Osteossarcoma canino: casos clínicos

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Vila Real, 2016

Osteossarcoma Canino - Casos Clínicos

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária

Joana Rita Veiga dos Santos

Orientador: Profª Drª Justina Maria Prada Oliveira

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Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

Vila Real, 2016

Osteossarcoma Canino - Casos Clínicos

Dissertação de Mestrado em Medicina Veterinária

Joana Rita Veiga dos Santos

Orientador: Profª Drª Justina Maria Prada Oliveira

Co-Orientador: Drª Carla Susana Reis Marrinhas

Composição do Júri:

Presidente: Doutora Adelina Maria Gaspar Gama Quaresma

Vogais: Doutora Justina Maria Prada Oliveira

Doutora Felisbina Luísa Queiroga

Doutora Isabel Cristina Ribeiro Pires

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V Agradecimentos

Agradeço à minha orientadora, Professora Doutora Justina Maria Prada Oliveira, por ter aceite orientar a minha dissertação. Obrigado pela prontidão, disponibilidade e paciência.

Agradeço à Doutora Carla Susana Reis Marrinhas pelos ensinamentos e pela experiência transmitida. Agradeço, ainda, todo o material e conhecimento partilhados comigo e que foram essenciais para este trabalho.

Um “gigante” obrigado a toda a equipa do Hospital Veterinário do Baixo Vouga por todos os ensinamentos e pelo excelente ambiente de trabalho.

Agradeço a toda a equipa do Canis Hospital Veterinário (Girona, Espanha) por me terem recebido tão bem - a “portuga”- e por me terem dado confiança. Obrigado pela exigência e por me incentivarem a ser sempre melhor. Queria destacar o Dr. Jordi Cairo e Drª Ester Domenech por todo o material e incentivo disponibilizado para o desenvolvimento deste trabalho sobre o osteossarcoma.

Agradeço a toda a equipa da VetRia por toda a confiança que depositaram em mim. Durante o estágio trabalhei com outros colegas estagiários e posso dizer que tive a maior sorte do mundo. A todos eles queria dedicar esta tese: Rui Xavier, Daniela Carvalho, Marisa Almeida, Miguel Souza, Rita Quinteira, Ana Rita Almeida, Ana Elvira e Georgina Casillas Viladerrams. Foi muito bom encontrar pessoas como vocês, que depositam paixão e alegria pelo trabalho.

Quero agradecer a todos os amigos que o curso de Medicina Veterinária e que Vila Real me trouxeram: Mónica, Cátia, Carolina Érica, Andreia, Inês Santos, Xana Santos, Rita Fitas, Filipa Alves, Sara Martins, Sara Gouveia, Daniel Torrão, Fernando Cunha e Rui Miranda.

À Rita Quinteira, Mafalda Lino e Filipa Alves por serem o melhor grupo de trabalho. Um muito obrigado especial à turma B, a melhor turma de sempre. Obrigado aos já referidos e à Francisca, Glória, Catarina, Mariana e Inês Santiago.

Ao grupo Tapas pelos convívios e pelos petiscos.

Agradeço à família académica que a praxe me trouxe. Obrigado à minha madrinha e às minhas afilhadas. Um obrigado especial à minha afilhada Filipa, de quem gosto muito.

À Ana Inês por todas as viagens entre Águeda e Vila Real. Obrigado pela amizade e por seres a melhor “co-piloto”.

Um obrigado especial aos meus grandes amigos: Rita, Vera, Leandra, Sara, Pedro, Hugo, André e Nuno. Obrigado pela paciência, por aturarem o meu mau-humor quando o FC Porto perde, obrigado pelas aventuras e pelas inúmeras horas que passamos a conversar e a rir. Obrigado por estarem sempre lá.

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VI Aos meus “amores” de 4 patas por serem a minha fonte de inspiração: Ginger, Nina, Maggie, Mini, Lucky e Mary

Agradeço a toda a minha família (avós, tios, primos, padrinho, madrinha) que sempre apoiou o meu percurso em medicina veterinária.

Ao meu irmão Alexandre, por dizer sempre aquilo que não quero ouvir mas que preciso. Obrigado pelo apoio e incentivo. Espero que continuemos a falar um com o outro como se, ainda, tivéssemos 13 anos. Quero deixar, também, um agradecimento especial à Rita Magalhães Moita.

Ao meu namorado, Filipe, que acompanhou e acompanha todo o meu percurso em veterinária. Obrigado pela paciência, pela disponibilidade, pela compreensão, pelas viagens, pelas surpresas e por todos estes anos de namoro.

Por fim, o maior agradecimento vai para os meus pais, que me incentivam todos os dias a ser mais e melhor. Aos meus pais que desde sempre apostaram na minha formação pessoal e profissional, que sempre me ensinaram a não estar parada e sem os quais eu nunca teria chegado até aqui. Estiveram sempre de “braços abertos” quando eu mais precisei, mostrando-me sempre o melhor caminho. Agradeço-lhes, também, por me terem incutido o gosto por viajar e pelo enriquecimento cultural. Em especial, o meu gosto pela literatura que vem diretamente da minha mãe.

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VII

Resumo

A doença oncológica tem suscitado uma crescente preocupação em Medicina Veterinária.

O osteossarcoma é a neoplasia primária mais comum no osso e afeta principalmente cães geriátricos de raças grandes/gigantes. Na maioria dos casos, o tumor primário localiza-se no esqueleto apendicular, no entanto também localiza-se pode localizar no esqueleto axial e até, embora mais raro, ter uma localização extra-esquelética.

A sua etiologia não é totalmente conhecida, podendo resultar de fatores genéticos, moleculares e/ou físicos. Os sinais clínicos são variáveis, de acordo com o tipo anatómico de osteossarcoma.

O diagnóstico deve conjugar métodos imagiológicos e histopatológicos. Sendo o osteossarcoma um tumor muito agressivo e com elevada taxa de metastização, a imagiologia tem, também, um importante papel na identificação da doença metastática.

As opções terapêuticas devem incluir controlo do tumor primário com cirurgia e/ou radioterapia associado a quimioterapia adjuvante. Por vezes, há casos em que apenas é implementado tratamento paliativo.

Este trabalho tem como objetivo fazer uma revisão atualizada sobre o osteossarcoma e expor e discutir casos clínicos.

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IX Abstract

The oncologic disease is a growing concern in veterinary medicine.

Osteosarcoma is the most common primary bone tumor diagnosed in dogs. Appendicular skeletal osteosarcoma, the most frequent form of this disease, is typically seen in large to giant breeds and seen in old dogs. Axial skeletal osteosarcoma is less common than appendicular, but the biologic behavior of the disease is equally aggressive. This tumor can have, also, an extra-skeletal location (rare).

The etiology isn’t entirely known and it can result from genetic, molecular and physical factors. The clinical signs are variable, depending on anatomic location.

The diagnosis of osteosarcoma can be achieved with medical imaging and histopathologic techniques. This disease is highly metastatic, so medical imaging should be, also, used to find a possible metastatic disease.

Successful treatment of osteosarcoma includes local tumor control with surgery and/or radiotherapy, as well as the treatment of systemic tumor spread with chemotherapy. Sometimes, the palliation therapy is indicated in some specific cases.

The purposes of this work are: to do an updated review of theory of the osteosarcoma and the description of clinical cases of dogs diagnosed with this tumor.

