PARTICIPAÇÃO DOS RECEPTORES PURINÉRGICOS NO NÚCLEO DO TRATO SOLITÁRIO SOBRE AS RESPOSTAS CARDIORRESPIRATÓRIAS INDUZIDAS POR HIPÓXIA.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE

ARARAQUARA

Naira Marques

PARTICIPAÇÃO DOS RECEPTORES

PURINÉRGICOS NO NÚCLEO DO TRATO

SOLITÁRIO SOBRE AS RESPOSTAS

CARDIORRESPIRATÓRIAS INDUZIDAS POR

HIPÓXIA.

Araraquara

2012

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE ARARAQUARA

PARTICIPAÇÃO DOS RECEPTORES PURINÉRGICOS NO

NÚCLEO DO TRATO SOLITÁRIO SOBRE AS RESPOSTAS

CARDIORRESPIRATÓRIAS INDUZIDAS POR HIPÓXIA.

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, para obtenção do grau de Farmacêutica-Bioquímica.

Aluna: Naira Marques

Orientadora: Patrícia Maria de Paula

Araraquara 2012

AGRADECIMENTOS

À Deus que iluminou o meu caminho durante esta caminhada;

À minha família pela dedicação e apoio em todos os momentos da minha vida;

Aos meus amigos pelo companheirismo nas experiências destes anos;

À Profa. Dra. Patrícia Maria de Paula pela ótima orientação dada durante a execução deste trabalho.

À todos os colegas do Laboratório de Fisiologia que participaram de forma direta ou indireta deste trabalho.

Aos Professores do Laboratório de Fisiologia pela colaboração para execução deste trabalho.

Aos membros da banca:Ms. Michele Thaís Fávero e Dr. André Henrique Freiria-Oliveira.

E ao suporte financeiro dado pelo CNPq-PIBIC – Processo n° 800124/2012-0, FAPESP E CAPES.

Sumário

6.2. Cirurgia estereotáxica para implantes de cânulas de aço inoxidável no núcleo do trato solitário (NTS) ... 14

6.3. Injeções no NTS ... 15

6.4. Canulação da artéria femoral ... 16

6.5. Medida da pressão arterial e freqüência cardíaca ... 16

6.6. Medidas da Ventilação Pulmonar (VE) ... 17

6.7. Histologia para localização das injeções ... 18

6.8. Drogas e soluções utilizadas ... 19

7. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS ... 20

7.1. Registro Basal: ... 20

7.2. Protocolo 1: Participação dos receptores P2, do NTS, sobre a pressão arterial, frequência cardíaca e a ventilação em condições de normóxia (21% O2)... 20

7.3. Protocolo 2: Participação dos receptores P2, do NTS, sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia (7% O2). ... 21

7.4. Análise dos Resultados ... 21

8. RESULTADOS: ... 22

8.1. Efeito da injeção bilateral de suramin ou salina no NTS sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e ventilação (VE) em condições de normóxia (21% O2). ... 22

8.2. Efeito da injeção bilateral de suramin ou salina no NTS sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e ventilação (VE) em condições de hipóxia (7% O2)... 28

8.3. Efeito da injeção bilateral de PPADS ou salina no NTS sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e ventilação (VE) em condições de hipóxia (7% O2)... 35

9. HISTOLOGIA ... 42

10. DISCUSSÃO ... 43

11. CONCLUSÃO: ... 46

1. LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a pressão arterial média (PAM). ... 23

Figura 2: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a freqüência cardíaca (FC). 24

Figura 3: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre o volume corrente (VC). .... 25

Figura 4: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a frequência respiratória (fR). ... 26

Figura 5: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a ventilação (VE). ... 27

Figura 6 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a pressão arterial média (PAM). ... 30

Figura 7 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência cardíaca (FC) ... 31

Figura 8 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre o volume corrente (VC). ... 32

Figura 9 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência respiratória (fR).. 33

Figura 10 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a ventilação (VE). ... 34

Figura 11 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a pressão arterial média (PAM). ... 37

Figura 12 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência cardíaca (FC). ... 38

Figura 13 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre o volume corrente (VC). ... 39

Figura 14 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência respiratória (fR). . 40

Figura 15 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a ventilação (VE). ... 41

2. LISTA DE ABREVIATURAS

AP Ântero-posterior

ATP Adenosina tri-fosfato

DV Dorso-ventral

FC Freqüência cardíaca fR Freqüência respiratória

icv

L Lateral

NTS Núcleo do trato solitário PA Pressão arterial

PAM Pressão arterial média PAP Pressão arterial pulsátil PE polietileno

PT Deflexão de pressão associada com cada volume de ar corrente. PK Deflexão de pressão associada ao volume injetado para calibração. PaO2 Pressão parcial de oxigênio no sangue arterial

PPADS Ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-2',4'-disulfônico P2 Receptores purinérgicos tipo 2

P1 Receptores purinérgicos tipo 1 P2X Receptores purinérgicos tipo 2X P2Y Receptores purinérgicos tipo 2Y PB Pressão barométrica.

