Desenvolvimento de imunoensaios e biossensores para determinação de LDL eletrone...

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A – Para expansão dos hibridomas

Meio de cultura (solução-estoque)

Meio RPMI - Roswell Park Memorial Institute (Gibco, Invitrogen)

10,4 g

NaHCO3 2 g

HEPES 4,68 g

Antibiótico/antimicótico (Gibco -100x) 10 mL

H2O 1000 mL

Ajustar o pH para 7,4. Filtrar o meio em 0,22 µm no fluxo e depois acrescentar o antibiótico/antimicótico. Armazenar de 2ºC a 8ºC.

Meio de cultura para uso

Meio de cultura (solução-estoque) 90 mL Soro fetal bovino (Gibco) 10 mL L-glutamina (Gibco - 100x) 0,5 mL Armazenar de 2ºC a 8ºC por no máximo 1 semana.

B - Para eletroforese em gel de poliacrilamida

30% acrilamida / 0,8% bisacrilamida (Solução A)

Acrilamida 30 g

N,N-metileno-bisacrilamida 0,8 g

H2O 100 mL

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Tris-HCl 1,5M, pH 8,8 / SDS (Solução B)

Tris(hidroximetil)aminometano 18,17 g

SDS 20% 2 mL

H2O 100 mL

Adicionar 50 mL de água ao trizma e ajustar o pH para 8,8. Acrescentar o SDS, completar o volume e filtrar a solução em 0,45 µm. Armazenar de 2ºC a 8ºC.

Tris-HCl 0,5M, pH 6,8 / SDS (Solução C)

Tris(hidroximetil)aminometano 6,06 g

SDS 20% 2 mL

H2O destilada 100 mL

Adicionar 50 mL de água ao trizma e ajustar o pH para 6,8. Acrescentar o SDS, completar o volume e filtrar a solução. Armazenar de 2ºC a 8ºC.

Cálculo para concentração em % do gel de separação

Solução A x / 3 mL Solução B 2,5 mL

H2O destilada (7,5 - x / 3) mL

Persulfato de amônia 10% 50 µL

TEMED 5 µL (10 µL se x menor que 8) Onde x é a porcentagem de poliacrilamida

Persulfato de amônio 10% e TEMED devem ser colocados por último.

Gel de empilhamento

H2O destilada 6,1 mL

Solução A 1,3 mL Solução C 2,52 mL Persulfato de amônia 10% 50 µL

TEMED 10 µL

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Tampão de corrida 4X

Tris(hidroximetil)aminometano 12 g

Glicina 57 g

SDS 4 g

H2O q.s.p. 1000 mL

Ajustar o pH para 8,8. Diluir 1:4 para uso.

Tampão de amostra 5X

Tris 1M pH 6,8 3,1 mL Glicerol 5,0 mL Azul de bromofenol 1% 0,5 mL H2O destilada 1,4 mL

Adicionar 10% de ß-mercaptoetanol no momento do uso. Em condição desnaturante adicionar 1 mL de SDS 2%.

C – Para corar géis de eletroforese

Corante para gel de poliacrilamida com Comassie Blue

Metanol 30%

Ácido acético 10% Comassie Blue G-250 0,5%

H2O 59,5%

Deixar o gel 20 minutos submerso, sob homogeneização.

Descorante para gel corado com Comassie Blue

Metanol 30%

Ácido acético 10%

H2O 60%

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Coloração para gel de poliacrilamida por nitrato de prata

1ª solução:

40 mL de metanol 9,6 mL de ácido acético 30,4 mL de água destilada

40 µL de formol (colocar só na hora do uso) tempo: 10 minutos ou overnight

lavar 3x com água destilada

2ª solução:

100 mL de etanol

100 mL de água destilada

dividir está solução em 3, para lavar 3 x de 10 minutos cada lavar 3x com água destilada

3ª solução:

100 mL de água destilada 0,03g de tissulfito de sódio tempo: 10 minutos

4ª solução:

0,2 g de nitrato de prata (AgNO3 – colocar só na hora do uso) 70 µL de formol (colocar só na hora do uso)

tempo: 10 minutos

5ª solução:

6 g de carbonato de sódio (NO2CO3)

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tempo: revelação, assim que aparecerem as bandas, lavar o gel 3x com água destilada

6ª solução:

40 mL de metanol 9,6 mL de ácido acético 30,4 mL de água destilada tempo: 5 minutos

Esta solução serve para bloquear a reação

7ª solução:

50 mL de metanol

tempo: 5 minutos para fixar e corar

Colocar água destilada e agitar para reidratar o gel por 5 a 10 minutos

Corante para gel de agarose

Ácido acético 5% Corante negro de amido 0,1%

Corar o gel por aproximadamente 10 minutos e descorar com ácido acético 5% até visualização das bandas.

