UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
SIMONE DE NAZARÉ MELO RAMOS
INFLUÊNCIA DOS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) NA
FORMAÇÃO DO SABOR
INFLUENCE OF THE MICROORGANISMS INVOLVED IN THE PROCESS OF CUPUASSU FERMENTATION (Theobroma grandiflorum Schum) ON THE
FLAVOR FORMATION
CAMPINAS 2015
SIMONE DE NAZARÉ MELO RAMOS
INFLUÊNCIA DOS MICRORGANISMOS ENVOLVIDOS NO PROCESSO DE FERMENTAÇÃO DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) NA
FORMAÇÃO DO SABOR
INFLUENCE OF THE MICROORGANISMS INVOLVED IN THE PROCESS OF CUPUASSU FERMENTATION (Theobroma grandiflorum Schum) ON THE
FLAVOR FORMATION
Orientadora: Profa Dra PRISCILLA EFRAIM
Campinas – SP
2015
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos, da Universidade Estadual de Campinas, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Doutora em Tecnologia de Alimentos.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA POR SIMONE DE NAZARÉ MELO RAMOS E ORIENTADA PELA PROF(A). DR(A). PRISCILLA EFRAIM
Thesis presented to the Faculty of Food Engeneer of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor in the area of Food Technology.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2012/00296-4; CNPq, 485287/2011-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Claudia Aparecida Romano - CRB 8/5816
Ramos, Simone de Nazaré Melo Ramos, 1968-
R147i Influência dos microrganismos envolvidos no processo de fermentação de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) na formação do sabor / Simone de Nazaré Melo Ramos. – Campinas, SP : [s.n.], 2015.
Orientador: Priscilla Efraim.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos.
1. Cupuaçu. 2. Polpa de frutas. 3. Fermentação. 4. Compostos orgânicos voláteis. 5. Metagenômica. I. Efraim, Priscilla. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Influence of the microorganisms involved in the process of cupuassu fermentation (Theobroma grandiflorum Schum) on the flavor formation Palavras-chave em inglês:
Cupuassu Fruit pulp Fermentation
Volatile organics compounds Metagenomic
Área de concentração: Tecnologia de Alimentos Titulação: Doutora em Tecnologia de Alimentos Banca examinadora:
Priscilla Efraim [Orientador] Eliete da Silva Bispo
Jorge Herman Behrens
Maristela da Silva do Nascimento Suzana Caetano da Silva Lannes Data de defesa: 18-12-2015
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Priscilla Efraim DTA/FEA/ UNICAMP (orientadora)
Profa. Dra. Eliete da Silva Bispo Universidade Federal da Bahia (titular)
Prof. Dr. Jorge Herman Behrens DEPAN/FEA/UNICAMP
(titular)
Profa. Dra. Maristela Silva Nascimento DTA/FEA/ UNICAMP
(titular)
Profa. Dra. Suzana Caetano da Silva Lannes Faculdade de Ciências Farmacêuticas / USP (titular)
Dra. Aparecida das Graças Claret de Souza Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (suplente)
Dra. Marcela Mendes Salazar
Instituto Senai de Inovação em Biomassa (suplente)
Profa. Dra. Nathalia Cristina Cirone Silva DCA/FEA/UNICAMP
(suplente)
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Cupuaçu És soberano Do pomolário
Americano Num cofre pardo Guardas com ciúmes
Raros sabores Vivos perfumes Urna selvagem, Ubre silvestre, Moreno seio, Tanta delícia Tua curva crosta
Retém no meio
DEDICATÓRIA
Com muito amor e carinho:
A Deus,
Aos meus pais Marlene e Osmar,
Minha irmã Marcia
Ao meu sobrinho Francisco
Ao filho do coração Cassiano
Dedico
AGRADECIMENTOS
Ao meu querido Deus, por ter colocado essa nobre etapa na minha vida. Aos meus pais, Marlene e Osmar, que me forneceram instrumentos e ensinamentos para minha caminhada.
À minha irmã, Marcia, pelo apoio, incentivo, compreensão e, principalmente, por ter me dado o Francisco como sobrinho, que adoçou vários momentos em Campinas, assim como meu filho do coração, Cassiano.
Aos meus primos Rodrigo e Junior e ao cunhado Roosevelt pelo apoio e torcida em Manaus. À minha prima Andréia, por ter me acompanhado no início do curso em Campinas.
À minha querida tia Nice in memoriam, por ter compartilhado comigo momentos de alegria e torcido por mim à distância.
À minha querida orientadora e agora amiga, Profa Dra Priscilla Efraim, por ter me aceitado como orientada, conduzindo com profissionalismo e ética um trabalho tão enriquecedor para ambas, com oportunidades de mais trabalhos futuros.
Ao estimado e muito humano Prof. Dr. Flávio Schmidt, pela oportunidade concedida.
À Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), através da Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA) e Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA) pelo privilégio de fazer parte do quadro discente de pós-graduação.
À minha querida amiga e eterna professora, Dra. Ângela Líbia Cardoso, por ter influenciado na minha decisão de cursar doutorado.
Ao casal amigo Célia Regina, pela “influencia terapêutica” e Wolfgang Bourier, pela super ajuda na Alemanha.
À D. Fátima e Sr. Alcides da CUPUAMA, pelas sementes de cupuaçu fornecidas para a realização dos trabalhos.
Ao Dr. Homero de Miranda Leão, da Secretaria Municipal de Saúde de Manaus, pelo apoio à minha participação no curso.
À Fundação de Vigilância em Saúde do Estado do Amazonas (FVS), na pessoa do Dr. Bernardino Cláudio Albuquerque e ao Laboratório Central de Saúde Pública (LACEN), representado pela Dra. Tirza Mattos, por autorizar minha liberação para participação no curso e permissão de uso das instalações e equipamentos do LACEN para realização da primeira fase dos experimentos.
Aos colegas do setor de produtos do LACEN: Dra. Rejane Ortis, Daniel, Juliana, Leonardo, Neide e D. Rai, pela super ajuda, apoio e compreensão ao nosso trabalho durante as análises em Manaus.
Às amigas Louzamira e Ângela Rocha, que de longe me deram amplo apoio no que eu precisava.
Aos alunos de graduação do Amazonas: Adriane, Kelly, Klaucio, Lawrence, Luiz, Mairlon, Natasha, Rosilene e Tatiane, pela colaboração nos ensaios realizados em Manaus.
À amiga Dra. Paula Hehl, pela força e carinho.
Aos queridos amigos de Campinas: Margarete Batistella (Meg), Jane e Bal, que me acolheram em suas casas, dividindo comigo momentos inesquecíveis.
Às amigas Diana e Kazumi, pelo super apoio, companheirismo, conselhos, dicas, cafés, batatas assadas e guaranás de desabafo (choros).
Aos amigos do DTA Lidiane, Sebastian, Tchuby, Ingrid, Mária, Ludmilla, Laura, Bruna, Miguel, Franklin, Bruno, pelos momentos saudáveis e divertidos nas horas de folga.
À querida amiga Carol Bittencourt que me “co-orientou” em vários momentos no laboratório.
À amiga Adriana pela ajuda nos experimentos realizados em Manaus e ao amigo Júlio, pelas dicas valiosas sobre cromatografia.
À querida amiga e “chefe” do laboratório de frutas, Aninha Koon, pelo imenso apoio, paciência, doçura e compreensão e a Juliana Hashimoto, pelas dicas oferecidas.
Ao Wolfgang Danzl e Alexandre Martins do Instituto Fraunhofer, pela autorização e viabilização da realização de uma parte dos experimentos no IVV em Freising – Alemanha.
Ao Prof. Dr. Gotfried Ziegleder, pela valiosa orientação na interpretação dos resultados analíticos no IVV.
Ao Christopher Schmidt e Brigitte Stumpf do IVV, pela excelente colaboração técnica e científica.
À Sra. Arali da Jaf Inox pela autorização da utilização dos equipamentos e instalações e apoio do corpo técnico da empresa, no processamento dos produtos.
Á Dra Aline Oliveira do Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) e Prof. Jorge Behrens da FEA pela colaboração na análise estatística dos resultados de sensorial.
À amiga Izabela Rocha e Juliana Glezer, pela imensa colaboração na análise sensorial dos produtos no laboratório do DTA.
Aos estagiários Rafael, Deisi, Tiago Aleluia e Carole pela colaboração no processamento das amostras e análises físico-químicas.
Ao Prof. Dr. Gonçalo Pereira por autorizar a realização de extração das amostras de DNA no Laboratório de Genômica e Expressão da Unicamp.
À amiga Dra Marcela Salazar pela orientação valiosa no laboratório de genômica, assim como análise dos resultados de sequenciamento juntamente com o doutorando Leandro Nascimento e Marcelo Carazzole.
