Karina Silva Funabashi

98 

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Loading....

Texto

(1)

EXTRAÇÃO DE DNA PARA A ANÁLISE DA AMELOGENINA

EM AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA, INCLUIDAS EM

PARAFINA E ARQUIVADAS POR 1 E 5 ANOS NO

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DE SÃO PAULO

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de São

Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do

título de Mestre em Ciências.

São Paulo

(2)

ii

Karina Silva Funabashi

EXTRAÇÃO DE DNA PARA A ANÁLISE DA AMELOGENINA

EM AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA, INCLUIDAS EM

PARAFINA E ARQUIVADAS POR 1 E 5 ANOS NO

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DE SÃO PAULO

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de São

Paulo – Escola Paulista de

Medicina, para obtenção do

título de Mestre em Ciências.

Orientadora: Profa. Dra. Edna Sadayo Miazato Iwamura

São Paulo

(3)

iii

Univ

Funabashi, Karina Silva

Extração de DNA para a análise da amelogenina em amostras fixadas em formalina, incluídas em parafina e arquivadas por 1 e 5 anos no Departamento de Patologia da Universidade Federal de São Paulo. / Karina Silva Funabashi. – São Paulo, 2011.

xviii, 99f.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Patologia.

Título em inglês: DNA extraction for amelogenin analysis in formalin fixed, paraffin embedded samples stored for 1 and 5 years from Department of Pathology of Federal University of São Paulo.

(4)

iv

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

Chefe do Departamento: Profa. Dra. Maria Teresa Seixas Alves

Coordenadora do Curso de Pós-graduação:

(5)

v

EXTRAÇÃO DE DNA PARA A ANÁLISE DA AMELOGENINA EM

AMOSTRAS FIXADAS EM FORMALINA, INCLUIDAS EM

PARAFINA E ARQUIVADAS POR 1 E 5 ANOS NO

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA DA UNIVERSIDADE

FEDERAL DE SÃO PAULO

Presidente da banca:

Prof.ª Dr.ª Edna Sadayo Miazato Iwamura

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Gilles Landman

Prof.ª Dr.ª Janete Maria Cerutti

Prof. Dr. Rogério Nogueira de Oliveira

(6)

vi

Aos meus pais Mitur e Maria Luiza, que sempre iluminaram os meus caminhos com muito amor e amizade, vibrando com minhas vitórias e incentivando nos momentos difíceis.

Ao Prof. Dr. Antonio Sesso, Pesquisador Associado do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo pela Universidade de São Paulo, pela transmissão de conhecimentos científicos, com grandes e valiosos ensinamentos.

A todos os docentes e funcionários que de alguma forma participaram deste trabalho.

À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina UNIFESP/EPM.

(7)

vii

AGRADECIMENTO ESPECIAL

À Profa. Dra. Edna Sadayo Miazato Iwamura, Professora Adjunta do Departamento de Patologia da UNIFESP-EPM, orientadora deste trabalho, pela oportunidade, confiança a mim depositada e por todos os ensinamentos científicos e intelectuais que colaboraram para minha formação.

(8)

viii

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) por fornecer os recursos financeiros para o desenvolvimento dessa pesquisa através do processo de número 2008/11233-8.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro.

(9)

ix

À Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina – UNIFESP/EPM, por ter me recebido como aluna do Programa de Pós-graduação em Patologia e possibilitando minha titulação;

Aos docentes do Programa de Pós-graduação em Patologia da UNIFESP/EPM, pelos ensinamentos, apoio, críticas e exemplo como docentes e pesquisadores;

À Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara, coordenadora do programa de Pós-graduação em Patologia da UNIFESP/EPM, pela receptividade e auxílio;

À médica patologista do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, Dra. Iria Visoná, que muito colaborou na realização deste trabalho, principalmente na análise histológica das amostras;

Aos residentes do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, que muito colaboraram na realização deste trabalho, principalmente na coleta e seleção das amostras;

Aos funcionários do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, Daniel Rosa Filho, Vera Cotrim, Angélica Maria da Silva, Arquimedes Leonardi, José Sérgio Alves e Fátima de Seixas, pela simpatia, receptividade e apoio ao meu trabalho;

Ao Joaquim Soares de Almeida, biólogo e técnico de laboratório do Departamento de Patologia da UNIFESP/EPM, pela simpatia, disponibilidade e por preparar com habilidade e atenção os cortes dos blocos de parafina para este trabalho;

(10)

x precisava de auxílio;

Aos secretários Norberto Silva Lobo e Denise Pelegrini, pela simpatia e auxílio;

Aos colegas do Programa de Pós-graduação em Patologia da UNIFESP/EPM, pela convivência e experiências trocadas para a formação profissional;

Ao Marcos Araújo Sobrinho, pelo companheirismo, auxílio e compreensão durante todo este trabalho;

Aos amigos que acompanharam todo o projeto: Valéria Fernandes, Orlando Piubelli, Alpio Stanchi, Suellen Albertão e Márcia Nascimento. Obrigada pelo apoio, carinho e suporte.

Aos colegas Carla Godoy, Mirella Soler, Marcelo Silva e Denise Barcelos, pela convivência, amizade, formação de espírito crítico e auxílio para o desenvolvimento deste trabalho. Vocês foram de suma importância para o meu crescimento profissional, intelectual e pessoal.

(11)

xi

"O mistério gera curiosidade e a curiosidade é a base do desejo humano para compreender. "

(12)

xii

Dedicatória ... vi

Agradecimentos ... vii

Epígrafe ... xi

Lista de Figuras ... xiii

Lista de Tabelas e Gráficos ... xv

Lista de Abreviaturas ... xvi

Resumo ... xviii 1. INTRODUÇÃO ... 01 2. OBJETIVOS ... 20 3. MATERIAIS E MÉTODO ... 21 4. RESULTADOS ... 30 5. DISCUSSÃO ... 45 6. CONCLUSÃO ... 50 7. Anexos 8. Referências Bibliográficas Abstract

(13)

xiii

Figura 1. Ciclo de temperatura durante reação de PCR ... 03 Figura 2. Localização cromossômica do gene da amelogenina ... 14 Figura 3. Organograma da análise do processo de fixação e inclusão em amostras de baço e cérebro ... 27 Figura 4. Fotomicrografia de amostra de baço normal recente (coletada em 2009). 100x ... 30 Figura 5. Fotomicrografia de amostra de fígado normal recente (coletada em 2009). 100x ... 30 Figura 6. Fotomicrografia de amostra de cérebro normal recente (coletada em 2009). 100x. ... 31 Figura 7. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com

fenol-clorofórmio. ... 36 Figura 8. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com kit comercial. .... 36 Figura 9. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com Salting-Out. ... 37 Figura 10. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras armazenadas por 1 ano e extraídas com fenol-clorofórmio. .... 37 Figura 11. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras armazenadas por 1 ano e extraídas com kit comercial. ... 38 Figura 12. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras armazenadas por 1 ano e extraídas com Salting-Out. ... 38 Figura 13. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras armazenadas por 5 anos e extraídas com fenol-clorofórmio. .. 39 Figura 14. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras armazenadas por 5 anos e extraídas com kit comercial. ... 39 Figura 15. Amplificação dos produtos de PCR do gene da β-actina em amostras armazenadas por 5 anos e extraídas com Salting-Out. ... 40

(14)

xiv

clorofórmio. ... 41 Figura 17. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina em amostras recentes (coletadas em 2009) extraídas com kit comercial. ... 41 Figura 18. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina em amostras recentes (coletadas em 2009) de baço e cérebro fixados em formalina tamponada e não-tamponada por 24h, seguido por extração com kit. ... 44 Figura 19. Amplificação dos produtos de PCR do gene da amelogenina em amostras recentes (coletadas em 2009) de baço e cérebro fixados em formalina tamponada e não-tamponada por 7 dias, processadas pelos banhos de etanol e xilol e seguidas para extração com kit. ... 44

