INTRODUÇÃO
O uso de produtos naturais na odontologia vem crescendo a cada ano, com resultados promissores no tratamento de diversas infecções na cavidade bucal, sendo que a Fitoterapia é a ciência que utiliza as plantas para o tratamento e prevenção de diver- sas doenças. É caracterizada pela utilização de plan- tas medicinais em suas diferentes formas farmacêu- ticas, sem o uso de substâncias ativas isoladas. O Brasil tem uma das mais ricas biodiversidades do pla- neta, com milhares de espécies em sua flora, con- tando com mais de 55.000 espécies catalogadas. As plantas são importantes fontes de produtos natu- rais biologicamente ativos, muitos dos quais são prin- cípios para síntese de um grande número de fármacos e são mundialmente empregadas na me- dicina popular (Marchese et al., 2004). Uma grande porcentagem da população brasileira (82%) faz uso de produtos à base de ervas. Conforme a Organiza- ção Mundial da Saúde, 80% da população mundial utiliza desta terapêutica (fitoterapia) no atendimen- to à saúde.
Um tipo de substância natural que tem mereci- do destaque na pesquisa científica devido às suas propriedades benéficas à saúde é a própolis. A própolis é uma substância composta por material
EFEITO DA PRÓPOLIS NO CRESCIMENTO IN VITRO DE MICRORGANISMOS ASSOCIADOS À PERIODONTITE EM PACIENTES HIV-POSITIVO
Effect of propolis on in vitro growth of microrganisms associated with periodontitis in HIV positive patients
Eliana Cristina Fosquiera1, João Paulo Steffens1, Stella Maria Glaci Reinke1, Ricélia Cecília Possagno1, Vitoldo Antonio Kozlowski Junior2, Eluise Cristina de Rezende3, Elizabete Brasil dos Santos4
RESUMO
A própolis tem demonstrado ser um bom antimicrobiano frente a diferentes microrganismos. O ob- jetivo deste estudo foi avaliar in vitro a eficácia da própolis no controle de microrganismos que podem estar associa- dos à periodontite em pacientes HIV-positivo. Para isto, fo- ram utilizadas soluções de própolis marrom aquosa e alco- ólica a 12%, própolis verde alcoólica a 12% e controle posi- tivo com clorexidina 0,12%. Avaliaram-se o halo de inibição e as unidades formadoras de colônia eliminadas na pre- sença da própolis que demonstrou resultados estatistica- mente semelhantes à clorexidina sobre os microrganismos testados, sendo que a própolis verde apresentou ação antimicrobianas maior que a própolis marrom. A própolis apresentou poder antimicrobiano sobre P. aeruginosa e S.
aureus semelhantes à clorexidina (p>0,05). Em relação a C. albicans, o poder antifúngico da própolis, apesar de in- ferior ao da clorexidina, não deve ser desconsiderado. Os dados obtidos indicam que a própolis pode ser usada como coadjuvante no controle do biofilme dental em pacientes HIV-positivo, evitando os efeitos adversos da clorexidina.
UNITERMOS:
Recebimento: 06/05/08 - Correção: 22/07/08 - Aceite: 06/08/08
Própolis, Periodontite, Infecções Opor- tunistas relacionadas com a AIDS. R Periodontia 2008;
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resinoso e balsâmico coletado pelas abelhas. Tem como prin- cipais componentes as ceras, sais minerais, vitamina C e, prin- cipalmente, flavonóides, responsáveis pela ação bactericida (Torres et al., 2000; Martins et al., 2002). Há variações, por- tanto, na sua composição, que são determinadas principal- mente pela flora da área ecológica, pelos ciclos evolutivos das plantas provedoras de resinas, pelos microrganismos pre- sentes em torno da região e fatores climatológicos. Almeida et al. (1997) verificaram em seu estudo sobre determinação de flavonóides totais em amostras de própolis, que os níveis de flavonóides presentes na própolis variam em quantidade e qualidade, devido a essa grande variabilidade nas compo- sições da própolis. A própolis tem sido empregada na forma sólida; na forma de ungüento à base de vaselina, lanolina, manteiga, azeite de oliva, ou extrato óleo-alcoólico; na for- ma de extrato alcoólico; e extrato hidroalcoólico. Conforme a variação da proporção própolis/veículo, ela apresentará re- sultados bacteriostáticos ou bactericidas (Geraldini et al., 2000; Fernandes et al., 2006). Consequentemente, quanto mais características e composições de diferentes amostras de própolis são conhecidas, mais estudos na área da saúde são necessários para determinar sua aplicação no tratamen- to ou prevenção de várias doenças.