À querida Profa. Valéria Maia e Tiago Palladino, pela excelente ajuda na análise estatística dos resultados de biologia molecular.
À FAPEAM pela concessão da bolsa. À FAPESP e CNPq pelos recursos concedidos para a realização dos trabalhos.
E a todos que indiretamente participaram deste trabalho.
RESUMO GERAL
O cupuaçu é um fruto popular de sabor exótico e agradável originário da região amazônica brasileira. Da sua polpa podem ser preparados sucos, geleias, licores, etc. Na composição da polpa e sementes estão presentes macro e micronutrientes que lhes conferem alto valor nutricional, além da presença de compostos bioativos e baixíssima concentração de cafeína e teobromina. A elevada quantidade de lipídeos nas sementes representa excelente matéria-prima para a produção de cosméticos. As sementes são fermentadas para obter produto similar ao chocolate, o cupulate, sendo antes realizado o seu despolpamento, pois a quantidade excessiva de polpa inviabiliza a fermentação. Por representar importante fonte de substratos que contribuem para a formação de precursores de sabor durante a fermentação, foram testadas três concentrações de polpa em relação à quantidade inicial aderida às sementes: 0, 7,5 e 15%, e duas formas de revolvimento para cada experimento (fixo – R1 e realizado de acordo com a temperatura – R2), totalizando 6 experimentos assim codificados: 0R1, 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 e 15R2. Foi constatado que quanto maior a concentração de polpa, mais prolongado o tempo de fermentação e mais altas as temperaturas registradas. Não houve diferença significativa entre os dois tipos de revolvimentos aplicados. Maior concentração de ácidos orgânicos foi observada nos experimentos com maior concentração de polpa (15R1 e 15R2), especialmente o ácido acético. Na prova de corte para avaliação do grau de fermentação, os experimentos 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 e 15R2 apresentaram os melhores resultados. As amêndoas foram processadas para obtenção dos cupulates e estes submetidos às seguintes avaliações sensoriais: análise descritiva quantitativa (ADQ) e Check-All-That-Apply (CATA), além do teste de aceitação. Na ADQ os experimentos 15R1 e 15R2 apresentaram as maiores médias em quase todos os atributos, embora não diferissem estatisticamente das outras amostras. No CATA os atributos amargo, terra, café, firme ao morder e sabor residual ruim foram os mais citados. No teste de aceitação as amostras 0R1 e 15R2 obtiveram os melhores resultados, e por este motivo, foram submetidas à análise de compostos voláteis através de GC-MS. Os resultados demonstraram que a amostra 15R2 contribuiu para a formação de importantes compostos de sabor, especialmente linalol e acetofenona, além de apresentar maiores concentrações de pirazinas. Na
enumeração de micro-organismos durante a fermentação (métodos culturais), os resultados demonstraram que houve desenvolvimento simultâneo de leveduras, bactérias láticas e acéticas ao longo da fermentação, com declínio de acéticas nos momentos finais. Em métodos não culturais (Metagenômica) através de sequenciamento do DNA extraído nas amostras em plataforma Illumina MiSeq, para identificação dos níveis taxonômicos de leveduras e bactérias envolvidos no processo (métodos não culturais), os resultados demonstraram haver maior diversidade bacteriana em 7.5R1, 7.5R2, 15R1 e 15R2, e maior diversidade de leveduras em 0R1 e 0R2, indicando influência negativa da polpa sobre as leveduras. Nas análises de estimativa de diversidade e riqueza (Índice de Shannon e Chao1) o domínio bactéria apresentou os maiores índices no ambiente de fermentação.
Palavras chave: cupuaçu, polpa de fruta, fermentação, compostos voláteis,
ABSTRACT
Cupuassu is a popular fruit with exotic and pleasant flavor originated from the Brazilian Amazon region. Cupuassu’s pulp can be used to prepare juices, jellies, liqueurs, etc. In the pulp and the seeds composition, macro and micronutrients give a nutritional value, and bioactive compounds and very low concentration of caffeine and theobromine. The seeds have a high amount of lipids, making them an excellent raw material for cosmetics. The seeds can be fermented to produce a product similar to chocolate, the cupulate, being depulping, as the excessive amount of pulp can derail fermentation. As the pulp represents an important source of substrates that contribute to the formation of flavor precursors during the fermentation, three concentrations of pulp were tested relative to the initial amount adhered to seeds: 0, 7.5 and 15%, and two types of turning for each experiment (fixed - R1 and performed according to the temperature - R2), totalizing 6 experiments: 0R1, 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2. It was found that the higher pulp concentrations resulted in longer fermentation times and higher registered temperatures. There was no significant difference between the two types of applied turnings. Higher concentrations of organic acids were observed in the experiments with higher pulp concentrations (15R1, and 15R2), especially acetic acid. In cut test for assessing the degree of fermentation, the experiments 0R2, 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2 showed the best results. Beans were processed in order to obtain the cupulate and the final products were submitted to sensory evaluation: Quantitative Descriptive Analysis (QDA) and Check-All-That-Apply test (CATA), and the acceptance test. In the QDA, 15R1 and 15R2 samples obtained higher scores in almost all the attributes, although they did not statistically differ from the other samples. In CATA, the attributes bitter, earth, coffee, firm to the bite and bad aftertaste were the most cited ones. In the acceptance test, the 15R2 and 0R1 samples achieved the best results, and for this reason, their volatile compounds were analyzed by GC-MS. The results showed that 15R2 sample contributed to the formation of important flavor compounds, particularly linalool and acetophenone, and have higher concentrations of pyrazines. In the microorganisms counting during fermentation (culturable methods), the results showed that there was a simultaneous growth of yeasts, lactic and acetic acid bacteria throughout the fermentation with acetic acid bacteria declining in the final
moments. In non-culturable methods (Metagenomic) by sequencing of the DNA extracted from the samples MiSeq Illumina platform, for identifying the taxonomic levels of yeasts and bacteria involved in the process (non-culturable methods), the results demonstrated a greater bacterial diversity in 7.5R1, 7.5R2, 15R1 and 15R2, and greater diversity of yeasts in 0R1 and 0R2, indicating negative influence of pulp on the yeast growth. In diversity and richness estimation analysis (Shannon and Chao1 Index), the bacteria domain had the highest rates in the fermentation room.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL ... 1
OBJETIVO GERAL... 4
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 4
CAPÍTULO 1 – CUPUAÇU: UM FRUTO POTENCIAL ... 6
RESUMO ... 6
1. INTRODUÇÃO ... 7
2. CUPUAÇU ... 9
2.1 Aspectos botânicos... 9
2.2 Distribuição geográfica, aspectos de propagação, produção e doenças do cupuaçuzeiro ... 10 3. FRUTOS ... 12
3.1 Composição física e química ... 12
4. SEMENTE ... 18 4.1 Histologia ... 18 4.2 Fermentação ... 19 4.2.1 Aspectos físico-químicos ... 19 4.2.2 Aspectos microbiológicos ... 22 4.3 Secagem ... 25 5. PROCESSAMENTO TECNOLÓGICO ... 26 5.1 Produtos de cupuaçu ... 26 6. IMPORTÂNCIA NUTRICIONAL ... 28 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 29 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 30
CAPÍTULO 2 - EVOLUTION OF THE FERMENTATION OF CUPUASSU SEEDS (Theobroma grandiflorum Schum): PHYSICAL AND CHEMICAL CHARACTERIZATION ………... 44 ABSTRACT ……….. 44
1. INTRODUCTION ………. 44
2. MATERIAL AND METHODS ………. 47
2.1 Preliminary fermentation test ……….. 47
2.2 Raw material ……….. 47
2.3.1 Fermentation ……….. 47
2.3.2 Drying ……….. 48
2.4 Physical and Chemical Determinations ………. 48
2.4.1 Temperature and pH of the Fermenting Mass ……….. 48