(15)

xv

Tabela 1. Parâmetros de fixação a serem considerados para uma

boa preservação do tecido. ... 07 Tabela 2. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de

amplificação para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de baço congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e

amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos. ... 32 Tabela 3. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de

amplificação para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de fígado congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e

amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos. ... 32 Tabela 4. Concentração de DNA (ng/µl/cm²) e taxa de sucesso de

amplificação para o gene da β-actina e amelogenina em amostras de cérebro congeladas, coletadas em 2009 (recentes parafinadas) e

amostras de baço armazenadas por 1 ano e 5 anos. ... 33 Tabela 5. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e

cérebro fixadas em formalina tamponada e não-tamponada por 24h. 42 Tabela 6. Concentração do DNA extraído das amostras de baço e

cérebro fixadas em formalina tamponada e não-tamponada por 7 dias

e processadas nos banhos de xilol e etanol. ... 43 Gráfico 1. Grau de pureza do DNA extraído de amostras de baço

coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e

arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração. 34 Gráfico 2. Grau de pureza do DNA extraído de amostras de fígado

coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e

arquivadas por 1 ano e 5 anos, nos diferentes métodos de extração. 34 Gráfico 3. Grau de pureza do DNA extraído de amostras de cérebro

coletadas em 2009 (recentes parafinadas), congeladas (controle) e

(16)

xvi

AmeloF Sentido do primer da amelogenina 3´-5´ (forward) AmeloR Sentido do primer da amelogenina 5´-3´ (reverse)

AMELX Gene da amelogenina localizado no cromossomo X

AMELY Gene da amelogenina localizado no cromossomo Y

A-T Ligação adenina – timina

B Baço

BN Baço em formalina não-tamponada

BT Baço em formalina tamponada

C Cérebro

CH2OH Metilol

cm Centímetro

CN Cérebro em formalina não-tamponada

CT Cérebro em formalina tamponada

C-T Ligação citosina – timina

DMSO Dimethyl sufoxide

DNA Ácido desoxirribonucléico

dNTPs Desoxirribonucléicos fosfatados (adenina, timina, citosina e guanina)

EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético

F Fígado

FN Fígado em formalina não-tamponada

FT Fígado em formalina tamponada

(17)

xvii

HCl Ácido clorídrico

ME Microscopia eletrônica

mg Miligramas

ml Mililitros

NaCl Cloreto de sódio

Neg Controle negativo

Ng/µl/cm² Nanogramas / microlitro / centímetro ao quadrado O4Os Tetróxido de ósmio

PCR Reação em cadeia da polimerase

Pos Controle positivo

SBME Sociedade brasileira de microscopia eletrônica

SDS Dodecil sulfato de sódio

TE Solução de Tris-EDTA

µl Microlitro

µm Micrômetro

v/v Volume por volume

Xg Unidade de rotação

β Beta

βF Sentido do primer da β-actina 3´-5´ (forward) βR Sentido do primer da β-actina 5´-3´ (reverse)

(18)

xviii

Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina permitem investigações retrospectivas valiosas para estudos moleculares, especialmente em estudos genéticos, nos casos em que o DNA não se encontra disponível em amostras congeladas e/ou frescas. Entretanto, de acordo com alguns autores, é difícil obter um DNA de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação resulta na fragmentação dos ácidos nucleicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o DNA extraído de tecidos parafinados, após 1 e 5 anos de armazenamento, através de 3 métodos de extração. Para isso, foram utilizados o gene da β-actina (136pb), a fim de detectar a viabilidade e fragmentação do DNA extraído, e da amelogenina (X: 212pb e Y: 218pb) para diferenciação do sexo do indivíduo e viabilidade na utilização de primers com comprimento maior. O estudo envolveu 12 casos de autópsia recentes, onde amostras normais de fígado (n=10), baço (n=10) e cérebro (n=10) foram coletadas em duplicata, de modo que um grupo seguiu para o processo de fixação e inclusão em parafina, e outro grupo seguiu para o congelamento. Além disso, foram utilizados os mesmos tipos de tecidos, normais (n=10 cada), oriundos de 13 casos de autópsia armazenados por 1 ano e 15 casos armazenados por 5 anos. Após a remoção da parafina, as amostras foram submetidas às extrações com kit comercial (QIAGEN QIAamp Mini), Salting-Out e fenol-clorofórmio. O DNA extraído foi quantificado no aparelho Nanodrop® e ajustado para PCR (10ng/µl). Os produtos de PCR foram visualizados em gel de agarose a 1%. As amostras de baço e fígado apresentaram maior rendimento em relação à extração de DNA quando comparado ao cérebro, em todos os tempos. Todas as amostras arquivadas apresentaram boas condições de extração de DNA, porém deve-se levar em consideração o processo de fixação e inclusão dos tecidos, que podem comprometer a qualidade do DNA. A extração pelo fenol rendeu maior quantidade de DNA e grau de pureza em relação aos outros métodos estudados, porém o kit comercial mostrou melhores resultados quanto à amplificação do DNA obtido.Houve amplificação do gene da amelogenina em todas as amostras utilizadas, porém recomenda-se a utilização de primers menores para uma completa análise do fragmento a ser estudado.

(19)

O procedimento da biópsia é utilizado rotineiramente na medicina, visando o diagnóstico das doenças, orientando o tratamento e o prognóstico dos pacientes. Essas amostras são armazenadas em frascos contendo soluções fixadoras, na maioria das vezes a formalina, para posterior inclusão em parafina. Os blocos de parafina são cortados em micrótomos e os cortes obtidos são aderidos às lâminas de vidro e corados para análise histológica. Após a obtenção dos cortes, esses blocos ficam arquivados e representam importante fonte de material biológico para pesquisa.

Tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina representam a maior fonte de materiais biológicos arquivados disponíveis para estudos genéticos. São materiais essenciais para diagnósticos médicos e pesquisa clínica. Com isso, espécimes biológicos arquivados puderam ser analisados em diversas situações:

a) Diagnóstico: para detectar ou não a presença de três tipos de vírus em crianças com síndrome da morte súbita (Alvarez-Lafuente et al 2008); doenças neurológicas humanas (Ferrer et al 2007) e alguns espécimes tumorais (Ananian et al 2010, Lassalle et al 2009 e Budimlija et al 2009).

b) Estudos retrospectivos: em museus de anatomia que armazenam amostras raras de más-formações congênitas, doenças infecciosas (Santos et al 2008, Dubeau et al 1986, Goelz et al 1985, Kallio et al 1989, Warford et al 1988) e expressão de um determinado gene em uma neoplasia rara (Ribeiro-Silva et al 2007);

c) Em casos de investigações forenses, análise de DNA pós-morte e casos de erro médico, como troca de amostras. Em muitas situações este tipo de material pode representar a última fonte disponível para análise genética, e podem contribuir para obtenção de dados históricos e de aspecto legal (Duval et al 2010, Doran et al 1986, Crisan et al 1990, Banaschak et al 2000).

De modo que, os tecidos fixados em formalina e incluídos em parafina são uma excelente fonte de DNA, porém sua extração continua sendo um desafio.

O uso do DNA extraído de tecidos parafinados em procedimentos de genética molecular é dependente de sua qualidade e quantidade. Diversos

(20)

autores afirmam que é essencial um método de extração de DNA adequado e deve ser escolhido de acordo com características específicas de uma investigação. (Santos et al 2009, Coura et al 2005, Farrugia et al 2010, Grantzdorffer et al 2009, Okello et al 2010, Gilbert et al 2007, Rivero et al 2006).

De acordo com alguns autores, é difícil obter DNAgenômico de boa qualidade, uma vez que o processo de fixação, freqüentemente, resulta na fragmentação do DNA, além das ligações cruzadas de proteína-proteína e proteína-DNA que se formam. Além disso, o formaldeído dentro do tecido

gradualmente se modifica em ácido fórmico, hidrolisando o DNA (Gillio-Tos et al 2007).