PR Pressão de vapor de água a temperatura corporal. PC Pressão de vapor de água na câmara do animal . Tb Temperatura corporal (em Kelvin)

TC Temperatura do ar dentro da câmara do animal. TR Temperatura ambiente

VC Volume de ar corrente VE Ventilação pulmonar

3. RESUMO

A queda da pressão parcial de oxigênio no sangue arterial (PaO2), provocada pela hipóxia aguda, aumenta as descargas dos quimiorreceptores periféricos, carotídeos e aórticos, cujas aferências estimulam núcleos bulbares como o núcleo do trato solitário (NTS, Chitravanshi e cols., 1994, Mifflin, 1992), resultando em uma série de repostas compensatórias incluindo o aumento da VE ( Overgaard e cols., 1996, Sun e Reis, 1994). Estudos demonstraram que a via neural do quimiorreflexo periférico no NTS tem como neurotransmissores o L-glutamato e mais recentemente o ATP. Além disso, o ATP atuando em receptores purinérgicos presente na superfície ventral do bulbo estaria envolvido com as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia. No entanto, a participação dos receptores purinérgicos do NTS sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia ainda é desconhecida. Portanto, o presente estudo investigou o envolvimento dos receptores purinérgicos P2 no NTS sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia em ratos acordados, usando injeção bilateral de suramin (antagonista inespecífico dos receptores P2) e PPADS (antagonista seletivo dos receptores P2X). Foram utilizados ratos Holtzman (290-310g, n=4-9/grupo) com implante de cânulas guia no NTS. Para medida da pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) foi inserido na artéria abdominal, através da artéria femoral, um tubo de polietileno (P-10 conectado ao P-50). Freqüência respiratória (FR), volume corrente (VC) e VE foram registrados através do método de pletismografia de corpo inteiro. Os parâmetros FR, VC, VE, PAM e FC foram registrados antes e após a injeção bilateral de salina, suramin (2 nmol/100 nl) ou PPADS (2 nmol/100 nl) no NTS durante hipóxia (7% de O2 por 35 min) ou normóxia (21% de O2). A hipóxia reduziu a PAM (100 ± 11 mmHg, vs. normóxia: 121 ± 3 mmHg, p<0,05), aumentou a

VE (1521 ± 376 ml/min/kg, vs. normóxia 730 ± 227 ml/min/kg, p=0,015) sem alterações da FC (388 ± 32 bpm, vs. normóxia 384 ± 6 bpm). A injeção bilateral de suramin no NTS reduziu a hiperventilação hipóxica (505 ± 208 ml/min/kg, vs. salina: 1508 ± 376 ml/min/kg, p<0,05) sem alterações da PAM (106 ± 8 mmHg, vs. salina105 ±7 mmHg) e FC (399 ± 24 bpm, vs. salina 416 ± 9 bpm). A injeção bilateral de suramin no NTS não alterou a PAM, FC e VE em condições de normóxia. Por outro lado, a injeção bilateral de PPADS no NTS não alterou a hiperventilação hipóxica (808 ± 57 ml/min/kg, vs. salina 891 ± 86ml/min/kg, p= 0,527), a PAM (123 ± 5 mmHg, vs. salina 106 ± 3 mmHg) e FC (449 ± 12 bpm, vs. salina 407 ± 38 bpm). A injeção bilateral de PPADS no NTS não alterou a PAM, FC e VE em condições de normóxia. Os presentes resultados mostraram que os receptores purinérgicos P2 no NTS estão envolvidos na hiperventilação induzida por hipóxia, sugerindo que a ativação destes receptores no NTS facilita a hiperventilação induzida por hipóxia. Porém, os resultados também mostraram que os receptores purinérgicos P2X não participam da hiperventilação hipóxica, sugerindo uma provável participação de outros receptores dessa classe, como por exemplo, receptores purinérgicos P2Y.

4. INTRODUÇÃO

A hipóxia é um estímulo classicamente conhecido por causar uma série de respostas compensatórias, incluindo aumento imediato da ventilação pulmonar (VE) (West, 1985). A queda da pressão parcial de oxigênio no sangue arterial (PaO2), provocada pela hipóxia aguda, aumenta

as descargas dos quimiorreceptores periféricos, carotídeos e aórticos, cujas aferências estimulam núcleos bulbares como o núcleo do trato solitário (NTS, Chitravanshi e cols., 1994, Mifflin, 1992), resultando em aumento da VE ( Overgaard e cols., 1996, Sun e Reis, 1994).

Os quimiorreceptores periféricos fazem sua primeira sinapse no NTS (Crill e Reis, 1968, Ciriello e cols., 1981, Mifflin, 1992). Estudos da literatura demonstraram que os neurotransmissores das vias neurais do quimiorreflexo no NTS são L-glutamato (Haibara e cols., 1995, 1999) e mais recentemente o ATP (Braga e cols, 2007).

O conceito da neurotransmissão purinérgica, onde o ATP e a adenosina são as principais substâncias ativas, foi introduzido por Burnstock em 1972. O ATP bem como seu metabólito, a adenosina, são purinas extracelulares envolvidas em diversos efeitos biológicos atuando nos receptores chamados purinérgicos (Ralevic e Burnstock, 1998, Fredholm, 1995; Burnstock, 1997, Kennedy, 2000, Fagura e cols., 2000). Os receptores purinérgicos foram primeiramente divididos bioquímica e farmacologicamente por Burnstock (1972) em 2 classes: P1 e P2. De acordo com esta classificação os receptores P1 são exclusivos para a adenosina e são subdivididos em 4 tipos: A1, A2a, A2b e A3, estando todos acoplados à proteína G e são dependentes de adenilciclase. Além disso, eles são antagonizados por metilxantinas e seus derivados. Os receptores P2 são exclusivos para o ATP e são subdivididos em 2 tipos: P2X e P2Y(Ralevic e Burnstock, 1998). Nos mamíferos, os receptores P2X são subdivididos em 7 tipos: (P2X1 a P2X7) e são

dependentes de canais iônicos (ionotrópicos). Os P2Y são subdivididos em 8 tipos: (P2Y1, P2Y2, P2Y4, P2Y6, P2Y11, P2Y12, P2Y13 e P2Y14) e são acoplados a proteína G e operam via inositol trifosfato ( Burnstock, 2007). O ATP é o agonista natural para os receptores P2, porém a sua meia vida é muito curta, ou seja, o ATP é muito instável e é rapidamente degradado na fenda sináptica por ecto-nucleotidases, sendo a adenosina o seu principal metabólito. Os receptores purinérgicos P2X são ativados por análogos ou agonistas mais estáveis do que o ATP como o alfa- beta- metileno-ATP e o alfa-gama-metileno-ATP, enquanto os receptores P2Y tem como agonista o 2-metilthio-ATP ( Burnstock, 1997).