2.4.2 Moisture and Water Activity (Aw) ……… 48
2.4.3 Titratable acidity and pH of seeds during fermentation and dried beans.. 49
2.4.4 Total Nitrogen ……… 49
2.4.5 Total phenolic compounds ………. 49
2.4.6 Organic acids ………. 49
2.5 Cut test fermented and dried seeds ………... 50
2.6 Statistical analysis ………. 51
3. RESULTS AND DISCUSSION ………..………... 51
3.1 Evolution of the fermentation ……….. 51
3.1.1 Fermentation time/turning ……… 51
3.1.2 Temperature and pH of the fermenting mass ………... 51
3.2 Physical and chemical characterization of the seeds during fermentation .. 53
3.2.1 Moisture and water activity ……….. 56
3.2.2 Titratable acidity (TA) and pH of crushed seeds ………. 56
3.2.3 Organic acids ………. 57
3.2.4 Total nitrogen ………. 57
3.2.5 Total phenolic compounds ……….. 58
3.3 Characterization of dried beans ………. 58
3.3.1 Cut test ……… 60
3.4 Correlations ……… 61
4. CONCLUSIONS ………... 64
5. REFERENCES ………... 65
CAPÍTULO 3 - CUPUASSU CANDY BAR ... 72
ABSTRACT ... 72
1. INTRODUCTION ... 73
2. MATERIAL AND METHODS ... 75
2.1 Fermentation ... 75
2.3 Processing ... 76
2.4 Sensory Analysis ... 77
2.4.1 Quantitative Descriptive Analysis (QDA)... 77
2.4.2 Affective test... 79
2.4.3 Statistical Analysis ... 80
3. RESULTS AND DISCUSSION ... 80
3.1. Quantitative Descriptive Analysis (QDA) ... 80
3.1.1 Sensory profile of cupulates samples ... 80
3.2 Affective test ………... 85
3.3 CATA (Check All That Apply ... 87
4. CONCLUSION ………... 92
5. REFERENCES………...……….. 93
CAPÍTULO 4 - PULP CONCENTRATION INFLUENCES ON THE FORMATION OF VOLATILE COMPOUNDS ON CUPUASSU SEEDS (Theobroma grandiflorum Schum) ……… 99
ABSTRACT ……….. 99
1. INTRODUCTION ………. 100
2. MATERIAL AND METHODS ………. 103
2.1 Cupuassu Seeds Fermentation ……….………. 103
2.2 Drying ……….. 103
2.3 Obtaining processing for nibs and cupulates …….………. 104
2.4 Analysis of volatile compounds …….……… 104
2.4.1 Sample preparation and fractioned steam distillation ……… 104
2.4.2 Extraction and flavor analysis ………. 105
2.5 Identification and quantification of volatile compounds ……… 106
2.6 Principal component analysis of GC-MS peak areas ………. 107
3. RESULTS AND DISCUSSION ………. 107
3.1 Identification of volatile compounds during fermentation ……….…. 107
3.2 Major volatile compounds identified in dried beans, nibs and cupulates .. 113
3.2.1 Dried beans ……….……….. 116
3.2.2 Nibs ……….. 117
3.2.3 Cupulates ……….. 118
5. REFERENCES ……… 121
CAPÍTULO 5 - PLANT AND METAGENOMIC DNA EXTRACTION OF MUCILAGINOUS SEEDS ……….. 129 ABSTRACT ……….. 129 BACKGROUND INFORMATION ……….. 131 METHOD DETAILS ………. 132 Preparation of material ……… 132
Maceration and fat removal ……… 132
DNA extraction ………. 132
Purification ……… 133
DNA yields, quality and PCR conditions ……….. 133
ADDITIONAL INFORMATION ………... 135
REFERENCES ……….... 136
CAPÍTULO 6 - A POLPA INFLUENCIA NA DIVERSIDADE MICROBIANA EM FERMENTAÇÃO DE SEMENTES DE CUPUAÇU (Theobroma grandiflorum Schum) ... 139 RESUMO ... 139
1. INTRODUÇÃO ... 140
2. MATERIAL E MÉTODOS ... 145
2.1 Fermentação das sementes de cupuaçu ... 145
2.2 Coleta das amostras ... 145
2.3 Análises microbiológicas ... 145
2.4 Análise estatística ... 146
2.5 Sequenciamento (16S e ITS4) ... 147
2.5.1 Extração de DNA ... 147
2.5.2 Sequenciamento ... 147
2.6 Análise das sequencias do DNA 16S ... 147
2.7 Análise das sequências do DNA ITS4 ... 147
2.8 Análise estatística de diversidade ... 148
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 148
3.1 Análises microbiológicas ... 148
3.1.1 Leveduras ... 150
3.1.2 Bactérias acéticas (AAB) ... 151
3.1.4 Esporos de bactérias mesófilas aeróbias (EBM) e esporos de bactérias termófilas aeróbias (EBT) ...
154
3.2 Sequenciamento ... 156
3.2.1 Análise geral das sequencias do DNA 16S e ITS4 ... 156
3.3 Análise de rarefação para estimativa de riqueza das populações de bactérias ... 157 3.4 Composição do perfil taxonômico das comunidades de leveduras e bactérias identificadas ... 163 4. CONCLUSÃO ... 176 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 177 DISCUSSÃO GERAL ... 187 CONCLUSÃO GERAL ... 209 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 210
INTRODUÇÃO GERAL
O cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) é uma das frutas nativas mais populares da região amazônica, com grande aceitação pelo seu sabor e aroma agradáveis. Além disso, é um fruto que apresenta alto rendimento, já que a polpa pode ser utilizada para o preparo de diversos produtos, tais como doces, compotas, geléias, bombons; a placenta no preparo de adubo; a casca como embalagem artesanal; e as sementes para a produção de cupulate, produto similar ao chocolate (Venturieri, 1993; Nazaré, Barbosa & Viegas, 1990; Gondim, Thomazini, Cavalcante & Souza, 2001).
Apesar de o cupuaçu ser abundante na região amazônica, na maioria dos casos ocorre perda dos frutos devido a diversos fatores, entre os quais, a ausência de boas práticas agrícolas, que dificulta a obtenção de frutos sadios. O plantio adensado e desordenado, além das formas inadequadas de controle de pragas, coleta de frutos, condições de armazenamento e transporte, são outras questões recorrentes. A inexistência de agroindústrias em quantidade suficiente para beneficiamento agrava o problema de escoamento da produção na região (Souza, 2007).
Assim como ocorre com o cacau (Theobroma cacao L.), e dada a relativa similaridade química e estrutural entre os frutos (Mattietto, 2001), é na etapa de fermentação que ocorre principalmente a formação de compostos precursores de sabor. O processo inicia no momento em que é feita a abertura dos frutos (Schwan & Wheals, 2004). Sabe-se que o controle do processo natural de fermentação tanto do cacau quanto do cupuaçu é complexo e é nesta etapa que o sabor desejável começa a ser formado.
Apesar dos principais compostos envolvidos na fermentação de cacau já terem sido identificados, os processos químicos e bioquímicos que levam ao sabor e percepção da qualidade do chocolate ainda não estão bem esclarecidos (Afoakwa, Paterson, Fowler, & Ryan, 2008). Quanto à fermentação do cupuaçu as informações são ainda mais escassas.
Cabe destacar que, apesar de apresentar similaridades em relação ao cacau, as sementes de cupuaçu possuem teor de polpa consideravelmente maior,
sendo inviável a fermentação sem um despolpamento prévio das sementes. Esta prática pode levar a profundas alterações da diversidade microbiana envolvida, e a formação dos compostos precursores de sabor. Em fermentação de cacau foi demonstrado que um consórcio de micro-organismos está envolvido de forma um tanto quanto sincronizada na fermentação e com funções essenciais no processo (Schwan & Wheals, 2004; Camu et al., 2007; Ho, Zhao & Fleet, 2014).
Os métodos de cultivo usuais são limitados e não permitem conhecer profundamente a comunidade microbiana em amostras ambientes. Cada vez mais ferramentas moleculares são desenvolvidas e tem permitido avançar no conhecimento dos microrganismos presentes em fermentação de cacau e sua possível relação com o processo (Camu et al., 2007; Hamdouche et al., 2014; Illeghems, Weckx, & De Vuyst, 2014). Na fermentação de cupuaçu, as pesquisas para identificação de microrganismos foi feita por métodos convencionais de cultivo (Oliveira, 2001). Em cacau, nos últimos anos tem se intensificado a utilização de ferramentas moleculares para a identificação dos microrganismos. Os métodos, como a metagênomica, por exemplo, permitem conhecer populações microbianas em um dado ambiente e que não podem ser recuperadas pelos métodos de cultivo usuais (Guazzaroni, Beloqui, Golyshin, & Ferrer, 2009; Simon & Daniel, 2011). Estes métodos, também chamados de sequenciamento de nova geração, permitem obter dados de sequenciamento em larga escala a partir de diversos ambientes, com construição de bibliotecas de DNA (Simon & Daniel, 2011).
O uso das sementes de cupuaçu para produção de alimentos ainda é incipiente, e a otimização das etapas de processamento permitiria a obtenção de produto com melhor qualidade reduzindo o seu descarte. O cupuaçu é um fruto com potencial, visto que alguns estudos demonstram uma aceitação satisfatória do produto final (cupulate) em análises sensoriais (Nazaré et al., 1990; Cohen et al., 2004; Lopes et al., 2008).
