CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CAPRINO: INFLUÊNCIA DOS DILUIDORES DE CONGELAÇÃO, TEMPOS DE EQUILÍBRIO E CURVAS DE RESFRIAMENTO RODRIGO FREITAS BITTENCOURT

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Mestrado em Medicina Veterinária Tropical

CRIOPRESERVAÇÃO DE SÊMEN CAPRINO: INFLUÊNCIA DOS DILUIDORES DE CONGELAÇÃO, TEMPOS DE EQUILÍBRIO E CURVAS DE RESFRIAMENTO

RODRIGO FREITAS BITTENCOURT

Salvador – Bahia 2006

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Livros Grátis

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Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária Tropical, na área de Reprodução Animal.

Orientador: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Ribeiro Filho

Salvador – Bahia 2006

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Disssertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária Tropical.

Salvador, 21 de Fevereiro de 2006

Comissão Examinadora:

Prof. Dr. Antonio de Lisboa Ribeiro Filho - UFBA (Orientador)

Prof. Dr. Anselmo Domingos Ferreira Santos – Pio Décimo

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À minha avó Maria Hildete Bittencourt; Ao meu avô Soares

Aos meus pais, Parísio e Etinete Bittencourt; Aos meus irmãos, Max e Karina Bittencourt; À minha noiva, Marta Vasconcelos;

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AGRADECIMENTOS

Inicio meus agradecimentos àquele que eu nuca vi, mas conheço bastante. Com ele, compartilhei meus momentos de solidão e tristeza, mas também, os de alegria e felicidade. Com ele, e muitas vezes só com ele, participei todos os piores e os melhores momentos da minha vida; e por isso eu te agradeço meu Deus.

Novamente agradeço a Parisio e Etinete Bittencourt, meus pais, pelos exemplos de vida que são, pelo carinho, amor, e por estarem sempre de meu lado, confiando e apoiando, e às vezes tentando me mostrar com toda dedicação, meus erros. Erros, que em certos momentos, por não ouvi-los, só venho a descobrir após cometê-los. Vocês são minha vida, e vos agradeço por isso.

À Max e Karina Bittencourt, meus irmãos, pelo apóio, pelo amor e pelos exemplos de coragem, retribuo o amor e vos agradeço.

Aos meus bichinhos, Larissa, Lara e Valéria, meu amor e minha vida, vos devoto.

Dona Maria Hildete Bittencourt, minha avó, sua eterna alegria, sua força e sua vontade de viver são meus maiores exemplo de vida, meu amor e meus agradecimentos a te consigno. À Dona Ieda Bittencourt, minha tia e madrinha, por seu amor aos animais e por ter sido um das grandes responsáveis para que eu tenha seguido essa profissão que tanto amo, sagro-te meu amor e meu eterno agradecimento.

Às minhas tias (ordem alfabética pra não ter briga) Ana, Conceição, Elza, Iara, Marlene, Neuza (in memorian), Norman, Rita, Solange.

Aos meus tios Eduardo, Elias, Gerson, Miguel e tio Waltinho pelos momentos felizes, e de muita alegria.

Aos meus primos-irmãos Augusto, Pedro, Tony (meu compadre) e Eduardinho Bittencourt, Leo e Jefinho que compartilharam comigo os melhores momentos da minha vida, e quantas estórias temos pra contar ... e você Luís Alberto, meu compadre, também está entre os meus. Às mais belas primas que alguém poderia ter, Bartira, Carol, Cristiana, Cristina, Luciana, Márcia, Mariana (comadre), Renata e Roberta.

De te July, minha comadre, gosto muito e quero sempre tê-la ao meu lado.

Ao meu amigo e mestre Prof. Dr. Antônio de Lisboa Ribeiro Filho, agradeço por me possibilitar conviver por tantos anos ao lado de um dos maiores nomes da Reprodução Animal do país, mas, principalmente, pela sua sabedoria, grande mestre da inteligência emocional e relações interpessoais, pela sua confiança e amizade, minha eterna gratidão. (“Se pude ver mais longe foi porque subi no ombro de gigantes” Isaac Newton)

Aos meus grandes amigos da equipe de Reprodução Animal (Laboratório de Embriologia) da Universidade Federal da Bahia, Ana Karine, Ana Paula Portela, Daniela Freitas e Ricardo Guerra, como também, os calouros da equipe Alexandre, Carmo, Carol e Raul.

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Aos meus grandes amigos e irmãos do período de graduação, Bernado, Francisco Augusto e Gleison Andrade.

Meus amigos e sócios da Pró-Rumens Assessoria e Consultoria Agropecuária, agradeço pela amizade e pelo apóio.

Ao meu grande irmão Sidney Gonzalez pela amizade e apóio incondicional, em todos os momento em que precisei.

Ao grande amigo Anselmo Santos, agradeço a amizade, a força e a extrema confiança à mim prestada.

Aos meus amigos funcionários do HOSPMEV, Biri, Sena, Zaca, Washington e Vitoriano, agradeço pela ajuda e pela amizade de tantos anos.

Aos meus amigos, funcionários administrativos da faculdade, Ana Íris, Lílian, Seu Manuel e aos(às) bibliotecários(as), pelo apóio e amizade.

Agradeço a ajuda importante da CAPES, pela bolsa de mestrado e da FAPESB, pelo financiamento do projeto.

Meus agradecimento à Tencopec e à Agrofácil Produtos Agropecuário, pelo patrocínio do projeto.

Deixei por último você que com certeza está lendo essas palavras anciosas em busca das palavras que constem do teu nome. Será que achas que de ti esqueceria? Marta Freitas Vanconcelos. Nome e sobrenome do mais puro e verdadeiro amor, que à mim surgiu como um anjo. Aquele anjo que não se espera. Que não se acredita. Apesar de tê-la em minha vida depois de todos os pré-citados, a sua importância é imensurável. Com você divido momentos que nunca tive, a amizade mais sincera, o olhar mais verdadeiro, o carinho mais terno e o amor mais sublime. A sua eterna busca pela perfeição me estimula. E a sua disposição e apóio incondicional me alimenta. Assim, quero tê-la comigo sempre, através dos tempos. E que esses sejam eternos e surpreendentes, assim como você é.

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Os meus sonhos nada mais são

Do que objetivos a serem alcançados. Alguns estão a um passo,

Outros, mais distantes, Além do horizonte. Distância pela qual

Minhas pernas fortes me guiarão, Com paciência sim, mas com clareza. E se no caminho houver algo,

Que o tempo me obste atingir Não tem problema.

Meus sonhos são tão belos, Que do meu ofego,

Farei descanço, E do meu suor, Farei vitória. (Autor anônimo)

Aquele que nunca descansa, Aquele que almeja,

De corpo e alma ao impossível, Esse é o vencedor.

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ÍNDICE

LISTA DE FIGURAS X LISTA DE TABELAS XI LISTA DE ABREVIATURAS XIII

RESUMO XIV

SUMMARY X

V

1. INTRODUÇÃO GERAL 1

2. REVISÃO DE LITERATURA 4

2.1. O espermatozóide e a membrana plasmática 4

2.2 Criopreservação espermática e suas etapas 7

2.2.1. Curva de resfriamento do sêmen 8

2.2.2. Tempo de equilíbrio 10 2.2.3 Curva de congelação 11 2.2.4 Descongelação do sêmen 12 2.3. Diluidores de congelação 12 2.4. Crioprotetores celular 14 2.4.1 Crioprotetores penetrantes 14

2.4.2. Crioprotetores não penetrantes 16

2.4.2.1 Lecitina de soja 18

2.5. Utilização do EDTA 19

2.6. Equex STM 20

2.7. Avaliação do sêmen descongelado 21

2.7.1. Características microscópicas e morfológicas do sêmen 21

2.7.2. Teste de termoresistência 22

3. EXPERIMENTO 1: Influência do tempo de equilíbrio para a eficácia da criopreservação da célula espermática caprina

Resumo 24

Abstract 24

3.1. Introdução 25

3.2. MATERIAIS E MÉTODOS 26

3.2.1. O local e os animais 26

3.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação 27

3.2.3. Diluição e diluidores 28

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3.2.5. Tempo de equilíbrio 28

3.2.6. Congelação do sêmen 29

3.2.7. Descongelação e avaliação espermática 29

3.2.7.1. Curva de descongelação e características microscópicas do sêmen 29

3.2.7.2. Teste de termoresistência 29

3.2.7.3. Morfologia espermática do sêmen descongelado 29

3.2.8. Delineamento e análise estatística 30

3.3. RESULTADOS E DISCUSSÕES 30

3.3.1. Características do sêmen fresco 30

3.3.2. Características microscópicas do sêmen descongelado 32 3.3.3. Características morfológicas do sêmen descongelado 34

3.4. CONCLUSÕES 35

3.5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 36

4. EXPERIMENTO 2: Utilização do EDTA, do Equex STM e da lecitina de soja como componentes de um diluidor de congelação do sêmen caprino.