Na Odontologia, diversos estudos estão sendo realiza- dos para demonstrar a aplicação e uso da própolis em diver- sas áreas como Periodontia (periodontites e doenças gengivais necrosantes), Endodontia (infecções pulpares), Patologia Oral (aftas), Cariologia e Cirurgia Oral (feridas cirúr- gicas pós-extrações dentárias) (Manara et al., 1999; Torres et al., 2000). As funções biológicas da própolis são bactericida, bacteriostática, antiviral, fungicida, fungistática, antiflogística, antialérgica, bioestimuladora, dermatoplástica e anestésica local. Apresenta atividade citotóxica, cicatrizante do tecido ósseo, tecido cartilaginoso, polpa dental, entre outros (Martins et al., 2002).
Alguns estudos demonstraram a presença de microrga- nismos “superinfectantes” e oportunistas em pacientes HIV positivos (Nakou et al., 1997; Botero et al., 2007). A concor- dância destes estudos sobre a presença destes microrganis- mos pode ser explicada pela baixa imunidade destes paci- entes, que permite a colonização de patógenos que nor- malmente não estariam associados à periodontite em paci- entes sistemicamente saudáveis.
As infecções fúngicas da cavidade bucal são comuns em indivíduos infectados pelo vírus do HIV, sendo a candidose a lesão mais comum. Dentre as espécies de Candida, C.
albicans é a espécie mais freqüentemente isolada de candidoses bucais, entretanto outras espécies também po- dem ser responsáveis pelas infecções bucais em indivíduos
HIV positivo ou não (Moran et al, 1997, Jabra-Rizk et al, 2000).
As espécies de Candida são geralmente encontradas como microrganismos comensais normais na cavidade bucal. Po- rém, tendem a aumentar em qualquer circunstância onde a resistência do hospedeiro está comprometida, como no caso de pacientes HIV-positivo (Ramos et al., 1999; Wingeter et al., 2007). Alguns patógenos como Staphylococcus aureus, Candida albicans e Pseudomonas aeruginosa, mesmo rara- mente associados a tipos comuns de periodontites, esta- vam presentes em pacientes HIV-positivo com periodontite (Nakou et al., 1997; Botero et al., 2007).
Estudos observaram in vitro a ação da própolis sobre S.
aureus, C. albicans e P. aeruginosa verificando que ela inibe significativamente o crescimento desses microrganismos (Koo et al., 2000; Martins et al., 2002; Fernandes et al., 2006, Santos et al., 2007).
Considerando-se as excelentes propriedades da própolis e tendo em vista inúmeros relatos sobre sua aplicação clíni- ca tanto na área médica quanto odontológica, o objetivo deste estudo foi verificar, in vitro, o efeito antimicrobiano da própolis sobre S. aureus, C. albicans e P. aeruginosa, os quais podem estar associados a periodontite em pacientes HIV- positivo.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas própolis marrom extrato aquoso a 12%, manipulada na Farmácia Erva Farma (Ponta Grossa – PR), própolis marrom extrato alcoólico a 12% - Propolina® do fabricante Breyer & Cia, Extrato de própolis verde alcoólica 12%® - fabricante Apis Flora. Como controle positivo utili- zou-se o digluconato de clorexidina 0,12% - Periogard®
(Colgate-Palmolive) e como controle negativo, solução fisio- lógica.
Foram preparadas suspensões com microrganismos S.
aureus ATCC 25923, C. albicans ATCC 10231 e P. aeruginosa ATCC 27853 padronizadas, correspondendo à escala 0,5 de McFarland. As suspensões foram semeadas em duplicata, com auxilio de swab, em ágar Müeller Hilton. As placas fo- ram incubadas à 37ºC/10 minutos para secagem e a seguir, papéis de filtro foram embebidos com 3µL das soluções a serem testadas e depositadas sobre o ágar. As placas foram novamente incubadas a 37oC/24hs e a seguir mediu-se o halo de inibição do crescimento microbiano quando presen- te, com auxílio de uma régua milimetrada e lupa estereoscópica.
Para se determinar o número de unidades formadoras de colônias (ufc) eliminadas após contato com as diferentes amostras de própolis e clorexidina, 1mL da suspensão pa- dronizada em 108 células/mL de S. aureus, P. aeruginosa e
C. albicans foi pipetado em tubos de ensaio, aos quais foi adicionado 0,1mL da solução de própolis e clorexidina. Após homogeneização e descanso por 5 minutos, alíquotas de 10 µL foram semeadas, em duplicata, em ágar BHI (Brain Heart Infusion agar) e as placas incubadas a 37oC/24 h. Após incubação, determinou-se o número de colônias viáveis dos microrganismos estudados.