O cupuaçu é um fruto com aroma intenso, tendo sido identificados diversos compostos voláteis na polpa (Quijano & Pino, 2007). Estudos apontam uma composição química no cupuaçu diversa da de cacau (Mattietto, 2001; Kuskoski, Asuero, Morales & Fett, 2006), que pode conferir ao produto final sabor diferenciado e característico. Em cacau, alguns compostos voláteis migram da polpa para o
interior da semente durante a fermentação, reagindo quimicamente com as enzimas presentes para formar importantes compostos de sabor (Kadow, Bohlmann, Phillips, & Lieberei, 2013).
Assim, o aprofundamento dos estudos sobre a etapa de fermentação, assim como a influência forma de revolvimento, para a obtenção de produtos de boa qualidade sensorial é extremamente relevante para entender a dinâmica bioquímica que ocorre no processo. Neste sentido, a identificação e função dos microrganismos presentes na fermentação, bem como dos compostos orgânicos formados e outras mudanças que ocorrem são uma contribuição para favorecer o aproveitamento desta parte do fruto, que apresenta elevado valor nutricional e grande potencial para ser usado como matéria-prima de um produto alimentício promissor.
OBJETIVO GERAL
Avaliar a influência da polpa sobre os microrganismos na fermentação de sementes de cupuaçu (Theobroma grandiflorum Schum) e na formação do sabor, em função de diferentes condições de fermentação utilizadas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar, através de ensaios físico-químicos, a influência de diferentes teores de polpa e formas de revolvimento sobre os microrganismos durante a fermentação;
Identificar, através de sequenciamento de larga escala, os microrganismos presentes durante a fermentação;
Estimar a riqueza microbiana envolvida na fermentação de sementes de cupuaçu e a influência da polpa sobre a mesma;
Caracterizar sensorialmente os cupulates e identificar os compostos orgânicos voláteis nas amostras com melhor aceitação.
CAPÍTULO 1: CUPUAÇU: UM FRUTO POTENCIAL
Simone de Nazaré Melo Ramos, Aparecida das Graças Claret de Souza, Priscilla Efraim
_________________________________________________________________
CAPÍTULO 1
CUPUAÇU: UM FRUTO POTENCIAL
Simone de Nazaré Melo Ramosa, Aparecida das Graças Claret de Souzab, Priscilla Efraima*
a
Departamento de Tecnologia de Alimentos, FEA, UNICAMP. Rua Monteiro Lobato, 80. Cidade Universitária Zeferino Vaz. Campinas-SP. Brasil. CEP 13.083-862
b
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA Amazônia Ocidental. Rodovia AM 010 Km 29. Manaus-AM. Brasil. CEP 69010-970.
*
Autor correspondente: Tel.+55 19 3521-3998. E-mail: efraim@fea.unicamp.br
RESUMO
O cupuaçu é um fruto nativo da região amazônica, do mesmo gênero do cacau, popular pelo sabor característico e agradável da polpa, principal parte de interesse comercial, utilizada para o preparo de sucos, geleias, licores, doces, etc. A semente e a polpa apresentam em sua composição macro e micronutrientes que lhes conferem alto valor nutricional. Apesar disso, as sementes ainda são negligenciadas como matéria-prima, sendo, na maioria das vezes, consideradas resíduos. Pelo elevado teor de lipídiosque possuem, representam para a indústria de cosméticos, excelente matéria-prima na elaboração de produtos de beleza que requerem estabilidade e funcionalidade, sendo possível obter também, através da sua fermentação, produto análogo ao chocolate, o cupulate. Após o processamento, as amêndoas sofrem transformação conferindo ao cupulate características sensoriais apreciáveis. Estudos realizados têm comprovado que os compostos químicos identificados na polpa influenciam também no sabor final. Além disso, a baixíssima concentração de cafeína e teobromina representa uma boa alternativa para pessoas com intolerância às xantinas a presença de compostos bioativos. Neste trabalho, são apresentadas evidências de que o cupuaçu é um fruto com alto potencial de aproveitamento industrial, com promissoras chances de se tornar, assim como o cacau, um fruto com ampla aceitação global.
Palavras-chave: cupuaçu, sementes, manteiga de cupuaçu, nutrientes, compostos
1. INTRODUÇÃO
O cupuaçu é um fruto muito apreciado pelo sabor exótico, principalmente da polpa, a parte mais utilizada para o preparo de sucos, doces, entre outros produtos. A descoberta e aceitação do fruto pelo mercado externo tem se expandido, sobretudo, pelas características sensoriais que apresenta (Venturieri, 2011).
O nome cupuaçu é derivado da língua Tupi, e significa kupu: similar ao cacau e açu: grande (Santos, 2003). Também é conhecido por nomes vernaculares como “copoasu, cupuaçuzeiro, cupuarana, cupu-assu, copoaçú, cupu do mato, pupú, pupuaçú” e na língua inglesa como “Brazilian cocoa, copoasu, cupuassu, large-flowered coca” (Lim, 2012). Devido ao forte valor social e econômico que representa para o País, em 2008 foi sancionada uma lei designando o cupuaçu como fruta nacional brasileira (Sousa, 2011). No Brasil, a espécie pré-colombiana de cupuaçu provavelmente foi disseminada a partir da região pré-amazônica, no Maranhão, para outros estados da região norte através da intensa migração dos povos indígenas (Cuatrecasas, 1964; Alves, 2002).
Apesar de ser um fruto com grande potencial, o cupuaçu ainda é negligenciado por diversos fatores, entre os quais culturais, regionais, econômicos e sazonais. Embora as pesquisas sobre o aproveitamento de partes do fruto estejam em ascensão, para a população da região produtora o fruto representa uma oportunidade comercialmente atraente pela possibilidade de obtenção de vários produtos. Na Figura 1 está uma representação esquemática de produtos que podem ser obtidos a partir do fruto(Venturieri, 1993; Gondim et al., 2001).
Figura 1. Fluxograma dos produtos obtidos a partir do cupuaçu (Adaptado de Venturieri, 1993)
A sazonalidade do fruto e a escassez de empresas de beneficiamento e estocagem são também fatores limitantes. Além disso, a produção do cupuaçu ainda está muito voltada à agricultura familiar com dificuldade no escoamento da produção na região amazônica levando à perda total da safra em alguns casos (Scudeller & Santos-Silva, 2009). Segundo Xavier et al. (2009) citado por Jorge (2011), a perda pós-colheita se situa entre 15 a 50% quando comparada à média brasileira para frutos tropicais.
Apesar de a região amazônica ser a principal produtora de cupuaçu, o destino da maior parte dos frutos ainda está restrito à própria região (Souza, 2007). A oferta irregular de cupuaçu devido a uma série de fatores e a necessidade de atender às exigências previstas na legislação sanitária de outros países tem sido impedimento para que o fruto entre no mercado internacional (Alves, 2002).
2. CUPUAÇU
2.1 Aspectos botânicos
O cupuaçuzeiro (Theobroma grandiflorum Schum), pertence à família Malvaceae. É uma planta que pode atingir até 15 m de altura. Segundo Venturieri (1993), os estudos mais completos da taxonomia do gênero Theobroma foram realizados por Cuatrecasas (1964), que o dividiu em 22 espécies repartidas em seis seções: Andropetalum, Glossopetalum, Oreanthes, Rhytidocarpus, Telmatocarpus e Theobroma. Destas, apenas a Andropetalum não é encontrada no Brasil. Das vinte e duas espécies existentes, apenas T. grandiflorum, o T. obovatum, T. subincanum, T. speciosum, T. sylvestre, T. microcarpum, T. glaucum, T. canumanense, T. bicolor, e T. cacao estão restritas à Bacia Amazônica.
A floração do cupuaçuzeiro ocorre durante o verão amazônico (julho-setembro) (Souza, 2007). Segundo Prance & Silva (1975) citados por Alves (2002), o pico de frutificação ocorre no 1º trimestre do ano e quando maduros, os frutos caem espontaneamente (Cohen, Luccas, Sousa, & Jackix, 2003).
O cupuaçuzeiro desenvolve bem em temperaturas relativamente elevadas, com média anual de 21,6C a 27,5 C, umidade relativa de 77% a 88% e precipitações na faixa de 1900 mm a 3100 mm (Diniz, 1984).