Resumo 39

Abstract 39

4.2. MATERIAIS E MÉTODOS 41

4.2.1. O local e os animais 41

4.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação 42

4.2.4. Resfriamento do sêmen 43

4.2.5. Tempo de equilíbrio 44

4.4. CONCLUSÕES 53

4.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 53

5. EXPERIMENTO 3: Interferência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino

Resumo 57

Abstract 57

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5.2.1. O local e os animais 59 5.2.2. Colheita e avaliação do sêmen pré-congelação 60

5.2.4. Resfriamento do sêmen 61

5.2.4.1 Curva de resfriamento lento e tempo de equilíbrio 61 5.2.4.2 Curva de resfriamento rápido e tempo de equilíbrio 62

5.4. CONCLUSÕES 69

5.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 72

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LISTA DE FIGURAS

1, membrana citoplasmática; 2, acrossoma; 3, membrana nuclear; Figura 1

4, núcleo; 5, capa pós-nuclear; 6, centríolo proximal; 7, filamento axial; 8, hélice motocondrial; e 9, envoltório fibroso. 4 Estrutura do axonema: O axonema é composto por 9 pares de Figura 2

microtúbulos periféricos (Subfibras A e B) e um par de microtúbulos

centrais. 5

Ilustração gráfica da peça intermediária (PI, a direita), com a membrana celular parcialmente removida e da peça principal (PP, a esquerda), com corte transversal e com a membrana celular removida, para mostrar as estruturas internas. PI com a MC, membrana celular; HM, hélice mitocondrial; CM, crista mitocondrial; A, axonema. PP com a HM, hélice mitocondrial; AJ, anel de Jensen; MC, par de microtúbulos central; MP, Figura 3

microtúbulos periféricos; FE, fibra externa densa e a CL, coluna central. 5 Espermatozóide com corte da membrana plasmática, na região apical da Figura 4

cabeça, para visualização da suas estruturas. 6 Estruturas de membrana do espermatozóide: (1) membrana plasmática; (2) membrana acrossomal externa; (3) fluido acrossomal; (4) membrana acrossomal interna; (5) membrana nuclear; (6) núcleo; (7) anel nuclear; Figura 5

(8) mitocôndria. 7

Na temperatura ambiente os fosfolipídios permanecem na formação bilaminar (A). Com a redução da temperatura os fosfolipídios com formações similares tendem a se agrupar em domínios que resultam na formação da estrutura cristalina (B). Concomitantemente, as proteínas são forçadas a se agregar, favorecendo o surgimento da fase hexagonal-II. Figura 6

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LISTA DE TABELAS:

EXPERIMENTO 1: Influência do tempo de equilíbrio para a eficácia da criopreservação da célula espermática caprina.

Valores encontrados para as características microscópicas (volume, motilidade total motilidade progrssia, vigor, turbilhonamento e Tabela 1.1

concentração) do sêmen nas sete amostras (AM). 30 Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais) do sêmen fresco nas sete amostras (AM) e suas respectivas Tabela 1.2

médias (AM). 31

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro Tabela 1.3

tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após a descongelação. 32 Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5), logo após o teste de Tabela 1.4

Termoresistência. 33

Médias de defeitos menores (DME), defeitos maiores (DM), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen Tabela 1.5

a fresco, e para os quatro tratamentos (G0,5; G1,5; G2,5; G3,5). 34

EXPERIMENTO 2: Utilização do EDTA e do Equex STM como componentes de um diluidor de congelação do sêmen caprino

Características microscópicas (volume, motilidade total, motilidade progressiva, vigor e concentração) do sêmen a fresco para os dois bodes e Tabela 2.1

as médias gerais nas nove amostras (AM). 46 Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e defeitos totais) do sêmen fresco para os dois bodes (A e B) as médias Tabela 2.2

gerias na nove amostras (AM). 47

Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os cinco tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX Tabela 2.3

e Bioexcell®), logo após a descongelação. 47 Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX, TRIS+EDTA+EQUEX Tabela 2.4

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Médias de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os cinco tratamentos(TRIS, TRIS+EDTA, TRIS+EQUEX Tabela 2.5

e Bioexcell®) logo após a descongelação. 51

EXPERIMENTO 3: Interferência da curva de resfriamento e do tempo de equilíbrio sobre a congelabilidade do sêmen caprino

Valores encontrados para as características microscópicas (volume, motilidade total, motilidade progressiva, vigor, turbilhonamento e Tabela 3.1

concentração) do sêmen a fresco nas dez amostras (AM). 64 Características morfológicas (defeitos maiores, defeitos menores e Tabela 3.2

defeitos totais) do sêmen a fresco e suas médias nas dez amostras (AM). 65 Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro Tabela 3.3

tratamentos (CL15, CL75, CR30 e CR90), logo após a descongelação. 66 Médias de motilidade total (MT), motilidade progressiva (MP) e vigor para o para os espermatozóides do sêmen a fresco, e para os quatro tratamentos (CL15, CL75, CR30 e CR90), logo após o teste de Tabela 3.4

termoresistência (TTR) 67

Médias de defeitos maiores (DM), defeitos menores (DME), defeitos de acrossoma (AC) e defeitos totais (DT) para os espermatozóides do sêmen Tabela 3.5

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LISTA DE ABREVIATURAS

AC - acrossoma

AM - amostra

CD - cauda dobrada

CBRA Colégio Brasileiro de Reprodução Animal CONC - concentração espermática

DM - defeitos maiores DME - defeitos menores DSS dodecil-sulfato de sódio DT - defeitos totais

EDTA - etileno-diamino-tetra-acetato-dissódico EQUEX Equex STM

GOT transaminase glutamato oxalacético IA inseminação artificial

MT - motilidade total

MP motilidade progressiva TE tempo de equilíbrio

TTR - teste de termoresistência VIG - vigor espermático VOL - volume

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BITTENCOURT, R.F. Criopreservação do sêmen caprino: influência dos diluidores de congelação, tempos de equilíbrio e curvas de resfriamento. Salvador, Bahia, 2006. 88p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2006.

RESUMO

O presente trabalho foi dividido em três experimentos com o objetivo de avaliar a interfêrencia de diferentes protocolos sobre a congelabilidade do sêmen caprino. O Experimento 1 procurou estudar o efeito do período de equilíbrio, à temperatura de 5oC, sobre a eficácia da congelação do sêmen caprino. Para tanto, foram testados quatro tempos de equilíbrios diferentes: 0,5; 1,5; 2,5 e 3,5h. Nesse estudo verificou-se a existência da interferência do tempo de equilíbrio sobre a viabilidade dos espermatozóides caprinos após o processo de congelação-descongelação, tendo o período de equilíbrio de 1,5h como o melhor protocolo. No Experimento 2 objetivou-se avaliar a influência da adição do EDTA, que é um quelante de cálcio, e do emulsificante Equex STM, que tem como substância ativa o dodecil-sulfato de sódio, a um diluidor de congelação do sêmen caprino, formulado a base de Tris-gema de ovo. Também foi objetivo desse trabalho, verificar a eficácia de um diluidor comercial a base de lecitina de soja (Bioexcell®), para a criopreservação do sêmen dessa espécie. Demonstrou-se que a adição do Equex STM ao meio promoveu melhoria nos índices de viabilidade espermática pós-descongelação, em relação aos diluidores que não o continham na composição. Nesse experimento, o Bioexcell® mostrou-se ineficaz para a congelação do sêmen caprino. O Experimento 3 objetivou estudar a interferência da curva de resfriamento e tempo de equilíbrio, sobre os parâmetros espermáticos pós-descongelação na espécie caprina. Assim, foram formados quatro grupos experimentais, dois foram submetidos a uma curva de resfriamento lenta (-0,46oC/min) e os outros dois a uma curva rápida (-1,07oC/min). A esses grupos foram acrescidos diferentes tempos de equilíbrio, após à estabilização da temperatura do sêmen em 5oC. Um grupo resfriado com a curva lenta foi mantido por 15min em equilíbrio e outro por 75min. Os grupos resfriados com curva rápida foram submetidos a tempos de equilíbrio de, respectivamente, 30 e 90min. Não foram observadas diferenças estatísticas entre os grupos, em relação aos parâmetros espermáticos avaliados pós-descongelação.