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X Índice Geral

1 Revisão: Histologia, Anatomia, e Fisiologia Óssea ... 1

1.1 Definição e Funções ... 1

1.2 Classificação Morfológica do Osso ... 1

1.3 Estrutura Celular ... 2

1.4 Dinâmica do Tecido Ósseo ... 3

2 Revisão Bibliográfica: Osteossarcoma ... 5

2.1 Incidência e Fatores de Risco ... 5

2.1.1 Predisposição racial ... 6

2.1.2 Localização Anatómica ... 7

2.2 Cão como Modelo de Estudo para Osteossarcoma Humano ... 8

2.3 Etiologia ... 9

2.3.1 Fatores Físicos ... 10

2.3.2 Fatores Genéticos ... 10

2.3.3 Fatores Moleculares ... 12

2.4 Classificação e Comportamento Biológico do Osteossarcoma ... 14

2.5 Sinais Clínicos ... 16

2.5.1 Osteossarcoma e Dor Óssea ... 17

2.6 Diagnóstico ... 18

2.6.1 Análise Sanguínea ... 19

2.6.2 Radiografia... 19

2.6.3 Tomografia Computorizada (TC) ... 22

2.6.4 Ressonância Magnética (RM) ... 24

2.6.5 Cintigrafia Nuclear Óssea ... 25

2.6.6 Ecografia ... 25

2.6.7 Citologia ... 26

2.6.8 Biópsia, Diagnóstico e Classificação Histopatológica ... 27

2.7 Estadiamento do Osteossarcoma ... 30

2.7.1 Gradação histológica ... 30

2.7.2 Estadiamento ... 31

2.8 Tratamento ... 32

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XI

2.8.2 Quimioterapia adjuvante ... 38

2.8.3 Imunoterapia ... 40

2.8.4 Tratamento paliativo ... 41

2.8.5 Tratamento do Osteossarcoma Axial ... 45

2.8.6 Tratamento do Osteossarcoma Extra-esquelético ... 45

2.8.7 Novas terapias no Osteossarcoma ... 46

2.9 Fatores de Prognóstico ... 47

3 Objetivos ... 51

4 Casos Clínicos ... 53

4.1 Caso Clínico I – Osteossarcoma Apendicular subtipo Osteoblástico ... 53

4.1.1 Identificação ... 53

4.1.2 Anamnese e Exame físico ... 53

4.1.3 Exames Complementares ... 53

4.1.5 Tratamento ... 55

4.2 Caso Clínico II- Osteossarcoma Apendicular Fibroblástico ... 56

4.3 Caso Clínico III – Osteossarcoma Apendicular subtipo Osteoblástico ... 61

4.3.2 Anamnese e Exame Físico ... 61

4.3.3 Exames complementares ... 61

4.4 Caso Clínico IV – Osteossarcoma Axial subtipo Condroblástico ... 63

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XII

4.6 Casos Clínico VI – Osteossarcoma Apendicular subtipo Osteoblástico ... 69

4.6.3 Diagnóstico ... 69

5 Discussão dos Casos Clínicos ... 73

6 Conclusão... 77

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XIII Índice de Figuras

Figura 1 – Anatomia do osso longo em fase de crescimento………...1

Figura 2 - Apresentação típica do osteossarcoma apendicula………...16

Figura 3 - Imagem radiográfica típica de osteossarcoma………20

Figura 4 - Osteossarcoma com lesão predominantemente esclerótica………....20

Figura 5 – Radiografia torácica lateral compatível com metastização pulmonar …………... 21

Figura 6 - TC da cavidade nasal com osteossarcoma……….22

Figura 7 – TC de osteossarcoma na 1ª vértebra cervical ……….. 22

Figura 8 – TC do rádio distal com osteossarcoma (com e sem contraste) ………. 23

Figura 9 – TC torácica: diferença entre lesão metastática e terminação de estruturas vasculares ………24

Figura 10 – Imagem de RM da porção distal do rádio. Diagnóstico: osteossarcoma………..25

Figura 11 – Citologia de osteossarcoma corado com Giemsa ………...27

Figura 12 - Citologia de osteossarcoma corado com Giemsa ………..27

Figura 13 – Citologia de osteossarcoma……….29

Figura 14 – Imagem histopatológica corada com HE………29

Figura 15 – Imagem histopatológica de osteossarcoma telangiectásico ………..……29

Figura 16 – Imagem histopatológica de osteossarcoma condroblástico...29

Figura 17 – Imagem histopatológica de osteossarcoma fibroblástico ………...30

Figura 18 – Imagem histopatológica de osteossarcoma osteoblástico .………30

Figura 19 – Cão com membro anterior amputado……….33

Figura 20 – Projeção lateral radiográfica após colocação de endoprótese ………..35

Figura 21 – 1ª geração (GEN1) de endoprótese metálica………36

Figura 22 – 2ª geração (GEN 2) de endoprótese metálica ……….36

Figura 23 – Projeção radiográfica lateral 5 semanas após colocação de fixadores externos………37

Figura 24 – Comparação de ILD e ST entre 5 protocolos baseados em carboplatina e doxorrubicina………40

Figura 25 – Guidelines WHO para controlo de dor no osteossarcoma ………...42

Figura 26 – Radiografia lateral do MAD com destaque para a região proximal do úmero……….53

Figura 27 – Imagens de citologia aspirativa………54

Figura 28 – Comparação entre a exploração torácica com radiografia e com TC…………...55

(13)

XIV

Figura 30 – Tumefação na porção distal do rádio do MAE………..56

Figura 31 – Projeção crânio-caudal da porção distal do rádio……….57

Figura 32 – Projeção lateral da porção distal do rádio……….….57

Figura 33 – Radiografia torácica normal………..58

Figura 34 – Hemograma normal………...59

Figura 35 – Radiografia torácica lateral com suspeita de metastização pulmonar………...60

Figura 36 – Tumefação na região distal da tíbia direita………61

Figura 37 – Imagem da TC à porção distal da tíbia...61

Figura 38 – Imagem da TC à porção distal da tíbia………...62

Figura 39 – Imagem torácica normal por TC………...62

Figura 40 – Massa na narina direita e corrimento serosanguinolento………....63

Figura 41 – Rinoscopia com identificação de massa na coana direita ……….63

Figura 42 – Radiografia lateral ao fémur ………...65

Figura 43 – Imagem de citologia ………..66

Figura 44 – Outro campo da mesma imagem citológica..………...….66

Figura 45 – Tumefação a nível do fémur esquerdo após biópsia ………..…67

Figura 46 – Avaliação radiográfica torácica ……….………..68

Figura 47 – Imagem radiográfica do membro anterior esquerdo ……….…….69

Figura 48 – Imagens da cirurgia de salvamento de membro com endoprótese …………..…70

Figura 49 – Animal do caso clínico VI antes e após a cirurgia de salvamento de membro………..………71

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XV

Índice de Tabelas

Tabela 1 - Localização do osteossarcoma extra-esquelético visceral e de tecidos moles em

33 cães (Duffy et al., 2015) ... 8

Tabela 2 – Sistema para score histológico do tumor proposto por Straw et al., 1996 (Loukopoulos & Robinson, 2007) ...31

Tabela 3 – Sistema de Gradação histológico a partir da conversão do sistema de score histológico proposto por Straw et al., 1996 (Loukopoulos & Robinson, 2007) ...31

Tabela 4 – Estadiamento cirúrgico de Osteossarcoma (Geller & Gorlick, 2010) ...32

Tabela 5 - Resumo de alguns fatores de prognóstico no osteossarcoma canino...49

Tabela 6 – Controlo Renal após 8 dias de tratamento com meloxicam ...59

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XVI Lista de Abreviaturas, siglas, símbolos ou acrónimos

< - menor > - maior

% - Pontos percentuais

AINEs – Anti-inflamatorios não esteroides ALP – Fosfatase alcalina

bALP – Fosfatase alcalina – isoenzima óssea Bid – a cada 12 horas

cALP – Fosfatase alcalina - isoenzima induzida por corticoesteróides

CARBO4 – Carboplatina 4 ciclos CARBO6 – Carboplatina 6 ciclos

CARBODOX6 – Carboplatina intercalada com Doxorrubicina 6 ciclos

CDK4 – Quinase dependente da ciclina 4 CDKN2A – Inibidor de quinase dependente da ciclina 2

DOX5.3 – Doxorrubicina ciclos de 14 dias DOX5.2 – Doxorrubicina ciclos de 21 dias FIA – Fator inibidor da apoptose

E2F – Família de fatores de transcrição 2 EDTMP – Ácido fosfórico tetrametileno etileno ERBB -2 – Recetor da tirosina quinase 2 ET-1 – Endotelina 1

G - gauge

GRIK4 - Recetor ionotrópico de glutamato 4 GWS – Estudos de associação de genomas Gy – Gray (unidade internacional da radiação) IGF-1 – Fator de crescimento semelhante à Insulina 1