D - Para Western Blot

Tampão de transferência

Tris 3 g

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Corante para membrana de nitrocelulose

Ponceau S 0,5 g Ácido acético 0,1 mL

H2O 100 mL

E – Para purificação de LDL(-) e LDL(n)

Solução antioxidante e inibidora de proteases

BHT 44,06 mg

PMSF 1,742 g

Benzamidina 3,132 g Aprotinina 20 mg Metanol 50 mL Armazenar a -20ºC protegida da luz.

Salinas para ultracentrifugação das lipoproteínas

Densidade NaCl 1,006 11,45 g/L 1,020 31,56 g/L 1,065 101,83 g/L

1,216 75,82 g de NaBr (ou KBr) em q.s.p. 250 mL de salina de densidade 1,006

Ajustar o pH para 7,4

F – Para determinação de proteínas pelo método de Lowry

Tartarato alcalino

Na2CO3 20 g

tartarato de Na e K 1 g NaOH 0,1N 4 g

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Sulfato de Cobre

CuSO4. 5H2O 5 g

H2O 1000 mL

Solução de uso: 1 parte de CuSO4+ 9 partes de tartarato alcalino (1:10)

Procedimento:

500 µL da solução de uso 25 µL de SDS a 4% 10 µL da amostra

Homogeneizar e deixar em repouso por 15 minutos

Adicionar 100 µL de Folin-Ciocalteau (diluído em água destilada 1:3), homogeneizar suavemente e deixar em repouso por 30 minutos, protegido da luz. Leitura em espectrofotômetro a 620 nm.

G – Para ELISA

PBS 10x

NaCl 81,82 g

KCl 1,89 g

KH2PO4 1,91g

Na2HPO4 . 12 H2O 28,62 g

H2O q.s.p. 1000 mL

PBS tween 0,05%

PBS 1x 1000 mL

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PBS tween 0,01%, leite 2%

PBS 1x 100 mL

Tween 20 0,01 mL Leite desnatado 2 g

Aquecer até 100°C, esfriar e filtrar em gaze 11 fio s.

PBS tween 0,01%, leite 5%

PBS 1x 100 mL

Tween 20 0,01 mL Leite desnatado 5 g

Aquecer até 100°C, esfriar e filtrar em gaze 11 fio s

Tampão carbonato-bicarbonato

Na2CO3 0,795 g

NaHCO3 1,465 g

H2O 500 mL

Tampão citrato-fosfato

Na2HPO4 . 12H2O 3,68 g

Ácido cítrico 1,16 g

H2O 200 mL

Solução para OPD

Tampão citrato-fosfato 5 mL H2O2 30% 5 µL

OPD 5 mg

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Solução de parada para OPD (H2SO4 2 M)

H2SO4 53,3 mL

H2O 446,7 mL

Solução de parada para TMB (H2SO4 0,5 M)

Solução de parada para OPD 125 mL

H2O 375 mL

H – Para clonagem molecular, expressão e purificação da proteína

recombinante

Meio LB (Luria-Bertani)

NaCl 10 g

Triptona/peptona 10 g Extrato de levedura 5 g H2O q.s.p. 1000 mL

Ajustar o pH para 7,0 e autoclavar.

LB ágar

Meio LB 300 mL ágar 4,5 g Autoclavar

TFB (Transformation buffer)

KCl 0,745 g

CaCl2 . 2H2O 0,730 g

Glicerol 10 g Acetato de potássio 0,098 g

H2O 100 mL

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Tampão para lise bacteriana

NaH2PO4 2,4 g

NaCl 11,69 g

H2O q.s.p. 1000 mL

Ajustar o pH para 7,4 e no momento do uso adicionar 1 mM PMSF, 5 mM EDTA e 150 µg/mL lisozima.

Tampão para solubilização de corpos de inclusão

NaH2PO4 0,24 g

NaCl 1,17 g

Uréia 42,04 g Imidazol 0,2 g H2O q.s.p. 100 mL