Existem diversos protocolos descritos para a extração de DNA de tecidos frescos, sangue e cultura celular, mas extrações de DNA em tecidos parafinados requerem protocolos especiais. Obter uma boa qualidade de produtos de PCR de DNA extraído de tecidos parafinados é uma tarefa difícil, pois, geralmente este material é escasso, degradado e contém substâncias que inibem a reação de amplificação da amostra, como a formalina, ou que inibem a enzima proteinase K utilizada no procedimento de extração, como também o xilol (Coura et al 2005). A literatura tem mostrado que o tamanho médio de fragmentos obtidos de DNA após a PCR é de 300-400pb em biópsias congeladas, mas em tecidos parafinados o tamanho é bem menor (Casale et al 2010).

O advento da tecnologia da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), técnica molecular específica, sensível, de rápida execução e de baixo custo, permitiu a detecção de fragmentos específicos de DNA e com isso aumentou o interesse, pelos pesquisadores no estudo de espécimes preservados e armazenados em arquivos de hospitais e museus. (Arnheim et al 1990 e Paabo et al 1989).

Ao contrário do DNA bem conservado oriundo de tecidos frescos congelados, o DNA recuperado de amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina é altamente degradado. Portanto, numerosas tentativas são realizadas para se descobrir um método ideal para uma recuperação e amplificação eficiente de DNA nestes materiais. (Legrand et al 2002).

(21)

Nas décadas de 80 e 90, a utilização de técnicas moleculares para extração de DNA em materiais arquivados em parafina era bastante limitada, visto que alguns procedimentos requeriam a destruição dos blocos. Nesta época, o processo de degradação do DNA através do contato com a formalina era ainda desconhecida e somente eram amplificados fragmentos de DNA a partir de amostras que continham DNA totalmente integro. (Shibata et al 1988 e Faloona et al 1987).

A técnica de PCR é realizada a partir de uma amostra de DNA e alguns reagentes que propiciaram a amplificação de regiões específicas desta amostra. Para isso, são necessários dois primers que flanqueiam a sequência de DNA de interesse, dNTPs (que são os 4 nucleotídeos), a enzima DNA polimerase, íons de magnésio e um tampão que equilibrará toda essa mistura. A reação é realizada através de ciclagens em diferentes temperaturas (conforme figura 1). Uma temperatura inicial é aplicada a fim de separar a dupla hélice de DNA na seqüência. Em seguida, é utilizada uma temperatura específica para que os primers sejam anelados na amostra, e finalmente a temperatura é ajustada para aproximadamente 72ºC (fase de extensão), onde a enzima adicionará a partir dos primers, os nucleotídeos correspondentes à região a ser amplificada (Kubista et al 2006).

Fig.1. O ciclo de temperatura da PCR: (1) a temperatura é elevada a

aproximadamente 95ºC para separar as duplas fitas de DNA, (2) a temperatura é dimunuída para o anelamento dos primers, (3) a temperatura é ajustada para 72ºC para a polimerase estender os primers. (Kubista et al 2006)

tempo 95°C -

72°C - 50°C -

Desnaturação Anelamento Extensão

1

2

(22)

A fase de desnaturação deve ter temperatura suficiente para a separação das fitas de DNA. A temperatura e duração da desnaturação dependem do comprimento e às vezes da sequência de DNA a ser analisada, além do equipamento e reagentes utilizados (Faloona et al 1987).

A temperatura de anelamento depende do conjunto de primers utilizados e dos nucleotídeos nele contidos. Existem diversos programas gratuitos disponíveis que estimam a temperatura de desnaturação ideal para cada primer. Entretanto, estes programas não contam com o efeito estabilizador da polimerase, que se liga ao primer anelado e estabiliza o complexo. Na verdade, o mecanismo mais provável é de que a polimerase se liga primeiramente ao primer e em seguida o complexo polimerase-primer se liga à sequência de DNA alvo. A temperatura ótima para a polimerase é de aproximadamente 72ºC, utilizada na maioria dos protocolos de PCR. (Kubista et al 2006)

A investigação genética requer a extração de DNA de uma variedade de tecidos com os mais variados tipos de preparações. Dentre estas, o processamento de tecidos parafinados pode variar de acordo com as rotinas de laboratórios clínicos, pois apesar de padronizado, pode ter variações no tipo de fixador utilizado, tempo de fixação (especialmente em soluções de formaldeído) e suplementos. Alguns autores relatam que a fixação de um tecido em formalina por mais de uma semana pode danificar os ácidos nucleicos, pois induz a um extensivo “crosslinking” nas proteínas do tecido, resultando na fragmentação do DNA. (Bonin et al 2003).

A obtenção do DNA em condições ideais para amplificação é o fator limitante desse tipo de amostra. O tipo de fixador utilizado, tempo de fixação, condições de inclusão e condições de armazenagem podem resultar na degradação do DNA (Ben-Ezra et al 1991).

Uma garantia fundamental para prevenir possíveis contaminações com produtos de PCR é realizar a preparação das amostras em local isolado do processo de análise. O seccionamento dos blocos de parafina requer esforços consideráveis para prevenir contaminações entre as amostras. Deve ser realizada uma rigorosa limpeza do micrótomo, das lâminas de corte e qualquer outro equipamento utilizado nesse processo, pois qualquer resquício de tecido pode contaminar a próxima amostra a ser seccionada. O uso de lâminas

(23)

descartáveis fornece maior proteção contra este tipo de problema, além da troca freqüente de luvas descartáveis entre a limpeza dos equipamentos e as secções dos blocos. (Greer et al 1994)

Uma vez que o micrótomo está limpo, várias secções (5-20µm) podem ser obtidas de cada bloco e colocadas em um tubo para microcentrífuga de 1,5ml. A espessura do corte depende do tamanho da amostra. Para biópsias pequenas (2-3mm), cortes de 10-20µm podem ser utilizados, enquanto que tecidos maiores (5x5mm) podem ser cortados com 5µm. (Greer et al 1994)

Para a remoção da parafina, são necessárias diversas lavagens com

alcoóis. Alguns autores afirmam que a utilização de etanol a diversas graduações (30-100%) podem remover completamente a formalina (Fang et al 2002, Rivero et al 2006, Gräntzdörffer et al 2009, Duval et al 2010). Outros utilizam kits comerciais para desparafinização (Okello et al 2010).

Apesar de eficiente, esse método é laborioso, pois exige várias lavagens com solventes que são tóxicos e centrifugações, o que aumenta o risco de contaminação das amostras. Procedimentos usando sal têm sido usados para extrair o DNA de sangue e amostras citológicas e provou ser menos laborioso e tóxico do que o método do fenol-clorofórmio (Rivero et al 2006).

1.1 FIXAÇÃO DE SISTEMAS BIOLÓGICOS

Tão cedo quanto 400a.c, Hipócrates discutiu os efeitos biológicos do mercúrio e do álccol como fixadores. Entretanto, curiosamente sobre as estruturas histológicas dos tecidos começaram apenas com a invenção do microscópio. Centenas de anos mais tarde, a importância da qualidade do espécime para uma validez exata foi realizado. Um estudo sistemático dos fixadores deu início na última metade do século 19. Entretanto, deve ser notado que o próprio fixador leva a um maior número de artefatos (Srinivasan et al 2002).

A célula animal está em um estado de fluidez ou um semifluidez, e a fixação envolve algumas modificações químicas dos constituintes e proteínas dos tecidos, evento este necessário para prevenir sua perda durante o processamento do tecido (Williams et al 1999).

(24)

Uma atenção maior foi focada em desenvolver fixadores que podem preservar células e constituintes dos tecidos em um estado tão semelhante quanto à célula original permitindo passar por procedimentos de preparação sem mudança (Chaw et al 1980).

Diversos fixadores são discutidos na literatura a fim de solucionar os problemas de preservação das amostras. O glutaraldeído é amplamente utilizado na microscopia eletrônica, entretanto, a penetração lenta e a necessidade de diversas trocas para manter os níveis de aldeído tornam-se uma grande limitação para a biologia molecular (Srinivasan et al 2002).