O fruto tem formatos variáveis, oblongo, ovalado, elíptico, obovoide ou redondo (Figura 2), diâmetro transversal de 9 cm a 15 cm, diâmetro longitudinal de 10 cm a 40 cm, peso variando de 200 g a 4000 g, com média de 1200 g, sendo 38% em média de polpa, 17% de sementes frescas, 2% de placenta e 43% de casca. A espessura da casca (epicarpo e mesocarpo) varia de 0,6 cm a 1 cm de espessura, as sementes em número de 15 a 50 são ovoides ou ovoide-elipsoides, de 2,0 cm a 3,0 cm de comprimento, 2,0 cm a 2,5 cm de largura, 1,0 cm a 1,8 cm de espessura e, peso de 4 g a 7 g. Nos frutos sem sementes o percentual de polpa é de 60% a 68%. Quando maduro, o fruto se desprende da planta, exalando cheiro agradável e característico (Souza & Sousa, 2002)
Figura 2. Formatos do fruto de cupuaçu (Adaptado de SOUZA, 1996)
2.2 Distribuição geográfica, aspectos de propagação, produção e doenças do cupuaçuzeiro
No Brasil o cupuaçu está amplamente distribuído pela Floresta Amazônica Legal Brasileira, em outros países da América do Sul (Equador, Guiana, Martinica, Costa Rica, São Tomé, Trinidad e Gana) e, de acordo com Venturieri (1993), alguns indivíduos podem ser encontrados nos Estados do Rio de Janeiro e Bahia.
A propagação do cupuaçu é feita de forma seminal ou por enxertia. Entre os tratos culturais empregados para o cultivo de cupuaçuzeiro estão: a adubação, controle de invasoras e poda fitossanitária para o controle da vassoura-de-bruxa (Souza et al., 2012).
As sementes de cupuaçu são consideradas recalcitrantes, pois não podem sofrer dessecação (redução da umidade) ou ser estocadas em baixas temperaturas, tendendo a perder a viabilidade. Com um teor de umidade entre 49,8 e 51,7% permanecem 100% viáveis, enquanto que com 14,6% morrem (Cruz & Cicero, 2008). Assim, as sementes tornam-se exigentes quanto às condições de armazenamento para uso em futuras propagações.
Para o cupuaçu foi criado um banco de germoplasma, que consiste em depósito da variabilidade genética, a partir de partes do vegetal (plantas, anteras, pólen, sementes, etc.). A vantagem deste procedimento consiste em identificar espécies que apresentam características desejáveis, tais como frutos com tamanhos
maiores, menor quantidade de sementes por fruto e resistência à pragas (Alves, 2002).
Maior concentração na diversidade de espécies nativas foi encontrada principalmente nas regiões sul e sudeste do Pará e noroeste do Maranhão, com oportunidade de melhoramento do cupuaçu, pela disponibilidade de genes e genótipos, e também como reserva biológica, tendo em vista a degradação das espécies nativas em áreas que estão sendo degradadas para a formação de pastos (Alves, 2002).
Souza (2007) também cita, segundo dados do Instituto de Desenvolvimento da Amazônia (IDAM), ter havido de 1996 até 2006 uma baixa produtividade de frutos por hectare, ocasionada por técnicas variáveis de produção (algumas em locais de difícil acesso dificultando a logística de transporte), deficiência de empresas de beneficiamento, assim como locais adequados para estocagem a frio, e sazonalidade dos frutos. Além disso, o cupuaçu também é considerado fruta de baixíssima fecundidade tendo sido demonstrado que em plantas de sete anos a relação flor:fruto é de 2.500:4, sendo necessário o desenvolvimento de técnicas de polinização para a produção de maior quantidade de frutos (Venturieri & Ribeiro Filho, 1995). No entanto, a possibilidade de maior produção pode ser conseguida quando o cultivo está próximo de áreas de floresta, em função da influência positiva exercida pelo microclima (Reisdorff, Gasparotto, & Lieberei, 2000).
O crescimento do cupuaçuzeiro também é favorecido em ambiente parcialmente sombreado (Silva, Freitas, Siebeneichler, Mata, & Chagas, 2007). É uma planta de fácil associação a outras espécies vegetais, especialmente em solo arenoso, sendo observado aumento na produtividade quando consorciado ao cultivo de outras plantas frutíferas (Bicalho & Hoefle, 2010; Falesi, Santana, Homma, & Gomes, 2010).
No Estado do Amazonas, a produtividade de cupuaçu diminuiu nos últimos anos, impactando na disponibilidade de frutos. Entre os motivos estão a falta de boas práticas de manejo e a suscetibilidade a pragas e doenças, principalmente a “vassoura de bruxa” (Brasil, 2014). Por essa razão, programas de melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos pela Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária-EMBRAPA visando desenvolver cultivares para aumentar não só a produção de frutos por hectare, mas também a resistência das plantas ao ataque de pragas, como a “vassoura de bruxa”. As cultivares de cupuaçu mais recentemente desenvolvidas no programa de melhoramento da Embrapa são: Belém, Codajás, Coari e Manacapuru; Carimbó, BRS 227; BRS 228; BRS 229; BRS 311 e BRS 312 (Souza et al. 2012; Brasil, 2014).
A vassoura de bruxa é causada por um fungo (Moniliophtora perniciosa) que afeta a produção de cupuaçu e outras culturas, estando entre as mais importantes pragas, pelo prejuízo econômico que causa, com ocorrência generalizada na Amazônia. Pode levar a planta à morte quando não são aplicadas medidas de contenção (Lima & Souza, 1998). O fungo acomete o tecido meristemático nas plantas, atingindo também as flores e os frutos. Os frutos jovens não se desenvolvem e nos adultos é observado um escurecimento da casca com apodrecimento da polpa, na parte interna (Souza, 2007). Segundo Ferreira (1989), citado por Gondim et al. (2001), além da Amazônia brasileira, a doença também é detectada em plantações de cacau em países da América do Sul, entre os quais Peru, Bolívia, Equador, Colômbia, Venezuela, Suriname, Guianas e Trinidad.
3. FRUTOS
3.1 Composição física e química
Em sementes de cupuaçu foi detectada a presença de uma purina, a teacrina (ácido 1,3,7,9-tetrametilúrico) (Vasconcelos, Silva, Maia, & Gottlieb, 1975), provável precursora da cafeína (Santos, 2003), também encontrada em Cammelia assamica var. kucha, consumida na forma de chá, e apreciada pelo efeito anti-fadiga que causa, através da restauração de neurotransmissores como a dopamina (Li et al., 2015). Estudos indicam que a substância possui potente efeito sedativo e hipnótico, bem diferente do observado em teobromina e cafeína sobre o sistema nervoso central. Em associação com o fenobarbital, por exemplo, induz ao sono (Xu; Kurihara; Zhao; Yao, 2007), tendo sido observadas também atividades anti-inflamatória e analgésica (Wang et al., 2010). Estudos sobre os efeitos da teacrina no organismo pelo consumo de cupuaçu ainda são desconhecidos.
Outras xantinas como a teobromina, teofilina e cafeína também são encontradas em sementes de cupuaçu, porém em concentrações bastante inferiores
quando compradas às encontradas em sementes de cacau (Lo Coco, Lanuzza, Micali, & Cappellano, 2007). No Quadro 1 são apresentadas as concentrações encontradas das xantinas nas sementes dos frutos
Quadro 1. Concentração de xantinas encontradas em sementes e amêndoas de
cacau e cupuaçu
COMPOSTOS CACAU CUPUAÇU
Teobromina 33 mg.g-1 1.0 mg.g-1
Teofilina 0.20 mg.g-1* 0.30 mg.g-1*
Cafeína 5.60 mg.g-1 0.50 mg.g-1
*Amêndoas torradas
Na Tabela 1 são apresentadas características físico-químicas e concentrações de macro e oligoelementos na polpa, semente, amêndoas secas e torradas de cupuaçu.