Os resultados foram analisados estatisticamente pelos métodos ANOVA, teste de Tukey e teste t-student. Corre- lação de Pearson foi utilizada para verificar a associação e efeito das variáveis halo de inibição e log[ufc] dos microrga- nismos viáveis frente às amostras testadas ao nível de significância de 5%.
RESULTADOS
Os resultados das atividades antibacteriana e antifúngica in vitro dos extratos aquoso e alcoólico da própolis marrom, própolis verde alcoólica e clorexidina obtidos com a avalia- ção do halo de inibição estão demonstrados na tabela 1. O resultado da contagem de ufc viável dos microrganismos testados após contato com os produtos está demonstrado na tabela 2. Os testes de difusão em ágar realizados com o álcool de cereais, que constitui o veículo usado no preparo dos extratos da própolis, não apresentaram atividade antimicrobiana. A própolis verde teve a ação mais significati- va sobre os microrganismos, produzindo halo de inibição maior do que do controle positivo em ambas as bactérias testadas, e foi o único tipo de própolis que teve ação sobre o crescimento fúngico.
O uso da própolis se mostrou eficaz em relação à ativi- dade antimicrobiana in vitro para P. aeruginosa, C. albicans e S. aureus. No teste de difusão em ágar, a própolis verde mostrou eficácia estatisticamente semelhante a da clorexidina frente a P. aeruginosa (p>0,05), enquanto que para a C.
albicans, a clorexidina demonstrou ser mais efetiva que to- das as amostras de própolis testadas sem ser estatisticamente diferente (p>0,05). Não houve diferença estatisticamente significante entre as amostras testadas frente a S. aureus (p>0,05), embora os maiores halos de inibição tenham sido observados para as amostras de própolis marrom e verde em veículo alcoólico.
Quanto ao log do número de ufc viável de P. aeruginosa, após o contato com as amostras, verificou-se que apenas não houve diferença significante entre o controle positivo (clorexidina) e a solução de própolis verde extrato alcoólico (p>0,05). Para o S. aureus, todas as amostras inibiram a formação das unidades de colônias, com exceção da própolis marrom extrato aquoso não sendo, entretanto, o log[ufc]
diferente do controle positivo (p>0,05). Embora a contagem
observada para C. albicans tenha sido menor para a própolis verde extrato alcoólico, ela foi estatisticamente diferente da clorexidina a 0,12% (p<0,01), enquanto para a própolis marrom extrato aquoso e alcoólico a diferença para o con- trole positivo foi muito mais signficante (p<0,001).
Os dados obtidos das variáveis observadas foram sub- metidos à correlação de Pearson (Figura 1) obtendo-se o valor de r = – 0,6091 com 95% do intervalo de confiança, ficando entre – 0,8766 e – 0,05398 sendo a correlação entre o log[ufc]
e o halo de inibição negativo e significante (p=0,0355).
DISCUSSÃO
Alguns estudos demonstraram a presença de microrga- nismos “superinfectantes” e oportunistas em paciente HIV- positivo (Nakou et al., 1997; Botero et al., 2007). A concor- dância destes estudos sobre a presença destes microrganis- mos pode ser explicada pela baixa imunidade destes paci- entes, que permite a colonização de patógenos que nor- malmente não estariam associados a periodontite em paci- entes sistemicamente saudáveis. Além disso, o microrganis- mo S. aureus foi relacionado com pacientes não responsivos ao tratamento periodontal (Edwardsson et al., 1999). Esta relação pode evidenciar grande virulência e patogenicidade deste microrganismo, implicando na necessidade de sua eli- minação para o restabelecimento da saúde periodontal.
A terapia periodontal básica e não cirúrgica em pacien- tes com doença periodontal visa a remoção de depósitos de cálculo e biofilme dental, sendo relatada na literatura insufi- ciência desta técnica em eliminar completamente os micror- ganismos envolvidos na doença (Waerhaug, 1978). Isto sig- nifica que a remoção completa da microbiota local não re- presenta condição indispensável para o restabelecimento da saúde periodontal. No entanto, em pacientes imunocomprometidos, suprimidos ou que não responderam ao tratamento periodontal inicial, a variedade de espécies microbiológicas promove diminuição nas taxas de sucesso no tratamento periodontal convencional.