IGF-2 – Fator de crescimento semelhante à Insulina 2

IGFBPs – Proteínas de ligação a IGF-1

IGFBP-rPs – Proteínas relacionadas com IGFBP-1

IL-1 – Interleucina 1

ILD – Intervalo livre de doença

IORT – Radiação intraoperativa extracorporal

IV – Intravenosa

HER-2 - Recetor do fator de crescimento epidermal humano 2

Kb – kilobase Kg – quilograma

lALP – Fosfatase alcalina – isoenzima hepática

MAD – Membro anterior direito MAE – Membro anterior esquerdo MBq - Megabecquerel

MDM2 – Mouse double minute 2 MET – Recetor da tirosina quinase

MTP-PE- Muramil tripéptido fosfatidiletanolamina

NGF – Factor de crescimento de nervo NK – Células Natural Killer

PGE2 – Prostaglandinas 2

PTEN - Fosfatase homologa à tensina RB1 – Retinoblastoma

RM – Ressonância Magnética Sid – a cada 24 horas

Sm153 – Samarium 153

SNPs – Polimorfismos de nucleótido único ST – Sobrevida total

TAM – Macrófagos associados ao tumor TC – Tomografia computorizada

TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa TP53 – Proteína tumoral 53

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1 Figura 1 - Anatomia do osso longo em fase de

crescimento (Reece et al., 2015)

1 Revisão: Histologia, Anatomia, e Fisiologia Óssea

1.1 Definiçã o e Fu nçõ e s

Os ossos são órgãos de elevada consistência encarregues de suportar e proteger os tecidos moles (Climent et al., 2001). No seu conjunto, formam o esqueleto que, estruturalmente, se divide em três partes: o esqueleto axial que compreende coluna vertebral, costelas, esterno e ossos do crânio; o esqueleto apendicular do qual fazem parte os ossos dos membros; e o esqueleto esplâncnico que se refere a formações ósseas intimamente associadas a tecidos moles como é o caso do osso peniano (Clarke, 2008).

Além da função de suporte e proteção, os ossos permitem o movimento e a locomoção, em conjunto com os músculos e tendões; favorecem o armazenamento e a homeostasia mineral; permitem a manutenção ácido-base e servem de reservatório para fatores de crescimento e citoquinas. Além disto, alguns ossos albergam a medula óssea que é responsável pela hematopoiese (Clarke, 2008).

1.2 Classifica ção Morf ológica d o Osso

Quanto à morfologia podem classificar-se os ossos em quatro categorias: ossos irregulares, curtos, longos e planos (Clarke, 2008). A figura 1 representa a estrutura típica do osso longo.

 Diáfise: corresponde ao eixo longo e compacto do osso. Também denominado de corpo do osso. E é composto principalmente por osso compacto ou cortical (Clarke, 2008).

 Epífise: representa a porção terminal do osso, sendo constituída por osso trabecular ou esponjoso rodeado por uma fina camada de osso cortical (Clarke, 2008).

 Placa epifisária ou placa de crescimento: matriz cartilaginosa que existe nos animais em crescimento e que separa a epífise da diáfise (Clarke, 2008).

 Metáfise: porção constituída por osso esponjoso que permite a ligação da diáfise à epífise (Reece

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2  Espaço medular: porção de tecido ósseo esponjoso que existe no centro da

diáfise dos ossos longos. No espaço medular existem espiculas ósseas que fornecem espaço para a medula óssea (Reece et al., 2015).

 Periósteo: é um tecido fibroso que rodeia a superfície externa do osso cortical exceto na articulação, onde o osso cortical passa a ser coberto por cartilagem articular. Contém vasos sanguíneos, fibras nervosas, osteoblastos e osteoclastos (Clarke, 2008).

 Endósteo: é uma estrutura membranosa que cobre a superfície interna do osso cortical, do osso trabecular e dos canais de volkmann. Está em contacto com o espaço medular e contém vasos sanguíneos, osteoblastos e osteoclastos (Clarke, 2008).

1.3 Estrutur a Celular

O tecido ósseo é composto por células e por uma matriz. Quanto à composição celular encontram-se osteócitos, osteoblastos, osteoclastos e, ainda, células progenitoras (Rubin et

al., 2012).

As células osteoprogenitoras derivam das células estaminais mesenquimatosas e podem ser encontradas na medula óssea, periósteo e na cavidade medular. São estas células que se vão diferenciar em osteoblastos e osteócitos (Rubin et al., 2012).

Os osteoblastos são células mesenquimatosas que, quando ativadas, têm um núcleo grande e aparelho de Golgi e reticulo endoplasmático muito desenvolvidos. A membrana plasmática destas células é rica em fosfatase alcalina - isoenzima óssea (bALP), pelo que a mensuração da atividade desta isoenzima pode ser usada para determinar a atividade osteoblástica. Os osteoblastos produzem fibras de colagénio tipo I e outras proteínas como proteinoglicanos e glicoproteínas que, no seu conjunto, formam o osteóide - matriz orgânica não mineralizada do osso (Clarke, 2008). Produzem ainda inúmeros fatores de crescimento que regulam a diferenciação celular e o crescimento ósseo. Entre eles encontra-se a Interleucina-1 (IL-1), o Fator de Crescimento semelhante à Insulina - 1 (IGF-1), o IGF-2 e o Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (Rubin et al., 2012).

Os osteócitos representam a diferenciação terminal dos osteoblastos que ficam retidos na matriz (Clarke, 2008). Os osteócitos encontram-se em lacunas no osso já mineralizado e têm prolongamentos (processos filipodais) que comunicam com os canaliculi (Clarke, 2008). Os canaliculi são um sistema de canais que permite a comunicação entre osteócitos e que ao prolongarem-se até à superfície óssea, permitem, ainda, que estas células comuniquem com os osteoblastos e com o fluido extracelular (Reece et al., 2015). Nesta comunicação entre os osteócitos - osteoblastos, os osteócitos traduzem os sinais de

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3 stress de flexão/ extensão do osso em atividade biológica que é efetuada pelos osteoblastos (Clarke, 2008). Os canaliculi estão preenchidos por um líquido relativamente rico em cálcio e quando há estímulo, por parte da paratiróide, os osteócitos podem bombear este líquido para o fluido extracelular. Apesar da quantidade de cálcio libertada ser pequena, permite uma resposta rápida (em horas) à hipocalcemia (Reece et al., 2015).

Os osteoclastos são células grandes, multinucleadas, com lisossomas ricos em enzimas hidrolíticas e que encontram-se ativas durante a reabsorção óssea (Rubin et al., 2012). Durante a reabsorção óssea, os osteoclastos libertam iões de hidrogénio que acidificam a matriz inorgânica, permitindo a sua dissolução. Também libertam a enzima catepsina K, que digere a matriz proteica (matriz orgânica) (Clarke, 2008).

A matriz extracelular é composta por uma componente orgânica e inorgânica. A componente orgânica é essencialmente proteica, em que o seu principal componente são as fibras de colagénio tipo I. E em menor quantidade encontram-se outras proteínas (proteinoglicanos e glicoproteínas) das quais se destaca a osteocalcina. O seu nível sanguíneo pode ser usado como marcador da formação óssea (Rubin et al., 2012).

A matriz inorgânica resulta da deposição de minerais como cálcio, fósforo, magnésio, sódio, potássio, cloro e flúor. Sabe-se, ainda, que há outros minerais ou radioisótopos que podem substituir estes minerais, como é o caso do estroncio-90 que é um radioisótopo capaz de substituir o cálcio e usar o osso como seu reservatório (Reece et al., 2015).

Os minerais, no osso, providenciam rigidez mecânica e força, enquanto a matriz orgânica produz elasticidade e flexibilidade (Rubin et al., 2012).

1.4 Dinâmica d o Te cido Ósseo

A formação, o desenvolvimento e o crescimento dos ossos são realizados através de dois mecanismos distintos: a ossificação intramembranosa e a ossificação endocondral. Estes dois processos diferem, essencialmente, pela ausência (ossificação intramembranosa) ou presença de uma fase em que há formação de tecido cartilaginoso que depois é substituído por osso (ossificação endocondral). Com efeito, a sequência de eventos observada nos processos de osteogénese embrionária é basicamente a mesma que se encontra na consolidação de uma fratura ou nos mecanismos de osteointegração de qualquer biomaterial (Judas et al., 2012).

