ENVOLVIMENTO DO INTESTINO MÉDIO NA IMUNIDADE DE Litopenaeus vannamei EM RESPOSTA AO WSSV E AO
SISTEMA DE CULTIVO
Tese submetida como requisito final para a obtenção do grau de Doutor em Aquicultura pela Universidade Federal de Santa Catarina. Orientador: Profa. Dra. Luciane M. Perazzolo
Coorientador: Prof. Dr. Rafael D. da Rosa
Florianópolis 2019
Este trabalho é dedicado a todos os grandes professores/mestres com quem convivi durante minha formação acadêmica. Sou grata e honrada pelos professores que tive.
Primeiramente gostaria de agradecer aos meus orientadores, Luciane e Rafael, por terem aberto as portas do laboratório para mim. Obrigada por todos os ensinamentos dentro e fora do laboratório, por terem me ajudado a me tornar uma profissional melhor e uma pessoa melhor. Tenho orgulho de dizer que fui aluna de vocês.
Assim como a dedicatória desse trabalho, agradeço muito a todos os professores que passaram pela minha vida acadêmica nesses 13 anos de UFSC. Tive muita sorte de ter tido a oportunidade de aprender com vocês. Em especial, gostaria de agradecer aos membros da banca pela disponibilidade em avaliar o trabalho. Vocês foram escolhidos com muito cuidado por serem profissionais por quem tenho grande admiração! Obrigada professores Patrícia, “Mano”, Walter, Maggioni, Guilherme e Priscila!
À “famiLIAA", hoje representada pelos meus queridos amigos Cairé, Gabriel, Natan, Nicolas, Flávio, Talita, Luiz, Gustavo, Léo e Breno. Obrigada por tornarem os dias mais alegres, divertidos, por terem me ensinado tanto sobre convivência e trabalho em grupo, e até mesmo a gostar de novos estilos musicais!
Aos “ICs” que me acompanharam, e com quem pude treinar um pouco a difícil missão de “ensinar”, Lara, Marco e Iago.
Aos queridos “amigos para a vida” que o laboratório me presenteou, Grazi, Jaque e Fábio.
Aos pacientes e competentes bioinformatas que me auxiliaram na execução de trabalho, Priscila e André. Obrigada por terem me apresentado a esse novo mundo e me ensinado tanto esses anos!
À minha turma amada sempre presente 062, sem dúvida a mais legal de todas!
Aos meus amigos de Minas por também estarem sempre presente no meu dia a dia, mesmo com muitos km nos separando!
À pós-graduação em Aquicultura, às agências financiadoras CAPES e CNPq, por me fornecerem todas as condições necessárias para realização desse trabalho.
À minha família, em especial a minha mãe, por ser um exemplo de mulher guerreira para mim, e ter me ensinado a não desistir daquilo que mais procuro.
E ao meu melhor amigo, namorado, noivo, por toda compreensão e companheirismo nesses quase 12 anos juntos! Obrigada por sempre ser meu porto seguro!
“Por vezes, o que fazemos parece ser uma gota d’água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota.” (Madre Tereza de Calcutá)
“Continue a nadar! Continue a nadar!” (Procurando Nemo, 2003)
O uso de medidas profiláticas visando a contenção de doenças e a busca por ferramentas biotecnológicas que aumentem a resistência e a imunocompetência dos peneídeos nos cultivos são fundamentais para a sustentabilidade da carcinicultura. Nesse contexto, o presente estudo inicialmente avaliou o potencial efeito imunoestimulante de uma dieta suplementada com Arthrospira platensis para camarões Litopenaeus vannamei (cap. 2). A dieta promoveu uma alteração na expressão de genes relacionados ao sistema imune e na concentração de bactérias totais no intestino médio do camarão, bem como uma maior sobrevivência frente ao WSSV. Para analisar o efeito de diferentes sistemas de cultivo sobre a imunidade intestinal do camarão, o perfil de expressão de diversos genes relacionados com defesa foi analisado no intestino médio de camarões cultivados em bioflocos (BFT) e em água verde (cap. 3). Dos 30 genes analisados, a expressão de 25 genes foi maior em animais cultivados em BFT, sendo apenas um gene (LvDcr1) mais expresso nos animais criados em água verde. Com base nesses resultados, decidiu-se avaliar mais detalhadamente o efeito do cultivo de camarões em BFT sobre a microbiota intestinal e a expressão de genes no intestino médio. Dessa forma, amostras de intestino médio foram coletadas de camarões cultivados por 4 meses em BFT (B) e em água clara (controle, C), e após desafiados oralmente com o WSSV (BW e CW). O sequenciamento do gene 16S rRNA dessas amostras revelou que animais BFT apresentaram um bacterioma mais rico e diverso que os animais cultivados em C (cap. 4). O desafio oral com WSSV aparentemente provocou uma distribuição mais homogênea da composição das populações bacterianas, independentemente do cultivo. E, finalmente, nas mesmas amostras utilizadas para avaliação do bacterioma, avaliou-se o perfil dos transcritos expressos no intestino médio desses animais utilizando a técnica de RNA-Seq (cap. 5). Foram obtidos 46.301 contigs, correspondentes a 26.023 clusters gênicos. Destes, 1.182 clusters foram diferencialmente expressos entre os grupos B e C, dos quais 725 foram mais expressos em B e 457 nos animais controle. O desafio com WSSV alterou a expressão de 39 clusters gênicos, sendo 10 mais expressos em BW e 29 em CW. Esses achados em conjunto fornecem importantes informações sobre a relação microbiota-patógeno-hospedeiro, servindo de base para estudos futuros visando o controle de enfermidades virais na carcinicultura.
Palavras-chave: Aquicultura; Camarão; Sistema Imune; Vírus da Síndrome da Mancha Branca; Bioflocos.
The use of prophylactic measures addressing disease contention and the biotechnological tools to enhance shrimp resistance and immunocompetence are of great importance in promoting shrimp aquaculture sustainability. In order to explore that issue, we initially evaluated the immunomodulatory potential of a diet enriched with Arthrospira platensis on shrimp Litopenaeus vannamei (cap.2). The supplemented diet promoted alteration in the expression of immune-related genes and in total bacteria abundance in the midgut of shrimp. Additionally, the survival of WSSV challenged shrimp was higher in supplemented shrimp. To gain insight into the impact of environmental rearing conditions on shrimp intestinal immunity, we assessed the expression profile of key genes associated with immune defenses in the midgut of shrimp reared in biofloc system (BFT) and green-water system (cap.3). From the 30 analyzed genes, the expression of 25 were higher in the midgut of shrimp reared in BFT than in animals cultured in green water. Only one gene (LvDcr1) was more expressed in shrimp from green water. With these results in hand, we decided to evaluate in detail the BFT-rearing effect on shrimp midgut microbiota and on the intestinal gene expression profile. Concerning that, midgut samples were collected from shrimp reared for four months in BFT (B) and clear seawater (control system, C), and orally challenged with WSSV (B.W e C.W). The 16S rRNA gene sequencing revealed that the BFT-reared shrimp possessed a more abundant and diverse bacteriome than shrimp cultured in C (cap.4). The WSSV oral challenge led to a more homogeneous distribution of bacterial population composition in shrimp midguts, regardless of the culture system. Finally, we evaluated the transcripts profile from these midgut samples by using RNA-Seq technique (cap.5). We obtained 46,301 contigs, corresponding to 26,023 clusters. From these, 1,182 clusters were differentially expressed between B and C animals, with 725 more expressed in B and 457 more expressed in C. The WSSV challenge altered the expression of 39 clusters, including 10 genes more expressed in B.W and 29 in C.W. These findings can provide relevant information regarding the microbiota-pathogen-host interaction, assisting the viral disease control in shrimp farming.
Keywords: Aquaculture; Shrimp; Imune System; White Spot Syndrome Virus; Biofloc.