O fixador Bouin é constituído de ácido pícrico, ácido acético glacial e formalina, que apesar de preservar melhor os detalhes das células e apresentar menor quantidade de artefatos, é cada vez menos utilizado. Embora nestas amostras uma quantidade considerável de DNA pode ser extraído, o rendimento obtido de ácidos nucléicos é menor do que em tecidos fixados em formalina (Baloglu et al 2008). O uso de etanol e metanol como fixadores preserva bem os ácidos nucléicos e provocam poucas mudanças químicas nos tecidos. Por ter uma rápida penetração, pode contribuir para a uniformidade do tecido fixado e mínima perda dos componentes da amostra. (Giannella et al 1997 e Noguchi et al 1997)

Em diversas aplicações clínicas, o diagnóstico pode ser dificultado por métodos de fixação que falham na conservação da estrutura dos ácidos nucléicos e proteínas em tecidos e até mesmo em diagnosticar estágios tumorais (Hsu et al 2007) e a capacidade limitada de extrair DNA, RNA ou proteínas de alta qualidade de tecidos fixados. Diversos fatores de pré fixação, intra fixação e pós fixação (conforme tabela 1) estão integralmente envolvidos na manutenção do estado in vivo do tecido humano ex vivo (Srinivasan et al 2002).

(25)

Tab. 1. Parâmetros de fixação a serem considerados para uma boa preservação do

tecido. (Srinivasan et al 2002)

Grupo I: parâmetros de pré-fixação 1. Fatores constantes:

a. Natureza do anestésico b. Duração da anestesia c. Injúria anóxica in situ

2. Fatores variáveis:

a. Tempo de pré-fixação

Grupo II: parâmetros de intra-fixação 1. Propriedades dos fixadores:

a. Química e mecanismo de ação b. Penetração no tecido 2. Condição da fixação: a. Temperatura b. Duração c. pH d. Osmolaridade e. Concentração f. Tamanho do espécime g. Volume do fixador

Grupo III: parâmetros pós-fixação 1. Parâmetros de armazenamento

a. Duração b. Temperatura

c. Condição (empacotado em vácuo)

2. Natureza do fator biológico a ser analisado

a. Proteínas b. Enzimas c. Lipídios d. Ácidos nucleicos e. Mucopolissacarídeos f. Glicogênio

Como o nome sugere, a fixação é o processo pelo qual se obtém a estabilização das estruturas celulares e intercelulares. As fixações por métodos físicos incluem: a secagem ao ar, a criofixação, utilização de substâncias crioprotetoras, a criofixação convencional, a criofixação por congelamento ultra-rápido (“quick freezing”), etc. (Ben-Ezra et al 1991).

A fixação química é obtida pelo emprego de substâncias que, reagindo com determinados sítios das biomacromoléculas, estabilizam as mesmas. As moléculas das substâncias empregadas na fixação química podem ou não ser adicionadas às macromoléculas tissulares (Greer et al 1991).

As proteínas, por exemplo, as intracelulares de membranas, citosólicas, etc, e as produzidas pela célula para exportação para atuarem

(26)

extracelularmente, pertencem a uma das duas seguintes categorias: Proteínas fibrosas e proteínas globulares. Nas proteínas fibrosas, como o colágeno e queratina, a cadeia polipeptídica, em sua estrutura secundária está disposta em hélice e se enrola ao redor de um cilindro imaginários de cerca de 1nm de diâmetro. As proteínas globulares solúveis têm cadeia polipeptídica enovelada numa configuração esferoidal com os radicais hidrofóbicos na parte inferior da estrutura terciária da proteína e os radicais hidrofóbicos expostos na superfície. Segmentos variáveis, conforme o tipo de proteína globular desse polipeptídio podem exibir estrutura em hélice. As proteínas integrais que

atravessam as membranas têm os radicais hidrofóbicos expostos para o segmento hidrofóbico da bicamada de fosfolipídios. Essa interação permite o ancoramento dessas proteínas à membrana (Casale et al 2010)

Para a microscopia eletrônica, os procedimentos de fixação têm sido mais estudados e descritos devido às suas características de resolução. Os fixadores químicos podem desnaturar as proteínas em graus variáveis, conforme a estrutura molecular do agente fixador. A desnaturação, que se for intensa e irreversível é indistinguível da coagulação, consiste numa modificação da estrutura da cadeia polipeptídica que é revirada e passa a exibir exteriormente radicais hidrofóbicos, o que determina a precipitação e insolubilização de uma proteína previamente solúvel (Greer et al 1991 e Srinivasan et al 2002).

Os fixadores que têm ação coagulante sobre as proteínas precipitam permanentemente as mesmas, alteram bastante sua configuração (por isso não são utilizadas em microscopia eletrônica) e, geralmente, não são incorporados às proteínas, sendo por isso também referidos como não aditivos. Sob a ação dos fixadores não coagulantes, como os aldeídos fórmicos e glutaraldeído, a acroleína e o tetróxido de ósmio (O4Os), as proteínas assumem o aspecto de gel transparente, isso porque ocorre uma estabilização estrutural através de uma amarração que as moléculas fixadoras fazem sobre as macromoléculas tissulares sem distorcer muito estas

últimas. A “amarração“ que esses fixadores propiciam deve-se ao fato que suas moléculas ou parte das mesmas estabelecem ligações cruzadas entre

os componentes estruturais. Desse modo, esses fixadores são incorporados aos tecidos, daí também serem nomeados de fixadores aditivos. (Sociedade

(27)

Brasileira de Microscopia Eletrônica - SBME 1989).A Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica editou um manual no qual seguem as recomendações de procedimentos de fixação.

As soluções comerciais designadas formalina têm concentração de formaldeído de 37 a 40%. A formalina apresenta de 11% a 16% de metanol que extrai boa parte do material do citosol e das membranas da célula. Tecidos fixados em solução aquosa de formalina a 10% (ou de formaldeído 3.7% - 4.0%) subseqüentemente em tetróxido de ósmio a 1% em tampão fosfato 0,1 M pH 7.3 e processados para inclusão em resina epóxi exibem péssima preservação das estruturas submiscroscópicas, principalmente devido à ação deletéria do metanol contido na primeira solução fixadora. Preservação estrutural razoável, para fins de diagnóstico histopatológico ao ME, é obtida de fragmento de órgão diretamente fixado em formalina 10% em tampão fosfato 0,1 M pH 7,2-7.4 e depois em O4Os. (Sociedade Brasileira de

Microscopia Eletrônica - SBME 1989).

A fixação depende do coeficiente de difusão do fixador e a taxa em que reage com os componentes do tecido. O coeficiente de difusão em 1 hora é a distância em milímetros que o fixador é difundido no tecido, e é inversamente relacionada à raiz quadrada do tempo. No geral, quanto mais alto o coeficiente de difusão, melhor o fixador. A formalina a 4% possui um coeficiente de difusão de 0,78. Em contato com a água, a formalina rapidamente se torna hidratada para formar metileno glicol. Quando o tecido está imerso na formalina, ele é rapidamente penetrado pelo metileno glicol. A atual fixação química covalente depende da fração da formalina formando ligações com os componentes do tecido e a dissociação da formalina com o metileno glicol. (Srinivasan et al 2002)

Para facilitar uma maior uniformidade de penetração do fixador no tecido, é aconselhável utilizar pequenos fragmentos de amostras (5mm a 1cm) e o volume do fixador deve ser 20 vezes maior que o volume do tecido. (Srinivasan et al 2002 e Greer et al 1991)

(28)

1.2 FORMALINA

Ferdinard Blum foi creditado como a primeira pessoa a utilizar formalina como fixador de tecidos em 1893 (Puchtler et al 1985). Desde esta data, a formalina tamponada a 10% é o fixador universal mais amplamente utilizado, pois preserva uma grande quantidade de tecidos e seus componentes. A formalina é o fixador mais utilizado na prática histopatológica devido ao seu fácil manuseio, menor toxicidade e um grande número de anticorpos podem ser utilizados para imunohistoquímica. (Zsikla et al 2004). Entretanto, as tentativas de extrair DNA utilizável de tecidos fixados em formalina são variavelmente bem sucedidas. (Srinivasan et al 2002)

Na preparação dos fixadores, consideram-se, entre outros fatores, o pH da solução, a sua tonicidade e ainda a presença de íons bivalentes e açúcares. O pH parece ser um dos elementos mais importantes a ter em conta, pois os resultados obtidos com fixadores não tamponados são muito variáveis. Os tampões estabilizam as modificações de pH que acompanham a morte celular à medida que o fixador penetra nos tecidos. Geralmente a fixação faz-se a um pH fisiológico (7.2 - 7.5). No entanto, um pH baixo próprio do tecido (como biópsias gástricas), não gera efeito negativo na qualidade do DNA (Zsikla et al 2004).