PALAVRAS-CHAVES: Caprinos; sêmen congelado; tempo de equilíbrio, diluidores; curvas de refriamento.

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BITTENCOURT, R.F. Criopreservação do sêmen caprino: influência dos diluidores de congelação, tempos de equilíbrio e curvas de resfriamento. Salvador, Bahia, 2006. 88p. Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária Tropical) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2006.

SUMMARY

The present study was divided in three experiments with the objective of verifying the effect of different freezing goat semen protocols. In the Experiment 1 it was studied the stabilization time influence at 5oC on the effectiveness of the freezing goat semen. For that, they were tested four different equilibration times: 0,5; 1,5; 2,5 and 3,5h. In this work, it was observed the existence of the equilibration time interference on the viability of the goat sperms after the freezing-thawing process. The 1,5h stabilization time protocol was the best one. In the Experiment 2 it was aimed to evaluate the influence of EDTA and Equex STM addition to a goat semen freezing extender, formulated with tris-egg yolk. The EDTA is a calcium chelator and the Equex STM surfactant has as active substance the sodium dodecyl sulfate. It was also aim of this study to evaluate the utilization of a soybean-based commercial extender (Bioexcell®). It was shown that the addition of Equex STM to the extender promoted improvement on the sperm viability indexes post-thawing, in relation to the extenders that didn't contain it in the composition. In this experiment, Bioexcell® was ineffective for freezing goat semen. The Experiment 3 aimed to study the interference of the cooling rate and stabilization time on the post-thawing sperm parameters in the goat species. For that, four experimental groups were formed. Two ones were submitted to a slow cooling rate (-0,46oC/min) and the other two ones to a fast cooling rate (-1,07oC/min). After the semen stabilization at 5oC, it was submitted to different equilibration times. One. One of the groups cold with the slow rate was maintained by 15min in stabilization and the other one for 75min. The groups cold with the fast rate were submitted at stabilization times of 30 and 90min, respectively. In relation to the sperm parameters evaluated post-thawing, statistical differences were not observed among the groups.

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1. INTRODUÇÃO GERAL

A Caprino-ovinocultura avançam no Brasil, respaldadas pela profissionalização das entidades de criadores e dos próprios produtores. O rebanho brasileiro de ovinos e caprinos cresceu consideravelmente nos dois últimos anos. O mercado nacional nas duas atividades encontra-se aquecido e o consumidor, parte fundamental do processo, busca, cada vez mais, por produtos e empresas que ofereçam, acima de tudo, qualidade. Já o criador tem o desafio de incrementar seu negócio. Isso deve ser feito investindo em genética e estando atento a todas as transformações do mercado que possam agregar valor à sua criação (COUTINHO, 2005).

A caprinocultura tem se destacado no setor agropecuário proporcionando bom retorno econômico ao empreendedor, sendo uma atividade que apresenta enorme potencial produtivo. Segundo o IBGE (2003) o rebanho caprino efetivo do Brasil, no ano de 2003, era de 9.581.653 milhões de cabeças. Destas, quase 93% se encontram no Nordeste (8.905.773 milhões), tendo a Bahia como o principal núcleo criador desta espécie, com 3.572.318 milhões de cabeças, o que representa um pouco mais de 37% do total de caprinos criados no Brasil.

Contudo, apesar do Brasil ser um dos maiores produtores de caprinos do mundo a sua produção ainda está bem abaixo da demanda do mercado interno de carne e couro dessa espécie. Por essa razão, para o abastecimento do mercado interno, o Brasil vem importando de outros países, peles e carcaças de caprinos, carne desossada, refrigerada ou congelada. A importação de carne caprina passou de US$ 833 mil em 1996 para US$ 17,1 milhões em 2000, representando um crescimento bastante significativo. No Nordeste brasileiro a capacidade instalada dos curtumes é para o processamento de 12,2 milhões de peles ao ano, no Sul do país essa capacidade gira em torno de 1,8 milhões de peles por ano (VASCONCELOS e VIEIRA, 2002). Porém, segundo COUTO (2001) a capacidade de produção dos curtumes no Nordeste e Sul do Brasil fica ociosa em, respectivamente, 37% e 50%. A exportação de peles caprina acumulada no período de 1992 a 1999 foi de US$ 25,9 milhões, a passo que a importação nesse mesmo período foi de US$ 60,5 milhões. A exportação de peles caprina em 2000 no Brasil representou US$ 0,3 milhões, ao mesmo tempo em que importou US$ 8,9 milhões. Os principais países importadores da pele caprina foram a Argentina, a Nigéria e a Itália e os principais exportadores, a Espanha, os Estados Unidos e a Itália (VASCONCELOS e VIEIRA, 2002). Esses dados demontram uma demanda crescente referente à quantidade de carcaça e peles de caprinos e ovinos no país, bem como, evidenciam o potencial da caprino-ovinocultura em fornecer retorno econômico para o investidor brasileiro.

Por outro lado, o aquecimento da caprinocultura pode ser demonstrado, também, pelo crescimento da participação da atividade na balança comercial brasileira, com aumento numérico significativo dos subprodutos da espécie caprina nas pautas de exportação. O setor de couros é um exemplo claro: O número de couros caprinos exportados no período de Janeiro a Novembro de 2004 (37.113) comparado como o mesmo período em 2005 (811.072) demonstra um crescimento de 2.085,41%. E o valor, em dólares, do faturamento brasileiro com as exportações de couro caprino, cresceu de US$ 461.625 mil para US$ 3.286.475 milhões, o que representa um aumento de 611,94% (COUROBUSINESS, 2005).

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De uma forma geral, a caprinocultura tem aumentado sua participação no agronegócio brasileiro e mundial, e pela forma que ela está crescendo, com base e seriedade, a tendência é que esse quadro se mantenha em expansão. Os principais atrativos da caprinocultura é que em uma mesma área de criação de bovinos pode-se criar uma quantidade muito maior de caprinos. Tudo isso respeitando e cumprindo um bom manejo de pastagem, cercamento apropriado e outros conceitos (COUTINHO, 2005).

Os valores elevados da importação de subprodutos caprinos, para um país que é um dos seus maiores produtores, podem ser facilmente entendidos. Inicialmente, pode-se atribuir à desorganização da cadeia produtiva, as limitações na qualidade e na quantidade dos produtos à disposição das unidades de processamento. Embora, o mercado sinalize para o consumo de carne de animais jovens, abatidos com até seis meses de idade, a maioria dos animais abatidos são velhos e com carcaças de baixa qualidade e rendimento (LEITE, 2002).

Para aumentar os índices de produtividade da espécie caprina torna-se necessário maximizar o seu potencial biológico, mediante programas de reprodução programada, que podem promover o melhoramento genético e como consequência dele, o aumento da eficiência produtiva dos caprinos.

Porém, a baixa oferta de machos caprinos (MACHADO e SIMPLÍCIO, 1995) faz da inseminação artificial (IA) um instrumento importante para uma difusão mais eficiente do germoplasma de animais considerados melhoradores, que possam proporcionar o melhoramento genético do rebanho caprino, que no Brasil, em sua grande maioria, é caracterizado pela utilização de raças não especializadas (VASCONCELOS e VIEIRA, 2002).

A IA tem um importante papel na criação de caprinos, especialmente em sistemas intensivos de produção, facilitando o controle reprodutivo e no auxílio à realização de testes de progênie mais precisos e em menor espaço de tempo (LEBOEUF et al., 2000).

A prática da IA na cabra, a exemplo do que ocorre na vaca, é facilitada pela conformação anatômica da cervix, a qual, normalmente, é facilmente penetrada pela pipeta de inseminação durante a fase estrogênica do ciclo estral (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989).

Provavelmente, o primeiro registro de inseminação artificial na cabra seja aquele reportado por BENEDIKTOV (1934) (citado por SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989).

A utilização da IA associada a congelação de sêmen, tem como a principal justificativa, o melhoramento genético dos rebanhos, pela habilidade em produzir uma grande progênie por macho, e em diversos lugares diferentes ao mesmo tempo (LEBOEUF et al., 1998), além de criar a possibilidade da manipulação e armazenamento de material genético (LEBOEUF et al., 2000). Essa característica é necessária para criar e difundir o melhoramento das raças e as

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facilidades na aplicação das recentes técnicas de genética molecular, em programas de seleção animal (LEBOEUF et al., 1998).