A análise estatística não encontrou diferenças significa- tivas entre o controle positivo clorexidina e as soluções tes- tadas sobre nenhum microrganismo (p>0,05) na avaliação do halo de inibição do crescimento microbiano (Tabela 1).
Apesar do resultado favorável à utilização das diferentes amostras de própolis, é interessante observar a importância da formação e diâmetro deste halo, uma vez que a presença do mesmo revela o poder antimicrobiano da solução empre- gada. A clorexidina tem sido amplamente utilizada como controle positivo para avaliação do potencial antimicrobiano em testes de soluções. Embora possa ser discutida a confiabilidade da técnica de difusão em ágar, uma vez que
erros podem ocorrer em várias etapas do seu desenvolvi- mento, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), disponibiliza normativas desenvolvidas pelo CLinical Laboratory Standards Institute (CLSI, anteriormente desig- nado NCCLS - National Committee for Clinical Laboratory Standards), que sendo seguidas, reduz o risco de variações entre os testes. Em nosso estudo, com a padronização dos ensaios e obtenção de resultados semelhantes nas duplica- tas, não se observou a necessidade de se realizar testes em triplicata ou em maior número de repetições, observando- se uma coerência entre os dados obtidos, uma vez que foi constatada uma significante correlação negativa para as va- riáveis estudadas (p=0.0355) demonstrando que, à medida que aumenta o halo de inibição, diminui o log [ufc] dos mi- crorganismos viáveis (Figura 1).
A própolis marrom não se mostrou efetiva em inibir o crescimento de C. albicans tanto em solução alcoólica quanto aquosa (Tabela 2). A própolis aquosa não demonstrou po- tencial antimicrobiano sobre S. aureus ou C. albicans, mas teve resultado superior ao controle positivo sobre a bactéria Gram negativa P. aeruginosa (Tabela 1), o que seria interes- sante verificar em estudos posteriores, uma vez que os três microrganismos utilizados no presente estudo possuem ca- racterísticas distintas, por ser S. aureus uma bactéria gram
positiva, P. aeruginosa gram negativa e C. albicans um fun- go colonizador da cavidade bucal.
Quando se realizou o teste para se verificar qual o nú- mero de ufc viáveis após contato de cinco minutos com a própolis, o extrato alcoólico de própolis verde foi o que de- monstrou maior potencial antimicrobiano (Tabela 2), e a própolis em extrato aquoso demonstrou ineficiência sobre o fungo testado. Entre os microrganismos, S. aureus foi o que Halo de inibiçãoa
Microrganismos Própolis marrom Própolis marrom Própolis verde Clorexidina Testados extrato aquoso extrato alcoólico extrato alcoólico 0,12%
P. aeruginosa 12,50 (6,50)ns 7,50 (7,50)ns 16,00 (4,00)ns 11,50 (3,50)
S. aureus 0,00 (0,00) 17,50 (2,50)ns 17,50 (2,50)ns 14,00 (4,00)
C. albicans 0,00 (0,00) 0,00 (0,00) 15,50 (1,50)ns 19,50 (8,50)
Tabela 1
HALO DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO BACTERIANO E FÚNGICO EM MM DAS DIFERENTES SOLUÇÕES FRENTE A MICRORGANISMOS FREQUENTEMENTE RELACIONADOS À PERIODONTITE EM PACIENTES HIV-POSITIVO
(p=0.045, ANOVA)
a Valor em mm obtido da média de duas repetições (erro padrão da média).
ns Não significante versus clorexidina 0,12%
Unidades formadoras de colônia viáveisa
Microrganismos Própolis marrom Própolis marrom Própolis verde Clorexidina Testados extrato aquoso extrato alcoólico extrato alcoólico 0,12%
P. aeruginosa 2,49 (0,05) 2,08 (0,27) 0,30 (0,30)ns 0,35 (0,35)
S. aureus 0,39 (0,39)ns 0,00 (0,00)ns 0,00 (0,00)ns 0,00 (0,00)
C. albicans 8,00 (0,00) 2,27 (0,02) 1,49 (0,06) 0,00 (0,00)
Tabela 2
LOG DO NÚMERO DE UFC VIÁVEL DOS MICRORGANISMOS TESTADOS APÓS CONTATO COM OS EXTRATOS DE PRÓPOLIS
(p<0.0001, ANOVA)
a Valor em log obtido da média de duas repetições (erro padrão da média).
ns Não significante versus clorexidina 0,12%
Figura 1- Correlação de Pearson entre log[ufc} dos microrganismos viáveis e halo de inibição de crescimento (mm) obtido para as amostras testadas.
demonstrou maior sensibilidade a todas as soluções testa- das (Tabela 2).