Tabela 1. Características físico-químicas e concentrações de macro e oligoelementos na polpa, semente, amêndoas seca e torrada de cupuaçu
físico-química polpa semente amêndoa amêndoa torrada
Umidade (%) 89,2±0,3 [1] 6,92 [4] 6,07 [4]
pH 3,5±0,2 [1] 6,35±0,01 [2] 5,41±0,03 [2] 5,27±0,03 [2]
acidez total titulável 3,5±0,0 [1]* 7,70±0,50 [2]** 11,69±0,75 [2]** 11,74±0,75 [2]**
Proteína (%) 8,8±1 [5] 9,43±0,12 [2] 8,89±0,36 [2] 8,63±0,22 [2] Lipídios (%) 12,7±2,2 [5] 64,85±0,61 [2] 53,60±1,04 [2] 53,73±0,30 [2] Cinzas (%) 5,3±0,5 [5] 2,94±0,02 [2] 2,02±0,01 [2] 2,15±0,04 [2] Fibras (%) 14,3±0,6 [5] 3,28±0,05 [2] 6,51±0,98 [2] 7,638±0,44 [2] Açúcares (%) 49,0±4,0 [5] - - - Glicose (% DM) 6,9±0,8 [5] - - - Frutose (% DM) 8,8±0,5 [5] - - - Sacarose (% DM) 34,6±1,7 [5] - - - ácido ascórbico (mg/g) 96-111 [8] - - -
fenóis totais (mmol.L-1 ácido gálico) 0,4±0,0 [1] - - -
ativ. antirradical livre (µmol.L-1 de
Trolox) 0,6±0,2 [1] - - - aa essenciais (mg/g) treonina - 59,2±0,4 [3] 57,21±1,5 [3] 56,66±1,1 [3] valina - 72,60±1,5 [3] 63,36±3,7 [3] 60,63±0,3 [3] metionina - 4,59±1,1 [3] 4,26±1,1 [3] 2,49±0,6 [3] cistina - 23,31±0,4 [3] 22,70±1,2 [3] 22,86±1,2 [3] isoleucina - 45,8±0,3 [3] 41,61±0,4 [3] 42,24±0,8 [3] leucina - 84,4±1,5 [3] 77,07±1,5 [3] 79,52±1,5 [3] tirosina - 37,06±0,7 [3] 43,50±1,5 [3] 42,74±1,1 [3] fenilalanina - 45,47±0,3 [3] 41,13±0,4 [3] 40,26±0,3 [3] lisina - 53,11±1,5 [3] 45,39±4,7 [3] 43,74±0,3 [3] histidina - 14,52±0,7 [3] 12,77±1,5 [3] 11,43±1,2 [3] triptofano - 12,99±0,1 [3] 14,609±0,7 [3] 12,92±0,4 [3] aa não essenciais (mg/g) arginina - 56,55±1,5 [3] 56,74±3,7 [3] 52,685±0,4 [3] ácido aspártico - 123,81±2,6 [3] 144,21±3,4 [3] 151,59±1,5 [3] serina - 53,11±3,4 [3] 59,57±2,3 [3] 58,15±2,2 [3] ácido glutâmico - 148,26±1,1 [3] 141,37±3,7 [3] 147,11±3,4 [3] prolina - 44,33±2,2 [3] 52,01±1,5 [3] 51,19±8,9 [3] glicina - 57,7±0,3 [3] 69,99±6,1 [3] 62,13±0,8 [3] alanina - 47,76±0,3 [3] 45,86±2,2 [3] 47,22±0,8 [3] amônia - 15,28±0,7 [3] 14,66±0,4 [3] 14,41±0,8 [3] proteína total - 26,17±0,3 [3] 21,15±0,8 [3] 20,12±0,5 [3]
ácidos graxos (g/100g de ácidos graxos totais)
ácido mirístico 0,12±0,03 [5] - - -
ácido palmítico 55,22±0,62 [5] 7,54±0,08 [6] - -
Continuação ácido palmitoleico 0,56±0,15 [5] - - - ácido esteárico 3,12±0,15 [5] 32,6±0,1 [6] - - ácido oleico 18,8±2,44 [5] 41,31±0,06 [6] - - ácido linoleico 3,08±0,63 [5] 4,9±0,1 [6] - - ácido α-linolênico 17,98±2 [5] 0,20±0,01 [6] - - ácido margárico - 0,19±0,01 [6] - - ácido vacênico - 0,47±0,02 [6] - - ácido eicosanóico - 10,51±0,04 [6] - - ácido eicosenóico - 0,34±0,01 [6] - - ácido docosanóico - 1,72±0,01 [6] - - ácido tetracosanóico - 0,19±0,01 [6] - -
ácido graxo saturado 1,4004 [5] 52,81±0,07 [6] - -
ácido graxo monoinsaturado - 42,12±0,04 [6] - -
ácido graxo poliinsaturado - 5,07±0,11 [6] - -
ácido graxo mono e poliinsaturado 0,9782 [5] - - -
ω-6/ω-3 - 0,1713 - -
minerais e traços de elementos (µg/g amostra fresca)
Al 0,8±0,3 [7] 2,1±0,3 [7] - - B 0,3±0,1 [7] 2,9±0,1 [7] - - Ca 96±9 [7] 369±9 [7] - - Cl 87±21 [7] 340±31 [7] - - Cu 0,4±0,1 [7] 2,7±0,1 [7] - - Fe 2,7±0,3 [7] 7,5±0,3 [7] - - K 3439±46 [7] 2621±24 [7] - - Mg 93±2 [7] 802±9 [7] - - Mn 0,6±0,1 [7] 2,7±0,1 [7] - - P 118±2 [7] 730±4 [7] - - S 334±7 [7] 177±4 [7] - - Si 3±1 [7] 4±1 [7] - - Sr 0,7±0,1 [7] 1,6±0,1 [7] - - Zn 2,2±0,1 [7] 7,3±0,1 [7] - -
[1] (Canuto, Xavier, Neves, & Benassi, 2010) [2] (Carvalho, García, & Wada, 2005) [3] ( Carvalho, Garcia, & Fárfan, 2008) [4] (Santos, 2000) [5] (Rogez et al., 2004) [6] (Pugliese, 2010) [7] (Naozuka, 2008) [8] (PUGLIESE et al, 2013) *expresso em mg de ácido cítrico/100g de polpa; ** expresso em meq NaOH/100g
FW: peso fresco SFA: ácido graxo saturado UFA: ácido graxo insaturado MUFA (PUFA): ácidos graxos mono e poliinsaturados
Tanto a polpa quanto as sementes de cupuaçu possuem alto conteúdo protéico e lipídico, boa fonte de minerais (macro e oligo-elementos) destacando-a como fruta de elevado valor nutricional. O açúcar prevalente é a sacarose (Tabela 1).
Os diferentes formatos do fruto (oblongo, ovado, elíptico, obovado e redondo) não apresentam diferenças significativas nas características requeridas para rendimento industrial com relação à utilização da polpa e sementes (Matos et al., 2008). Foram constatadas médias percentuais muito próximas no peso dos frutos (1.305 g), assim como concetração de polpa (37,4%), pH (3,11), umidade (84,3 %), Brix 13,61o), e acidez titulável (3,02%) (Matos et al., 2008). Assim, a utilização de frutos para fins industriais pode ser feita com base na seleção de árvores com maior produção e maturação de frutos em diferentes períodos do ano.
O cupuaçu é uma fruta rica em vitamina C, apresentando concentração entre 96 a 111 mg/100g na polpa fresca. Quando disponibilizada para comercialização, a polpa apresenta drástica redução de vitamina C (9 a 13 mg/100g) (Pugliese, Tomas-Barberan, Truchado, & Genovese, 2013).
Na polpa de cupuaçu foram detectados 21 compostos voláteis, sendo que os mais predominantes nas amostras eram ésteres, representados principalmente por butanoato de etila, hexanoato de etila e ácido hexadecanóico. Os dois primeiros compostos contribuem para o aroma do cupuaçu (Franco; Shibamoto, 2000). A concentração de compostos voláteis varia de acordo com o pH, sendo maior em amostras com pH 3.3, próximo ao pH natural do fruto. No total foram identificados 24 ésteres, 13 terpenos, 8 álcoois, 4 carbonilas, 4 ácidos, 2 lactonas e 1 fenol (Tabela 2) (Quijano & Pino, 2007).
Tabela 2. Compostos voláteis detectados em polpa de cupuaçu (µg/kg). COMPOSTOS pH 3,3 pH 7 Acetato de etila 250 102 2-propanol - 4 Etanol 77 29 Propanoato de etila 52 - Propanoato de 3-metilbutila 20 - Butanoato de etila 389 381 2-Metilbutanoato de etila 162 - Acetato de butila 440 7 Acetato de 3-metilbutila 43 - 1-butanol 129 13 1-penten-3-ol 24 - 2-metil-2-pentenal - 5 Mirceno 12 - 3-metilbutanol 3 2 Butanoato de butila - 14 Hexanoato de etila 1253 359 (E)-β-Ocimeno 37 28 Acetato de 3-metil-3-buten-1-il 62 3 Acetato de hexila 201 4 Terpinoleno 15 - 3-hidroxi-2-butanona 102 - 3-metil-2-buten-1-ol 278 - 2-metilpentanoato de etila 40 12 1-hexanol 30 7 3Z-Hexenol 18 6 Nonanal 19 - Hexanoato de butila 79 5 Octanoato de etila 52 10
Óxido de (Z)-linalol (furanóide) 27 0
Óxido de (E)-linalol (furanóide) 31 8
Ácido acético 47 0 (E,E)-2,4-Heptadienal 5 - Sorbato de etila 6 - 3-Hidroxibutanoato de metila 44 - Linalol 986 104 3-Hidroxibutanoato de etila 86 - Β-Cariofileno 23 5 Decanoato de etila 37 6 Ácido butanóico 117 29 Butanoato de propila 48 5 3-Hidroxihexanoato de etila 520 - α-Terpinol 440 89 Propanoato de linalil 111 51 Germacrene D 37 5 Nerol 12 0 Dodecanoato de etila 27 - Geraniol 42 - Ácido hexanóico 21 4 Acetato de 2-fenilpropila 37 2 γ-Octalactona 8 - Ácido octanóico 70 - Acetato de trans-Cinamil 32 21 Eugenol 35 15 δ-Decalactona 9 - Acetato de cedrila 29 6 Acetato de (E,E)-farnesil 10 - - Não detectado
Fonte: Quijano & Pino (2007)
A complexidade de compostos voláteis presentes na polpa de cupuaçu justifica o aroma e sabor intenso do fruto, caracterizado como exótico e muito agradável. Alguns dos compostos identificados têm papel preponderante na formação do sabor durante a fermentação, secagem e processamento das
amêndoas para a obtenção do cupulate. Estudos comprovam que compostos voláteis presentes na polpa de cacau, por exemplo, migram para a semente durante a fermentação (Kadow et al., 2013), presumindo-se que o mesmo ocorre com cupuaçu.