Desde que o sêmen caprino foi congelado pela primeira vez por SMITH e POLGE (1950) e por BARKER (1957), (citados por LEBOEUF et al., 2000), e que estes reportaram que a fertilidade do sêmen congelado de caprino era muito baixa para ser considerado como de valor prático, muitas investigações têm sido desenvolvidas sobre a congelação de sêmen caprino (LEBOEUF et al., 2000).

Apesar do grande número de protocolos que vem sendo testados para a congelação de sêmen caprino, os métodos de congelação (curva de resfriamento e tempo de equilíbrio) e a maioria dos diluidores usados, são provenientes de trabalhos realizados com bovinos e que tiveram bons resultados nessa espécie (LEBOEUF et al., 2000).

Assim, como são carentes os estudos para o desenvolvimento de novos diluidores de congelação de sêmen caprino, bem como de protocolos de congelação (curva de resfriamento e tempo de equilíbrio), específicos para essa espécie, esse trabalho surge com o objetivo de testar diferentes aspectos do processo de criopreservação celular, entre eles: curvas de resfriamento, tempos de equilíbrio e diluidores

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2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. O espermatozóide e a membrana plasmática

O espermatozóide é uma célula altamente especializada responsável em executar a função exclusiva de fertilizar um oócito. A cabeça tem a função primordial de promover a penetração no oócito, levando toda a informação genética contida nela. A cauda contém a máquina metabólica responsável pela produção de energia e pelo mecanismo da motilidade espermática (PINEDA, 1989).

O espermatozóide é usualmente dividido em cabeça, colo, peça intermediária, peça principal e peça terminal (Fig. 1) (AMANN e PICKETT, 1987).

Figura 1 – 1, membrana citoplasmática; 2, acrossoma; 3, membrana nuclear; 4, núcleo; 5, capa pós-nuclear; 6, centríolo proximal; 7, filamento axial; 8, hélice mitocondrial; e 9, envoltório fibroso.

Fonte: GARNER e HAFEZ (1993)

SQUIRES et al. (1999) dividiram o espermatozóide com suas devidas funções em: a) Cabeça que inclui o núcleo, contendo o DNA (material genético), e o acrossoma, contendo enzimas. A membrana acrossomal funde-se com a membrana plasmática, diretamente sobre esta, e promove a liberação das enzimas acrossomais, que favorecem a penetração do espermatozóide na zona pelúcida do oócito. As proteínas da membrana plasmática da cabeça favorecem a ligação dos espermatozóides a receptores da zona pelúcida do oócito; b) Colo que têm a função de conectar a cabeça com a peça intermediária e é relativamente frágil; c) Peça intermediária contendo as mitocôndrias que convertem fontes de energia, como a glicose, em ATP e, este transfere energia para as organelas em todos os processos celulares. A peça intermediária também contém uma série de fibras que continuam por toda a cauda do espermatozóide e são responsáveis pela motilidade espermática e; d) Peça principal e terminal com as fibras da peça intermediária continuando pela peça principal e terminando ao

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final da peça terminal. Nessa última porção também encontra-se o ponto final da membrana plasmática. A função principal está na promoção da motilidade celular.

O corpo central da peça intermediária junto com a continuação desse feixe, que se estende longitudinalmente por toda a cauda, compõe o axonema (Fig. 2). Este é composto por nove pares de microtúbulos, que circundam, radialmente, um par de microtúbulos central (arranjo 9+2). Esse arranjo de microtúbulos é recoberto pelas fibras externas densas. O axonema e essa associação de fibras densas, na peça intermediária, ainda estão envolvidos, perifericamente, por inúmeras mitocôndrias, compondo a bainha mitocondrial, que se encontra disposta em hélice (hélice mitocondrial) (Fig 1 e 3) (GARNER e HAFEZ, 1993).

Figura 2: Estrutura do axonema: O axonema é composto por 9 pares de microtúbulos periféricos (Subfibras A e B) e um par de microtúbulos centrais.

Fonte : GAGNON (1995) as duas figuras da esquerda e MURDOCK (2003) a da direita.

Figura 3: Ilustração gráfica da peça intermediária (PI, a direita), com a membrana celular parcialmente removida e da peça principal (PP, a esquerda), com corte transversal e com a membrana celular removida, para mostrar as estruturas internas. PI com a MC, membrana celular; HM, hélice mitocondrial; CM, crista mitocondrial A, axonema. PP com a HM, hélice mitocondrial; AJ, anel de Jensen; MC, par de microtúbulos central; MP, microtúbulos periféricos; FE, fibra externa densa e a CL, coluna central.

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Recobrindo todas essas estruturas, está a membrana plasmática (SQUIRES et al., 1999), organizada em uma camada bilaminar de lipídios (Fig. 3 e 4), composta por fosfolipídios, com uma porção hidrofílica direcionada para o exterior e a hidrofóbica, direcionada para o interior dessa camada (SINGER e NICOLSON, 1972). Entremeada na camada lipídica, existem inúmeras proteínas (integrais e periféricas), que agem como bombas de íons, levando cálcio, sódio e outros íons para fora da célula, ou formam associações com células do trato reprodutivo feminino, agindo como receptores para a fusão do espermatozóide ao oócito (SQUIRES et al., 1999).

Figura 4: Espermatozóide com corte na membrana plasmática, da região apical da cabeça, para visualização da sua estrutura.

Fonte: Mosaico fluido proposto por SINGER e NICOLSON (1972)

Embora as estruturas microtubulares e fibrosas sejam importantes para motilidade celular, as estruturas de membrana são mais importantes em relação aos processos que desencadeiam o choque térmico (AMANN e PICKETT, 1987). Como a membrana é importante para a manutenção do balanço iônico celular, lesões nessa estrutura podem resultar em morte celular (SQUIRES et al., 1999)

As estruturas de membrana incluem a membrana plasmática, as membranas acrossomais, interna e externa, a membrana nuclear e a mitocôndria, com suas membranas internas (Fig 5). Essas membranas espermáticas, provavelmente, têm uma estrutura similar, embora difiram bioquimicamente (AMANN e PICKETT, 1987).

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Figura 5: Estruturas de membrana do espermatozóide : (1) membrana plasmática; (2) membrana acrossomal externa; (3) fluido acrossomal; (4) membrana acrossomal interna; (5) membrana nuclear; (6) núcleo; (7) anel nuclear; (8) mitocôndria.

Fonte: GADELLA et al. (2001).

As membranas são fluidas na temperatura corporal. Essa fluidez representa a habilidade das moléculas de fosfolipídios de se moverem lateralmente. A temperatura é um fator importante que pode alterar essa fluidez. Em geral quanto mais colesterol, menos flexível, ou menor é a fluidez da membrana. Porções da membrana, contendo taxas relativamente altas de colesterol, especialmente se os fosfolipídios são polinsaturados, provavelmente tornam-nas mais resistentes à mudança de temperatura (AMANN e PICKETT, 1987). O colesterol age estabilizando a membrana plasmática associando-se primariamente às cadeias de fosfolipídios e preenchendo os espaços existentes entre eles (SQUIRES et al., 1999).

2.2. Criopreservação espermática e suas etapas

A criopreservação do sêmen dos mamíferos é caracterizada por ter uma reconhecida queda de fertilidade quando comparado com o sêmen a fresco. Isso se deve tanto por uma menor viabilidade pós-descongelação como por uma disfunção subletal que ocorre em uma parte da população dos espermatozóides submetidos ao processo. As razões dessa redução na capacidade fecundante são várias, ou afetam a proporção de sobreviventes (choque-térmico, susceptibilidade a curva de resfriamento, composição do diluidor e estresse osmótico.) ou afetam o status funcional dos sobreviventes (estabilidade da membrana plasmática, lesões oxidativas, integridade dos receptores da membrana, estrutura nuclear) (WATSON, 2000).

Os problemas da criopreservação não estão relacionados com a manutenção dos espermatozóides a -196oC, pois nessa temperatura não há reações bioquímicas, mas principalmente com as alterações causadas durante o processo de resfriamento e descongelação (PARKS e GRAHAM, 1992).

As crioinjúrias às várias organelas celulares são consideradas como sendo provocadas pelos dois maiores estresses do processo de criopreservação celular: a mudança na temperatura e a

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formação e dissolução do gelo e suas conseqüências. Antes do processo de criopreservação, que envolve a saída e o retorno das células a temperatura corporal, tanto o choque térmico pelo frio quanto pelo calor, devem ser incluídos como estresses potenciais a serem considerados, com igual importância que os estágios que envolvem a queda da temperatura até o ponto de congelação (WATSON, 1995).