Apesar do seu aspeto aparentemente inerte, os ossos são estruturas altamente dinâmicas: crescem, remodelam-se e mantêm-se ativos durante toda a vida do organismo. Esta permanente reorganização do tecido ósseo é levada a cabo pelas diversas células ósseas. Estas assumem várias formas e funções, contribuindo para a constante formação, reabsorção, reparação e manutenção da arquitetura óssea (Judas et al., 2012).

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4 Os mecanismos de remodelação óssea permitem não só a constante adaptação funcional e otimização das estruturas ósseas, como ajudam a remover e reparar áreas de tecido danificado (Judas et al., 2012).

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5

2 Revisão Bibliográfica: Osteossarcoma

2.1 Incidên cia e Fator e s de Ris co

O osteossarcoma é o tumor ósseo primário mais comum no cão (Mitchell et al., 2016). É responsável por 80-85% dos tumores ósseos primários que afetam o cão e é caracterizado por ter um comportamento agressivo e invasivo, com elevado potencial metastático (Piro, 2015). Na maioria dos casos, o osteossarcoma envolve a zona metafisária dos ossos longos (Chaffee, 2013).

Este tumor representa 3-4% de todos os tumores caninos (Buracco, 2008). É transversal a cães de todas as idades. No entanto, cães de média a avançada idade são os mais afetados, sendo que a média de idades ronda os 8 anos (Varshney et al., 2016). Embora, também, esteja descrito um 2º pico de incidência, embora mais pequeno, em animais jovens com menos de 3 anos (Varshney et al., 2016). Em medicina humana, o osteossarcoma também tem uma distribuição bimodal: 70-75% dos casos afetam adolescentes e jovens-adultos entre os 10-25 anos (Mueller, 2007), mas existe um 2º pico de incidência em adultos com mais de 40 anos (Varshney et al, 2016).

Esta doença pode afetar qualquer raça, mas ocorre principalmente em raças de porte grande a gigante (Varshney et al., 2016). Vinte e nove por cento dos casos de osteossarcoma canino ocorrem em animais com mais de 40 kg (Ehrhart, 2013) e apenas 5% ocorrem em cães com peso inferior a 15 Kg (Mueller, 2007; Ehrhart, 2013).

Historicamente, a incidência do osteossarcoma tem sido considerada maior em machos do que em fêmeas. No entanto, há estudos que consideram que a distribuição é semelhante entre os géneros (Fenger et al., 2014). A predisposição entre fêmeas e machos pode variar dependendo da localização do tumor primário e da raça afetada (Vanel et al., 2013).

Há estudos que referem o género como fator de risco, outros que o refutam. E, ainda, há estudos que se focam em estudar a influência das hormonas gonadais no risco de osteossarcoma (Phillips et al., 2007). A título de exemplo refere-se o estudo, de 2000 de Dawn M.Cooley e colaboradores, que sugeriu que o risco de sarcoma ósseo foi inversamente relacionado com a exposição total de hormonas gonadais. Os autores fizeram uma análise de multivariância em Rottweilers e verificaram que os meses de sexualidade intacta estão inversamente associados com o risco de sarcoma. Isto é, por cada mês adicional sendo sexualmente intacto há uma redução de 1,4% no risco de desenvolver este tumor. O mecanismo exato que explique estes factos, ainda, não está entendido, mas esta associação inversa pode ser causal, porque as hormonas sexuais endógenas são essenciais para a homeostasia do esqueleto logo, a hipótese de que alterações nestas

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6 hormonas possa influenciar a oncogénese óssea é biologicamente aceitável. Outra possível explicação foi o facto das fêmeas sujeitas a gonadectomia precoce terem atingido um tamanho maior, o que no caso do osteossarcoma é um fator de risco. Uma outra justificação relaciona-se com o facto de tanto as fêmeas como os machos terem vivido mais tempo, o que se acredita que possa ser um contributo para uma maior incidência de casos oncológicos associados a gonadectomia. Em resumo, este estudo mostrou que machos e fêmeas de Rottweilers com menor exposição a hormonas gonadais tiveram um maior risco de sarcoma ósseo (Dawn et al., 2002).

2.1.1 Predisposição racial

Raças específicas como Rottweiler, Galgo, Dogue Alemão, São Bernardo, Galgo Irlandês e o Galgo Escocês parecem estar em maior risco de desenvolverem osteossarcoma (Fenger et al., 2014). O Rottweiler foi a primeira raça a ser documentada com elevado risco para este tumor, tendo uma taxa de incidência de 12,5% (Thomas et al., 2009). O facto de estas raças estarem mais predispostas sugere que fatores genéticos estejam implicados. De facto, o gene CDKN2A tem sido recentemente associado ao risco de osteossarcoma em cães e a verdade é que este alelo de “risco” é fixo em determinadas raças como Rottweiler e Galgo Irlandês (Varshney et al., 2016). Também têm sido identificadas outras aberrações citogenéticas recorrentes e específicas da raça Rottweiler como: a mutação no recetor da tirosina quinase (MET), que é um recetor conhecido por estar desregulado no osteossarcoma canino e humano (Fenger et al., 2014).

A prática de comparar todo o genoma de vários cães simultaneamente com um “set” de polimorfismos de nucleótido único (SNP’s) predeterminado é designada de estudo de associação de genoma (GWS- genoma-wide association) e pode ser uma ferramenta poderosa para encontrar loci associados com uma determinada doença (Davis & Ostrander, 2014). Um estudo GWS realizado em Galgos, Rottweilers e Galgos Irlandês identificou 33

loci de risco hereditários que explicam 55-85% na variância de fenótipo no osteossarcoma.

No caso dos Galgos, verificaram que o locus que exibia associação mais forte era o mesmo que sofria maior rearranjo no osteossarcoma canino. Este estudo revelou uma série de fatores poligénicos e de mutações genéticas hereditárias que estão associadas a vias específicas que levam a osteossarcoma. O GRIK4 é um recetor de glutamato que foi significativamente associado com o risco de osteossarcoma nos Galgos e Rottweilers (Schiffman & Breen, 2015).

Há argumentos que dizem que esta predisposição para determinadas raças está mais relacionada com o tamanho do que com a raça (Dobson, 2013).

(22)

7 O osteossarcoma é particularmente prevalente em Galgos de corrida reformados e é possível que o stress e o trauma ósseo estejam implicados na etiologia da doença nesta raça (Dobson, 2013).

Uma incidência familiar tem sido observada na raça São Bernardo e Galgo Escocês. Mais recentemente um estudo no modelo de transmissão de osteossarcoma numa população de mais de 1000 Galgos Escocês sugeriu que existe um gene “major” com efeito dominante que pode explicar esta transmissão familiar (Dobson, 2013).

2.1.2 Localização Anatómica

Esta neoplasia primária pode ocorrer no esqueleto apendicular (75%), no axial (24%) ou, então, ter uma localização extra-esquelética (1%) (Buracco, 2008).

O osteossarcoma apendicular afeta duas vezes mais os membros anteriores do que os posteriores, sendo o rádio distal e o úmero proximal as localizações mais comuns (Varshney et al., 2016). Outras localizações também frequentemente descritas incluem: fémur distal, tíbia proximal e distal e ulna distal (Piro, 2015). O tumor desenvolve-se a partir da cavidade medular, penetra no córtex e envolve-se com os tecidos moles (Piro, 2015). A predileção deste tumor para se desenvolver na região metafisária dos ossos longos correlaciona-se com o maior stress e, até, com o desenvolvimento de microfracturas, como consequência do rápido crescimento e do elevado suporte de carga a que estes ossos estão sujeitos (Thomas et al., 2009).

As localizações do osteossarcoma axial mais descritas são: mandíbula, maxila, vértebras, crânio, costelas, cavidade nasal, seios paranasais e pénis (Ehrhart, 2013). No subcapítulo anterior, foi referido que apenas 5% dos casos de osteossarcoma ocorrem em cães com menos de 15 kg, mas é de notar que, na maioria destes casos, o tumor tem origem no esqueleto axial (Mueller, 2007).

Também está reconhecida uma forma de osteossarcoma extraósseo/extra-esquelético. Esta forma da doença é rara e afeta cães mais velhos numa média de idades próxima dos 11 anos. Por norma, tem pior prognóstico do que o osteossarcoma ósseo (Mueller, 2007). O osteossarcoma extra-esquelético localiza-se principalmente em órgãos viscerais, sendo o baço o mais afetado (Duffy et al., 2015). Na tabela 1, onde estão resumidas as localizações do osteossarcoma extra-esquelético, pode verificar-se que, por vezes, este tumor pode ser uma massa externamente palpável, principalmente quando atinge os tecidos moles associados ao esqueleto (Duffy et al., 2015).