Recentemente vários estudos têm demonstrado que o ATP extracelular, atuando nos receptores P2X, está envolvido em vários mecanismos centrais de regulação cardiovascular, respiratória e da temperatura corporal (Phillis e cols, 1997; Horiuchi e cols, 1999, Ralevic e cols, 1999; Ralevic, 2000; Gourine e cols, 2002; Paton e cols, 2002; Gourine e cols, 2004; de Paula e cols, 2004; Gourine e cols, 2005a). Existem evidências de que o ATP, atuando no bulbo ventrolateral desempenha um importante papel no controle vasomotor e da atividade simpática (Horiuche e cols, 1999; Ralevic, 2000). Além disso, os receptores P2X do bulbo ventrolateral estão envolvidos na hiperventilação induzida por hipercapnia (Spyer e Thomas, 2000). Adicionalmente, estudos mostraram que as purinas também participam do controle cardiovascular e respiratório atuando especificamente no NTS (Phillis e cols, 1997; Spyer e Thomas, 2000; de Paula e Machado, 2001; Paton e cols, 2002; de Paula e cols, 2004, Antunes e cols, 2005a; Antunes e cols, 2005b). Ainda neste contexto, estudos de Gourine e cols, 2002, 2004 e 2005a, mostraram o envolvimento da neurotransmissão purinérgica no controle da temperatura corporal, onde a injeção intracerobroventricular (icv) ou intra-hipotálamo de agonistas purinérgicos P2X promoveram queda na temperatura corporal de ratos.

Em vista destas evidências, de que os receptores purinérgicos estão envolvidos nos mecanismos centrais do controle cardiovascular e respiratório, é possível que estes receptores no NTS participem também dos ajustes cardiorrespiratórios induzidos por hipóxia.

Assim, no presente projeto verificaremos a hipótese de que os receptores purinérgicos, no NTS, estão envolvidos com os ajustes cardiorrespiratórios induzidos por hipóxia em ratos não anestesiados.

5. OBJETIVOS

Verificar a possível participação dos receptores purinérgicos P2, através da injeção dos antagonistas purinérgicos suramin e PPADS (ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-2',4'-disulfônico)] no NTS, sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia em ratos não anestesiados.

6. MATERAIS E MÉTODOS

6.1. Animais

Foram utilizados ratos Holtzman, com peso entre 280-320g, fornecidos pelo Biotério do Campus de Araraquara da UNESP. Os animais foram mantidos a uma temperatura controlada (25 r 1ºC) e submetidos a um ciclo claro:escuro de 12:12h. Os animais tiveram livre acesso à água e ração e os experimentos foram realizados entre as 8:00 e 18:00h. Os protocolos experimentais aos quais os animais foram submetidos foram aprovados e autorizados pelo Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA (Proc. CEUA nº 23/2010) da Faculdade de Odontologia de Araraquara, UNESP.

6.2. Cirurgia estereotáxica para implantes de cânulas de aço inoxidável no núcleo do trato solitário (NTS)

Para o implante de cânulas cerebrais no NTS, os ratos foram anestesiados com cetamina (Cristália, Itapira, SP, Brasil, 80 mg/kg de peso corporal) combinada com xilazina (Agener União, Embu-Guaçu, SP, Brazil, 7 mg/kg de peso corporal) e adaptados a um aparelho estereotáxico (modelo Kopf 900, David-Kopf, Tujunga, CA, EUA). Após a anti-sepsia da pele com solução de álcool iodado, foi feita uma incisão longitudinal na pele e tecido subcutâneo, expondo-se a região da calota craniana, a qual foi posteriormente irrigada com solução fisiológica e água oxigenada. A torre do estereotáxico foi colocada na posição vertical (angulação zero) e a cabeça do animal foi ajustada até que os pontos bregma e lambda da calota craniana ficassem no mesmo nível horizontal e então foram feitas as leituras das coordenadas ântero-posterior (AP), lateral (L) e dorso-ventral (DV) a partir do bregma. O ponto de introdução da cânula guia foi

determinado utilizando-se as coordenadas estereotáxicas do atlas de Paxinos e Watson (1998) em relação ao bregma. As coordenadas utilizadas para o implante das cânulas-guias em direção ao NTS foram: AP = 14,5 mm caudal ao bregma; L = r 0,5 mm à linha média e DV = 7,5 mm abaixo do osso. Neste ponto foi feita a trepanação da calota craniana com o auxílio de uma broca odontológica esférica acoplada a um motor de baixa rotação. Por esse orifício foram introduzidas as cânulas de 15 mm de comprimento, sendo que a extremidade inferior desta ficou 1 mm acima da superfície dorsal do tronco cerebral. As cânulas-guias foram fixadas ao crânio do animal através de resina acrílica e de pequenos parafusos de aço inoxidável, previamente colocados na calota craniana. Após a completa fixação das cânulas, a torre do estereotáxico foi removida e para evitar obstrução das cânulas-guias, foi introduzido nas mesmas um mandril (oclusor de 15 mm de comprimento) também de aço inoxidável, o qual foi mantido dentro das cânulas até a realização dos experimentos. O procedimento cirúrgico não excedeu 40 min. Após a cirurgia cerebral, os animais receberam uma injeção intramuscular (0,2 ml/rato) de pentabiótico veterinário – pequeno porte (benzilpenicilina 80.000 UIs e estreptomicina – 33 mg, Fort Dodge Saúde Animal Ltda) e uma injeção subcutânea de analgésico/anti-inflamatório (cetoprofeno 1% - 0,1 ml/rato). Os animais ficaram em observação e recuperação durante 6 dias.