Figure 1. (A) Details of the experimental design. Two experimental groups were set up, and shrimp were fed with a control (CF) or an Arthrospira platensis supplemented feed (SF) for 40 days. For immune parameters measurements and gene expression analysis, 36 animals of each group were sampled after 20 days of food supplementation. The remaining animals (36 animals per condition) were experimentally infected with WSSV and mortalities were monitored daily for 20 days. Each experimental group was fed with its respective diet (SF or CS) during all experimentation period (40 days). (B) Kaplan-Meier survival curves of shrimp after WSSV infection. (C) Comparison of four standardized shrimp immune parameters between the experimental groups: total hemocyte counts (THC), total protein concentration (PC), phenoloxidase activity (POA) and serum agglutination titer (AGT). Results are presented as the mean ± standard deviation, and asterisks indicate statistical differences (*) (Mann-Whitney t-test, P < 0.05). ... 53 Figure 2. Relative expression profile of 12 immune-related genes in circulating hemocytes (white bars) and midgut (black bars) of shrimp after 20 days of food supplementation. Results are presented as the mean ± standard deviation, and asterisks (*) indicate statistical differences (cutoff of 1.5-fold change in expression level; Student’s t-test, P < 0.05). SF: Arthrospira platensis supplemented feed. CF: control feed. ... 55 Figure 3. Absolute quantification of total bacteria in the midgut of shrimp fed supplemented diet in comparison to control animals. Results are presented as the number of 16S rRNA gene copies per ng of total DNA (gDNA). The absolute quantification was assessed by qPCR using a standard curve derived from a 10-fold dilution series of a plasmid containing the DNA target sequence. Differences are indicated by asterisks (*) (Student's t-test, P < 0.05). SF: Arthrospira platensis supplemented feed. CF: control feed. ... 56 Figura 4. (A) Heat map apresentando o perfil de expressão de 30 genes imunológicos (Tabela S1) no intestino médio de Litopenaeus vannamei cultivados em dois sistemas contrastantes: GWS (green-water system, sistema em água verde) e BFT (biofloc technology, tecnologia em bioflocos). O nível de expressão relativa dos genes
clara). Cada célula no gráfico corresponde ao nível de expressão de um dado gene em uma réplica biológica de uma condição experimental, e a intensidade da cor (de azul a vermelho) indica a magnitude da expressão, baseada na escala de cor presente na parte superior direita do gráfico. (B) Diferenças nos níveis dos transcritos dos genes que apresentaram expressão significativamente diferente (>2-fold-change; teste t de Student não pareado, P<0,05) entre os grupos BFT e GWS. Os valores estão expressos em diferença de expressão (fold-change, BFT/GWS). ... 73 Figura 5. Quantificação absoluta das bactérias totais no intestino médio de camarões cultivados em GWS (sistema de água verde) e BFT (sistema de bioflocos). A quantificação absoluta foi realizada através de qPCR utilizando uma curva padrão derivada de uma diluição seriada de plasmídeos contendo a sequência do DNA alvo. Os valores estão expressão numa escala de log10 cópias do gene bacteriano para o RNA ribossomal 16S por ng de gDNA. ... 75 Figura 6. Gel de eletroforese representativo (1,5%) corado com brometo de etídeo mostrando a detecção molecular do WSSV por Nested-PCR (primeira etapa = 1447 pb; segunda etapa = 941 pb) e de IMNV por RT-PCR (993 pb). A amplificação do gene da β-actina (LvActin) foi utilizado como controle interno (846 pb). BFT: sistema de bioflocos - biofloc technology, GWS: sistema de água verde - green-water system, CWS: sistem de água clara - clear seawater system, C-: controle negativo, C+: controle positivo. ... 76 Figure 7. Post-larvae stage 5 (PL5 = five-day-old) from lineage HB12 of Litopenaeus vannamei were cultivated during four months in two culture systems: Biofloc Technology (BFT) (4 tanks) and clear seawater system (CWS) (4 tanks), at an initial stocking density of 300 and 20 PL5.m-3, respectively. WSSV-free juvenile shrimp (5-8 g) from each condition (n=80) were individually challenged with WSSV by the oral route (5×106 genome viral copies). The remaining animals (n=40/ condition) were not handled. At 48 hours post-challenge (hpc), midguts from unchallenged (BFT and CWS) and WSSV-challenged (BFT.W and CWS.W) shrimp (n=40/ condition) were collected and processed for 16S RNA gene sequencing. ... 88
dissimilarities between bacterial communities present in the midgut of Litopenaeus vannamei reared in two different rearing systems (BFT: biofloc; CWS: clear seawater) and after an oral challenge by the White spot syndrome virus (BFT.W: shrimp reared in BFT and challenged by the WSSV; CWS.W: shrimp reared in CWS and challenged by the WSSV). ... 94 Figure 9. Venn diagram showing unique and shared operational taxonomic units (OTUs) of midgut bacteria of Litopenaeus vannamei reared in biofloc (BFT) and clear seawater (CWS) and challenged by the WSSV (BFT.W and CWS.W), by using a per os method. ... 97 Figure 10. Relative abundance of the most prevalent bacterial phyla and families identified in the midgut of Litopenaeus vannamei (highlighted in red in the not-to-scale image) reared in biofloc (BFT) and clear seawater (CWS), and at 48 hours after an oral challenge by the White spot syndrome virus (BFT.W and CWS.W). ... 99 Figura 11. Efeito do cultivo e do desafio com o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV) sobre o transcritoma do intestino médio de juvenis Litopenaeus vannamei. Escalonamento multidimensional não-métrico (NMDS) indicando os níveis de expressão de 26.023 clusters gênicos identificados pelo Corset no intestino médio de L. vannamei cultivados em bioflocos (B) e em água clara (C) e desafiados com o WSSV (BW e CW). Cada ponto representa uma duplicata de um pool de 20 intestinos médios de camarões para cada grupo experimental. . 126 Figura 12. Gráfico de dispersão (MA plot) representando todos os clusters gênicos (26.023) identificados no intestino médio de L. vannamei. (a) clusters gênicos diferencialmente expressos nos camarões cultivados em bioflocos (B) em relação aos camarões cultivados em água clara (C) (1.182 no total). (b) clusters gênicos diferencialmente expressos nos camarões cultivados em bioflocos e desafiados com WSSV (BW) em relação aos camarões cultivados em água clara e desafiados com WSSV (CW) (39 no total) (fold-change calculado entre B/C e BW/CW). Pontos em vermelho indicam maior expressão dos animais do grupo B em relação ao grupo C e de animais BW em relação aos CW. Pontos azuis indicam uma menor expressão entre a relação destes mesmos grupos (p < 0,05 e FDR < 5%). Os
indicam o intervalo de fold-change igual a 2 (positivo e negativo). ... 128 Figura 13. Anotação funcional e classificação das sequências do transcritoma do intestino médio de L. vannamei cultivados em bioflocos e água clara e desafiados oralmente com WSSV. Distribuição funcional de anotação seguindo terminologia de categorias definidas pelo Gene Ontology: Componentes Celulares, Processos Biológicos e Funções Moleculares. ... 131 Figura 14. Anotação funcional e classificação das sequências diferencialmente expressas entre (a) camarões L. vannamei cultivados em bioflocos e água clara e (b) animais cultivados nos dois tipos de cultivo e desafiados oralmente com o WSSV do transcritoma do intestino médio de L. vannamei cultivados em bioflocos e água clara e desafiados oralmente com WSSV. Distribuição funcional de anotação seguindo a terminologia de categorias definidas pelo Gene Ontology. ... 134