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8 Tabela 1 - Localização do osteossarcoma extra-esquelético visceral e de tecidos moles em 33 cães (Duffy et al., 2015) .

a- As localizações de osteossarcoma externamente palpável incluem: tórax lateral (n=2), flanco (n=1), membro anterior (n=1), região dos glúteos (n=1) e região perianal (n=1)

2.2 Cão c omo Modelo d e Estud o par a Oste ossar coma Human o

Uma importante oportunidade para aumentar o conhecimento sobre a biologia e a terapia do osteossarcoma através de estudos pré-clínicos é potenciada pelo desenvolvimento espontâneo deste tumor no cão (Gorlick & Khanna, 2010). O seu comportamento espontâneo é caracterizado pelo seu crescimento durante longos períodos de tempo e pela heterogenicidade interindividual e intratumoral que levam à recorrência da doença e à metastização para locais distantes (Fenger et al., 2014). A ocorrência natural de cancro no cão tem uma vantagem intrínseca para o estudo da doença em humanos, na medida em que o cão representa um complexo biológico que não é possível obter com outros modelos de estudo (Fenger et al., 2014).

O cão é um modelo bem estabelecido para o estudo de osteossarcoma em humanos, dadas as semelhanças biológicas e genéticas da doença (Shoeneman et al., 2012). Por exemplo, em termos histológicos, o tumor em ambas as espécies é indistinguível (Guijarro et

al., 2014). Este estudo comparativo entre animais e humanos não é um conceito novo e é

denominado de oncologia comparativa (Gorlick & Khanna, 2010). A oncologia comparativa é caracterizada pela colaboração interdisciplinar, com objetivo de obter avanços tanto para humanos como para animais (Schiffman & Breen, 2015).

A estrutura genética da população canina, marcada pela presença de raças, oferece muitas vantagens para a análise genómica. A sequenciação do genoma de cães e a análise de polimorfismos de nucleótido único (SNPs) evidencia que a diversidade genética é similar àquela que é vista na população humana (Fenger et al., 2014).

O paralelismo entre o osteossarcoma canino e humano é capaz de ser o mais forte entre a oncologia comparativa. Em ambos, cão e humano, a doença é caracterizada pelo crescimento do tumor primário no esqueleto apendicular e pelo elevado risco de metastizar para os pulmões (Gorlick & Khanna, 2010). Outras características desta neoplasia, partilhadas por ambas as espécies, incluem: a presença de micrometástases no momento

Localização do Tumor Número de Cães (%)

Baço 10 (30.3%)

Massa palpável externamentea _{7 (21.2%)}

Fígado 6 (18.2%) Rim 4 (12.1%) Mesentério 2 (6.1%) Parede abdominal 2 (6.1%) Omento 1 (3.0%) Intestino Delgado 1 (3.0%)

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9 do diagnóstico e respostas semelhantes ao tratamento convencional (cirurgia e quimioterapia) (Fenger et al., 2014).

As principais diferenças prendem-se com a prevalência e a idade de desenvolvimento da doença (Gorlick & Khanna, 2010). A prevalência de osteossarcoma é pelo menos 10 vezes superior nos cães do que nos humanos (Fenger et al., 2014).Isto permite ter uma população de estudo muito maior, o que pode ser considerado vantajoso, pois a baixa prevalência de osteossarcoma na população humana é um fator limitante na maioria dos estudos (Fenger et al., 2014). Relativamente à idade, no cão desenvolve-se, principalmente, em animais de média a avançada idade, enquanto que nos humanos afeta principalmente na segunda década de vida (10-25 anos) (Gorlick & Khanna, 2010). Esta diferença, encontrada na idade, pode ser entendida como uma limitação, pois se por um lado o osteossarcoma canino afeta principalmente cães com esqueleto maduro por outro lado o osteossarcoma humano afeta jovens em crescimento (Guijarro et al., 2014). Uma outra limitação deste modelo comparativo está relacionada com facto de existirem algumas raças com mutações específicas hereditárias que podem influenciar o desenvolvimento, a biologia, a progressão e a resposta ao tratamento da doença (Guijarro et al., 2014).

Apesar dos tratamentos agressivos, nos últimos 15 anos, não tem havido melhorias no tempo de sobrevivência. No caso dos jovens afetados, 30-40% sucumbem da doença e no caso de cães mais de 90% (Fenger et al., 2014).

A elevada prevalência e rápida progressão da doença no cão permitem fazer dele um excelente modelo de estudo do desenvolvimento da doença (incluindo a doença metastática) e de novas opções de tratamento, permitindo obter resultados num relativo curto período de tempo (Guijarro et al., 2014).

2.3 Etiologia

A etiologia do osteossarcoma canino, na generalidade, é desconhecida (Mueller, 2007). No entanto, parece envolver uma complexa interação entre o ambiente, fatores físicos, a suscetibilidade genética e aberrações moleculares adquiridas (Fenger et al., 2014). Ainda não foram identificadas muitas alterações ou aberrações genéticas comuns e recorrentes que expliquem o desenvolvimento deste tumor. Sabe-se que o osteossarcoma possui um genoma desorganizado e que os achados genéticos mais consistentes são a desregulação do gene proteína tumoral 53 (TP53) e do gene retinoblastoma (RB1) (Morrow & Khanna, 2015). Devido à instabilidade genómica, o osteossarcoma é caracterizado por ter, a nível molecular, um cariótipo extremamente complexo e caótico (Thomas et al., 2009; Dobson, 2013), com várias aberrações genéticas a nível estrutural e numérico,

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10 nomeadamente desequilíbrios na dosagem entre oncogenes e supressores tumorais (Thomas et al., 2009).

Os efeitos mutagénicos da radiação ionizante e de traumas ósseos (ex: implantes metálicos) são possíveis fatores físicos também envolvidos na etiologia (Mueller, 2007).

2.3.1 Fatores Físicos

Acredita-se que fatores externos como carcinogénicos químicos, radiação ionizante, implantes metálicos e anteriores alterações ósseas como a osteomielite e fraturas podem originar osteossarcoma (Varshney et al., 2016).

A radiação ionizante experimental e terapêutica é um fator de etiologia bem documentado tanto no cão como no humano. Em cães, o osteossarcoma é uma rara complicação da radiação secundária. Foi descrito o seu desenvolvimento como resultado do uso de radiação em 3 de 87 cães (3,4%) tratados para sarcoma em tecidos moles e em 3 de 57 cães irradiados para epúlide acantomatosa na cavidade oral. De acordo com estes resultados, 21% dos cães sob elevada dose de radiação intra-operatória (mais de 25 Gy) desenvolveram osteossarcoma após o tratamento, sugerindo que elevada dose por fração e/ou dose total possa predispor ao desenvolvimento deste tumor (Ehrhart, 2013).

Alguns fatores físicos que podem estar implicados na iniciação do osteossarcoma canino incluem: o elevado peso que a região metafisária suporta e a transformação maligna junto dos implantes metálicos ou de fraturas anteriores. A proliferação rápida de células torna-as mais suscetíveis a agentes oncogénicos e a erros mitogénicos, levando à sua transformação maligna. Existem, ainda, outras condições ósseas que podem estar associadas a um maior risco de desenvolvimento de osteossarcoma tais como osteomielite crónica ou enfartes ósseos embora ainda não seja clara qual a sua relação causal (Fenger

et al., 2014).

2.3.2 Fatores Genéticos

A gama de mutações associadas ao osteossarcoma, além de grande e complexa, varia significativamente entre tumores (Gorlick & Khanna, 2010). Muitos dos genes candidatos implicados nesta doença em humanos têm sido, também, caracterizados na doença canina (Varshney et al., 2016).

A via de genes supressores tumorais pode ter um papel muito importante na etiologia do osteossarcoma. Parece que a perda de função dos genes supressores tumorais como o TP53 e o RB1 são eventos que frequentemente contribuem para o desenvolvimento inicial deste tumor (Mueller, 2007). Também o gene da fosfatase homóloga à tensina (PTEN) parece estar envolvido (Varshney et al., 2016).