6.3. Injeções no NTS

As drogas utilizadas foram dissolvidas em salina fisiológica e foram manualmente injetadas no NTS em um volume de 100 nl em cada sítio de injeção desta região, utilizando-se uma seringa Hamilton (5 Pl, Hamilton, Reno, NV, EUA) conectada com um tubo de polietileno PE-10e a uma agulha injetora que foi introduzida no NTS pela cânula guia previamente fixada nesta região. A cânula injetora foi 1,2 mm mais longa do que as cânulas-guias a fim de que as

injeções atingissem diretamente o NTS. As injeções foram bilaterais e realizadas de modo seqüenciado, ou seja, injeção de um lado do NTS seguida da injeção do lado contralateral.

6.4. Canulação da artéria femoral

Um dia antes dos experimentos foi realizada a canulação da artéria femoral. A cânula utilizada foi confeccionada previamente com um tubo de polietileno PE-10 (Clay Adams, Parsipanny, NJ) de 4 a 5 cm, soldado a outro tubo de polietileno PE-50 (15 cm). Antes de ser implantada, a cânula foi preenchida com solução fisiológica e obstruídas na extremidade livre do PE-50 com pinos de metal. Sob anestesia com quetamina (Cristália, Itapira, SP, Brasil, 80 mg/kg de peso corporal) combinada com xilazina (7 mg/kg de peso corporal Agener União, Embu-Guaçu, SP) a cânula arterial foi introduzida na aorta abdominal, através da artéria femoral. Uma vez implantada, a cânula foi dirigida subcutaneamente, com auxílio de um trocáter, para a região escapular do rato, onde foi exteriorizada e fixada com linha de sutura. A cânula arterial foi utilizada para registro direto da pressão arterial pulsátil e cálculo da pressão arterial média e da freqüência cardíaca.

6.5. Medida da pressão arterial e freqüência cardíaca

A pressão arterial média (PAM) e freqüência cardíaca (FC) foram registradas em ratos não anestesiados submetidos à canulação prévia (um dia antes do registro) da artéria femoral e com livre movimentação. O tubo PE 50 foi conectado com um transdutor de pressão (Stathan P 23 Db, NH, EUA.) acoplado a um sistema computadorizado de registro (Power Lab16/305P, ADInstruments, Castle Hill, NSW, Austrália).

6.6. Medidas da Ventilação Pulmonar (VE)

As medidas de VE foram obtidas por pletismografia de corpo inteiro (Bartlett e Tenney, 1970). Este método é baseado no princípio de que um animal, dentro de uma câmara vedada, terá seu volume de ar corrente inspirado aquecido, da temperatura da câmara à temperatura corporal e saturado com vapor de água; enquanto na expiração, seu volume de ar corrente será esfriado até a temperatura da câmara, havendo perda de vapor de água. Estas situações de aquecer e umidecer o ar inspirado e de esfriar e desidratar o ar expirado são acompanhadas por pequenas mudanças de pressão, que podem ser detectadas por um transdutor sensível. A câmara de acrílico, onde o animal foi colocado e se movimentava livremente, tinha conexão com o transdutor diferencial de pressão e com outra câmara de referência, a qual evita artefatos de medidas provocados pela variação de pressão dentro do laboratório, como a abertura de portas. Além disto, a câmara estava equipada com um termômetro e uma seringa para calibração.

Durante as medidas de ventilação, o fluxo foi interrompido e a câmara selada por curtos períodos de tempo (~ 2 min) e as oscilações na temperatura do ar causadas pela respiração foram medidas como oscilações na pressão. Os sinais detectados pelo transdutor diferencial de pressão foram coletados por um registrador, o qual estava conectado a um conversor analógico-digital. Isto permitiu a digitalização dos sinais em um computador, utilizando um programa de aquisição de dados. Os dados foram analisados através de um programa de cálculos, permitindo a obtenção da frequência respiratória (FR) e da amplitude do sinal (PT). O volume corrente (VC) foi

calculado através da fórmula abaixo (Bartlett e Tenney,1970). A calibração do volume foi feita antes e durante cada experimento por injeção na câmara de uma quantidade conhecida de ar (1 ml) usando uma seringa graduada. A VE foi calculada multiplicando o VC pela FR. Segundo

Bartlett e Tenney (1970) medidas diretas de VE por pneumotacografia resultam em valores bastante próximos daqueles obtidos por pletismografia.

VC = PT x VK x TC x (PB - PC) . PK TR (PB-PC) – TC x (PB-PR) Tb

Definição dos símbolos da equação:

VC: Volume de ar corrente.

VK: Volume de ar injetado na câmara do animal para calibração. PT: Deflexão de pressão associada com cada volume de ar corrente. PK: Deflexão de pressão associada ao volume injetado para calibração. Tb: Temperatura corporal (em Kelvin)

TC: Temperatura do ar dentro da câmara do animal. PB: Pressão barométrica.

PR: pressão de vapor de água a temperatura corporal. PC: pressão de vapor de água na câmara do animal. TR: temperatura ambiente.