Table 1. Physicochemical parameters of the BFT water after four months of Litopenaeus vannamei rearing ... 92 Table 2. Overview of 16S-based Illumina Hi-Seq 2500 sequencing of Litopenaeus vannamei midgut reared in bioflocs (BFT) and clear seawater (CWS) and challenged with WSSV (BFT.W and CWS.W) ... 93 Table 3. Bacterial communities’ diversity and richness in the midgut of Litopenaeus vannamei reared in Biofloc technology (BFT) or clear seawater system (CWS) and after a viral challenge ... 95 Tabela 4. Visão geral do sequenciamento e métricas de qualidade do transcritoma do intestino médio de camarões L. vannamei cultivados em bioflocos e água clara e desafiados ou não com o WSSV. ... 125 Tabela 5. Principais genes com anotação para o banco de proteínas de L. vannamei, com expressão diferencial identificada pelo RNA-Seq no intestino médio de camarões cultivados em bioflocos (B) e em água clara (C). ... 129 Tabela 6. Resposta transcricional no intestino médio de L. vannamei associada às condições de cultivo [bioflocos (B) e água clara (C)] e ao desafio com o WSSV (BW e CW). A diferença de expressão gênica relativa (RT-qPCR) entre os grupos B/C e BW/CW está apresentada em valores de fold-change (cut-off de 2). A ocorrência dos contigs (RNA-Seq) correspondentes aos genes avaliados por RT-qPCR está indicada na tabela. As ocorrências em negrito indicam genes que apresentaram diferença de expressão na análise por RNA-Seq. Valores em vermelho indicam a expressão gênica estatisticamente superior e em azul, expressão gênica estatisticamente inferior entre os grupos B/C e BW/CW (* P<0,05; ** P<0.01), avaliados por RT-qPCR. ... 135
BFT – biofloc technology, tecnologia de bioflocos dsRNA – double stranded RNA, RNA de dupla fita
IMNV – infectious myonecrosis virus, vírus da mionecrose infecciosa GO – Gene Ontology
MAMPs – microbe-associated molecular patterns, padrões moleculares associados à microrganismos
mRNA – messenger RNA, RNA mensageiro
OTUs – operational taxonomic units, unidades operacionais taxonômicas pb – pares de base
PL – pós-larvas
PRPs – proteínas de reconhecimento padrão RNAi – Sistema de RNA de interferência
RNA-Seq – RNA Sequencing, Sequenciamento de RNA
RT-qPCR – reverse transcription quantitative polymerase chain reaction, reação em cadeia da polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa
siRNAs – small interference RNA, pequeno RNA de interferência WSSV – white spot syndrome virus, vírus da síndrome da mancha branca
mL – mililitro µL – microlitro g – grama mg – miligrama µg – micrograma t – toneladas μM – micromolar h – hora(s) min – minuto(s) s – segundo(s)
°C - graus Celsius < - maior
> - menor % - porcentagem α - letra grega alfa β - letra grega beta Δ - letra grega delta μ - micro
CAPÍTULO 1:INTRODUÇÃO GERAL ... 29 1.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE O SISTEMA IMUNE DOS CRUSTÁCEOS ... 32 1.2 SISTEMA IMUNE E MICROBIOTA INTESTINAL EM CRUSTÁCEOS ... 35
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE O USO DO
SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO EM ESTUDOS SOBRE A IMUNIDADE DE CAMARÕES ... 37 1.4 OBJETIVOS ... 41 1.4.1 Objetivo geral ... 41 1.4.2 Objetivos específicos ... 41 1.5 ESTRUTURA DA TESE ... 43 CAPÍTULO 2:ARTIGO CIENTÍFICO 1 ... 45 Potential immunomodulatory and protective effects of the Arthrospira-based dietary supplement on shrimp intestinal immune defenses ... 46 1. Introduction ... 48 2. Material and Methods ... 49 2.1 Animals, experimental design and WSSV infection ... 49 2.2 Assessment of shrimp immune parameters ... 50 2.3 Quantitative gene expression analysis ... 51 2.4 Total bacterial quantification ... 51 3. Results and Discussion ... 52 References ... 58 CAPÍTULO 3:ARTIGO CIENTÍFICO 2 ... 63 Condições ambientais de cultivo são decisivas para alterações no padrão de expressão de genes imunológicos no intestino médio de camarões... 64 1. Introdução ... 67 2. Material e Métodos ... 68 2.1. Camarões e condições de cultivo ... 68 2.2. Diagnóstico molecular para WSSV e IMNV ... 69 2.3. PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) ... 69 2.4. Quantificação bacteriana por PCR quantitativa em tempo real (qPCR)... 63 3. Resultados e Discussão ... 71
CAPÍTULO 4:ARTIGO CIENTÍFICO 3 ... 83 Exploring the impact of the biofloc rearing system and an oral WSSV challenge on the intestinal bacteriome of Litopenaeus vannamei ... 84 1. Introduction ... 86 2. Materials and methods ... 87 2.1 Animals and experimental design ... 87 2.2 WSSV per os challenge and midgut collection ... 89 2.3 Genomic DNA (gDNA) extraction ... 89 2.4 16S rRNA gene library preparation and high throughput sequencing ... 90 2.5 Sequence data analysis ... 90 3. Results and Discussion ... 91 3.1 Overview of the Illumina sequencing, diversity, and richness of bacteria ... 91 3.2 Influence of rearing conditions on the bacterial communities of shrimp midgut ... 98 3.3 Shrimp intestinal microbiota plasticity in response to a viral challenge……. ... 102 4. Conclusion ... 105 References ... 107 CAPÍTULO 5:ARTIGO CIENTÍFICO 4 ... 115 Perfil do transcritoma do intestino médio de Litopenaeus vannamei cultivados em bioflocos e desafiados oralmente com o vírus da síndrome da mancha branca ... 116 1. Introdução ... 118 2. Materiais e Métodos ... 120 2.1 Animais e Desenho Experimental ... 120 2.2 Desafio per os com WSSV e coleta dos intestinos médios ... 120 2.3 Extração de RNA e sequenciamento do transcritoma (RNA-Seq)... ... 121 2.4 Montagem de novo e análise de dados ... 122 2.5 Análise dos genes diferencialmente expressos ... 122 2.6 Expressão relativa de genes relacionados ao sistema imune .... 123 3. Resultados ... 124
3.2 Expressão diferencial de genes e anotação dos contigs ... 125 3.3 Análise da expressão de genes relacionados ao sistema imune por RT-qPCR ... 134 4. Discussão ... 137 Referências ... 145 CONCLUSÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ... 153 REFERÊNCIAS DA INTRODUÇÃO GERAL ... 155 APÊNDICES ... 163 APÊNDICE A: ... 163 ANEXOS ... 165 ANEXO 1. Folha de rosto do artigo 1, referente ao capítulo 2 da tese... ... 165 ANEXO 2. Folha de rosto do artigo 3, referente ao capítulo 4 da tese... ... 166 ANEXO 3. Artigo com co-autoria publicado durante a realização da tese. ... 167
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO GERAL
Um crescente destaque tem sido dado ao cultivo mundial de animais aquáticos, uma vez que a contribuição da pesca extrativista para o fornecimento de alimentos tem sido gradativamente reduzida (FAO, 2018; SUBASINGHE, 2014). Entre os animais aquáticos cultivados, os crustáceos contribuem com cerca de 10% (7,9 milhões de toneladas) do total produzido pela aquicultura. Devido ao seu alto valor de mercado, o cultivo de crustáceos responde por 24,6% (US$57,1 bilhões) do valor total gerado (FAO, 2018). A espécie que domina a produção de crustáceos no mundo é o camarão marinho Litopenaeus vannamei (BOONE, 1931), que em 2016 representou cerca de 53% da produção mundial de crustáceos. Essa espécie possui excelentes características zootécnicas como elevada taxa de crescimento, tolerância à alta densidade de estocagem, a salinidades extremas e a baixas temperaturas, e suportam rusticidade no manejo (FAO, 2004). Países orientais como China, Vietnã, Indonésia, Índia e Tailândia produzem cerca de 80% desse peneídeo, sendo os 20% restantes produzidos no hemisfério ocidental por países como Equador, México e Brasil (FAO, 2018). Em 2016, o Brasil produziu aproximadamente 52 mil toneladas de camarão para atender o mercado interno, sendo os estados do Ceará e Rio Grande do Norte responsáveis por 85% da produção nacional (FAO, 2018; ABCC, 2016).