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11 Em humanos e cães, o ganho de função de diversos oncogenes tem sido identificado como tendo, também, um possível papel no osteossarcoma (Varshney et al., 2016).

Via RB1: O gene RB1 codifica a proteína RB (pRB) que funciona como um regulador fundamental no ciclo celular, principalmente na transição da fase G1 para a fase S. A principal ação da pRB é ligar-se à família de fatores de transcrição E2F, prevenindo a ação desses fatores e interrompendo a progressão do ciclo celular. Quando há estímulo mitogénico, a ação de pBR é bloqueada através da sua fosforilação pela quinase dependente da ciclina 4 (CDK4) (Morrow & Khanna, 2015). Se esta via RB1 é desregulada a proliferação celular torna-se descontrolada (Mueller, 2007).

A perda de função do gene RB1 tem sido associada à formação e progressão do osteossarcoma canino e humano (Varshney et al., 2016). No caso do cão, verificou-se haver perda de número de cópias envolvendo RB1 em 29% dos osteossarcomas caninos e redução correlativa na expressão da pRB em 62 % (Fenger et al., 2014).

Por outro lado, estima-se que a mutação de ganho de função de E2F e CDK4 possa contribuir para a doença em 60% e em 10%, respetivamente (Varshney et al., 2016).

CDKN2A codifica duas proteínas, estrutural e funcionalmente distintas: p16 e p14. A p16 é um mediador da via RB1 e bloqueia a ação da CDK4, logo a sua perda de função traduz-se na inativação da pRB. Isto significa que a desregulação em CDKN2A tem o mesmo efeito que a perda de função de RB1(Morrow & Khanna, 2015).

Via TP53: O gene TP53 atua como supressor tumoral na maioria dos tumores, incluindo o osteossarcoma. A proteína p53 codificada por esse gene regula atividades celulares essenciais como a replicação celular, as vias de apoptose e a resposta aos danos no DNA. A p53 previne a replicação de células quando o seu genoma se encontra danificado, interrompendo o ciclo celular, ativando a reparação de danos ao ADN ou induzindo a apoptose. A perda da sua função leva a proliferação celular descontrolada, sendo que a mesma pode ser afetada por mutações no próprio gene TP53 ou por mutações em mediadores da sua atividade. Como é o caso da p14 (codificada por CDKN2A) que é um regulador da via TP53 e que, em condições normais, faz sequestro de MDM2, no nucléolo, impedindo que o mesmo promova a degradação de p53. Assim, desregulação em CDKN2A/p14 e em TP53 têm o mesmo efeito – inativação de p53 (Morrow & Khanna, 2015).

A desregulação na via TP53, também, pode acontecer quando o oncogene MDM2 está amplificado. O que está descrito em 2-3% dos osteossarcomas. O oncogene COPS3 também promove degradação da p53 e estima-se que exista mutação de ganho de função neste COPS3 em 20-80% dos osteossarcomas (Varshney et al., 2016).

Via PTEN: PTEN é outro gene que atua como supressor tumoral. Desempenha um importante papel na regulação da proliferação, migração e sobrevivência celular, bem como

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12 na invasão das células tumorais e na angiogénese tumoral (Mueller, 2007). A perda genómica de PTEN tem sido também documentada tanto em cães como em humanos. Linhas celulares de osteossarcoma têm demonstrado deleções de PTEN e redução da sua expressão. Estudos mais recentes indicam que a perda no número de cópias envolvendo o gene PTEN é um evento comum no osteossarcoma canino, estando presentes em 30 a 42% dos tumores analisados (Fenger et al., 2014).

ERBB-2: O recetor da tirosina quinase 2 (ERBB-2) é um oncogene que codifica o recetor 2 do fator de crescimento epidermal humano (HER-2).Este recetor induz a cascata de mecanismos que resulta na transformação e crescimento celular. A expressão de HER-2 foi estudada em 7 linhas celulares e em 10 amostras de osteossarcoma e verificou-se uma taxa de expressão de 86% e de 40%, respetivamente (Mueller, 2007).

c-Myc: Este oncogene foi avaliado a partir de 9 amostras de osteossarcoma canino e de 17 amostras de tecido ósseo normal e verificaram-se amplificações desse gene no tecido tumoral (Mueller, 2007). O c-Myc é um fator de transcrição que atua como um amplificador geral da expressão de genes, sendo responsável pela transcrição de vários genes. O c-Myc está amplificado em 6-7% dos osteossarcomas e sobreexpresso em, pelo menos, 34% dos tumores (Varshney et al., 2016).

MET: Existem estudos que mostram que o oncogene MET pode contribuir para o fenótipo maligno (metastático) do osteossarcoma canino e humano. Uma variedade de linhas celulares tumorais, incluindo do osteossarcoma, foram testadas para expressão de MET e verificou-se estar sobreexpresso em todas essas linhas celulares (Mueller, 2007).

2.3.3 Fatores Moleculares

Além da dificuldade em identificar alterações genéticas recorrentes associadas à etiologia do osteossarcoma, as células em que este tumor tem origem também parece ser uma questão pouco clara. Até há pouco tempo pensava-se que, logicamente, as células da linhagem óssea como osteoblastos, osteoclastos fossem os alvos celulares para a transformação maligna. Dados mais recentes, sugerem que este processo de transformação ocorre em células mais primitivas como as células estaminais mesenquimatosas. Este evento é caracterizado pela complexidade cariotípica que, sendo bem tolerada por estas células, permite que as mesmas se diferenciem em células da linhagem óssea (Morrow & Khanna, 2015).Verificou-se que a perda de função dos genes TP53 e RB1 nas células estaminais mesenquimatosas conduzia à formação de sarcomas em ratos. Isto foi evidenciado pela observação da passagem destas células estaminais e da sua transformação espontânea em osteossarcoma, corroborando com a hipótese de que estas células sejam as de origem do tumor (Gorlick & Khanna, 2010).

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13 Uma das principais características moleculares do osteossarcoma é o seu cariótipo complexo e aberrante que pode conter alterações estruturais (translocações e/ou rearranjos) e alterações no número de cópias de DNA (Fenger et al., 2014). A instabilidade cromossómica que se instala, pode dever-se a aberrações nos telómeros ou à perda ou ganho de cromossomas ou segmentos dos mesmos. Isto faz com a ploidia (número de cromossomas) do osteossarcoma possa variar de aneuploidia a hexaploidia (Morrow & Khanna, 2015).

A complexa disfunção cromossómica resulta na desregulação do ciclo celular e das vias de resposta aos danos do DNA (Morrow & Khanna, 2015).

Algumas moléculas parecem ter um papel importante no desenvolvimento do osteossarcoma como por exemplo: IGF-1, proteínas de ligação à IGF-1 (IGFBPs), survivina, “B-cell lymphoma 2” (Bcl-2) e a enzima ciclooxigenase 2 (COX-2).

A IGF-1 e as IGFBPs têm uma importante função reguladora na fisiologia dos osteoblastos (Mueller, 2007). IGF-1 é o fator de crescimento mais abundante do osso e é mediador anabólico dos efeitos da hormona de crescimento. É maioritariamente produzido no fígado e secretado num modo autócrino pelas células estaminais mesenquimatosas e pelos osteoblastos (Yang et al., 2016). Verificou-se que as células de osteossarcoma que expressam IGF-1 e recetores de IGF-1, exibem, também um fenótipo anti-apoptose. No osteossarcoma os níveis de IGF-1 estão, ainda, associados com o seu comportamento metastático. A relação entre a sinalização IGF-1 e patogénese de osteossarcoma não é totalmente entendida. No entanto, uma explicação possível passa pelo facto dos níveis de IGF-1 estarem associados com o peso e com o crescimento ósseo, relacionando com o facto de este tumor ser mais frequente em raças gigantes (Yang et al., 2016).

Um estudo de 2016 de Yang e colaboradores mostra que a desregulação da sinalização de IGF-1 pode representar um passo essencial na génese do osteossarcoma. Acredita-se que as IGFBPs e as proteínas relativas de IGFBPs (IGFBP-rPs) sejam inibidoras dos efeitos mitogénicos e anti-apoptose da IGF-1 e que a expressão dessas proteínas seja estimulada pela IGF-1. Parece que este mecanismo autorregulador está desregulado/interrompido no osteossarcoma. Associado a isto, há ainda evidência da perda de todas IGFBPs e IGFPrPs nas células deste tumor, quando comparado com células ósseas normais (Yang et al., 2016).