A formalina a 10% tamponada é ainda a melhor opção nas diversas circunstâncias. Além do baixo custo, o tecido é preservado durante longos períodos sem sofrer deteriorização, além de ser compatível com a maioria das colorações especiais. A formalina pura é uma solução concentrada (40%) do gás formaldeído em água. Assim a solução de formalina a 10% representa a solução de um gás a 4%.(Alves et al 2002)

A velocidade de penetração da formalina a 10% é de cerca de 1 mm/h, mas este período pode ser abreviado com a utilização de forno de microondas comercial, desde que sejam mantidas as temperaturas entre 63° e 65 °C, já que a ebulição da formalina conduz a artefatos indesejáveis(Alves et al 2004). Estudos das reações químicas entre formalina e ácidos nucléicos têm demonstrado que diversas reações são semelhantes àquelas observadas em interações com formalina e proteína. A formalina inicia a desnaturação do DNA (ligações de hidrogênio são rompidas e ocorre o desempilhamento das

(29)

bases) nas regiões de adenina e timina (A-T) da dupla fita de DNA, criando sítios para interação química (Zsikla et al 2004).

Existem 4 interações da formalina com DNA:

1. Reação adicional: a formalina é adicionada ao ácido nucléico, formando um grupo de hidroximetil (metilol, -CH2OH).

2. Ataque eletrofílico do N-metilol em uma base amino, formando uma ponte de metileno entre dois grupos aminos.

3. Tratamento com formalina pode gerar sítios apurínicos e apirimídicos (sítios de AP) via hidrólise das ligações N-glicosílicas, levando a resíduos de pirimidina e purina. Sítios de AP possuem um íon carboxônio altamente instável que hidrolisa rapidamente.

4. Formalina pode causar hidrólise lenta das ligações fosfodiésteres, levando a pequenas cadeias de polideoxiribose com pirimidinas intactas (Srinivasan et al 2002).

Quando comparado ao DNA extraído de tecidos congelados, tecidos fixados em formalina exibem alta freqüência de sequencia não reproduzível. Como resultado, na reação de PCR, a polimerase falha em reconhecer a citosina e incorpora uma adenina no lugar de uma guanina, criando uma mutação artificial C-T ou G-A. Além disso, o DNA danificado é conhecido por promover saltos durante amplificação, permitindo que a polimerase insira um resíduo de adenina no final da molécula da amostra em questão (Srinivasan et al 2002).

(30)

1.3 PARAFINA

A parafina é uma mistura de hidrocarbonetos sólidos derivados do petróleo. A parafina é branca ou incolor, mais ou menos translúcida e inodora. Existem vários tipos, cada um com um ponto de fusão diferente. As parafinas mais moles têm um ponto de fusão de aproximadamente 45°C e são melhores para tecidos moles como os tecidos conjuntivos dos fetos. As parafinas duras derretem-se a cerca de 60°C e são as mais indicadas para tecidos duros, como por exemplo, o tecido fibroso denso e o osso. Para utilização em laboratório aconselha-se uma parafina cujo ponto de fusão ronde os 56°C, já que não é prático num laboratório de patologia de rotina incluir algumas amostras com parafinas moles e outras com parafinas duras(Alves et al 2002).

As parafinas utilizadas para impregnação e inclusão são variadas e são escolhidas de acordo com a demanda de cada laboratório. Por terem diferentes pontos de derretimento e texturas, podem impactar nas características de seccionamento dos blocos finais. A maioria dos laboratórios utiliza a parafina sintética, que possui baixa temperatura de derretimento (55-63ºC) e é composta por látex, DMSO (dimethyl sulfoxide) e “plastificantes” que modificam a textura e maleabilidade. O uso de parafinas com alta temperatura de derretimento resulta em uma inadequada desparafinização e redução da quantidade de ácidos nucléicos recuperados (Hewitt et al 2008).

Os tecidos embebidos em parafina podem ficar armazenados por longos períodos. Alguns pesquisadores afirmam que há uma redução na quantidade de ácidos nucléicos recuperados em amostras antigas, na ordem de 5%-50% por cada década armazenada. Não é claro se esta redução é em função do tempo em que o tecido está parafinado, da qualidade do processamento do tecido ou das mudanças dos reagentes e processos utilizados durante a fixação. Apesar disso, muitos laboratórios trabalham com materiais de 20 e 25 anos atrás (Cronin et al 2004 e Gillio-Tos et al 2007) e até mesmo em espécimes de museus datadas do século 20, para estudo da gripe espanhola (Taubenberger et al 1997).

(31)

1.4 AMELOGENINA

Nos estágios terminais do desenvolvimento dos dentes, as células epiteliais presentes no esmalte interno são diferenciadas em ameloblastos, que sintetizam e secretam proteínas específicas. Existem duas classes de proteínas que são constituintes do desenvolvimento do esmalte: a amelogenina e a enamelina . A amelogenina contém altas concentrações de prolina, glutamina, leucina e histidina (Sasaki et al 1995).

Os genes da amelogenina foram identificados nos cromossomos sexuais tanto em camundongos quanto no homem por Lau et al 1989. Duas cópias do gene da amelogenina foram detectadas no genoma humano através da técnica de Southern Blot (Shimokawa et al 1989).

Fincham et al, em 1991, encontrou diferenças nos componentes da amelogenina humana de acordo com o sexo do indivíduo. Foram extraídas amostras de dentes de indivíduos e as proteínas foram analisadas por eletroforese. Bandas específicas da amelogenina foram detectadas e o dimorfismo sexual foi observado.

Após este estudo, em 1992, Salido et al relataram que os genes da amelogenina são expressados tanto no cromossomo X, quanto no cromossomo Y.

Trata-se de um gene homólogo, que está localizado no cromossomo Xp22.1-Xp22.3 e Yp 11.2 (conforme figura 2). Ele pode ser utilizado na determinação do sexo de amostras humanas desconhecidas através da Reação de Cadeia da Polimerase (PCR).Utilizando primers específicos para o íntron 1 do gene, a seqüência do gene para o íntron pode ser amplificada. O gene do cromossomo X, AMELX, dá origem a um produto de amplificação de 212pb e o gene do cromossomo Y, AMELY, 218pb. Desta forma o AMELX contém uma deleção de 6pb no íntron 1. Utilizando primers específicos para o íntron 1 do gene, a seqüência do gene para o íntron pode ser amplificada. Portanto, quando os fragmentos amplificados são colocados em gel de agarose, as amostras do sexo masculino (XY) apresentarão duas bandas (uma de 212pb e outra de 218pb), enquanto as do sexo feminino (XX) apresentarão apenas uma banda (Sasaki et al 1995).

(32)

Fig. 2. Localização do gene da amelogenina nos cromossomos X (AMELX) e Y

(AMELY), destacados em vermelho. (Fonte: Nature Genetics Reviews)

A identificação do sexo é uma importante variável biológica que auxilia na avaliação específica de um indivíduo e tem se tornado indispensável em casos forenses, não apenas em casos de estupro, mas também em desastres em massa e utilizado na maioria dos kits comerciais para PCR. Quando a utilização de métodos convencionais de identificação sexual é impossível ou dificultada (análise arqueológica), a análise de sequências específicas de DNA para os cromossomos X e Y permitem uma solução rápida (Gibbon et al 2009).