Entretanto, nos últimos anos, a sustentabilidade da carcinicultura vem enfrentando desafios oriundos especialmente da ocorrência de mortalidades advindas de doenças infecciosas, ocasionando perdas econômicas de bilhões de dólares (LIGHTNER et al., 2012; THITAMADEE et al., 2016). As principais doenças acometendo os peneídeos são as viroses e as bacterioses (KIBENGE, 2019; LIGHTNER et al., 2012). O vírus da síndrome da mancha branca (White spot syndrome virus ou WSSV) é considerado o patógeno que mais devastou os cultivos de camarões em todo o mundo, sendo responsável por dizimar populações inteiras desde o seu surgimento em 1992, em Taiwan (FLEGEL, 2012; LIGHTNER et al., 2012).
O WSSV pode causar mortalidades que chegam a 100% em 3-10 dias nas fazendas de camarões (LEU et al., 2009). O WSSV é um vírus envelopado, com genoma de DNA dupla fita circular (305 kpb) que codifica para ao menos 181 proteínas, com replicação nuclear e é o único representante do gênero Whispovirus da família Nimaviridae (ESCOBEDO-BONILLA et al., 2008; LI; WENG; HE, 2019). Esse vírus é capaz de causar infecções em todos os crustáceos da ordem Decapoda, infectando células de diversos tecidos (KOU et al., 1998). Uma vez que o
WSSV também infecta as células imunocompetentes dos crustáceos (hemócitos), o sistema imunológico destes animais fica seriamente comprometido desde o início do processo infeccioso (WANG et al., 2002). No estado de Santa Catarina, o WSSV foi o principal responsável pelo quase desaparecimento da carcinicultura no estado, cuja produção de 4.189 t em 2004 caiu para irrisórias 284,2 t em 2017 (EPAGRI, 2018). Até o presente momento, a atividade não se restabeleceu no estado de SC e, desde 2005, surtos de mancha branca são também registrados na região Nordeste do Brasil, causando mortalidades e sérios prejuízos principalmente nos estados do Ceará e Rio Grande do Norte (NUNES; FEIJÓ, 2016).
Outro importante patógeno viral que acomete os cultivos de camarões brasileiros é o vírus da mionecrose infecciosa (infectious myonecrosis virus ou IMNV). A primeira ocorrência da presença do IMNV foi registrada em cultivos de L. vannamei no estado do Piauí em 2002 (NUNES; MARTINS; GESTEIRA, 2004), sendo posteriormente encontrada em cultivos de outros estados do Nordeste brasileiro e na Indonésia (SENAPIN et al., 2007). Não há registros oficiais de ocorrência de mionecrose causada pelo IMNV em outras regiões do Brasil.
O IMNV é um vírus não envelopado, com o genoma composto por uma única molécula de RNA de dupla fita (dsRNA) (7,5 kpb), pertencente à família Totiviridae (PRASAD et al., 2017). A enfermidade causada pelo IMNV caracteriza-se por ser uma necrose lenta e progressiva da musculatura estriada do abdômen, apêndices e cefalotórax, com mortalidades cumulativas de até 70 % (PRASAD et al., 2017). As perdas econômicas na carcinicultura devido a infecções por IMNV ultrapassaram a casa de US$ 1 bilhão (LIGHTNER et al., 2012).
Frente a essa realidade e dada a severidade dessas viroses, o uso de medidas profiláticas visando a contenção de doenças e a busca por ferramentas biotecnológicas que aumentem a resistência e a imunocompetência dos animais são de fundamental importância para promover a sustentabilidade da carcinicultura. Nesse sentido, formas diferenciadas de cultivo têm emergido como alternativas aos sistemas tradicionais. Como exemplo, tem-se o cultivo superintensivo utilizando bioflocos (BioFloc Technology ou BFT) que surgiu simultaneamente para camarões nos Estados Unidos e tilápias, em Israel (AVNIMELECH, 1999; TAW, 2010). Essa tecnologia se caracteriza por um cultivo em altas densidades de estocagem, porém de maneira sustentável e segura sanitariamente e na ausência ou baixa renovação de água no sistema. Em cultivos tradicionais, os resíduos gerados pelos tanques são liberados no ambiente sem um tratamento prévio, e essa prática ambientalmente
incorreta é uma das principais formas de se propagar patógenos entre as fazendas de camarões (MOSS et al., 2012).
A formação dos bioflocos acontece em função da adição de fontes de carbono, como glicose, sacarose e melaço, cuja presença visa aumentar a razão entre o carbono e o nitrogênio na água, essenciais para estimular o crescimento de bactérias heterotróficas (DO ESPÍRITO SANTO et al., 2017; EMERENCIANO; GAXIOLA; CUZON, 2013). Os bioflocos são compostos por uma complexa comunidade microbiana formada não só por bactérias, mas também por algas, fungos, protozoários, rotíferos, nematoides e outros organismos (EMERENCIANO et al., 2017). Como consequência do aumento da densidade populacional no cultivo e da redução ou inexistência de troca de água, resíduos de ração, detritos e compostos nitrogenados inorgânicos são acumulados na água dos tanques (BURFORD et al., 2003). Esses detritos são, contudo, imediatamente transformados pela comunidade bacteriana ali estabelecida, que reciclam a amônia excretada pelos animais e os resíduos orgânicos oriundos de restos de ração de ração (AVNIMELECH, 1999).
Além disso, os animais cultivados em BFT podem alimentar-se dos próprios bioflocos formados no ambiente. Os bioflocos representam uma rica fonte proteica e há relatos que em cultivos de L. vannamei, mais de 29% do consumo diário dos animais é proveniente dos bioflocos (BURFORD et al., 2004). Além do valor nutricional, a comunidade bacteriana que integra os bioflocos parece agir como um “probiótico natural” no controle de doenças, através da competição por espaço, substratos e nutrientes com bactérias potencialmente patogênicas e/ou através da síntese de compostos antibacterianos (EMERENCIANO; GAXIOLA; CUZON, 2013). Relatos recentes, têm evidenciado uma melhora na imunidade dos camarões e redução na incidência de enfermidades associadas ao cultivo em bioflocos (KIM et al., 2015; KIM et al, 2014).
Entretanto, os mecanismos que levam à melhora no status imunológico dos animais têm sido pouco investigados, principalmente no que diz respeito ao aumento da resistência às infecções virais. Em 2014, Ekasari e colaboradores demonstraram que o sistema de bioflocos possui efeitos positivos na resposta imunológica de L. vannamei, avaliada através de parâmetros imunológicos, o que resultou em uma maior resistência dos animais quando desafiados com o IMNV (EKASARI et al., 2014). Até o momento, este é o único relato demonstrando uma relação positiva entre o cultivo de camarões em sistema BFT e o combate a infecções virais.