As moléculas survivinas têm duas conhecidas funções: regulação da divisão celular e inibição da apoptose. Além disso, parecem ter um papel importante na génese do osteossarcoma. Algumas survivinas localizam-se na mitocôndria e pensa-se que inibam a apoptose de forma direta através da sua libertação ou através do bloqueio da libertação do fator indutor da apoptose (FIA). Dados mais recentes sugerem que estas moléculas,

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14 também, tenham um papel na resistência à quimioterapia e na metastização da doença. As células normais não requerem survivina para sobreviverem, no entanto nas células cancerígenas, a sua presença é fundamental para a divisão celular e inibição da apoptose (Shoeneman et al., 2012).

A Bcl-2 é uma proteína pertencente a uma família que regula diferentes mecanismos celulares como a autofagia e a apoptose. A Bcl-2 é uma proteína anti-apoptose que pode proteger as células de variados estímulos de apoptose incluindo fármacos citotóxicos, radiação, calor. Na formação do tumor a apoptose é usualmente inibida e as células envolvidas ficam sujeitas a proliferação incontrolável. Além da atividade anti-apoptose, a Bcl-2 tem também a habilidade de inibir a autofagia através da ligação a um domínio específico, que tem o nome de BH3. Este mecanismo previne a acumulação de radicais de oxigénio tóxicos que podem causar instabilidade no genoma. Um estudo imunohistoquímico, investigou a expressão de Bcl-2 e verificou existir um aumento homogéneo na sua expressão em todos os casos de osteossarcoma investigados, quando comparado com amostras de osso normal. A sobreexpressão de Bcl-2 no osteossarcoma corrobora com a hipótese de que disfunção nos mecanismos de apoptose/autofagia podem ter um papel na formação do tumor (Piro, 2015).

Há muita evidência que sugere que a COX-2 e as prostaglandinas (PGE2) tenham um papel vital em vários aspetos da carcinogénese incluindo a promoção de angiogénese e a regulação negativa da apoptose. Estudos prévios têm demonstrado que COX-2 não é expressa no osso normal em cães mas, 77% das 44 amostras de osteossarcoma analisadas por Pang et al., foram positivas para expressão de COX-2. A expressão de COX-2 está correlacionada com o grau do tumor e com a sobrevivência. Dados sugerem que a sobreexpressão de COX-2 no tumor primário se correlaciona com a ocorrência de metástases distantes e com o prognóstico clinico após o desenvolvimento das mesmas (Pang et al., 2014).

2.4 Classifica ção e Co mportamento Bioló gico do Oste ossar c oma

Em termos de comportamento biológico, o osteossarcoma é particularmente agressivo nos cães, tanto local como sistemicamente, já que o desenvolvimento de metástases é muito comum (Vanel et al., 2013).

O osteossarcoma deriva da transformação maligna de osteoblastos e de células estaminais mesenquimatosas, que têm ou adquirem a capacidade de produzir osteóide. Tanto o osteossarcoma canino como o humano são classificados segundo a sua localização, tipo de células e de matriz extracelular e, ainda, segundo o grau histológico do tumor. Na maioria dos casos, o osteossarcoma localiza-se no esqueleto apendicular, tem

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15 grau histológico elevado e apresenta características osteoblásticas (tecido ósseo). No entanto, estes tumores também são capazes de se diferenciarem em tecido fibroso e em tecido condróide, corroborando com a ideia de que não têm apenas origem nos osteoblastos, mas sim em células mais primitivas e pluripotentes – as células estaminais mesenquimatosas (Fenger et al., 2014).O osteossarcoma é caracterizado em vários subtipos histológicos (fibroblástico, condroblástico e telangiectásico) baseando-se no seu padrão de diferenciação predominante. No entanto, o subtipo não influencia o comportamento biológico do tumor (Gorlick & Khanna, 2010).

O grau histológico do tumor está associado ao prognóstico e baseia-se nas suas características microscópicas: pleomorfismo celular, índice mitótico, matriz tumoral e percentagem de necrose (Fenger et al., 2014).

O osteossarcoma tem efeitos locais muito agressivos, provocando lise óssea, neoformação de osso, ou ambos os processos. Além disso, é acompanhado pela tumefação dos tecidos moles adjacentes (Ehrhart, 2013).

Apesar do local (intramedular ou superfície óssea) da formação inicial do tumor primário ser mera especulação baseada na aparência radiográfica, grande parte dos osteossarcomas originam-se no espaço intramedular e são de grau histológico elevado. Embora raro, também existem osteossarcomas intramedulares de baixo grau histológico (Gorlick & Khanna, 2010).

O osteossarcoma superficial, usualmente, origina-se em relação com córtex ou periósteo e com o mínimo envolvimento da cavidade medular. Dentro do osteossarcoma superficial encontra-se o osteossarcoma periosteal que usualmente é de grau elevado e que se origina no periósteo, tendo características invasivas que se visualizam na radiografia. Neste tipo, radiograficamente, há evidência de lise cortical com extensão do tumor no osso e nos tecidos adjacentes. É similar, em termos de histologia e de comportamento biológico, com o tumor central/intramedular. Em contraste, o osteossarcoma justa-cortical que, também, é superficial e que, também, deriva da superfície periosteal, é menos agressivo. Caracteriza-se pelo seu crescimento lento, pela sua taxa de metastização mais baixa e, consequentemente, por um prognóstico muito melhor que o intramedular. Em termos radiográficos, verifica-se a presença de lise cortical ligeira (Ehrhart, 2013).

Uma característica bem definida do osteossarcoma é a sua elevada taxa de metastização que resulta da disseminação, por via hematógena, de células tumorais do local do tumor primário para locais secundários distantes. A principal localização das metástases distantes é o parênquima pulmonar. Apesar do uso de quimioterapia sistémica, após o maneio do tumor primário, a maioria das mortes ocorrem como consequência das metástases. Antes do uso da quimioterapia o tumor primário era tratado com sucesso

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16

Figura 2 –. Apresentação típica de osteossarcoma apendicular Tumefação na região distal do rádio (Fotografia gentilmente cedida por Dr. Jordi Cairo – Canis Hospital Veterinário) através da amputação do membro afetado, no entanto, o desenvolvimento de metástases ocorria em mais de 85% dos casos. Isto sugere que, em pacientes com osteossarcoma, a difusão microscópica de células cancerígenas ocorra ao mesmo tempo que o desenvolvimento do tumor primário (Gorlick & Khanna, 2010).

A cascata de metástases representa uma série de processos que ocorrem quando a as células deixam o tumor primário e invadem o microambiente que envolve o tumor. As células infiltram-se em estruturas vasculares já existentes ou na neovascularização, sobrevivem na circulação e, depois, são sequestradas ou libertadas nos locais secundários distantes. Nestes locais, graças ao desenvolvimento de suprimento sanguíneo, há progressão e crescimento das metástases. É importante que as células metastáticas tenham capacidade de detetar, modular e controlar o stress celular para conseguirem metastizar com sucesso para os locais secundários (Morrow & Khanna, 2015).

Ainda, não há certezas sobre o momento, durante o desenvolvimento inicial do osteossarcoma, em que as células microscópicas deixam o tumor primário nem o que acontece depois. Não se sabe se essas células se movem diretamente para os pulmões onde permanecem durante longos períodos em “latência” ou se transitam do tumor primário para “ambientes protegidos” onde ficam em “latência” e depois se movem em todos aqueles passos em direção ao pulmão (Morrow & Khanna, 2015).

No momento do diagnóstico, apenas, entre 5-10% dos cães têm lesões metastáticas radiograficamente detetáveis. O osso é o segundo local mais comum para a metastização variando de 1,4 % a 28%, já os linfonodos é de 4,4% no momento do diagnóstico (Wallace

et al., 2013). A metastização para órgãos viscerais é rara e pouco reportada. Um estudo

com 157 cães, de Sacornrattana et al., verificou uma taxa de 2,5% de metastização para órgãos viscerais (Sacornrattana et al., 2012).