Mesmo com o amplo aceite pela literatura disponível sobre as variações no potencial antimicrobiano da própolis de acordo com a região geográfica da coleta, espécie de abelha coletora ou sua forma de preparo, a formulação uti- lizada neste estudo demonstrou efeitos semelhantes aos achados em outros estudos. Martins et al. (2002) e Fernandes et al. (2006), também verificaram propriedades antimicrobianas da própolis. Ota et al. (1998), demonstra- ram sensibilidade de S. aureus à própolis alcoólica através de halo de inibição, concordando com o presente estudo. Tam- bém Endler et al. (2003) através de antibiograma com própolis alcoólica, verificou halo de inibição de crescimento bacteriano para P. aeruginosa e S. aureus, mesmo utilizando concentra- ções diferentes.
Azevedo et al.(1999) e Kujumgiev et al.(1999), observa- ram potencial antifúngico da própolis frente a espécies de Candida, o que também pôde ser observado neste estudo através da diminuição no número de colônias frente a própolis em extrato alcoólico, apesar de se evidenciar através do halo de inibição importante efeito apenas para a própolis verde (Tabela 1), o que pode ter ocorrido devido ao maior contato do produto com as células fúngicas ou uma maior disponi- bilidade dos fitofármacos ou princípios ativos presentes nes- te tipo de própolis.
Apesar de bem aceito que o controle negativo com so- lução alcoólica pura demonstra resultados muito inferiores a solução alcoólica de própolis (Santos et al., 2007), observa- ram-se neste estudo diferenças significativas entre extrato aquoso e alcoólico de própolis. Outros estudos devem ser realizados para se avaliar qual o real efeito do álcool sobre estes microrganismos ou sobre o extrato de própolis na metodologia utilizada.
A ação antimicrobiana da própolis demonstrada neste estudo frente a microrganismos que podem estar associa- dos a periodontite em pacientes HIV-positivo, algumas ve- zes comparável com a da clorexidina, pode representar uma opção de adição em dentifrícios, pastilhas ou soluções para bochechos, evitando-se os efeitos colaterais da clorexidina como manchamento dental, alteração de paladar e descamação da mucosa, podendo ser utilizada como coad-
juvante no controle do biofilme dental nestes pacientes.
Apesar da diferença entre o poder antimicrobiano de um produto sobre um microrganismo isolado e em biofilme, su- gerem-se mais estudos para verificar se esta propriedade pode ser extrapolada para estas estruturas complexas presentes na cavidade bucal.
CONCLUSÃO
A própolis apresentou poder antimicrobiano sobre P. aer uginosa e S. aureus semelhantes à clorexidina (p>0,05). Em relação à C. albicans, o poder antifúngico da própolis, apesar de inferior ao da clorexidina, não deve ser desconsiderado sendo que a própolis verde apresentou ação antimicrobiana maior que a própolis mar rom.
Os dados obtidos indicam que a própolis pode ser usada como coadjuvante no controle do biofilme dental em pacientes HIV-positivo, evitando os efeitos adversos da clorexidina.
ABSTRACT
It has been demonstrated that propolis is a good antibiotic against different microorganisms. The purpose of this study was to evaluate in vitro the efficiency of propolis against microorganisms that can be related to periodontitis in HIV-positive patients. 12% alcoholic and aqueous brown propolis solutions, 12% alcoholic green propolis solution and 0.12% chlorhexidine were used. The halos of microbial growth inhibition and CFU eliminated in contact with propolis were determined. The results demonstrated differences not statistically significant between propolis and the clorhexidine on the microorganisms tested. Green propolis was more effective than brown propolis. Propolis, showed an antimicrobial effect against P. aeruginosa and S. aureus simi- lar to clorhexidine (p>0,05). In relation to C. albicans, the antifungal effect, although inferior to clorhexidine, should not disregarded. The data obtained suggest that propolis may be used as a good substitute for chlorhexidine without its adverse effects in controlling microorganisms from HIV- positive patients.
UNITERMS: Propolis, Periodontitis, AIDS-Related Opportunistic Infections
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Endereço para correspondência:
Elizabete Brasil dos Santos
Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG - Campus Uvaranas Av. Carlos Cavalcanti, 4748 - Departamento de Odontologia Bloco M CEP: 84030-900 - Ponta Grossa – PR – Brasil
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