Entre os compostos identificados na polpa de cupuaçu, estão o linalol (3,7-dimetil-1,6-octadien-3-ol) composto com potencial impacto no aroma, presente de forma abundante (Oliveira et al., 2004), sendo também encontrado em elevadas concentrações em cacau fino, contribuindo com um aroma floral e tipo chá (Pino; Roncal, 1992; Ziegleder, 1990 citados por Lima, 2012); o álcool amil 3-metil-1-butanol, que quando esterificado, origina o metil-1-butanol acetato, composto com notas de malte e chocolate (Rodriguez-Campos et al., 2011; Rodriguez-Campos et al., 2012); a 3-hidroxibutanona (acetoína), composto com sabor de manteiga, utilizado pela indústria em margarina e pode ser obtido de fermentações láticas (Schrader, 2007); e o eugenol, com propriedades inibitórias sobre o crescimento de microrganismos, atividade anti-oxidante. Seu uso combinado em atmosfera modificada promove a conservação de alimentos prevenindo a perda de ácido ascórbico, compostos fenólicos totais e antocianinas na casca de frutas (Valero et al., 2006).
4. SEMENTE 4.1 Histologia
Modificações na estrutura das sementes de cacau e cupuaçu durante a fermentação foram estudadas comparativamente e os resultados apontam semelhanças entre os dois frutos com relação à presença e concentração de alguns compostos químicos (Mattietto, 2001; Martini & Tavares, 2005), embora as sementes de cupuaçu sejam maiores que as de cacau (Martini, 2004).
As sementes de cupuaçu são constituídas por três regiões: um tegumento ou envoltório, cotilédones e eixo hipocótilo-radícula, situado na base da semente e unido aos dois cotilédones. Pelo fato de estar aderida ao cotilédone, há dificuldade na remoção da casca (tegumento), o que normalmente não ocorre com a amêndoa de cacau, pela existência de espaço entre as duas estruturas (Santos, 2003).
O mesófilo cotiledonar possui células de reserva (lípide-proteica), feixes vasculares e idioblastos (células) de polifenóis. Durante a fermentação, com a
entrada de água e outros compostos na semente, a parede celular é destruída e os compostos fenólicos são liberados, entrando em contato com enzimas específicas originando a coloração marrom nas amêndoas (Mattietto, 2001).
Comparando as sementes de cupuaçu com as de cacau, conclui-se que as de cupuaçu são superiores em reserva de lipídios e possuem menor teor de proteínas, polifenóis e carboidratos (Martini, 2004), embora a quantidade de amido seja maior nas sementes de cupuaçu do que em cacau (Mattietto, 2001). Este último representa uma importante reserva relacionada com a estrutura de parede (Martini, 2004; Santos, 2003), entremeando, juntamente com os lipídios, a proteínas de reserva nos cotilédones (Santos, 2003).
As proteínas encontram-se na forma de granulações dispersas no citoplasma (Santos, 2003). Durante a proteólise, os aminoácidos liberados combinam-se com constituintes fenólicos formando as quinonas, reduzindo o amargor e adstringência (Mattietto, 2001). Em sementes de cacau são armazenados dois tipos de proteínas: globulina-7S (vicilina) e a albumina (Mattietto, 2001). Apenas a primeira é responsável pela geração dos precursores de aroma. Em cupuaçu também foram identificadas frações proteicas de globulina e albumina, sendo a albumina a mais abundante (Carvalho et al., 2008).
A presença de mucilagem nos espaços intercotiledonares e dentro de estruturas (sacos de mucilagem) no parênquima do tegumento externo também foi observada no cupuaçu. A mucilagem é um polissacarídeo de caráter ácido e neutro, provavelmente um mucopolissacarídeo (Santos, 2003).
4.2 Fermentação
4.2.1 Aspectos físico-químicos
As sementes de cupuaçu são submetidas à fermentação para obtenção de cupulate (Nazaré et al., 1990), sendo previamente despolpadas, para reaproveitamento da polpa pela indústria. Ainda assim, uma porção permanece aderida à semente, servindo como substrato para início da fermentação (Cohen et al., 2003). Assim como ocorre com o cacau, a fermentação das sementes é feita de forma empírica com contaminação espontânea, desencadeando uma série de reações bioquímicas, culminando na transformação dos substratos presentes em
outros compostos que podem ou não conferir características sensoriais desejáveis, dependendo da forma como é feita a fermentação (Lagunez Gálvez et al., 2007).
As formas de fermentação de cacau e revolvimento aplicados para promover a aeração da massa e homogeneização da temperatura, são variáveis em várias partes do mundo. Pilhas de fermentação sobre folhas de bananeiras em contato direto com o solo, balaios e cochos de madeira são alguns exemplos (Beckett, 2009). Na fermentação de sementes de cupuaçu normalmente são usados cochos de madeira (Cohen, Mattietto & Jackix, 2004; Cohen, Sousa & Jackix, 2009; Pugliese, 2010; Jorge, 2011). O tempo de fermentação é variável, entre 5 e 7 dias (Nazaré et al., 1990; Cohen & Jackix, 2005), sendo que o prolongamento representa um risco para a qualidade do produto final pela obtenção de amêndoas com sabores estranhos (off-flavors). Durante a fermentação a temperatura máxima pode alcançar 47oC, inferior à de cacau que no mesmo estudo registrou 49oC (Mattietto, 2001). A quantidade de sementes de cupuaçu também parece influenciar. Quanto maior, mais elevada a temperatura da massa (Nazaré et al., 1990; Cohen & Jackix, 2005; Robayo, 2010). Enquanto na fermentação de cacau a temperatura elevada permanece estável até o final, em cupuaçu foi observado declínio progressivo, com registros finais na faixa dos 30oC (Nazaré et al., 1990; Mattietto, 2001; Cohen & Jackix, 2005; Robayo, 2010).
A acidez elevada no início da fermentação de cupuaçu apresenta redução até o final (Nazaré et al., 1990; Mattietto, 2001), sendo que nas primeiras 24h ocorre súbita elevação, coincidindo com o aumento dos ácidos lático e acético nesse período (Mattietto, 2001). Este evento pode estar relacionado com a intensa atividade microbiana pela formação dos referidos ácidos, a partir do ácido cítrico e açúcares, respectivamente, embora no mesmo estudo tenha sido observado que entre o 3o e o 6o dia de fermentação haja elevação no teor de açúcares tanto redutores quanto da sacarose (Mattietto, 2001).
O pH dos cotilédones de cupuaçu, incialmente em 6,3, apresenta redução para 5,72 em virtude da entrada de compostos ácidos durante a fermentação. A testa, em sentido contrário, apresenta elevação de 3,35 para 6,22, (Mattietto, 2001), ocasionada provavelmente pela hidrólise proteica, no interior dos cotilédones, com liberação dos compostos para o meio externo.
A umidade das sementes de cupuaçu tende a aumentar durante a fermentação. O aumento é atribuído à elevação da temperatura da massa, causando maior absorção e retenção de água pelas proteínas vacuolares (Mattietto, 2001), ou mesmo superoxidação do ácido acético presente, culminando com a liberação de CO2 e água (Schwan & Wheals, 2004).
As sementes de cupuaçu apresentam diversos aminoácidos essenciais e não essenciais (Tabela 1). Observa-se aumento no teor de alguns aminoácidos essenciais após a fermentação (ácido aspártico, serina, prolina, glicina) e após a torração (ácido aspártico, ácido glutâmico e alanina) (Carvalho et al., 2008). Mattietto (2001) observou que, com exceção da cistina, aminoácidos como a serina, ácido glutâmico, prolina, alanina, valina, leucina, tirosina, treonina e fenilalanina apresentam elevação, com destaque para as duas últimas. Dos aminoácidos citados, apenas a alanina, tirosina, leucina e fenilalanina são hidrofóbicos.