2.5 Sinais Clínic os

Os sinais clínicos dependem da localização do tumor primário (Szewczyk et al., 2015). Quando envolve o esqueleto apendicular, os sinais clínicos incluem: proliferação óssea ou tumefação dolorosa no local do tumor primário (Figura 2), que se pode estender aos tecidos moles envolventes; claudicação do membro afetado que, na maioria das vezes se deve a dor óssea severa, como consequência de uma agressiva osteólise maligna

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17 patológicas do osso afetado (Boerman et al., 2012; Fenger et al., 2014) e atrofia muscular do membro (Buracco, 2008).

Inicialmente, o nível de dor é moderado e responde ao uso de anti-inflamatórios não esteróides (AINES). Nesta fase, o animal pode apresentar claudicação ligeira e intermitente. No entanto, com o evoluir da doença, a dor torna-se severa e faz com que a claudicação também se torne mais grave e persistente. (North & Banks, 2009). Quando o animal, de forma aguda, deixa de fazer apoio do membro deve suspeitar-se da ocorrência de fraturas patológicas, que devem ser analisadas com recurso à radiografia (Morello et al., 2011). Os sinais sistémicos como hipertermia, anorexia ou perda de peso são incomuns na fase aguda da doença (Teixeira et al., 2010).

A nível do esqueleto axial, os sinais clínicos vão depender do osso que é afetado pelo tumor primário. Podem ocorrer sinais neurológicos quando se localiza a nível da coluna vertebral e há compressão da medula. Quando se aloja a nível retrobulbar pode originar exoftalmia. Pode ocorrer corrimento nasal (ex: epistaxis) quando se localiza na cavidade nasal. Sialorreia, halitose e instabilidade a abrir a boca são sinais que podem existir quando o osteossarcoma se encontra a nível do osso maxilar ou mandibular (Buracco, 2008). Se afeta as costelas pode haver evidência de uma massa dolorosa à palpação, evidência de sinais respiratórios e, mais raramente, de efusão pleural. Quando a pélvis é afetada podem ocorrer sinais de tenesmo, estrangúria e claudicação (North & Banks, 2009).

No osteossarcoma extra-esquelético, os sinais também dependem da localização. Afeta principalmente os órgãos viscerais da cavidade abdominal pelo que, os cães podem apresentar sinais gastrointestinais (vómito, diarreia, perda de peso); presença de uma massa à palpação abdominal e outros sinais como: hipertermia, hematúria, polidipsia/poliúria, letargia e distensão abdominal. Também pode ocorrer claudicação quando afeta os músculos dos membros (Duffy et al., 2015).

2.5.1 Osteossarcoma e Dor Óssea

Sob condições fisiológicas normais, a dor serve como um mecanismo de proteção e é originada pela despolarização de neurónios periféricos especializados, denominados de nociceptores. Estes nociceptores podem ser estimulados por vias mecânicas, químicas ou térmicas, sendo que a dor pode ser classificada como nociceptiva, neuropática ou inflamatória (Shor et al., 2015).

O osteossarcoma canino frequentemente está associado com dor e claudicação. Nestes tumores, os nociceptores residem principalmente no periósteo e na cavidade

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18 medular e podem ser patologicamente ativados por estimulação mecânica e química (Shor

et al., 2015).

Como consequência da osteólise maligna, a integridade do esqueleto regional é comprometida e ocorre distorção da conformação óssea. Esta distorção funciona como um estímulo mecânico de dor (Shor et al., 2015).

Uma variedade de mediadores químicos produzidos e secretados pelo tumor, têm a capacidade de ativar diretamente os nociceptores e induzir dor. Apesar de várias moléculas participarem na dor associada ao osteossarcoma, o fator de crescimento de nervo (NGF), a endotelina-1 (ET-1) e a prostaglandina E2 (PGE2) são as três moléculas melhor documentadas neste âmbito. Atuam como mediadores da dor no tumor ósseo e também participam nas atividades dos osteoblastos normais incluindo proliferação, migração e sobrevivência (Varshney et al., 2016).

Em amostras de osteossarcoma, Shor e colaboradores, mostraram haver evidência de proliferação excessiva de terminações nervosa no periósteo, sugerindo que a proliferação aberrante de terminações nervosas possa contribuir para a dor progressiva e intensificadora, em cães. Baseado nestes achados, será razoável sugerir que estratégias de tratamento que inibam a proliferação neuronal patológica, por exemplo através do bloqueio de NGF, possam atenuar a severidade da dor óssea neste tumor (Shor et al., 2015). Um estudo de Varshney et al.,2016, analisou in vitro células de osteossarcoma com diferentes capacidades secretoras e verificou que, entre as três moléculas (NGF, ET-1 e PGE2), a elevada concentração plasmática da PGE2 foi aquela que se encontrou de forma mais consistente. E que a sua concentração plasmática diminuiu de forma expectável após o uso de fármacos anti-inflamatórios não esteróides (AINES) (Varshney et al., 2016).

Apesar da dor localizada ser uma característica em cães diagnosticados com osteossarcoma, o espectro de manifestação da dor é heterogéneo e parece refletir uma complexa relação entre os fatores do hospedeiro e do tumor (o grau de osteólise, volume e localização do tumor). Outro fator a ter em conta é a capacidade inerente das células do osteossarcoma secretarem ativamente moléculas que contribuem, ainda mais, para este espectro de dor (Varshney et al., 2016).

2.6 Diagn óstico

O diagnóstico do osteossarcoma deve ser multidisciplinar associando história e sinais clínicos com métodos de diagnóstico histopatológicos e imagiológicos. Começará, sempre, com uma recolha completa da história (trauma, cirurgia ortopédica, outros tumores) e exame físico completo e metódico (Buracco, 2008).

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19 O “Gold Standard” do diagnóstico do osteossarcoma é a biópsia com avaliação histopatológica. Embora as técnicas de citologia aspirativa também sejam frequentemente usadas em veterinária, apenas a histopatologia nos permite obter um diagnóstico definitivo (Mueller, 2007).

Os meios imagiológicos têm um papel muito importante, não só no diagnóstico, mas também no estadiamento da doença (Morello et al., 2011). A radiografia é um dos meios imagiológicos mais usados, sendo essencial realizar diferentes projeções radiográficas ao membro afetado pelo tumor primário, à articulação adjacente e ao membro contra-lateral. A tomografia computorizada e ressonância magnética são meios mais avançados e usados para avaliar a extensão do tumor e o seu envolvimento com estruturas adjacentes como vasos, nervos e outros tecidos moles (Demiralp et al., 2011). No plano de estudos imagiológicos deve sempre incluir-se avaliação torácica, porque o osteossarcoma é um tumor invasivo com elevado potencial metastático, principalmente para os pulmões. Neste campo, a tomografia computorizada é mais sensível que a radiografia a detetar metástases pulmonares (Eberle et al., 2011).

2.6.1 Análise Sanguínea

Frequentemente, o hemograma e a análise bioquímica estão normais. A nível do hemograma podem ocorrer várias alterações inespecíficas como leucocitose ou leucopenia, ligeira anemia e aumento das alfa e/ou beta globulinas (Buracco, 2008). Achados laboratoriais bioquímicos podem mostrar um aumento na atividade da fosfataste alcalina (ALP) (Demiralp et al., 2011). No entanto, é necessário entender que a fosfatase alcalina sérica total deriva de isoenzimas com origem no fígado (lALP), no osso (bALP) e, ainda, da isoenzima induzida por corticosteroides (cALP) em animais com hiperadrenocorticismo ou a receber corticosteróides exógenos (Garzotto et al., 2000).

A hipercalcemia é rara no osteossarcoma (Buracco, 2008).

Os sinais clínicos da doença metastática pulmonar incluem inapetência, prostração e, embora menos comum, sinais respiratórios. Com as metástases pulmonares também se associa o desenvolvimento de osteopatia hipertrófica (North & Banks, 2009).

2.6.2 Radiografia

A avaliação radiográfica da lesão suspeita deve ser feita com pelo menos duas projeções: crânio-caudal e lateral. Quando se localiza no esqueleto apendicular é aconselhável comparar com o membro contra lateral, principalmente quando a lesão ainda é recente (Buracco, 2008).