação óssea fisiológica). Verificou que a análise deve se restringir a região diretamente envolvida com a mesma e não no hemiarco associado, visto que a avaliação por hemiarco prejudica a identificação das alterações, pois inclui áreas inalteradas pela ligadura que quando submetidas à análise por meio de valores médios, resultam no mascaramento da perda óssea ocorrida.
A alteração óssea linear entre hemiarco e região da ligadura, somente apresentou diferença na maxila por vestibular, resultado este obtido, pois a alteração óssea nesse local foi a maior de todas.
CONCLUSÃO
Conclui-se que a análise radiográfica do SOP expressa o percentual de alteração óssea interproximal de forma independente do dente avaliado. Em relação à análise morfométrica linear de reabsorção óssea causada por ligadura, verificou-se que a análise deve estar na região diretamente envolvida com a mesma e não o hemiarco associado. E a região onde se verifica a maior reabsorção óssea foi a vestibular da maxila.
ABSTRACT
The present study aimed to morphometrically (region of
ligature or hemiarco) and radiographically (periodontal bone support) the bone loss in experimental periodontitis in rats. Ligatures of cotton were positioned around the right second upper molar and around the first mandibular molar rights in 14 female Wistar rats. The contralateral molars served as intragroup controls. After four weeks, the rats were sacrificed and their mandible and maxilla were removed. The specimens were radiographiced and after dissected and stained with methylene blue dye. The periodontal bone support (PBS) was assessment in radiograph of 1° mandibular molar, 1° and 2° maxillary molars. The bone loss was evaluated by the distance from the cementoenamel junction to the alveolar bone crest in the roots of teeth associating with ligature and by hemiarco for free side. The different tooth showed no significant differences among the alteration of the percentages of PBS. The results indicated that the maxilla by buccal presented greater bone loss on region of roots associated with the ligature than hemiarco and than among others localizations (palatal of maxilla and lingual of mandible). The present study concluded that the alteration of PDS was independent of teeth evaluated and the morphometric methodology may be used on ligature regions and that the maxilla for buccal side showed more elevated bone loss in periodontitis in rats.
UNITERMS: Experimental studies, Methodology, Periodontal diseases, Rats.
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Endereço para correspondência: Profa. Dra. Daniela Martins de Souza
Departamento de Biociência e Diagnóstico Bucal
Av. Engenheiro Francisco José Longo, 777 - Jardim São Dimas CEP: 12245-000 - São José dos Campos – SP
Tel.:: (12) 3947-9034