Há diversas situações onde a identificação do sexo é crucial, como o diagnóstico prenatal de hemofilia e a determinação do número de cópias de cromossomos sexuais. Além disso, a caracterização sexual também é utilizada em aplicações médicas, como em casos de síndrome de Klinefelter (XXY). O princípio dos testes comercialmente disponíveis é baseado no fato

(33)

de que numerosos polimorfismos estão presentes nas duas cópias homólogas do gene da amelogenina nos cromossomos X e Y (AMELX e AMELY) (Tschentscher et al 2008 e Sullivan et al 1993).

A amelogenina é utilizada nos kits de identificação humana para propósitos forenses (Applied Biosystems).

1.5 EXTRAÇÃO DE DNA

Com base nas características estruturais dos ácidos nucléicos, algumas técnicas moleculares são utilizadas na manipulação do DNA dos organismos. A hibridização é a técnica que se baseia na complementaridade entre as fitas de DNA. Um fragmento de DNA marcado por uma substância radioativa é usado como sonda para determinar a presença da fita complementar em uma amostra específica. Essa técnica foi muito utilizada em testes de diagnóstico, porém, atualmente em conseqüência de sua baixa sensibilidade e de problemas advindos do uso de radioatividade, ela caiu em desuso (Oliveira et al 2007).

A clivagem é outra técnica que pode facilitar a manipulação do DNA. Para esse fim, existem as chamadas enzimas de restrição, que são capazes de cortar o DNA em sítios específicos, definidos geralmente pela seqüência de bases distribuídas ao longo da molécula, produzindo fragmentos de comprimento menor. As enzimas de restrição são sintetizadas naturalmente por muitas bactérias e centenas (com especificidade para diferentes sítios de restrição) estão disponíveis comercialmente. Outros tipos de manipulação de DNA incluem a amplificação (utilizando a técnica de PCR) e a eletroforese (Oliveira et al 2007)

Para o isolamento e purificação dos ácidos nucleicos, encontram-se disponíveis várias técnicas alternativas as quais originam DNA ou RNA com diferentes graus de pureza e de integridade física. Na maioria dos casos, estas técnicas iniciam-se com o processo de liberação dos ácidos nucleicos, o que envolve a lise das células a estudar, seguida de ataques enzimáticos e/ou químicos para destruir os componentes proteicos da mistura. Já no que diz respeito ao processo de purificação dos ácidos, várias alternativas se

(34)

encontram disponíveis (Rivero et al 2006, Baloglu et al 2008, Greer et al 1991, Gräntzdörffer et al 2009 e Duval et al 2010).

O processo de purificação mais económico e simples é denominado de Salting-Out e consiste na insolubilização dos longos filamentos de DNA por ação da concentração salina da solução. Neste método, o DNA obtido é de baixa pureza, sendo recolhido por suave enrolamento com uma vareta de vidro após adição de um sal. O DNA assim preparado necessita depois de ser submetido a um longo processo de ressolubilização, após o que se encontra pronto para ser estudado. Note-se que apesar do baixo custo envolvido, este é um processo muito ineficiente devido á baixa pureza do DNA obtido, ao elevado teor de mão de obra necessário, e ao longo tempo de preparação que envolve (Rivero et al 2006).

O processo tradicional de extração de DNA de elevada pureza e integridade física é denominado de fenol-clorofórmio. Este processo deve o seu nome ao fato de envolver o ataque químico de proteínas e outros compostos celulares por ação do fenol dissolvido em clorofórmio. Esta mistura contém ainda habitualmente d-hidroxiquinelona como corante (facultativo) e álcool isoamílico como regulador da densidade. Neste processo, após a libertação dos ácidos nucleicos, a solução aquosa é misturada com igual volume de solução de fenol/clorofórmio, e após homogeneização suave, é centrifugada. Como as soluções aquosas (contendo o DNA) e orgânicas (contendo o fenol) são imiscíveis, após a centrifugação podemos facilmente recolher a fase aquosa (no topo do tubo) e rejeitar a fase orgânica (no fundo do tubo) e a interfase contendo um anel esbranquiçado de proteínas e precipitados. A remoção da fase aquosa deve ser executada com muito cuidado, para que a alta viscosidade não acarrete o arrastamento de interfase proteica. O processo repete-se ciclicamente até não ser observável a presença de interfase protéica (Barcelos et al 2008, Oliveira et al 2007).

No final, a precipitação do DNA é feita por meio da utilização de etanol absoluto associado a uma solução com alta concentração de um sal catiônico. O etanol induz a transição estrutural nas moléculas de ácido, fazendo-as se agregarem, com conseqüente precipitação. A precipitação com etanol absoluto, além de concentrar o DNA, ajuda a remover resíduos de fenol e de clorofórmio presentes na amostra. O etanol a 70% é utilizado para remover

(35)

resíduos de sais. Embora tanto o cloreto de sódio como o acetato de sódio e o acetato de amônio sejam eficazes na precipitação do DNA, é mais difícil remover o cloreto de sódio, em razão da sua menor solubilidade (Barcelos et al 2008).

Este processo, apesar de permitir obter DNA de elevada pureza, concentração e integridade fisica, tem como o Salting-Out a desvantagem de ser exigente do ponto de vista da mão-de-obra e do tempo de execução, envolvendo ainda a manipulação de compostos tóxicos como o fenol e o clorofórmio (Oliveira et al 2007).

A solubilidade das proteínas depende, além de outros fatores, da concentração de sal na solução. Em baixas concentrações, a presença de sais estabiliza vários grupos de uma molécula de proteína, atraindo a mesma dentro da solução e reforçando a solubilidade. Este método é comumente conhecido como Salting-In. Entretanto, como a concentração de sal vai aumentando, o ponto de solubilidade máximo da proteína é alcançado. O aumento da concentração de sal implica na menor disponibilidade de água para solubilizar as proteínas. Desta maneira, a proteína começa a precipitar quando não há moléculas de água suficientes para interagir com as moléculas de proteínas. Este fenômeno de precipitação na presença de excesso de sal é conhecido como Salting-Out (Jakoby 1971).

Diversos tipos de sais têm sido empregados para a separação e purificação de proteínas através do Salting-Out. O mais amplamente utilizado é o sulfato de amônio, pois possui alta solubilidade e baixo custo (Jakoby 1971).

A grande revolução nos processos de purificação de ácidos nucleicos foi a descoberta em meados dos anos 80 de que certas formulações de sílica possuíam a capacidade de adsorver os ácidos nucleicos, de modo dependente do pH e da concentração salina. A formulação da matriz de sílica variou desde suspensões a colunas de centrifugação, colunas ou matrizes de colunas de vácuo, sistemas de filtração e até partículas magnéticas revestidas a sílica. Em todos os casos, o processo melhorou muito em termos de rapidez, automatibilidade, reprodutibilidade, utilização de mão de obra, rendimento e até custo (Oliveira et al 2007 e Okello et al 2010).

(36)

1.6 ELETROFORESE

A eletroforese é um método simples e muito eficiente para separar, identificar e para purificar fragmentos de DNA e de proteínas. Este método consiste na separação de moléculas ionizadas (aminoácidos, peptídeos, proteínas - incluindo lipoproteínas e glicoproteínas, nucleotídeos, ácidos carboxílicos e outras substâncias de relevância biológica), de acordo com sua carga elétrica e seu peso molecular. Moléculas com carga negativa migram para o pólo positivo (ânodo) e moléculas com carga positiva migram para o pólo negativo (cátodo) (Sambrok et al 2001).