Hoje, sabe-se que a maioria das lesões espermáticas de acrossoma ocorre durante a diluição, resfriamento ou como resultado do período de equilíbrio a que é submetido o sêmen. Isso é importante para que se otimize o processamento inicial do sêmen, fazendo com que a grande maioria de espermatozóides chegue ao processo de congelação-descongelação sem alterações de acrossoma e, assim, com maiores chances de sobreviverem ilesos ao processo (OETTLÉ, 1986).

2.2.1. Curva de refriamento do sêmen

As injúrias celulares podem ser causadas por alterações diretas na estrutura celular (como o rompimento de membranas), ou indiretamente por alterações nas funções celulares (como a redução de processos metabólicos). Taxas rápidas de resfriamento do espermatozóide da temperatura ambiente até 5oC, induzem a ocorrência de danos parcialmente irreversíveis caracterizados por padrão anormal de motilidade (circular ou retrógrado), rápida queda de motilidade, danos acrossomais, lesão da membrana plasmática, metabolismo reduzido e perda de componentes intracelulares (SQUIRES et al., 1999).

No processo de resfriamento dos espermatozóides, alterações no arranjo laminar da membrana plasmática podem ser evidenciadas, quando esta possui em sua constituição fosfolipídios de cadeias altamente insaturadas. Alguns desses fosfolipídios podem assumir um arranjo circular (fig. 6), denominado de hexagonal-II, com as extremidades hidrofílicas internas (grupo formado pelas cabeças dos fosfolipídios) e as extremidades hidrofóbicas externas (cadeias de ácidos graxos). Para muitos lipídios essa formação da fase hexagonal-II é transitória até o início da fase cristalina e gel. Porém, para certos fosfolipídios, essa estrutura permanece durante todo o resfriamento e torna-se irreversível, impossibilitando a reorganização do arranjo bilaminar quando há o reaquecimento do espermatozóide a temperatura ambiente. Com isso, há a formação de canais hidrofílicos, que possibilitam a passagem de íons ou outras moléculas pequenas, levando assim, a um aumento prejudicial da permeabilidade da membrana (AMANN e PICKETT, 1987).

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Figura 6: Na temperatura ambiente os fosfolipídios permanecem na formação bilaminar (A). Com a redução da temperatura os fosfolipídios com formações similares tendem a se agrupar em domínios que resultam na formação da estrutura cristalina (B). Concomitantemente, as proteínas são forçadas a se agregar, favorecendo o surgimento da fase hexagonal-II. Esse fato resulta no aumento da permeabilidade da membrana celular.

Fonte: AMANN e PICKETT (1987).

A proposta do resfriamento do sêmen é reduzir o metabolismo celular e a sua deterioração. Contudo o resfriamento rápido pode levar ao choque térmico e outras lesões. A curva de resfriamento vai depender do volume do sêmen diluído (volumes maiores vão resfriar mais lentamente) e da temperatura inicial da suspensão espermática (SQUIRES et al., 1999).

Com isso, diversos experimentos vêm demonstrando a importância da curva de resfriamento para a prevenção da ocorrência de lesões espermáticas durante o processo de criopreservação seminal.

Autores como MORAN et al. (1992) em trabalho com equinos, ressaltaram que a curva de resfriamento lenta é necessária no período em que os espermatozóides são mais sensíveis ao choque pelo frio, na faixa compreendida entre 19 e 8oC, quando podem ocorrer mudanças irreversíveis à membrana espermática, caso o resfriamento seja acelerado. Segundo FISER & FAIRFULL (1986) com o sêmen ovino ocorre algo parecido. O resfriamento rápido do sêmen pode acontecer entre as temperaturas de 30 oC a 15oC sem acarretar efeito sobre a sobrevivência espermática antes ou após a descongelação. Entretanto, taxas rápidas de refriamento de 30 oC até temperaturas inferiores a 10oC promovem queda progressiva da motilidade espermática e de acrossomas intactos antes da congelação e uma redução no percentual de células com motilidade pós-descongelação.

WURGAU & LEIDL (1989) trabalhando com diversas espécies (bovinos, caprinos, ovinos, suínos e equinos) observaram a influência da velocidade de resfriamento do sêmen até a

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temperatura de 4oC, sobre a viabilidade espermática após a congelação. Esses autores concluíram que a curva de resfriamento mais lenta promoveu melhores índices de motilidade pós-descongelação, quando comparada com o resfriamento mais rápido.

DEKA e RAO (1987) em estudo com caprinos identificaram uma menor incidência de lesões acrossomais, especialmente edema de acrossoma, no sêmen resfriado à taxas mais lentas, quando comparado ao ejaculado resfriado rapidamente, embora sem interferência, sobre a motilidade espermática.

Entretanto, resultados diferentes foram relatados por WURGAU (1986), que não encontrou diferenças significativas, de lesões espermáticas, para o sêmen exposto à curvas rápida e lenta de resfriamento até a temperatura de 4oC.

Estudos sobre a importância da curva de resfriamento para a eficácia da congelação do sêmen caprino são carentes e a maioria dos protocolos existentes se baseiam em trabalhos bem sucedidos realizado com outras espécies.

2.2.2. Tempo de Equilíbrio

Segundo OETTLÉ (1986) um apropriado período de equilíbrio, assim como, adequadas taxas de diluição e resfriamento celular, são fatores fundamentais para a prevenção do surgimento de alterações patológicas durante o processo criopreservação espermática e com a otimização desses processos iniciais de pré-congelação, pode-se aumentar os índices de viabilidade espermática pós-descongelação.

Porém, autores como RITAR e SALOMON (1983); SIMPLÍCIO e MACHADO (1989) e RITAR et al. (1990) citam que o período de equilíbrio pode ser uma etapa dispensável no processo de congelação do sêmen caprino.

Discordando dessa afirmativa, alguns autores têm demonstrado a importância do tempo de equilíbrio para o aumento da viabilidade do sêmen caprino descongelado. WESTHUYSEN (1978) verificou percentuais de 1 a 2% de células com motilidade pós-descongelação quando não foi utilizado o tempo de equilíbrio, enquanto que para o grupo que permaneceu por 2h em equilíbrio a 5oC a motilidade espermática variou de 18 a 40%.

SALOMON e RITAR (1982) citam em seu trabalho que uma metodologia alternativa a criopreservação do sêmen sem a eliminação do plasma seminal, poderia ser feita com uma diluição realizada em uma etapa, seguida do resfriamente por uma 1 a 1,5h, acompanhada, posteriormente, por um tempo de equilíbrio de apenas uma 1,5h, à temperatura de 4 a 5oC, antes da congelação.

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A maioria dos trabalhos demonstra que o período de equilíbrio ao qual o sêmen caprino deve ser submetido, previamente a congelação, vai até as 4h de estabilização à temperatura de 5oC (SINHA et al., 1992; DUTTA et al., 1996).

No entanto, DEKA e RAO (1986) encontraram maiores médias (P<0,05) de motilidade espermática pós-descongelação, para o sêmen submetido a 5h de equilíbrio, quando comparado com o sêmen equilibrado por 1 ou 3h, apesar de que, o sêmen que permaneceu por 1h em equilíbrio, obteve os menores índices de alterações de acrossoma.

SIVASELVAM et al. (2000) estudando dois tempos de equilíbrio (4 e 5h), observaram para o grupo de 4h os melhores índices de viabilidade espermática pós-descongelação.

DUTTA et al. (1996) testando 2, 4 e 6h de tempo de equilíbrio a temperatura de 5oC obtiveram melhores taxas de motilidade, células morfologicamente normais e acrossomas íntegros, com as 4h de equilíbrio. Dados esses que corroboram os encontrados por SINHA et al. (1992) que ao testarem os mesmos tempos de equilíbrio (2, 4 e 6h), tiveram os melhores resultados após a descongelação, com o grupo que permanceu por 4h em equilíbrio.

DAS e RAJKONVAR (1995) observaram que o sêmen que permaneceu por 3h em tempo de equilíbrio a 5oC, obteve melhores índices de motilidade pós-descongelação, quando comparado ao sêmen que permaneceu por uma 1 e 6h, resultados semelhantes ao obtidos em trabalho anterior (DAS e RAJKONVAR, 1993). DAS e RAJKONVAR (1994) e DAS e RAJKONVAR (1996) também obtiveram os menores índices de lesões acrossomais utilizando 3h de tempo de equilíbrio, em relação ao sêmen congelado após 1 e 6h de equilíbrio a temperatura de 5oC.