6.7. Histologia para localização das injeções

Ao final dos experimentos foi injetado 100 nl de solução de azul de Evans 2% no NTS para confirmar o local das injeções nesta região. Os ratos foram profundamente anestesiados e submetidos a uma perfusão cerebral por meio de injeção no ventrículo esquerdo de solução de

formalina 10% (50 ml). Em seguida, os encéfalos foram retirados e fixados em formalina 10% por 2-4 dias. Cortes transversais (50 Pm de espessura) foram feitos nos pontos de injeção no NTS com auxílio de um criostato (Leica). Os cortes histológicos, montados em lâmina foram corados pelo método Giemsa. A análise microscópica da localização do sítio de injeção no NTS foi feita em microscópio óptico. Somente os ratos nos quais o local da injeção estava situado corretamente no NTS foram utilizados para a análise estatística dos dados.

6.8. Drogas e soluções utilizadas

- Solução fisiológica (NaCl 0,15 M - veículo, foi injetada nos experimentos controles); - sal hexasódio do ácido 8,8'- [Carbonilbis [imino-3,1-phenilenecarbonylimino (4-metil-3,1-phenilene)carbonilimino]] bis-1,3,5-naftaleno trisulfonic [suramin (2,0 nmol/100 nl, antagonista não-seletivo dos receptores purinérgicos P2) Tocris Bioscience, Ellisville, MO, EUA].

- ácido piridoxalfosfato-6-azofenil-2',4'-disulfônico [PPADS (2,0 nmol/100 nl, antagonista seletivo dos receptores purinérgicos P2X) Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA];

Todas as drogas foram dissolvidas em solução fisiológica (NaCl 0,15 M). As doses utilizadas de suramin e PPADS foram retiradas de dados da literatura (de Paula e cols., 2004; Menezes e cols., 2011) bem como de estudos pilotos realizados no laboratório.

7. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

7.1. Registro Basal:

Cada animal foi colocado na câmara de pletismografia e submetido aos registros de PA, FC e VE. A câmara foi ventilada com ar atmosférico. Após um período exploratório (que variou entre 30-60 minutos até que o animal ficasse calmo e a PA, FC e VE se estabilizem) a medida dos parâmetros cardiorrespiratórios basal foram efetuadas.

7.2. Protocolo 1: Participação dos receptores P2, do NTS, sobre a pressão arterial, frequência cardíaca e a ventilação em condições de normóxia (21% O2).

Após o registro basal os animais foram divididos em 2 grupos:

Grupo 1: Os animais receberam no NTS, injeções bilaterais de suramin (2 nmol/100 nl, antagonista não seletivo de receptores purinérgicos P2) ou PPADS (2 nmol/100 nl, antagonista seletivo dos receptores purinérgicos P2X). Após as injeções, a PA, FC e VE dos animais foram medidas aos 5, 10, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85, 95 e 105 minutos em condições de normóxia (21% O2).

Grupo 2: Os animais controle receberam no NTS injeções de veículo (salina) no mesmo volume utilizado para o PPADS e suramin, 100nl, e foram submetidos aos mesmos procedimentos do grupo 1.

7.3. Protocolo 2: Participação dos receptores P2, do NTS, sobre as respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia (7% O2).

Após o registro basal os animais também foram divididos em 2 grupos:

Grupo 1: Os animais receberam, no NTS, injeções bilaterais de suramin (2 nmol/100 nl) ou PPADS (2 nmol/100 nl). Após as injeções, a PA, FC e a VE dos animais foram medidas aos 5 e 10 min em normóxia e aos 15, 25, 35 e 45 min em hipóxia (7% O2). Após 30 min de hipóxia, a

câmara voltou a ser ventilada com ar atmosférico (normóxia, 21% O2) e as medidas de PA, FC e

VE foram feitas aos 55, 65, 75, 85, 95 e 105 min após as injeções.

Grupo 2: Os animais controle receberam no NTS, injeções de veículo (salina) no mesmo volume utilizado para o PPADS e suramin, 100 nl, e foram submetidos aos mesmos procedimentos do grupo 1.

7.4. Análise dos Resultados

Os dados obtidos foram apresentados como média r erro padrão da média (EPM). Testes estatísticos adequados (análise de variância de duas vias,e pós testes de Newman Keuls,) foram utilizados para as comparações entre diferentes tratamentos. Diferenças foram consideradas significantes para p < 0,05.

8. RESULTADOS:

8.1. Efeito da injeção bilateral de suramin ou salina no NTS sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e ventilação (VE) em condições de normóxia (21% O2).

As figuras 1,2,3,4,5 apresentam os valores dos parâmetros cardiorrespiratórios durante 135 min em condições de normóxia (21% O2), antes (-30 e -15 min) e após (5, 10, 15, 25, 35, 45,

55, 65, 75, 85, 95, 105 min) a injeção bilateral de salina (círculos pretos) ou suramin (círculos vermelhos, 2 nmol/100 nl, antagonista não-seletivo de receptores purinérgicos P2) no NTS.

A figura 1 apresenta os valores de PAM, onde, podemos observar que a injeção bilateral de salina ou suramin no NTS não promoveram alterações significativas sobre a PAM em condições de normóxia.

A figura 2 apresenta os valores de FC , onde, podemos observar que a injeção bilateral de salina no NTS não promoveu alterações significativas sobre a FC, porém a injeção bilateral de suramin no NTS promoveu uma bradicardia somente no momento da injeção (tempo 0) quando comparado com o valor basal (tempo – 15 min) ( 324 ± 26 bpm vs, basal 389 ± 15 bpm ).

A figura 3, 4 e 5 apresentam os valores de volume corrente (VC), freqüência respiratória (FR) e ventilação (VE), respectivamente, onde, podemos observar que a injeção bilateral de salina ou suramin no NTS não promoveram alterações significativas sobre o VC, FR e VE em condições de normóxia. Porém, a injeção bilateral de suramin no NTS promoveu um aumento na FR ( 104 ± 4 com vs.salina 89 ± 4cpm) e VE ( 457 ± 27 ml/min/kg vs. salina 359 ± 32 ml/min/kg) aos 10 min após a injeção de suramin no NTS quando comparado com a injeção de salina também injetada no NTS.