Para haver migração, é preciso desequilibrar eletricamente duas regiões extremas de um meio que contenha eletrólitos, no qual esteja dissolvida ou dispersa uma substância com potencial para migrar. Para tanto, é estabelecida a diferença de potencial entre dois eletrodos ligados aos terminais de uma fonte de corrente contínua e dispostos em dois compartimentos, catódico e anódico; ambos os compartimentos contém, em geral, uma solução-tampão. O meio físico de separação, igualmente tamponado, se comunica através de suas extremidades com as soluções-tampão dos eletrodos, fechando assim o circuito elétrico. A corrente elétrica, ao passar pelo meio, conduzida pelos pequenos íons presentes na solução, dá ensejo ao deslocamento, por exemplo, de partículas protéicas carregadas para determinado pólo (Oliveira et al 2007).

Pelo fato das proteínas serem substâncias anfóteras, ou seja, capazes de adquirirem carga positiva ou negativa de acordo com o pH, é indispensável manter constante o pH do meio durante a eletroforese, por meio do uso de soluções-tampão (Oliveira et al 2007).

Os ácidos nucléicos, por possuírem carga total negativa (em decorrência do grupamento fosfato), migram sempre em direção ao pólo positivo (ânodo). O sistema tampão usado consiste em duas partes: o tampão usado na preparação do gel e o tampão da cuba eletrolítica, na qual se encontram os eletrodos (ânodo e cátodo). Nos tampões das cubas e do gel, a corrente elétrica é conduzida por íons, e nos eletrodos, por elétrons. Na presença de um sistema tampão adequado, a hidrólise da água, que se dá na superfície dos eletrodos, permite a troca entre elétrons e íons. O sistema

(37)

tampão pode ser contínuo (o mesmo tampão é utilizado no gel e nos eletrodos) ou descontínuo (quando diferentes composições ou concentrações de tampão são utilizadas no gel e nos eletrodos) (Sambrok et al 2001).

O principal fator a ser considerado na escolha do tampão é a sua capacidade de tamponamento. Os dois tampões mais usados na separação eletroforética de moléculas de DNA são TAE (tampão tris-acetato-EDTA) e TBE (tampão tris-boratoEDTA). Esses dois tampões possuem efeito ligeiramente diferente na mobilidade do DNA. Apesar de o TAE ser mais utilizado, ele é mais facilmente exaurido durante reações longas ou com alta voltagem. O TBE tem melhor capacidade tamponante, mas deve ser evitado para purificação de DNA de géis. (Sambrok et al 2001).

A eletroforese pode ser conduzida em solução com gradiente de densidade ou em diferentes meios de suporte, tais como papel-filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida. O suporte deve ser química e fisicamente inerte, de modo a não interferir na mobilidade das moléculas e, em relação aos géis de agarose ou à poliacrilamida, a porosidade do gel determina o poder de resolução das bandas e este geralmente é decorrente do grau de polimerização entre os monômeros (Oliveira et al 2007).

Diante da problemática exposta, é importante conhecer e analisar cada etapa deste tipo de estudo, desde o armazenamento e processo de amostras parafinadas até a análise molecular. Em nosso estudo, pretendeu-se avaliar a qualidade do DNA por diferentes métodos de extração e analisar todo o processo histológico em amostras parafinadas. Além disso, com o intuito de avaliar a integridade do DNA, o gene da amelogenina foi utilizado na diferenciação do sexo.

(38)

2. OBJETIVOS:

Avaliar a influência da fixação e do tempo de armazenamento na integridade do DNA da amelogenina extraída de tecidos humanos incluídos em parafina.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Em amostras normais de fígado, baço e cérebro fixadas em formalina e incluídas em parafina, obtidas de cadáveres:

1. Comparar a concentração e a qualidade do DNA extraído de tecidos normais coletados durante os procedimentos de necropsia, fixados em formalina e incluídos em parafina;

2. Comparar as amostras de fígado, baço e cérebro fixadas em formalina, incluídas em parafina e arquivadas por 1 e 5 anos;

3. Comparar 3 métodos de extração: fenol-clorofórmio, utilização de sais (Salting-Out, modificado de Rivero ERC 2006) e kit comercial (QIAamp Mini Kit QIAGEN®).

4. Avaliar a amplificação dos produtos de PCR utilizando o gene da amelogenina (212-218pb) para identificação do sexo.

(39)

3. MATERIAIS E MÉTODO:

3.1 MATERIAL:

1º grupo (casos recentes):

Foram coletadas amostras de fígado, baço e cérebro normais de 13 indivíduos, de forma aleatória, sendo adultos do sexo masculino e sexo feminino, submetidos aos procedimentos de necropsia, realizadas no Departamento de Patologia. Os fragmentos de cerca de 1cm² foram fixados em formalina tamponada e incluídos em parafina (n=10 de cada tipo de tecido); fixados em formalina não-tamponada e incluídos em parafina (n=10 de cada tipo de tecido) e congelados (casos controle, n=10 de cada tipo de tecido).

2º grupo (casos arquivados):

Foram coletados blocos de parafina contendo fragmentos de fígado, baço e cérebro normais de 15 indivíduos adultos, do sexo feminino e masculino, obtidas de necropsias realizadas no Departamento de Patologia da UNIFESP. As amostras foram fixadas em formalina não-tamponada, incluídas em parafina e arquivadas no Departamento de Patologia, sendo armazenadas por 1 ano (n=10 bloco de cada tecido) e armazenadas por 5 anos (n=10 blocos de cada tecido).

3º grupo:

Fragmentos de baço, fígado e cérebro normais de um único indivíduo (adulto do sexo masculino) retirados no momento da necropsia. Analisamos a qualidade do DNA extraído dentre diferentes etapas do processamento

(40)

histológico, a fim de avaliar os efeitos dos fixadores, dos banhos de etanol e xilol e do processo de parafinização, em cada etapa, de forma isolada.

Critérios de inclusão:

1. Possuir o exame com os resultados anátomo-patológico de necropsias; 2. Aspecto histológico de normalidade;

3. Blocos arquivados por 1 e 5 anos em boas condições de preservação.

Critérios de exclusão:

1. Exame histológico com diagnóstico de neoplasia ou alterações de normalidade (patologias relacionadas ao cérebro, fígado e baço);

2. Blocos de parafina em más condições de preservação (blocos danificados, tecidos emblocados inadequadamente, blocos gastos, etc.) 3. Biópsias;

4. Hepatopatias;

5. Doenças infecciosas (viroses e septicemias no geral); 6. Etilistas;

7. Tabagistas;

8. Presença de autólise, artefatos ou pigmentos na análise histológica.

O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da EPM/UNIFESP – CEP 0063/09.

3.2. MÉTODO:

3.2.1. Microtomia

Dois cortes com aproximadamente 10µm de espessura foram obtidos em micrótomo do tipo Minot (Leica, Modelo RM 2035) e armazenados em tubos de 1,5 ml. As amostras escolhidas apresentaram a mesma área de superfície (aproximadamente 1 cm2).

(41)

3.2.2. Extração de DNA

Foram cortados em micrótomo 2 secções de 10µm de espessura dos blocos de parafina e coletados em tubos de 1,5 ml.

3.2.3. Métodos de Extração:

Fenol-clorofórmio

Um mililitro (1mL) de xilol pré-aquecido (60ºC) é adicionado em tubos de 1,5ml, contendo os tecidos, que são mantidos a 60ºC por 30 minutos. O sobrenadante é descartado, é adicionado 1mL de xilol e em seguida mantido a 60°C por 10 minutos. Em seguida, o tecido é lavado duas vezes com 1mL de etanol absoluto (Merck). Toda troca de reagentes é precedida por centrifugação em 16000xg por 4 min. Após, as amostras são colocadas em 470µl de solução que chamaremos de DP (Tris HCl 1mM pH 8.0, EDTA 0,5mM e Tween 20 0,5%) e 30µl de proteinase K (30mg/µl). A digestão em proteinase K ocorre por 24h a 56ºC.