BARUAH et al. (2003) não verificaram diferenças significante (P>0,05), em relação às taxas de motilidade espermática e lesões acrossomais, para as amostras de sêmen equilibradas por 0,5; 1 e 1,5h.

2.2.3. Curva de congelação

Quando o sêmen é resfriado sob temperaturas abaixo de 0oC, ocorre a formação de gelo no meio extracelular, com aumento na concentração de sais, o que provoca a saída da água do meio intracelular para o extracelular, a favor do gradiente osmótico, levando o espermatozóide a uma desidratação progressiva e lesão celular (AMANN e PICKETT, 1987).

Também é importante enfatizar que a curva de congelação ideal deve ser suficientemente lenta, para permitir que os espermatozóides se desidratem e, rápida o bastante para evitar que os espermatozóides fiquem expostos, por muito tempo, as altas concentrações de soluto (SNOECK, 2003).

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A velocidade de congelação do sêmen pode ser regulada pela distância a que são colocadas as palhetas do nível do nitrogênio líquido e pelo tamanho da palheta: fina (0,25mL) ou média (0,5mL). Na forma mais comum, as palhetas contendo o sêmen caprino são colocadas horizontalmente no vapor do nitrogênio líquido a 4 ou 5cm de atura da lâmina do nitrogênio líquido por 4 ou 5 min, quando então as palhetas são derrubadas no nitrogênio líquido (LEBOEUF et al., 2000).

Para o sêmen envasado em palhetas de 0,5mL, usando um diluidor convencional, a curva de congelação ficará em torno de -60oC/min, quando as palhetas são colocadas no vapor de nitrogênio líquido à temperatura de -160oC (AMANN e PICKETT, 1987).

2.2.4. Descongelação do sêmen

A temperatura de aquecimento utilizada na descongelação do espermatozóide está intimamente relacionada com a curva de congelação. Quando a congelação é procedido rapidamente há a formação de microcristais intracelulares, não necessariamente deletérios a célula, contudo essas células contendo microcristais devem ser aquecidas rapidamente para evitar a recristalização desses pequenos cristais em cristais maiores, que podem então, lesar a as células. Por esse fato, quando a curva de resfriamento for rápida, a taxa de aquecimento (processo de descongelação) também deve ser rápida (AMANN e PICKETT, 1987). Além disso, as taxas ideais de resfriamento e aquecimento também são influenciadas pela concentração dos ingredientes no diluidor, incluindo a concentração do glicerol (SQUIRES et al., 1999).

Como as curvas de congelação utilizadas para o sêmen caprino são comumente de velocidade moderada, as curvas de descongelação são geralmente obtidas incubando-se as amostras em banho maria com a temperatura estabilizada em 37oC por 10 a 40s (DEKA e RAO, 1986; FERRARI, 1993; BARBOSA, 1999). Entretanto, alguns trabalhos têm citado que a descongelação do sêmen caprino à temperaturas mais elevadas (70oC) tem propocionado melhores taxas de viabilidade espermática pós-descongelação quando comparado aos protocolos convencionais de descongelação (37oC) (TULI et al., 1991; citado por LEBOEUF et al., 2000). Contudo, deve ser observado que a descongelação do sêmen à 37oC é mais confiável nas condições práticas da inseminação artificial e além disso, o risco de super-aquecimento, com o uso dessa temperatura, também é eliminado.

2.3. Diluidores de congelação

Um grande número de diluidores tem sido estudado para a congelação de sêmen caprino como, água-de-coco (ARAÚJO e NUNES, 1991), leite de cabra (DESHPANDE e MEHTA, 1991), maltose-gema de ovo (DAS e RAJKONWAR, 1996), ácido-cítrico-frutose-gema de ovo, com ou sem tris (SINGH e PURBEY, 1996a), citrato-frutose-gema de ovo (SINGH e PURBEY, 1996b), o leite desnatado de vaca, em pó e reconstituído, citrato de sódio-glicose-gema de ovo, sacarose-EDTA, CaNa2-gema de ovo, rafinose-gema de ovo, Spermasol-gema

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Em geral, o diluidor apropriado deve promover uma pressão osmótica compatível com a do sêmen e essa depende dos ingredientes no meio e da taxa de eletrólitos e não-eletrólitos; balanço apropriado de elementos minerais, já que há indícios de que o nível de eletrólitos e não-eletrólitos pode ter um efeito significativo sobre a fertilidade; combinação apropriada de nutrientes, para o fornecimento adequado de energia aos espermatozóides e manutenção da motilidade; neutralização de produtos tóxicos produzidos pelos espermatozóides, como o ácido lático e, equilíbrio do pH do meio; proteção contra mudanças de temperatura, especialmente contra o frio; estabilização dos sistemas enzimáticos e integridade das membranas conferida por macromoléculas que estabilizarão as membranas e minimizarão o vazamento de íons e enzimas (AMANN e PICKET, 1987).

AMANN e PICKET, (1987) também citam que a diluição do sêmen também é importante por permitir um tratamento efetivo do sêmen com antibióticos, minimizando a possibilidade de transmissão de patógenos ou de organismos potencialmente patogênicos, prolongar a sobrevivência dos espermatozóides e aumentar a vida útil do espermatozóide, proteger os espermatozóides de condições ambientais desfavoráveis, aumentar o volume do ejaculado, reduzindo os efeitos tóxicos dos subprodutos do metabolismo espermático, e possibilitar a avaliação apropriada da motilidade espermática individual, evitando, ao mesmo tempo, a aglutinação dos espermatozóides.

Autores como TULI e HOLTZ (1992), que compararam a utilização de quatro tampões (Tris, TEST, TEX e BES) em um meio de congelação de sêmen caprino, contendo gema-de-ovo e glicerol, concluíram que a porcentagem de espermatozóides vivos e com motilidade progressiva foi muito superior no diluidor contendo o Tris do que aqueles que usaram um dos outros 3 tampões. CHAUHAN e ANAND (1990), também verificaram que o sêmen de caprinos congelado em diluidores a base de Tris, gema-de-ovo e 7% de glicerol, tiveram melhores resultados in vitro (motilidade) e in vivo (taxa de prenhes das cabras inseminadas), do que diluidores que não continham o Tris em sua composição. SINGH e PURBEY, 1996a, ao observarem as taxas de alterações de acrossoma no processo de congelação, verificaram que a queda na percentagem de acrossomas intactos pré e pós-congelação, foi de 88,76% para 68,90%, no diluidor que continha o Tris em sua composição, enquanto que no diluidor que não o continha a queda foi de 85,98 para 56,70%.

DESHPANDE e MEHTA (1991) compararam a congelabilidade do sêmen caprino em três diluidores: citrato-frutose-gema de ovo, tris-ácido cítrico-frutose-gema de ovo e leite de cabra e observaram que a motilidade e o número de espermatozóides vivos pós-descongelação foi maior no sêmen congelado com citrato-frutose-gema de ovo.

Baseado no limitado número de estudos comparando os diluidores quanto à viabilidade espermáticda pós-descongelação, a liberação da transaminase glutamato oxalacético (GOT) e a fertilidade tem sido os critérios utilizados para a avaliação e escolha dos diluidores de preferência.(LEBOEUF et al., 2000). A liberação da enzima GOT pelas células está associada às lesões de membrana (TULI e HOLTZ, 1994).

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2.4. Crioprotetores celular

Agentes crioprotetores são essenciais para a criopreservação de quase todos sistemas biológicos (FAHY, 1986). A primeira descrição do uso de crioprotetores para a criopreservação é originada de MAXINOV (1908) citado por SALAMON e MAXWELL, (1995), que observou que tecidos e células de plantas suspendidas em soluções contendo glicerol parcialmente sobreviveram a congelação à 220C negativos.

Esses agentes devem ser adicionados ao diluidores seminais para possibilitarem a sobrevivência dos espermatozóides durante o processo de congelação e descongelação (AMANN e PICKET, 1987). Os crioprotetores são classificados como penetrantes, quando exercem sua ação crioprotetora dentro da célula ou não penetrantes, cuja atividade de crioproteção ocorre fora da célula.

2.4.1. Crioprotetores penetrantes

Entre os crioprotetores penetrantes o glicerol é o mais frequentemente utilizado como agente crioprotetor do espermatozóide caprino desde a demonstração da sua eficácia (SMITH & POLGE et al., 1950, citado por LEBOEUF et al., 2000), e têm ação tanto intracelular como extracelular na proteção das estruturas celulares (SQUIRES et al., 1999). O seu efeito protetor é atribuído a sua propriedade coligativa ou de ligação com a água (SALOMON & MAXWELL, 1995). Também aumenta o volume de canais de solventes descongelados, dilui as altas concentrações de sais (SQUIRES et al., 1999) e diminui a pressão osmótica do meio resfriado (SALAMON & MAXWELL, 1995).