Tempo (min) -30 -15 0 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 PA M (mm H g) 60 80 100 120 140 salina, n=8 suramin (2 nmol/100 nl), n=8 suramin ou salina

Figura 1: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a pressão arterial média (PAM). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n= número de animais.

Tempo (min) -30 -15 0 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 FC (bpm ) 200 250 300 350 400 450 500 salina, n=8 suramin (2 nmol/100 nl), n=8 suramin ou salina #

Figura 2: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a freqüência cardíaca (FC). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n= número de animais. # diferença significativa (p<0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e o momento da injeção de suramin (tempo 0).

Tempo (min) -30 -15 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 VC (ml/kg) 0 2 4 6 8 salina, n=8 suramin (2 nmol/100 nl), n=8 suramin ou salina

Figura 3: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre o volume corrente (VC). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ±EPM, n= número de animais.

Tempo (min) -30 -15 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 FR (cpm ) 20 40 60 80 100 120

140 salina, n=8 _{suramin (2 nmol/100 nl), n=8}

*

suramin ou salina

Figura 4: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a frequência respiratória (FR). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n= número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e suramin injetados no NTS.

Tempo (min)

*

Figura 5: Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de normóxia (21% O2) sobre a ventilação (VE). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n= número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e suramin injetados no NTS.

8.2. Efeito da injeção bilateral de suramin ou salina no NTS sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e ventilação (VE) em condições de hipóxia (7% O2). As figuras 6, 7, 8, 9, 10 apresentam os valores dos parâmetros cardiorrespiratórios durante 135 min em condições de hipóxia (7% O2), antes (-30 e -15 min) e após (5, 10, 15, 25,

35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105 min) a injeção bilateral de salina (círculos pretos) ou suramin (círculos vermelhos, 2 nmol/100 nl, antagonista não-seletivo de receptores purinérgicos P2) no NTS.. A câmara foi ventilada com mistura hipóxia por 30 min (tempos 15, 25, 35 e 45 min).

A figura 6 apresenta os valores de PAM , onde, podemos observar que a hipóxia causou uma hipotensãoem comparação com o basal (tempo -15) nos tempos 35min (91 ± 6 mmHg vs. basal 108 ± 4 mmHg) e 45 min ( 88 ± 5 mmHg vs. basal 108 ± 4 mmHg )tanto no grupo que ±recebeu injeção bilateral de salina, como no grupo que recebeu injeção bilateral de suramin no NTS e não houve diferença entre os tratamentos.

A figura 7 apresenta os valores de FC, onde, podemos observar que a hipóxia promoveu uma taquicardia no grupo que recebeu injeção bilateral de salina no NTS quando comparado com o basal (tempo -15 min)( 399 ± 24 bpm vs. basal 378 ± 18 bpm ), porém no grupo que recebeu suramin esta taquicardia não foi observada, provavelmente devido a bradicardia observada no momento da injeção bilateral de suramin no NTS.

A figura 8 apresenta os valores de VC, onde, podemos observar que a hipóxia causou um aumento do volume corrente quando comparado com o valor basal (tempo -15 min) ( 7,4 ± 0,4 (ml/Kg).FC vs. basal 4,68 ± 0,3 (ml/Kg). FC) e que a injeção bilateral de suramin no NTS causou uma redução deste aumento do volume corrente aos 15 min quando comparado com a injeção bilateral de salina no NTS (5,8 ± 0,3 (ml/Kg).FC vs. salina 7,4 ± 0,4 (ml/Kg). FC). .

A figura 9 apresenta os valores de FR, onde, podemos observar que a hipóxia causou um aumento da frequência respiratória (taquipnéia) quando comparado com o valor basal (tempo -15 min) ( 123 ± 7 cpm vs. basal 92 ± 1 com) e a injeção bilateral de suramin no NTS não alterou esta taquipnéia quando comparado com a injeção bilateral de salina no NTS.

A figura 10 apresenta os valores de VE, onde, podemos observar que a hipóxia causou um aumento da ventilação (hiperventilação, devido ao aumento do volume corrente e aumento da frequência respiratória) quando comparado com o valor basal (tempo -15 min)( 907 ± 84 ml/min/kg vs. basal 428 ± 33 ml/min/kg) e que a injeção bilateral de suramin no NTS causou uma redução desta hiperventilação aos 15 min quando comparado com a injeção bilateral de salina no NTS (505 ± 208 ml/min/kg, vs. salina: 1508 ± 376 ml/min/kg, p<0,05).

Tempo (min)

#

_#

7% de O2

Figura 6 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a pressão arterial média (PAM). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 35 e 45 min após a injeção de suramin.

Tempo (min) -30 -15 0 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 FC (b pm ) 200 250 300 350 400 450

500 salina, n=6 _{suramin (2 nmol/100 nl), n=9}

suramin ou salina #

*

*

*

Figura 7 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência cardíaca (FC). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e suramin injetados no NTS. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 0, 5, 25, 35, 45 e 55 min após a injeção de suramin ou salina no NTS.

Tempo (min)

*

7% O2

#

_#

#

_#

Figura 8 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre o volume corrente (VC). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. * diferença significativa (p< 0,05) entre os tratamentos com salina e suramin injetados no NTS. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 15, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina.

Tempo (min) -30 -15 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 FR (cpm) 40 60 80 100 120 140 160 salina, n=6 suramin(2 nmol/100 nl), n=9 suarmin ou salina * 7% O2 # # # # # #

Figura 9 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência respiratória (FR). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 15, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina ou suramin.