Assim como existe uma tentativa de tornar os cultivos de camarões mais biosseguros, também existe uma preocupação em se buscar substâncias que aumentem a imunocompetência destes animais. A busca por substâncias naturais com capacidade imunoestimulantes visa principalmente, evitar o uso de compostos químicos tóxicos, como é o caso dos antibióticos. Imunoestimulantes compreendem um grupo de compostos sintéticos e biológicos que melhoram a ação ou a resposta imune inata por meio da interação e ativação de células
imunocompetentes (MAQSOOD et al., 2011; MASTAN, 2015).Alguns
dos principais compostos ativos descritos na literatura como sendo capazes de gerar uma imunoestimulação em camarões são os polissacarídeos sulfatados (PS) presentes nas algas, as β-1,3-glicanas de fungos, peptidoglicanas (PGNs) e lipopolissacarídeos (LPS) presentes em bactérias, incluindo as cianobactérias (SMITH; BROWN; HAUTON, 2003; WU et al., 2016)
1.1 CONSIDERAÇÕES SOBRE O SISTEMA IMUNE DOS CRUSTÁCEOS
A exemplo de outros invertebrados, os crustáceos são desprovidos de sistema imune adaptativo composto por células linfocíticas clonais (linfócitos T e B), anticorpos e memória imunológica a longo prazo, dependendo assim somente de uma imunidade do tipo inata (BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2014; BUCHMANN, 2014). A primeira linha de defesa desses animais é proporcionada por uma carapaça externa rígida ou exoesqueleto que funciona como uma barreira física. O trato digestório desses animais também é revestido por uma barreira quitinosa, protegendo o epitélio intestinal e por diferentes enzimas e moléculas, algumas com atividade antimicrobiana (MCGAW; CURTIS, 2013). A exceção a isso é a região medial do intestino que é revestida por uma membrana peritrófica acelular e porosa, que permite a absorção seletiva de nutrientes e é composta por fibrilas quitinosas associadas a glicoproteínas e proteoglicanas (MCGAW; CURTIS, 2013; WANG et al., 2012a). Este revestimento do intestino médio serve como uma barreira, uma vez que separa os conteúdos do lúmen intestinal do epitélio e protege o tecido da abrasão por partículas alimentares e invasão de microrganismos e parasitas (WANG et al., 2012a). Apesar da presença da membrana peritrófica quitinosa, acredita-se que o intestino médio seja uma das principais vias de entrada para os microrganismos patogênicos. Uma vez rompidas as barreiras físicas, os microrganismos alcançam a hemocele e são reconhecidos por receptores e proteínas de
reconhecimento padrão (PRRs/PRPs), que desencadeiam uma série de reações imunológicas que visam neutralizar e eliminar os agentes invasores. De maneira geral, as respostas de defesa dos camarões estão intimamente ligadas ao líquido circulante, denominado hemolinfa. A hemolinfa consiste de uma fração celular, composta pelas células imunocompetentes ou hemócitos, e de uma fração líquida constituída pelo plasma, onde estão dissolvidos os fatores humorais (BACHÈRE et al., 2004; BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2014). As respostas imunológicas celulares e humorais atuam sinergicamente no combate às infecções.
Entre os mecanismos envolvidos no reconhecimento e destruição de patógenos nos crustáceos, destacam-se: (1) reconhecimento do não-próprio por receptores/proteínas de reconhecimento-padrão (PRRs/PRPs); (2) ativação de vias de sinalização intracelular; (3) fagocitose, encapsulamento e nodulação associadas à formação de armadilhas extracelulares de ácidos nucleicos; (4) produção de moléculas microbicidas, como as espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio e os peptídeos antimicrobianos (AMPs); (5) melanização mediada pelo sistema de ativação da pró-fenoloxidase (proPO), gerando moléculas intermediárias altamente citotóxicas; (6) coagulação da hemolinfa e, (7) os sistemas antivirais mediados pela interferência por RNA (RNAi), citocinas análogas a interferons, apoptose e autofagia (BARRACCO; PERAZZOLO; ROSA, 2014; TASSANAKAJON et al., 2018).
As defesas antivirais desencadeadas pelos crustáceos têm apenas sido melhor compreendidas recentemente. O primeiro relato de defesa antiviral em camarões foi descrito por Robalino e colaboradores (ROBALINO et al., 2004, 2005) e trabalhos posteriores apontam que esses animais contam com uma defesa antiviral mediada basicamente pelos seguintes mecanismos: apoptose celular, autofagia, produção de citocinas do tipo interferon (interferon-like) e sistema RNAi.
O sistema RNAi destaca-se por sua relevância na defesa antiviral dos artrópodes, sendo ativado por RNAs dupla fita (dsRNA) produzidos pelos vírus durante a replicação no hospedeiro. Sua ação é baseada no silenciamento gênico pós-transcricional (HANNON, 2002)(HANNON, 2002; ROBALINO et al., 2007). Nesse processo, o dsRNA desencadeia a destruição do RNA mensageiro (mRNA) homólogo à sua própria sequência. O RNAi representa um mecanismo de defesa natural contra vírus e transposons, presente em plantas, fungos, animais vertebrados e invertebrados e em alguns protozoários (HANNON, 2002). Diferentemente do sistema interferon, que é induzido por qualquer
sequência de dsRNA, a proteção antiviral baseada no sistema RNAi é sequência-específica.
A ativação do RNAi inicia-se pelo processamento de precursores de dsRNA longos em dsRNAs pequenos (21-25 pb), chamados de small interference RNAs (siRNAs), pela ação de um complexo proteico citosólico contendo a enzima Dicer, que é uma endoribonuclease do tipo III que cliva especificamente dsRNA ou regiões de grampo de RNAs de fita simples (ALIYARI; DING, 2009). Considera-se que a maioria dos vírus seja capaz de produzir dsRNAs durante a sua replicação na célula hospedeira, independente do seu genoma (SON; LIANG; LIPTON, 2015). Os siRNAs resultantes são então incorporados a um complexo multiproteico de silenciamento induzido por RNA ou RISC (RNA-induced silencing complex), que conduz à degradação específica de regiões complementares à sequência do dsRNA desencadeante ou à repressão da tradução do mRNA. Em última análise, a degradação do mRNA de sequência homóloga à fita senso do dsRNA impossibilita a tradução da proteína viral correspondente, impedindo assim que componentes importantes das partículas virais sejam sintetizados e limitando a infecção viral. Desta forma, a tecnologia de RNAi vem despontando como um método promissor para o controle das infecções virais na carcinicultura e várias revisões ressaltam sua importância (BARTHOLOMAY et al., 2012; LABREUCHE; WARR, 2013).
Os primeiros estudos com RNAi demonstraram que injeções com dsRNA de sequências virais específicas resultaram em uma proteção profilática praticamente completa contra infecções pelo WSSV e vírus da síndrome de Taura (ROBALINO et al., 2005). Desde esse primeiro estudo, outros se seguiram demonstrando que a administração de dsRNA em camarões, especialmente por injeção intramuscular, pode levar a uma proteção específica contra o WSSV (GUERTLER et al., 2013; SANJUKTHA et al., 2012; THAMMASORN et al., 2015), IMNV (FEIJÓ et al., 2015) e vírus da cabeça amarela (YHV, yellow head vírus) (YODMUANG et al., 2006). Em camarões, alguns genes das principais proteínas envolvidas na via de RNAi, como a Dicer (considerada uma PRP que reconhece vírus) e a Argonauta (proteína slicer do RISC) foram clonados em P. monodon (UNAJAK; BOONSAENG; JITRAPAKDEE, 2006) e L. vannamei (CHEN et al., 2011; LABREUCHE et al., 2010; YAO et al., 2010). Uma das proteínas que interage com a Dicer, para formar o primeiro complexo do sistema RNAi, é a proteína de ligação ao RNA em resposta à indução da expressão gênica (TRBP), que possui três domínios de ligação com o dsRNA. A TRBP funciona como uma ponte entre o dsRNA e a Dicer para permitir o recrutamento da Argonauta-2.
Nos camarões M. japonicus e Fenneropenaeus chinensis, um ortólogo da TRBP foi identificado e parece estar associado à resposta antiviral frente ao WSSV (WANG et al., 2012b).
1.2 SISTEMA IMUNE E MICROBIOTA INTESTINAL EM CRUSTÁCEOS
Como mencionado anteriormente os processos imunológicos melhor caraterizados em crustáceos estão associados aos componentes da hemolinfa. Entretanto, o intestino médio é uma região altamente exposta a microrganismos e ainda pouco estudada com relação às respostas de defesa ali presentes. A habilidade da mucosa intestinal em agir na defesa do hospedeiro está associada à combinação de três fatores: manutenção da sua integridade estrutural, composição microbiana e resposta imunológica. Um estudo prévio realizado pelo nosso grupo evidenciou pela primeira vez a participação do intestino na imunidade dos camarões e na manutenção da sua saúde (SILVEIRA et al., 2018). Contudo questões sobre os mecanismos envolvidos nessa imunidade e a participação exclusiva do epitélio intestinal permanecem não elucidadas.