Outros crioprotetores penetrantes ou internos incluem os do grupo de rápida penetração, o etilenoglicol, propanodiol e o dimetil sulfóxido (DMSO), que têm menores pesos moleculares que o glicerol, e agem protegendo o espermatozóide, provavelmente, através do mesmo mecanismo que o glicerol (MOLÍNIA et al., 1994a). Estes autores estudaram a eficiência desses crioprotetores, sozinhos ou em diversas associações, na criopreservação do espermatozóide ovino. Inicialmente verificou-se a ineficácia do DMSO, como crioprotetor do espermatozóide ovino. Também foi verificado que apesar do etilenoglicol e do propanodiol, exercerem atividade crioprotetora, sobre os espermatozóides, o glicerol, sozinho, em concentração de 6%, obteve os melhores resultados tanto na motilidade pós-descongelação, quanto na percentagem de acrossomas intactos. Os autores ainda citaram que o melhor desempenho do glicerol, está ligado à existência de uma interação entre esse e a membrana plasmática do espermatozóide, o que não acontece com os outros crioprotetores penetrantes.

MOLÍNIA et al. (1994a) também afirmaram que a afinidade pela água é a principal característica das substâncias utilizadas para a crioproteção das células vivas, expostas à temperaturas a baixo do ponto de congelação, e que essa estreita afinidade, é mais significativa para o glicerol, do que para os outros crioprotetores. Por último, esses autores observaram o efeito tóxico quando diferentes crioprotetores foram associados. Esse fenômeno já havia sido reportado por FAHY (1986), e no momento ele o denominou como, injúrias da congelação pela associação de crioprotetores.

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Os álcoois poliídricos ou polióis, que são, estruturalmente semelhantes ao glicerol, também, foram estudados na crioproteção do espermatozóide ovino por MOLINIA et al. (1994b), sozinhos ou associados ao glicerol. Esses autores, porém, concluíram que o glicerol, sozinho, em uma concentração de 6%, foi mais eficaz que os polióis estudados (adenitol, inositol, manitol, sorbitol e xilitol), tanto nas associações, quanto sozinhos.

Existem estudos com o DMSO, propanodiol, butanodiol, amidas, álcoois do açúcar, mas nenhum desses tem mostrado maior capacidade de preservação dos espermatozóides dos mamíferos que o glicerol. As exceções estão na maior sobrevivência dos espermatozóides dos coelhos e dos elefantes, em meios contendo DMSO (WATSON, 1995).

O glicerol tem sido o crioprotetor mais usado para a congelação de sêmen caprino. A concentração de glicerol usada em diferentes estudos, varia de 3% a 9%, obtendo-se os melhores resultados quando essa concentração encontra-se entre 4% a 7% do diluidor utilizado (LEBOEUF et al., 2000).

A concentração de glicerol guarda relação direta com o diluidor usado. Quando se usa leite desnatado, em pó e reconstituído, recomenda-se a adição de 6 a 7% de glicerol (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989); outros autores têm fixado em 7% a concentração do glicerol usado (CHAUHAN e ANAND, 1990; SILVASELVAM et al., 2000 a; BISWAS et al., 2001).

Isso pode ser explicado pela melhor congelabilidade do sêmen caprino em diluidores, contendo 7% de glicerol, que em concentrações mais baixas (DAS e RAJKONWAR, 1995; DAS e RAJKONWAR, 1996; SILVASELVAN et al., 2000 b; BISWAS et al., 2001), ou em concentrações mais altas (10%) desse crioprotetor (SILVASELVAM et al., 2000 b; BISWAS et al., 2001).

TULI e HOLTZ (1994) observaram que a adição do glicerol em etapas, desde a temperatura ambiente (30oC) até o resfriamento (5oC) promoveu melhores taxas de espermatozóides com motilidade progressiva e de espermatozóides vivos do que quando foi adicionado o glicerol de uma só vez (a temperatura ambiente) ou após o resfriamento a 5oC.

O etilenoglicol foi estudado, para a criopreservação do espermatozóide caprino, por SOUZA et al. (2002), que observaram que o etilenoglicol deu menor proteção ao espermatozóide caprino que o glicerol. SILVASELVAM et al. (2000b) ao comparar o glicerol e etilenoglicol, nas mesmas concentrações (5, 7 e 10%), baseado na motilidade pós-descongelação, concluiu que o glicerol a 7% foi o protocolo mais eficaz na crioproteção da célula espermática caprina. Esses resultado discordam dos verificados po BITTENCOURT et al. (2004), que encontraram um maior número de defeitos maiores e totais (p<0,01) para o grupo com sêmen caprino congelado em diluidor contendo o glicerol (7%) em relação ao grupo com etilenoglicol (7%), apesar da menor (P<0,0001) motilidade encontrada para o segundo grupo (51% x 10%).

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Contudo, a toxicidade dos crioprotetores ainda é um obstáculo fundamental ao potencial da crioproteção artificial completa, porém esse fenômeno ainda permanece pouco compreendido (FAHY et al., 1990).

Com o conhecimento biológico e físico-químico dos efeitos dos crioprotetores, é sugerido que a toxicidade destes agentes é um fator limitante, fundamental, dentro da criobiologia. Esse fato não só faz com que esta toxicidade impossibilite o uso de níveis necessários desses aditivos, para que se consiga uma ação crioprotetora completa, mas também pelo fato dessa toxicidade ser manifestada na forma de crioinjúrias, sobre e além dos processos clássicos de crioinjúria celular. Isso acaba levando ao confundimento de quais alterações celulares foram causadas pelos efeitos tóxicos do crioprotetor ou pelos inúmeros processos da criopreservação celular que podem ocasionar danos celulares (FAHY, 1986).

Entretanto, LEIBO (2003) (Comunicação Pessoal) discorda desse conceito de toxicidade celular provocada pelo crioprotetor e afirma que as lesões espermáticas são conseqüência do choque osmótico provocado pela introdução do sêmen em um meio contendo um crioprotetor, já que estes acarretam altas osmolaridades ao meio, incompatíveis com a osmolaridade seminal, que é em torno de 300 mOsmol/L (MELO, 1999; SNOECK, 2003). SNOECK (2003) verificou que a osmolaridade do seu diluidor de congelação (lactose-EDTA-gema-de-ovo) sem o crioprotetor era de 356 mOsmol/L, após a introdução do glicerol (5%) e etilenoglicol (5%), em duas soluções diferentes, a osmolaridade foi para 1110 mOsmol/L e 1230 mOsmol/L respectivamente, demonstrando que os espermatozóides podem sofrer um estresse osmótico grande em decorrência desse diferencial de osmolaridade entre o sêmen fresco e após diluição nos meios de congelação.

Esse fato é conflitante com os achados de FISER e FAIRFULL (1989), que demonstraram que a motilidade pós-descongelação e a integridade acrossomal de espermatozóides de carneiros, não foram afetadas pelas mudanças osmóticas glicerol-dependentes, associadas com a diluição do sêmen. Porém, MOLÍNIA et al. (1994a) sugere que esse fenômeno provavelmente não ocorre com o etilenoglicol e o propanodiol.

2.4.2. Crioprotetores não penetrantes

Os crioprotetores não penetrantes como a lactose e as lipoproteínas encontradas na gema do ovo, agem somente no compartimento extracelular. Estes crioprotetores favorecem a desidratação dos espermatozóides, reduzindo a probabilidade de formação de grandes cristais de gelo dentro das células (SQUIRES et al., 1999).

Além das proteínas do leite e da gema de ovo, outras substâncias atuam como crioprotetores não penetrantes, como a albumina sérica bovina (BSA), açúcares como a frutose, trealose, lactose, manose, rafinose, polímeros sintéticos como a polivinilpirrolidona, metilcelulose e amido (JASKO, 1994; McKINNON, 1996).

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Outros dois agentes que têm mostrado possuir propriedades crioprotetoras são a glicina betaína e a prolina. Estes agentes estabilizam a membrana plasmática, provavelmente, por manterem a hidratação das proteínas de membrana (WATSON, 1995).

A gema-de-ovo tem sido largamente usada como crioprotetor da membrana plasmática do espermatozóide em diversas espécies, inclusive na espécie caprina (DAS e RAJKONWAR, 1995; SILVASELVAM et al. 2000a; SILVASELVAM et al. 2000b). WATSON (1995), chegou a afirmar que ela seria o mais efetivo agente protetor do espermatozóide contra o choque térmico provocado pelo frio, prevenindo o dobramento de cauda dos espermatozóides e protegendo a motilidade espermática.