Tempo (min) -30 -15 5 1015 25 35 45 55 65 75 85 95 105 VE (ml/min.kg) 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 salina, n=6 suramin (2 nmol/100 nl), n=9 suramin ou salina

*

Figura 10 : Efeito da injeção bilateral de suramin (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a ventilação (VE). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e suramin injetados no NTS. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 15, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina ou suramin.

8.3. Efeito da injeção bilateral de PPADS ou salina no NTS sobre a pressão arterial média (PAM), frequência cardíaca (FC) e ventilação (VE) em condições de hipóxia (7% O2). A figura 11, 12, 13, 14 e 15 apresentam os valores dos parâmetros cardiorrespiratórios durante 135 min em condições de hipóxia (7% O2), antes (-30 e -15 min) e após (5, 10, 15, 25,

35, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105 min) a injeção bilateral de salina (círculos pretos) ou PPADS (círculos vermelhos, 2 nmol/100 nl, antagonista seletivo de receptores purinérgicos P2X) no NTS em condições de hipóxia (7% O2). A câmara foi ventilada com mistura hipóxia por 30 min

(tempos 15, 25, 35 e 45 min).

A figura 11 apresenta os valores de PAM , onde, podemos observar que a hipóxia causou uma hipotensão tanto no grupo que recebeu injeção bilateral de salina,( 91,5 ± 2 mmHg vs. basal 112,7 ± 7 mmHg ) como no grupo que recebeu injeção bilateral de suramin ( 102 ± 9 mmHg vs. basal 125 ± 3 mmHg) no NTS e não houve diferença entre os tratamentos.

A figura 12 apresenta os valores de FC, onde, podemos observar que a injeção bilateral de PPADS no NTS causou uma bradicardia ( 229 ± 38 bpm vs. basal 424 ± 22 bpm) no momento da injeção, quando comparado com o grupo que recebeu salina.

A figura 13, 14 e 15 apresentam os valores de VC, fR e VE, respectivamente,onde, podemos observar que a hipóxia causou um aumento do VC, fR e VE quando comparados com o valor basal (tempo -15 min) ( VC 8,53 ± 0,8 ml/Kg.FC vs. basal 4,96 ± 0,7 ml/kg.FC, fR 105 ± 6 cpm vs. basal 80 ± 2 cpm, VE 891 ± 86 ml/min/kg vs. basal 396 ± 54 ml/min/kg ) e a injeção bilateral de PPADS no NTS não alterou os aumentos do VC. Porém a injeção bilateral de PPADS no NTS causou um aumento da frequência respiratória (FR) aos 10 minutos ( 93 ± 3 cpm vs. salina 82 ±1 com) e 95 minutos( 89 ± 3 com vs. salina 79 ± 1 com) após a injeção quando comparado com a injeção bilateral de salina no NTS. Além disso, a injeção bilateral de PPADS

no NTS promoveu um aumento na ventilação (VE) aos 75 minutos ( 638 ± 43 ml/min/kg vs. salina 461 ± 44 ml/min/kg) após a injeção quando comparado com a injeção bilateral de salina no NTS.

Tempo (min) -30 -15 0 5 10 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105

PA

M

(m

m

H

g)

Figura 11 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a pressão arterial média (PAM). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 0, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina e PPADS.

Tempo (min) -30 -15 0 5 10 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 FC ( b pm) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 salina, n=4 PPADS (2 nmol/100 nl), n=7 7% de O2 #

*

*

Figura 12 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência cardíaca (FC). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e PPADS injetados no NTS. . # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e o tempo 0 min após a injeção de salina e PPADS.

Tempo(min) -30 -15 5 10 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105

VC (m

l/

K

g

)

16 salina, n=4 _{PPADS (2 nmol/100 nl), n= 7}

# # _# #

#

7% de O2

salina ou PPADS

Figura 13 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre o volume corrente (VC). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 15, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina ou PPADS.

7% de O2 Tempo (min) -30 -15 5 10 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 FR (cpm) 0 50 100 150 200 salina, n=4 PPADS (2 nmol/100 nl), n=7 # # # #

*

*

Figura 14 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a frequência respiratória (FR). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e PPADS injetados no NTS. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 15, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina ou PPADS.

7% de O2 * # # # # # # # # Tempo(min) -30 -15 5 10 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 VE (m l/m in.kg) 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 salina, n=4 PPADS (2 nmol/100 nl), n=7

*

Figura 15 : Efeito da injeção bilateral de PPADS (2 nmol/100 nl) ou salina no NTS de ratos não anestesiados em condições de hipóxia (7% O2) sobre a ventilação (VE). A seta indica o momento da injeção (tempo 0). Os resultados são expressos pela média ± EPM, n = número de animais. * diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com salina e PPADS injetados no NTS. # diferença significativa (p < 0,05) entre o valor basal (tempo -15 min) e os tempos 15, 25, 35 e 45 min após a injeção de salina ou PPADS

9. HISTOLOGIA

Figura 16: Fotomicrografia de uma secção transversal do tronco encefálico de um rato representativo dos grupos, mostrando os locais de injeção no NTS (setas). CC = canal central, AP = área postrema.

AP

1

1

.

.