Os aminoácidos hidrofóbicos (alanina, tirosina, valina, isoleucina, leucina e fenilalanina), juntamente com os peptídios hidrofílicos e açúcares redutores são importantes precursores de sabor. São transformados em compostos de sabor através de reações não enzimáticas (reação de Maillard) durante a secagem e torração das amêndoas (Rizzi & Bunke, 1998; Biehl & Ziegleder, 2003). Nos casos em que a fermentação é mais prolongada, microrganismos aeróbicos promovem um ataque aos aminoácidos e peptídeos liberados, caracterizando a sobre-fermentação (Biehl & Ziegleder, 2003). O teor de fibras nas sementes de cupuaçu é superior ao do cacau. Mas ao final da fermentação ocorre uma inversão ficando a concentração de fibras em cupuaçu abaixo da de cacau (Mattietto, 2001).
A quantidade de polifenóis é maior em cacau do que em cupuaçu. Em polpa de cupuaçu foram encontrados 20,5 mg.g-1 de polifenóis totais, não sendo detectadas antocianinas, compostos fenólicos que conferem pigmentação violácea (Kuskoski et al., 2006). Os polifenóis são estruturas metabólicas secundárias de vegetais, que vão de simples compostos (ácidos fenólicos) até compostos estruturalmente mais complexos, como os flavonoides. São substâncias que conferem cor, sabor e adstringência em alimentos. Funcionam como substratos em reações enzimáticas culminando com o escurecimento de alimentos (Cheynier, 2012). Além disso, alguns tipos de compostos fenólicos encontrados em cupuaçu
são considerados compostos bioativos pela atividade anti-oxidante (Yang et al., 2003).
Nas sementes, a quantidade de polifenóis é superior a da polpa, alcançando 42,7 mg.g-1 (Lim, 2012), porém três vezes inferior à de cacau (Pugliese, 2010), sendo que durante a fermentação, ocorre redução durante o processo de 109,7 mg/g para 57,46 mg/g, como resultado da oxidação enzimática, inclusive durante a secagem das amêndoas (Mattietto, 2001). A perda de compostos fenólicos em amostras desengorduradas também é expressivamente maior em extratos metanólicos, ocasionada provavelmente durante o aquecimento em soxhlet (Galeano & Paladines, 2012). Da mesma forma, também ocorre diminuição dos compostos fenólicos, flavonóides, proantocianidinas oligoméricas e atividade anti-oxidante em sementes de cupuaçu após a fermentação e secagem. A perda aumenta durante o processamento para obtenção do cupulate (Pugliese, 2010).
Durante a fermentação há liberação de enzimas que atuam sobre os substratos presentes. Algumas estão presentes naturalmente na polpa, nas sementes ou podem ter origem nos microrganismos que participam do processo. Em fermentação de sementes de cupuaçu, Garcia (2006) identificou a presença de amilases, invertases, pectinesterases, poligalacturonases, peroxidases, polifenoloxidases, proteases e lipases. Foi observado que a atividade dessas enzimas começa a apresentar elevação a partir das 24 h de fermentação. À medida que o processo avança, a atividade enzimática diminui até o final. Todas as enzimas estudadas apresentam ótima atuação em uma faixa de pH entre 4,2 e 4,6. Os compostos que são formados durante o processo, elevando o pH, interferem negativamente na atividade enzimática. Porém, maior atividade é observada nos momentos em que a temperatura da massa de fermentação está elevada, embora o mesmo estudo não tenha encontrado correlação entre elevação da temperatura com atividade enzimática, especialmente poligalacturonase, peroxidase, protease e a α e β amilases (Garcia, 2006).
4.2.2 Aspectos microbiológicos
As classes de microrganismos envolvidos na fermentação de cacau já foram estudadas através de várias técnicas moleculares (métodos não culturais), além da metodologia convencional (métodos culturais) (De Vuyst et al., 2008;
Nielsen et al., 2008; Santos et al., 2011; Illeghems et al., 2012; Romero-Cortes, 2012; Meersman et al., 2013). Em todos eles foi identificada a predominância de espécies de bactérias e leveduras com atuação específica sobre substratos dos frutos para formação de precursores de sabor. A ação dos microrganismos na fermentação é bastante interessante, pois acontece de forma relativamente sincronizada e sequencial na qual os metabólitos gerados por uma população servirão de substrato para outra, culminando na produção de compostos importantes para a formação de sabor (Schwan & Wheals, 2004).
Estudos apontam que as leveduras parecem ser as responsáveis pelo “start” do processo, com ação sobre os açúcares presentes na polpa, através da quebra em compostos mais simples que depois são convertidos em álcoois. São favorecidas pelas condições ambientais iniciais, predominantemente anaeróbicas (Schwan & Wheals, 2004). Foi comprovado que a presença de leveduras é essencial na fermentação, pois sua supressão leva a uma diminuição na concentração de etanol, com maior formação de outros tipos de álcoois e menos compostos pirazínicos em amêndoas torradas (Ho et al., 2014).
As leveduras prepararam o ambiente para a próxima etapa através da liquefação da polpa, pela ação de enzimas específicas (pectinases) sobre a pectina. O ambiente torna-se mais aerado para as bactérias acéticas, que a partir desse momento passam a ter uma evolução mais rápida, convertendo o etanol em ácido acético, já nas horas mais adiantadas da fermentação, caracterizando assim a fase aeróbica (Schwan & Wheals, 2004; Schwan, 1998). A participação indireta dos produtores ocorre através do revolvimento aplicado à massa de fermentação, com o objetivo de aumentar a aeração e elevação da temperatura, que pode alcançar até 50oC, pela conversão do etanol em ácido acético, em uma reação bastante energética, produzindo até 496 KJ/molécula de energia, levando à perda da germinação da semente (Lagunes Gálvez et al., 2007).
Em fermentação de cupuaçu, através de método cultural, foram identificados alguns gêneros de leveduras, tendo sido notada a presença de Candida sp ao longo de todo o processo, sugerindo a existência de cepas resistentes à elevação de temperatura que ocorre. Entres os outros gêneros/espécies identificados estão Kloeckera lindneri, Brettanomyces,
Thrichosporum adeninovorans, Pichia fermentans, todos na fase intermediária da fermentação (Oliveira, 2001).
A participação de bactérias láticas tem sido objeto de vários estudos. Sabe-se que atuam sobre o ácido cítrico presente na polpa para a produção de ácido lático, promovendo modificações no pH do ambiente (Schwan & Wheals, 2004). A ação das leveduras torna o ambiente favorável para as bactérias láticas acidúricas, quando então parte da polpa já está liquefeita. Entre as bactérias láticas identificadas nas primeiras horas de fermentação de cacau estão o Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum, Leuconostoc mesenteroides e Lactococcus lactis (Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa, 2011), sendo que os gêneros Leuconostoc e Lactococcus também foram identificados nas primeiras 24 h de fermentação em sementes de cupuaçu (Oliveira, 2001).
O ácido lático, produzido pelas bactérias láticas, é inconveniente para a qualidade do produto final, por se tratar de um composto não volátil que confere acidez indesejável (Schwan & Wheals, 2004). Porém, estudos indicam que as bactérias láticas têm um importante papel na fermentação, especialmente de produtos lácteos. Elas atuam sobre o aminoácido leucina, formando o 3-metilbutanal, um potente composto de sabor, também presente nas amêndoas de cacau (Ayad, Verheul, Engels, Wouters, & Smit, 2001; Beckett, 2009). Em fermentação de cacau, também atuam na conversão de açúcares e ácido cítrico em ácido lático, acético e manitol (Schwan, 1998; Camu et al., 2007; Mai, Ho & Tran, 2014).
A fase aeróbica da fermentação começa a se tornar evidente nas horas mais adiantadas da fermentação, quando a polpa já está quase toda liquefeita, pela conversão do etanol em ácido acético e elevação da temperatura sob a ação das bactérias acéticas (Schwan & Wheals, 2004; Afoakwa, 2011). Embora através de métodos culturais tenham sido identificadas bactérias acéticas em fermentação de cacau, ferramentas moleculares (métodos não culturais) têm permitido identificar gêneros e espécies, ainda não catalogados. Utilizando padrões já existentes também é possível identificar os grupos mais prevalentes na amostra (De Vuyst et al., 2008). Segundo estudos, a maior frequência de gêneros tais como Acetobacter em relação ao Gluconobacter, por exemplo, pode estar relacionada à preferência e