Além disso, o conhecimento acerca da microbiota endobionte dos camarões possui igual relevância, para se conhecer a comunidade bacteriana presente no intestino dos animais saudáveis e se há uma alteração nos camarões sob condições infecciosas. Assim como ocorre em humanos e insetos, a microbiota endobionte parece ser importante não só em processos de digestão e absorção de nutrientes, mas também na prevenção e combate a infecções. A microbiota pode desencadear uma resposta imune constitutiva no epitélio intestinal do mosquito que aumenta sua resistência a infecções (DONG; MANFREDINI; DIMOPOULOS, 2009; RODGERS et al., 2017). Além disso, bactérias intestinais específicas podem ter um impacto direto nos patógenos, alterando seu poder infeccioso (CIRIMOTICH; RAMIREZ; DIMOPOULOS, 2011; RODGERS et al., 2017).
Efetivamente, nos últimos anos muitos estudos têm sido publicados referente à caracterização da microbiota intestinal de camarões peneídeos (CARDONA et al., 2016; CHAIYAPECHARA et al., 2012; CHEN et al., 2017; CHEUNG et al., 2015; LIU et al., 2011; RUNGRASSAMEE et al., 2014), incluindo a espécie L. vannamei (JOHNSON et al., 2008; RUNGRASSAMEE et al., 2016; SHA et al., 2016; ZHANG et al., 2014). A homeostase da comunidade microbiana intestinal é alcançada por meio da integração de mecanismos complexos do hospedeiro responsáveis por eliminar microrganismos patogênicos e
tolerar microrganismos “amigáveis” (BUCHON; BRODERICK; LEMAITRE, 2013). Sabe-se que, sob situações de estresse, o equilíbrio das populações endobiontes de microrganismos pode ser rompido, abrindo uma oportunidade para que patógenos se disseminem e resulte em uma infecção. Diversos são os fatores que podem levar ao desequilíbrio da microbiota, como alterações físicas e químicas do ambiente que o hospedeiro está inserido, a presença de antibióticos, toxinas e agentes infecciosos, bem como má nutrição (APPRILL, 2017). Esses fatores podem tanto agir diretamente sobre a microbiota, favorecendo o crescimento de algumas populações microbianas e o desaparecimento de outras, ou indiretamente, afetando os processos imunológicos do hospedeiro que agem para regular a composição da microbiota.
Um exemplo da aplicabilidade de estudos sobre a interação da microbiota endobionte e o sistema imune pode ser evidenciado em estudos com o mosquito transmissor da dengue, Stegomyia aegypti. A bactéria endobionte do inseto, Wolbachia pipientis, é capaz de bloquear a transmissão do vírus da dengue no mosquito, representando uma estratégia biotecnológica para o controle dessa doença (DONG; MANFREDINI; DIMOPOULOS, 2009). Recentemente, o programa australiano “Eliminate Dengue” (http://www.eliminatedengue.com) realizou os primeiros estudos experimentais, baseado na manipulação microbiana de mosquitos possuindo uma microbiota “protetora” (YEAP et al., 2013). A aplicação desse conhecimento é considerada hoje uma das mais importantes ferramentas no combate de doenças transmitidas por invertebrados vetores (DONG; MANFREDINI; DIMOPOULOS, 2009). Um estudo que impactou o conhecimento acerca da interação entre sistema imune e microbiota em camarões foi realizado por Ponprateep e colaboradores (2012). Utilizando a técnica de RNAi, foi feito o silenciamento pós-transcricional do peptídeo antimicrobiano ALFPm3 (antilipopolysaccharide factor) em Penaeus monodon que levou a uma mortalidade de 86% dos animais em 7 dias. Essa alta mortalidade foi devido ao aumento exarcebado da comunidade bacteriana presente naturalmente na hemolinfa e no hepatopâncreas desses animais, que é normalmente controlada pelo peptídeo antimicrobiano ALF3 (PONPRATEEP et al., 2012).
Até recentemente, as principais estratégias para se identificar a composição microbiana eram baseadas na identificação microbiológica clássica, utilizando o cultivo de bactéria em meios de cultura. Porém, essa abordagem com alcance bastante limitado, apenas identifica as cepas bacterianas cultiváveis e desconsidera a grande maioria que não são
cultiváveis, e que representam mais de 80% das bactérias presentes nos ambientes (STREIT; SCHMITZ, 2004). Para superar as limitações dessa técnica, o sequenciamento de nova geração desponta como uma ferramenta acurada e potente para atingir uma cobertura mais ampla dos grupos taxonômicos bacterianos , proporcionando um levantamento rico e completo das comunidades bacterianas de um determinado ambiente, incluindo o intestino dos animais (EMERENCIANO et al., 2017; MARTÍNEZ-CÓRDOVA et al., 2017).
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE O USO DO
SEQUENCIAMENTO DE NOVA GERAÇÃO EM ESTUDOS SOBRE A IMUNIDADE DE CAMARÕES
O uso de técnicas genômicas e transcritômicas (RNA-Seq) em larga escala tem permitido a identificação de importantes imunoefetores em diferentes espécies, incluindo os camarões (ROBALINO et al., 2009). A descoberta de assinaturas moleculares associadas à resistência a infecções bacterianas têm aberto novas possiblidades para o desenvolvimento de ferramentas para o controle de enfermidades nos cultivos de camarão (DE LORGERIL et al., 2008).
Métodos baseados nas ciências “ômicas” (transcritômica, genômica, proteômica e metabolômica) estão sendo cada vez mais aplicados para auxiliar na compreensão da biologia de espécies de interesse aquícola e para desenvolvimento de ferramentas genômicas no combate a enfermidades (GUPPY et al., 2018). Transcritoma corresponde ao conjunto completo de transcritos (RNAs mensageiros, RNAs ribossomais, RNAs transportadores e os microRNAs) expressos em um dado tecido ou linhagem celular. O perfil do transcritoma pode variar segundo o estado fisiológico, estímulos físicos, químicos, biológicos ou doenças. Para estudar o transcritoma, os pesquisadores utilizam métodos de análise em grande escala, sendo o sequenciamento de nova geração (next-generation sequencing- NGS) um conjunto de métodos eficientes e capazes de gerar uma alta quantidade de informação de forma rápida e com custo relativamente baixo.
O termo RNA-seq refere-se a várias plataformas de NGS capazes de gerar o perfil completo do transcritoma em questão, sendo a Illumina uma das plataformas mais utilizadas (WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009). Nessa, inicialmente os transcritos (RNA total ou RNAs específicos) são isolados dos tecidos, fragmentados e transcritos reversamente em DNA complementares (cDNA). Os cDNA são então
ligados a adaptadores que possuem sequências complementares aos iniciadores que serão posteriormente utilizados nas reações de amplificação. Os adaptadores podem ser inseridos em um extremo do fragmento (single-end) ou nos dois extremos (paired-end). Os adaptadores aderidos à fita de cDNA ligam-se aos iniciadores fixos à placa de sequenciamento, ocorrendo a amplificação do cDNA na forma de ponte, formando os clusters clonais que são regiões na placa contendo milhares de cópias do mesmo fragmento de cDNA. A amplificação do cDNA através da reação em cadeia pela polimerase (PCR) é chamada de PCR em “fase sólida”. Após a amplificação, são adicionados deoxinucleotídeos à placa, contendo diferentes marcadores fluorescentes que podem, então, ser detectados pelo aparelho uma a uma (“base-a-base”) à medida que são incorporados na nova fita de DNA (ILLUMINA, 2017).