Após a digestão pela proteinase K, 0,5mL de fenol-clorofórmio-álcool-isoamílico (25:24:1 v/v) é adicionado. As amostras são centrifugadas a 16000xg por 2 minutos e em seguida o sobrenadante é transferido para outro tubo. A seguir, 0,5mL de fenol-clorofórmio é adicionado no sobrenadante e os tubos são centrifugados novamente a 16000g por 4 minutos. O sobrenadante é transferido para um novo tubo. O DNA é precipitado com 1mL de etanol absoluto e 40µl de acetato de sódio 3M pH 4.8 a -20ºC por 2 horas. A solução é centrifugada a 16000xg por 15 minutos. Após a decantação do DNA, o etanol é desprezado por inversão e os tubos são incubados à temperatura ambiente até secarem completamente. O DNA então é dissolvido em 80µL de solução TE (Tris-EDTA) e mantido à temperatura de 4ºC até a sua utilização (Barcelos et al 2008).

(42)

Utilização de sais: Salting-out (modificado de Rivero EC, 2006)

Um mililitro (1ml) de xilol pré-aquecido (60ºC) é adicionado nos tubos de 1,5ml contendo os cortes e mantidos a 60ºC por 10min. Em seguida, os tubos são centrifugados a 9300xg por 5 min. O sobrenadante é descartado, seguido por uma nova lavagem com xilol. O pellet é lavado em séries no sentido descrescente de etanol (etanol absoluto, etanol 95% e etanol 70%). Toda a lavagem é precedida por homogeneização e centrifugação a 9300xg por 5min. Em seguida, adiciona-se 470ul de tampão de digestão (1M NaCl, 1M Tris-HCl pH 8.0, 0,5M EDTA pH 8.0 e 10% de SDS) e 30ul de proteinase K (30mg/ml). A digestão em proteinase ocorre por 24h a 56ºC.

Após a digestão pela proteinase K, essa é inativada, incubando os tubos a 95ºC por 10min. Em seguida são adicionados 200µL de acetato de amônia. Os tubos são vortexados por 20 segundos na velocidade alta e em seguida incubados a -20ºC por 5 minutos e centrifugados a 13000xg por 3 minutos. O sobrenadante é transferido para um novo tubo de 1,5ml e 600µL de isopropanol é adicionado e centrifugado a 16000xg por 5 minutos. O pellet de DNA é lavado com 200µl de etanol a 70% e centrifugado a 16000xg por 1 minuto. O sobrenadante é descartado. O DNA é dissolvido em 80µl de solução de TE (Tris-EDTA) e mantido à temperatura de 4ºC até a análise.

Kit comercial (QIAamp DNA Mini Kit - QIAGEN®)

Os procedimentos de extração são realizados de acordo com as instruções do manual do fabricante. Um mililitro (1mL) de xilol é adicionado no tubo de 1,5ml (contendo os cortes do tecido parafinado) e vortexado vigorosamente por 5 segundos. Em seguida o tubo é centrifugado em velocidade máxima (16000xg) por 5 min, o sobrenadante é descartado e adiciona-se 1mL de etanol absoluto (Merck). O tubo é vortexado gentilmente e em seguida centrifugado a 16000xg por 5 min. Este processo é repetido por mais uma vez. A seguir, o tubo é incubado aberto a 37°C por 10-15 min até o etanol ter evaporado. O pellet é ressuspendido em 180µL de Buffer ATL e 20µL de proteinase K (30mg/ul), vortexado e incubado a 56°C por 2h. Após digestão pela proteinase K, são adicionados 200µL de Buffer AL, vortexados

(43)

por 15 segundos e incubados a 70°C por 10 min. Em s eguida são adicionados 200µL de etanol absoluto (Merck), vortexado por 15 segundos e a mistura é transferida para a coluna do kit, sem encostar na membrana. O tubo é então centrifugado a 8000rpm por 1 min e a coluna é transferida para um novo tubo coletor. São adicionados 500µL de Buffer AW1, o tubo é centrifugado a 8000rpm por 1 min e a coluna é transferida para um novo tubo coletor. Em seguida são adicionados 500µL de Buffer AW2 e o tubo é centrifugado a 14000rpm por 3 min. A coluna é transferida para um tubo limpo de 1,5mL e são adicionados 200µL de Buffer AE. O tubo é incubado em temperatura ambiente por 1 min e em seguida centrifugado a 8000rpm por 1 min. A coluna é descartada e o material é armazenado a -20°C até sua utilização.

3.3. Análise do processo de fixação e inclusão em fragmentos de baço, fígado e cérebro.

Conforme figura 3, realizamos um experimento em paralelo onde foram obtidos fragmentos de baço, fígado e cérebro normais de um indivíduo (adulto do sexo masculino) retirados no momento da necropsia. Analisamos a qualidade do DNA extraído dentre diferentes etapas do processamento histológico, a fim de avaliar os efeitos dos fixadores, dos banhos de etanol e xilol e do processo de parafinização, em cada etapa, de forma isolada.

Todas as amostras foram pesadas para 25mg ou cortadas em 10µm numa área de 1cm² e utilizados 2 cortes por bloco.

Esses fragmentos foram divididos e processados da seguinte forma:

1. Congeladas em Tissue Tek ® a -20ºC; 2. Fixadas em formalina 10% tamponada; 3. Fixadas em formalina 10% não-tamponada.

Amostras congeladas:

Foram pesadas e padronizadas para 25mg de tecido. A extração de DNA foi realizada conforme as recomendações do kit comercial QIAGEN QIAamp Mini®. Essas amostras foram utilizadas como controle da análise.

(44)

Amostras somente fixadas:

Os fragmentos fixados tanto em formalina tamponada quanto não-tamponada (por 24h) foram novamente divididas: uma parte seguiu por mais 6 dias no fixador e outra parte seguiu para o processo de extração de DNA.

Amostras fixadas e processadas para inclusão, exceto na parafina:

Após 6 dias de fixação em formalina tamponada e não-tamponada, as amostras foram submetidas aos banhos no aparelho Leica Jung Histokinnette 2000® em gradiente de etanol e xilol (3 banhos de etanol absoluto com 1h cada e 3 banhos de xilol com 1h cada). Os fragmentos previamente pesados (25mg) seguiram então para a extração de DNA no kit QIAGEN QIAamp Mini®.

Amostras fixadas e processadas para a inclusão em parafina (processo final):

Os fragmentos que foram processados até o final, ou seja, até a inclusão em parafina, foram cortados e padronizados para 1cm².

Após os banhos de etanol e xilol, as amostras foram incluídas em parafina de acordo com a rotina do departamento. Em seguida, foram obtidos 2 cortes de 10µm de cada bloco (fragmento com 1cm²) e seguiu-se a extração de DNA com o kit QIAGEN QIAamp Mini®.

(45)

Fig. 3. Organograma do experimento para análise do processo de fixação e inclusão

das amostras de fígado, baço e cérebro normais coletadas durante o procedimento de necropsia.

3.4. Avaliação do DNA extraído

3.4.1. Pureza e rendimento do DNA

A pureza do DNA extraído foi avaliada por espectrofotometria, através do aparelho Nanodrop (Thermo Scientific®), calculando a taxa A260/A280 para

as impurezas das proteínas. A concentração de DNA presente nas amostras foi calculada em ng/µl/cm². Banhos Etanol+Xilol Fixado 24h Fixado 7 dias Baço Caso 2010 Fígado Cérebro Fixação em formalina tamponada Fixação em formalina não tamponada Congeladas

Extração de DNA – kit QIAGEN QIAamp DNA Mini® Banhos Etanol+Xilol Fixado 24h Fixado 7 dias Baço Caso 2010 Fígado Cérebro Fixação em formalina tamponada Fixação em formalina não tamponada Congeladas Fixado 24h Fixado 7 dias Baço Caso 2010 Fígado Cérebro Fixação em formalina tamponada Fixação em formalina não tamponada Congeladas Baço Caso 2010 Fígado Cérebro Baço Caso 2010 Fígado Cérebro Baço Caso 2010 Caso 2010 Caso 2010 Fígado Cérebro Fixação em formalina tamponada Fixação em formalina não tamponada Congeladas Fixação em formalina tamponada Fixação em formalina não tamponada Congeladas

Imagem

Referências

temas relacionados :