0

0

m

m

m

m

C

C

C

C

10. DISCUSSÃO

Os resultados mostraram que a injeção bilateral de suramin (antagonista de receptores purinérgicos P2) no NTS reduziu significativamente a hiperventilação induzida por hipóxia, pela redução do volume corrente, sem promover alterações na taquipnéia induzida por hipóxia, bem como não alterou a PAM e FC, sugerindo que os receptores purinérgicos P2 do NTS facilitam a hiperventilação hipóxica atuando sobre o volume corrente, porém não estão envolvidos nas respostas cardiovasculares induzidas por hipóxia. Os resultados também mostraram que a injeção bilateral de suramin no NTS não alterou a VE, PAM e FC em condições de normóxia, sugerindo que os receptores purinérgicos P2 presentes no NTS não possuem um efeito tônico nas vias neurais de controle cardiorrespiratório. Além disso, os resultados também mostraram que a injeção bilateral de PPADS (antagonista seletivo de receptores purinérgicos P2X) não promoveu alterações significativas em nenhum dos parâmetros cardiorrespiratórios estudados, sugerindo que os receptores P2X não participam das respostas cardiorrespiratórias induzidas por hipóxia.

A hipóxia desencadeia uma série de respostas compensatórias à queda na PaO2, incluindo aumento imediato da ventilação pulmonar ou hiperventilação (West, 1985.). Esta hiperventilação é conseqüência da ativação dos quimiorreceptores periféricos localizados nos corpos carotídeos e aórticos e o processamento desta informação ocorre no tronco encefálico (Taylor e cols., 1999). Estudo de Finley e Katz, 1992, demonstraram que o NTS comissural (ou caudal) é densamente inervado pelas fibras nervosas aferentes vindas dos corpos carotídeos, sugerindo que o NTS caudal é a primeira estação sináptica dos quimiorreceptores periféricos. Além disso, estudos da literatura mostraram a ativação dos neurônios do NTS durante hipóxia e durante a ativação dos quimiorreceptores periféricos (Erickson e Millhorn, 1991, Berqim e cols,2000, Cruz e cols.,

2010). Estudo de Erickson e Millhorn, 1991 mostraram que a estimulação elétrica direta das fibras nervosas dos corpos carotídeos, bem como a estimulação do quimiorreflexo por hipóxia 10% promoveu um aumento na expressão de c-Fos em áreas do tronco encefálico especialmente o NTS (Erickson e Millhorn, 1991). Ainda nesse sentido, Berqim e cols em 2000, mostraram que a exposição a hipóxia 11% aumenta a expressão de c-Fos no NTS e em neurônios parapiramidais da superfície ventral do bulbo. Porém, a exposição a hipercapnia 5% leva um aumento da expressão de c-Fos apenas nos neurônios próximos da superfície ventral do bulbo. Além disso, ambos os estímulos (hipóxia e hipercapnia) promovem um aumento da expressão de c-Fos em áreas hipotalâmicas como núcleo paraventricular do hipotálamo e o núcleo supraóptico, mostrando que as vias neurais do quimiorreflexo não estão restritas às áreas do tronco encefálico e ponte, sendo estas áreas os principais centros de integração do quimiorreflexo periférico com o sistema nervoso central. Ainda neste contexto, Cruz e cols (2010), usando injeções intravenosas de KCN (cianeto de potássio) para ativação do quimiorreflexo periférico, mostraram um aumento na expressão da proteína c-Fos nos neurônios do NTS caudal de ratos, sugerindo a ativação deste subnúcleo do NTS após a estimulação do quimiorreflexo periférico com KCN.

Entretanto o neurotransmissor liberado no NTS em condições de hipóxia ainda não está esclarecido e o ATP poderia ser um possível candidato. A primeira evidência de que o ATP poderia estar envolvido no controle neural da ventilação foi demonstrado por Gourine e cols., 2005. Neste estudo, os autores mostraram que o ATP liberado na coluna respiratória ventral bulbar estava envolvido com a manutenção da atividade respiratória em condições de hipóxia. Ainda neste contexto, Zoccal e cols., 2011, mostraram que durante a hipóxia intermitente ocorre um aumento da sinalização purinérgica no bulbo ventrolateral, sugerindo que este nucleosídeo desempenha um importante papel no controle neural da respiração e da atividade simpática.

Reforçando essa idéia, Zhang e cols., 2012 mostraram que a injeção de ATP na região rostroventrolateral do bulbo (RVLM) promove um aumento na resposta ventilatória induzida por hipóxia aguda 10%, ocasionada pelo aumento da frequência de descargas do nervo frênico, e a injeção de PPADS no RVLM atenua esta resposta. Além disso, este mesmo estudo ainda mostrou um aumento na expressão dos receptores P2X2 no RVLM dos ratos expostos á hipóxia, sugerindo

que o ATP atuando em receptores P2X medeiam a neurotransmissão na coluna respiratória ventral e que este nucleosídeo pode contribuir para o controle da resposta ventilatória induzida por hipóxia.

Assim, os presentes resultados indicam que os receptores P2, mas não os P2X, do NTS contribuem para a hiperventilação induzida por hipóxia, porém não estão envolvidos nas respostas cardiovasculares induzidas por hipóxia. Desta forma, podemos sugerir que os efeitos dos receptores P2 do NTS sobre o controle da ventilação são independentes das respostas cardiovasculares induzidas por hipóxia. Também podemos sugerir um possível envolvimento dos receptores P2Y do NTS no controle da hiperventilação hipóxica, porém mais estudos serão necessários para comprovar esta participação.

11. CONCLUSÃO:

Os presentes resultados sugerem que os receptores purinérgicos P2 no NTS estão envolvidos na hiperventilação induzida por hipóxia atuando sobre o volume corrente, indicando que a ativação dos receptores purinégicos P2 no NTS facilita a hiperventilação induzida por hipóxia. Porém, os resultados mostram que provavelmente os receptores purinérgicos P2X não participam da resposta hiperventilatória induzida por hipóxia, sendo provável a participação de outros receptores dessa classe, como por exemplo, receptores purinérgicos P2Y.

12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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