A primeira etapa da análise de dados do sequenciamento consiste na montagem dos fragmentos identificados, genericamente denominados de reads. No caso de haver o genoma previamente sequenciado do organismo, os reads podem ser alinhadas diretamente com as sequencias do genoma depositadas em bancos de dados. Na ausência do genoma do organismo em questão, os transcritos precisam ser remontados a partir da chamada montagem de novo, que baseia-se na redundância dos reads para criar sobreposições entre regiões idênticas e, assim, produzir as sequências consenso, conhecidas por contigs. Posteriormente, o nível de expressão dos transcritos é calculado, comparando a expressão diferencial entre as amostras de diferentes condições experimentais, por exemplo. E por último, é realizado a “anotação dos contigs montados e dos clusters gênicos diferencialmente expressos”, a partir da comparação entre as suas sequências nucleotidicas e aminoacídicas encontradas e as sequencias depositadas em banco de dados disponíveis na internet (ILLUMINA, 2017). Além disso, outros tipos de anotações podem ser realizadas, como a classificação em categorias funcionais fornecida pelo Gene Ontology Resource (http://geneontology.org). Essa ferramenta de enriquecimento das análises atribui aos genes encontrados as categorias funcionais preditas. As categorias possuem um vocabulário controlado e unificado para os termos funcionais (termos GO), agrupados em três grupos principais: processos biológicos, função molecular e componente celular (BLAKE et al., 2015).
Em resumo, a técnica de RNA-Seq destaca-se por fornecer de uma forma eficaz e quantitativa o perfil transcritômico de um organismo (tecido ou célula) submetido a condições específicas de interesse para o estudo (WANG; GERSTEIN; SNYDER, 2009). Através do
sequenciamento de todos os transcritos em condições específicas, pode-se avaliar de forma precisa os níveis de transcritos e obter uma visão geral da expressão gênica, ferramenta esta fundamental nos dias atuais para organismos de interesse comercial, como o peneídeo L. vannamei.
Dentro deste contexto, o presente estudo avaliou o efeito de diferentes condições de cultivo não só no perfil de transcritos expressos no intestino médio de L. vannamei, submetidos ou não a infecção viral, mas também a resposta da microbiota intestinal frente a essas alterações. Os potenciais marcadores moleculares aqui identificados poderão fornecer importantes informações sobre a relação microbiota-patógeno-hospedeiro, auxiliando o controle de enfermidades virais na carcinicultura.
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 Objetivo geral
Avaliar o efeito de diferentes condições de cultivo, da presença de patógenos virais no organismo e da suplementação alimentar com cianobactérias sobre o perfil transcricional de genes expressos no intestino médio de camarões Litopenaeus vannamei.
1.4.2 Objetivos específicos
(a) Determinar o efeito da suplementação alimentar da cianobactéria Arthrospira platensis sobre a imunidade (hemocitária e intestinal) e a sobrevivência de camarões desafiados com o vírus da síndrome da mancha branca (WSSV), pela via sistêmica;
(b) Avaliar a imunidade intestinal de camarões cultivados em dois sistemas comerciais de cultivo de camarão no Brasil, bioflocos e água verde;
(c) Caracterizar as populações bacterianas presentes no intestino médio dos camarões cultivados em bioflocos e desafiados oralmente com WSSV;
(d) Identificar e comparar os níveis de transcritos diferencialmente expressos no intestino médio de camarões cultivados em bioflocos e água clara (controle) e desafiados oralmente com o WSSV.
1.5 ESTRUTURA DA TESE
Essa tese foi estruturada em cinco capítulos, organizados da seguinte forma:
Capítulo 1: Introdução Geral
Capítulo 2: Artigo científico 1 intitulado “Potential immunomodulatory and protective effects of the Arthrospira-based dietary supplement on shrimp intestinal immune defenses”.
Esse artigo foi publicado no periódico Fish and Shellfish Immunology, em fevereiro de 2019.
Capítulo 3: Artigo científico 2 intitulado “Environmental rearing conditions are key determinants of changes in immune gene expression patterns in shrimp midgut”.
Esse artigo será submetido ao periódico Developmental & Comparative Immunology.
Capítulo 4: Artigo científico 3 intitulado “Exploring the impact of the biofloc rearing system and an oral WSSV challenge on the intestinal bacteriome of Litopenaeus vannamei”.
Esse artigo foi publicado no periódico Microorganisms, em agosto de 2018.
Capítulo 5: Artigo científico 4 intitulado “Perfil do transcritoma do intestino médio de Litopenaeus vannamei cultivados em bioflocos e desafiados oralmente com o vírus da síndrome da mancha branca”.
Esse artigo será submetido ao periódico Fish and Shellfish Immunology.
CAPÍTULO 2: ARTIGO CIENTÍFICO 1
Este capítulo avaliou as potenciais propriedades imunoestimulantes de uma dieta suplementada com Arthrospira platensis no camarão Litopenaeus vannamei. Após 20 dias de suplementação, foi realizada avaliação dos parâmetros imunológicos (contagem total de hemócitos, concentração de proteína total, atividade da fenoloxidase e título de aglutinação sérica), análise da expressão de genes imunológicos na hemolinfa e intestino médio, bem como quantificação das bactérias totais do intestino. A sobrevivência dos camarões desafiados com WSSV também foi avaliada.
Esse trabalho foi recentemente publicado no periódico Fish and
Shellfish Immunology em fevereiro de 2019
Potential immunomodulatory and protective effects of the Arthrospira-based dietary supplement on shrimp intestinal immune defenses
Mariana Rangel Pilottoa,1, Samuel Milaneza,1, Renato Teixeira Moreirab, Rafael Diego Rosaa, Luciane Maria Perazzoloa,∗
a Laboratory of Immunology Applied to Aquaculture, Department of Cell Biology, Embryology and Genetics, Federal University of Santa Catarina, 88040-900, Florianópolis, SC, Brazil
b Center of Biotechnology Applied to Aquaculture (CEBIAQUA), Department of Fishery Engineering, Federal University of Ceará, 60440-970, Fortaleza, CE, Brazil
∗ Corresponding author. E-mail address: l.m.perazzolo@ufsc.br (L.M. Perazzolo).
Abstract
Herein, we evaluated the immunomodulatory and the antiviral protective properties of a cyanobacteria-enriched diet on the immune responses of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei challenged with the White spot syndrome virus (WSSV). Shrimp were fed with an Arthrospira platensis supplemented feed during 20 days, and its effects were examined by evaluating well-known standardized shrimp immune parameters (total hemocyte counts, total protein concentration, phenoloxidase activity, and serum agglutination titer). Additionally, we assessed the expression of crucial genes involved in both hemolymph- and gut-based immunities related to the shrimp capacity to circumvent viral and microbial infections. Dietary supplementation improved shrimp survival rates after challenge with a median lethal dose of WSSV. From all immune parameters tested, only the serum agglutination titer was higher in treated animals. On the other hand, the expression of some representative marker genes from different immune response pathways was only modulated in the midgut and not in the circulating hemocytes, suggesting that this feed supplementation can be used as an attractive strategy to enhance immunity in shrimp gut. Altogether, our results evidence the immunomodulatory properties of A. platensis supplemented feed in shrimp humoral and intestinal defenses and highlight the potential use of cyanobacteria based immunostimulants in shrimp farming for protection against infectious diseases.
Keywords: Litopenaeus vannamei, WSSV, Spirulina, immunostimulation, immune parameters, gene expression, intestinal immunity
1. Introduction
Arthrospira (Spirulina) platensis is a blue-green cyanobacterium with high protein content and antioxidants well known for its immunostimulant properties [1]. The administration of A. platensis-based supplements promotes several health beneficial physiological effects, such as immunomodulatory, antioxidant, anticancer, antimicrobial and antiviral activities [2]. Currently, these promising immunostimulants have shown applications not only in human health, but also in both veterinary medicine and aquaculture [3]. For instance, the administration of formulated diets containing extracts of A. platensis led to an improvement of the health status of different marine species, such as fish [3], pearl oysters [4] and shrimp [5].