WATSON e MARTIN (1975), observaram que a gema de ovo conferia certa proteção ao espermatozóide contra a queda de motilidade e sugeriu que a essa proteção ocorreria durante o resfriamento e congelação por sua interação com membrana plasmática do espermatozóide. Os lipídios presentes na gema-de-ovo são os principais responsáveis pela ação protetora sobre a membrana espermática. O componente essencial de sua ação é a interação desses lipídios na gema-de-ovo com a membrana espermática, tornando-a mais resistente durante o resfriamento (WATSON, 1995).

QUINN et al. (1980) observaram que ao adicionar fosfolipídios ao sêmen centrifugado de carneiros, foi promovida uma imediata proteção contra o choque térmico, verificada pela avaliação da motilidade. Ao recentrifugarem o sêmen, este tornou-se novamente susceptível ao choque térmico. Esses autores notaram que os fosfolipídios adicionados ao sêmen e incubados por 3h a 37oC, não tinham se incorporado às membranas celulares e que a relação de fosfolipídios e colesterol no espermatozóide não foi mudada. Assim, concluíram que o efeito protetor dos fosfolipídios contra choque térmico dos espermatozóides de carneiros é devido a uma fraca interação dessas estruturas lipídicas com a membrana plasmática das células.

Um problema específico na preservação do sêmen caprino tem sido o efeito prejudicial do plasma seminal na viabilidade dos espermatozóides em diluidores contendo gema-de-ovo e leite como componentes (LEBOEUF et al., 2000).

Alguns autores desaprovam a utilização da gema-de-ovo em diluidores usados para a congelação de sêmen caprino, por afirmarem que a existência de fosfolipases e lisofosfolipases no sêmen caprino (produzidas pelas glândulas bulbo-uretrais) seriam catalisadores da hidrólise de lipídios presentes na gema de ovo em ácidos graxos e lisofosfolipidios, substâncias essas que seriam deletérias para o espermatozóide (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989).

Porém, CHAUHAN e ANAND (1990) acompanharam todos os passos da congelação de sêmen caprino diluído em meio contendo gema-de-ovo, com o objetivo de verificar se essa hidrólise ocorreria. Eles observaram que em todas as etapas as 2 enzimas (fosfo e lisofosfolipases) apesar de permanecerem ativas, não desencadearam a hidrólise dos dois

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maiores lipídios da gema-de-ovo (fosfatidil colina e fosfatidil etanolamina),.presentes no diluidor. No mesmo estudo, esses autores inseminaram 26 cabras com sêmen diluído e congelado em meio composto por Tris-gema de ovo, e obtiveram 21 animais prenhes dos 26.

TULI e HOLTZ (1994) observaram que a redução da motilidade progressiva e do número de espermatozóides vivos em um diluidor contendo gema de ovo em sua composição, foi menor no sêmen com o plasma seminal do que aquele cujo plasma seminal foi removido.

AZERÊDO (1999) utilizou sondas fluorescentes para avaliar a integridade das membranas plasmáticas de espermatozóides caprinos na presença ou não de plasma seminal, antes e após congelação/descongelação. Após avaliar 36 ejaculados, de 3 animais, observou que o percentual de espermatozóides com membranas plasmáticas lesadas aumentou após a remoção do plasma seminal e, acentuou-se com a congelação/descongelação. Além disso, a motilidade espermática mostrou-se significativamente aumentada quando o plasma seminal estava presente, tanto antes, como após a congelação, levando-o a concluir que a remoção do plasma seminal mostrou-se prejudicial para a congelação de sêmen caprino.

DASKIN e TEKIN (1996) verificaram uma maior taxa de motilidade e uma menor percentagem de lesão de acrossoma (respectivamente 47% e 25%) pós-descongelação para o sêmen congelado sem centrifugação, em meio contendo gema de ovo, que para as amostras congeladas em meio sem gema (19% e 33% para motilidade e lesão acrossomal, respectivamente).

2.4.2.1. Lecitina de soja

Os aditivos de origem animal (gema-de-ovo e leite) comumente adicionados a diluidores de congelação de sêmen, representam um risco potencial para a contaminação do diluidor, caso certos contaminantes (microbianos ou outros) estejam no produto crú. Além desse fato, também há uma falta de controle da qualidade desses aditivos, devido a grande variação da composição dos mesmos (GIL et al., 2003).

Assim, diluidores comerciais, com a ausência da gema de ovo e do leite em suas composições, têm se tornado disponíveis recentemente (Biociphos® and Bioexcell®, IMV, L'Aigle, France), e já com a existência de relatos da boa fertilidade alcançada para o sêmen de reprodutores bovinos e ovinos criopreservados com esses meios (GIL et al., 2003; GIL et al., 2000).

GIL et al. (2003) compararam a eficácia do Bioexcell®, em relação a um diluidor convencional, a base de leite-gema de ovo, para a criopreservação do sêmen ovino. O estudo verificou índices de fertilidade semelhantes entre as ovelhas inseminadas com o sêmen congelado nos diferentes protocolos. Com isso, os autores ressaltaram que o Bioexcell®, que não contém nenhum aditivo de origem animal, pode ser uma alternativa segura quando o sêmen congelado for utilizado para a introdução de um novo material genético em um novo rebanho e, principalmente, em um outro país.

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Também, a utilização de diluidores de congelação sem a presença da gema-de-ovo e do leite anularia o efeito negativo sobre os espermatozóides caprinos, quando essas substãncias são colocadas em contato com o sêmen dessa espéce (SIMPLÍCIO e MACHADO, 1989).

2.5. Utilização do EDTA

Em temperaturas reduzidas, há uma queda na síntese de ATP e todos os mecanismos fisiológicos dependentes de ATP, como a bomba de sódio-potássio, ficam comprometidos. Isso pode resultar em uma despolarização parcial da membrana plasmática, provocando a abertura dos canais de cálcio controlados por voltagem, levando, assim, ao influxo de cálcio. Esse aumento do cálcio intracelular promoveria a ativação das fosfolipases, e, assim, ocorreria a hidrólise dos fosfolipídios da membrana espermática. Tanto as alterações provocadas aos fosfolipídios, como a formação de ácidos graxos livres, acarretariam um aumento da permeabilidade da membrana mitocondrial e plasmática, o que potencializaria a morte celular (AMANN & PICKETT, 1987).

Outro fator importante é a interação entre o íon de Ca2+ e os lipídios de membrana, o qual tem importante influência sobre a orientação das cabeças polares dos fosfolipídios da membrana, do grau de solubilidade e da fase de transição quando há mudança de temperatura (BAKAS et al., 1991).

Assim, visando minimizar o efeito deletério do cálcio durante o processo de congelação, a partir de 1973, alguns autores passaram a empregar o etileno-diamino-tetra-acetato-dissódico (EDTA) em meios diluidores para a congelação de sêmen eqüino (MARTIN et al., 1979).

A função principal do EDTA é a de quelar o cálcio no meio extracelular, diminuindo seu influxo para o meio intracelular (WATSON, 1981). Essa função é extremamente importante, principalmente no processo de resfriamento, já que a concentração de cálcio intracelular aumenta na proporção em que cai a temperatura, sendo o espermatozóide capaz de restaurar os níveis normais de cálcio até 220C ou em temperaturas superiores a esta, por um período de até duas horas. Porém o acúmulo irreversível de cálcio intracelular pode ser observado ao resfriar o espermatozóide bovino à temperaturas abaixo de 160C, estando esse acontecimento correlacionado com a ocorrência de lesões na membrana espermática (ROBERTSON & WATSON, 1986). O cálcio também tem uma importante função na ocorrência da reação acrossomal, que é reduzida na presença do EDTA (ROLDAN et al., 1994).

A peroxidação dos fosfolipídios da membrana espermática é um outro fator que influencia a queda da fertilidade do sêmen congelado. Essa peroxidação pode ser prevenida através da manipulação seminal em condições anaeróbicas e através da utilização de anti-oxidantes e agentes quelantes como o EDTA (SALAMON & MAXWELL, 2000).

Assim, o EDTA tem sido adicionado na composição de diluidores de centrifugação e de congelação de sêmen da espécie equina (ALGHAMDI et al., 2002, DEVIREDDY et al., 2002), de lhama (BAER et al., 1999), de bovinos e búfalos (DHAMI et al., 1993), suínos