The use of probiotics and immunostimulants in shrimp feeding has been widely used as prophylactic and therapeutic treatments against infectious diseases. Since its first appearance in the early 1990’s, the White spot syndrome virus (WSSV) has been considered the major threat for penaeid shrimp farming worldwide [6]. To defend themselves against pathogens, shrimp rely on both cellular and humoral immune responses mediated by phagocytic immunocompetent cells named hemocytes. Shrimp hemocytes comprise a heterogeneous circulating cell population and are the main site of immune effectors production [7]. However, more attention has been recently paid to shrimp epithelial immune defenses, especially those occurring in the intestines [8–10]. Indeed, the shrimp gut is broadly considered as a route of entry for many pathogens and, like the hemocytes, all intestine portions are also important sources of immune molecules [9].
In the last years, the effectiveness of immunostimulants from different natural origins has been extensively studied in shrimp aquaculture concerning zootechnical and health performances. Surprisingly, the molecular mechanisms underlying the beneficial properties of immunostimulants as well as their modulatory effects on shrimp gut immunity are largely unknown. Here we have studied some unexplored effects of cyanobacteria-enriched feed on antiviral and intestinal immune defenses of the most important cultivated shrimp species, Litopenaeus vannamei. Our results showed for the first time that the oral administration of A. platensis-based diets promotes immunostimulation and modulates the expression of immune-related genes in the midgut that can be associated with shrimp antiviral protection against the WSSV.
2. Material and Methods
2.1 Animals, experimental design and WSSV infection Litopenaeus vannamei juveniles (12 ± 3 g) were obtained from the Laboratory of Marine Shrimp (Federal University of Santa Catarina, Brazil). Following acclimation (one week), shrimp (n=144) were randomly divided into two groups (24 animals per group in triplicates) according to the diet used: SF (Arthrospira platensis supplemented feed) and CF (control feed). The cyanobacterial dry biomass was obtained from A. platensis cells cultivated in indoor tanks (50 L), containing the modified Jourdan medium at salinity 10, following by filtration (60 μm mesh) and dehydration at 40°C for 24 h [11]. The supplemented feed (SF) was prepared by mixing a powered commercial feed (Guabi Vannamei, 35 EXT) with 0.6% of the dry biomass of A. platensis and 5% of carboxymethylcellulose (CMC) diluted in warm water (40oC). The resulting mixture was pelleted and dehydrated overnight at 45oC. This dry biomass concentration was defined based on a previous dose-response trial (0.1%, 0.3%, 0.6% and 1.2%) (data not shown). The CF was prepared following the same protocol, without the addition of the cyanobacterial biomass. Each experimental group was fed twice daily during 40 days at a rate of 3% of shrimp body weight. Uneaten food was removed by siphoning after 1 hour, dried at 40°C and weighed. To calculate the food consumption (1-, 10- and 20-day points), the mass difference between offered and uneaten food was divided by the weight in g of the live weight (6 animals per group in triplicates).
Following the 20-day feeding period, 36 animals of each experimental condition (12 shrimp per tank in triplicates) were sampled and processed for the evaluation of cellular and humoral immune parameters and gene expression analysis. Sample preparation for immune parameter measurements is described in section 2.2. For gene expression analysis, hemolymph was withdrawn into modified Alsever solution (MAS: 27 mM sodium citrate, 336 mM NaCl, 115 mM glucose, 9 mM EDTA, pH 7.0) and hemocytes were collected and pooled (3 pools of 5 animals per condition) for total RNA extraction. Midguts (3 animals per condition) were collected just after the hemolymph withdrawn and immediately processed for total RNA extraction.
The remaining animals of each experimental group (36 animals per condition) were injected with 100 µL of a WSSV inoculum containing 3×102 viral particles (median lethal dose within 15 days, LD30/15). The WSSV inoculum was prepared as previously described [12]. After the
viral challenge, shrimp were individually split within the same tanks (3 animals per tank) to avoid cannibalism. Each experimental group was fed with its respective diet (SF or CF) for more 20 days. Mortalities were monitored daily, and cumulative survival curves were created using Kaplan-Meier. Details of the experimental design are illustrated in Fig 1A.
2.2 Assessment of shrimp immune parameters
The cellular and humoral shrimp defenses were compared between the experimental groups by evaluating the following well-known standardized immune parameters: total hemocyte counts (THC), total protein concentration (PC), phenoloxidase activity (POA) and serum agglutination titer (AGT) [13,14]. For THC, samples of hemolymph (3 pools of 5 animals per condition) were collected in MAS, fixed (4 % formaldehyde) and counted using a Neubauer chamber. The other immune parameters were assessed in serum samples. For the serum preparation, hemolymph (3 pools of 5 animals per condition) was collected without MAS and left to coagulate for 24 h at 4°C. The serum was collected by repeated centrifugation (2.000 ×g for 10 min) of the resulting clot. The PC of the serum was quantified by the Pierce BCA protein assay kit (Thermo Fisher Scientific) using bovine serum albumin as a standard control. The serum was diluted 3.000× and the absorbance measured in a microplate reader at 562 nm. For the determination of the POA, diluted serum samples were incubated for 5 min with an equal volume of 1 mg/mL trypsin (Sigma) and then with an equal volume of 3 mg/mL L-DOPA. After 5-min incubation, POA was measured spectrophotometrically by recording the formation of dopachrome from L-DOPA at 490 nm. POA was expressed as enzyme unit (U) and corresponded to an increase of 0.001 in the absorbance per min and per mg of protein at 20°C. The basal POA was quantified by replacing trypsin with ultrapure water.
The agglutinating capacity of the hemolymph was determined by incubating 50 µL of serially diluted serum samples (diluted in TBS: 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 5 mM MgCl2, pH 7.4) with an equal volume of 2% suspension of dog erythrocytes (diluted in TBS) in U-shaped bottom 96-well microplates for 1.5 h at room temperature. In controls, shrimp serum was replaced by TBS. The agglutination titer (AGT) was expressed as the reciprocal of the highest serum dilution that shows a positive reaction. The AGT was converted into log2 values. All assays were performed in duplicates. For all immune parameters,
differences were considered statistically significant at P < 0.05 using Mann-Whitney t-test.
2.3 Quantitative gene expression analysis
Total RNA was extracted from hemocyte and midgut samples using the TRIzol reagent (Thermo Fisher Scientific), treated with DNase I (Thermo Fisher Scientific) and precipitated with 0.3 M sodium acetate (pH 5.2) and isopropanol (1:1; v:v). RNA amount and quality were assessed by spectrophotometric analysis and the integrity of total RNA was analyzed by 0.8% agarose gel electrophoresis. First strand cDNA was synthesized from 1 µg of total RNA using RevertAid Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific) and oligo(dT)12-18 primers.
Reverse Transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) amplifications were performed in the StepOne PlusTM Real-time PCR System (Thermo Fisher Scientific) in a final volume of 15 µL containing 0.2 µM of each primer (Table S1), 7.5 µL of reaction mix (Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix 2×; Thermo Fisher Scientific) and 1 µL of cDNA. RT-qPCR assays were submitted to an initial denaturation step of 10 min at 95°C followed by 40 cycles of denaturation at 95°C for 15 s and annealing/extension at 60°C for 1 min. The LvL40 (ubiquitin/ribosomal L40 fusion protein) and LvRpS3A (S3A ribosomal protein) genes were used as references for RT-qPCR data normalization using the 2-ΔΔCq method [15]. Differences in gene expression were considered statistically significant at P < 0.05 (cutoff of 1.5-fold change in expression level) using Student’s t-test.
2.4 Total bacterial quantification
For bacterial quantification, genomic DNA (gDNA) was extracted from midguts using the DNAzol reagent (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions. gDNA amount and quality were assessed spectrophotometrically and the integrity of gDNA was analyzed by 0.8% agarose gel electrophoresis. The absolute quantification of total bacteria was performed by qPCR using the universal primers 926F and 1062R [16], that target a conserved region from the bacterial 16S rRNA gene. The absolute bacterial load in shrimp midguts was calculated using a standard curve derived from a 10-fold dilution series of a plasmid containing the DNA target sequence (107 to 103 plasmids/μL; R2 = 0.994).
