Resposta imune a antígenos de M. leprae e M. tuberculosis na proteção e na patogênese da hanseníase

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA DOUTORADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. MARISE DO VALE SIMON. RESPOSTA IMUNE A ANTÍGENOS DE M. leprae E M. tuberculosis NA PROTEÇÃO E NA PATOGÊNESE DA HANSENÍASE. ARACAJU 2013.

(2) MARISE DO VALE SIMON. RESPOSTA IMUNE A ANTÍGENOS DE M. leprae E M. tuberculosis NA PROTEÇÃO E NA PATOGÊNESE DA HANSENÍASE. Tese apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde.. Orientadora : Profa. Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus. ARACAJU 2013 i.

(3) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. S595r. Simon, Marise do Vale Resposta imune a antígenos de M. leprae e M. tuberculosis na proteção e na patogênese da hanseníase / Marise do Vale Simon. – Aracaju, 2013. 144 f. : il. Orientador (a): Profa. Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde) – Universidade Federal de Sergipe, Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Núcleo de Pós-Graduação em Medicina. 1. Hanseníase - Patogênese 2. Mycobacterium leprae 3. Antígenos 4. Patologia 5. Dermatologia I. Título. CDU 615.5-002.73-092. ii.

(4) MARISE DO VALE SIMON. RESPOSTA IMUNE A ANTÍGENOS DE M. leprae E M. tuberculosis NA PROTEÇÃO E NA PATOGÊNESE DA HANSENÍASE Tese apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Doutor em Ciências da Saúde. Aprovada em: 01/02/2013 __________________________________________________ Orientador: Profa. Dra. Amélia Ribeiro de Jesus __________________________________________________ 1° Examinador: Prof. Dr. Antônio Márcio Barbosa Júnior __________________________________________________ 2° Examinador: Prof. Dra. Cristiane Bani Corrêa __________________________________________________ 3º Examinador: Profa. Dra. Tatiana Rodrigues de Moura __________________________________________________ 4º Examinador: Prof. Dr. Walderi Monteiro da S. Júnior PARECER ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ iii.

(5) Dedico este trabalho a toda minha família.. iv.

(6) AGRADECIMENTOS. A Deus, que na sua infinita bondade deu-me coragem para optar pela realização deste sonho. À minha mãe, ao meu padrasto (in memorium) e meus irmãos que sempre me deram apoio e incentivo. À minha família, especialmente meu esposo Vitor pela compreensão e apoio nos momentos de ausência e pela ajuda na interpretação dos dados estatísticos. À Maria dos Anjos Jardim Botelho e Bacelar Rocha Botelho pela acolhida no período em que fiquei hospedada na residência deles em Belo Horizonte. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES por viabilizar a realização deste trabalho com a concessão de bolsa de estudo. À Universidade Federal de Sergipe (UFS), Aracaju-SE, pela oportunidade de uso de suas instalações e laboratórios para realização deste trabalho. Ao Infectious Research Immunology Institute (IDRI), Seattle, Washington-USA por fornecer os antígenos utilizados nesta pesquisa. À minha orientadora Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus pela amizade, confiança, apoio, incentivo e indispensável orientação durante o desenvolvimento deste trabalho. Ao Dr. Malcolm Duthie e ao Dr. Steven Reed pela concessão dos antígenos utilizados na pesquisa. Aos professores Dra. Tatiana Rodrigues de Moura, Dr. Roque Pacheco e Dr.Paulo Leopoldo, pelas orientações. Aos colegas Danillo Menezes dos Santos, Daniela Oliveira, Cecília Vazquez, Jonnia Sherlock Araújo, Lenise Franco, Adriana Lima, Priscila Lima e demais colegas de laboratório pela colaboração na realização desse trabalho. Aos funcionários do laboratório de análises clínicas do Hospital Universitário, especialmente Cândida Regina de Oliveira Vasconcelos e Paulo Herlan Castro dos Santos que sempre ajudaram na coleta de sangue dos pacientes e familiares. Aos Funcionários da Patologia, especialmente a Sra. Rosinalva Santos Soares (D. Rosa) e o Sr. Edson José Dionísio sempre prontos a me ajudar na busca dos laudos das biópsias. Aos funcionários do Ambulatório da Dermatologia. Ao pessoal do Núcleo de Pós-graduação em Ciências da Saúde na pessoa do Prof. Dr. Ricardo Gurgel e as secretárias Jolinda e Marta sempre atenciosos e prontos para resolver os problemas. Por fim, a todos que direta ou indiretamente ajudaram na realização deste trabalho, Muito Obrigada.. v.

(7) RESUMO. A hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae, bactéria intracelular que causa lesões cutâneas e neurológicas com perda de sensibilidade. A doença se constitue num importante problema de saúde pública, inclusive no Brasil. Muitos aspectos da sua imunopatogênese ainda não foram esclarecidos. A impossibilidade de crescimento do bacilo em cultura inviabiliza um maior número de estudos experimentais. O uso de antígenos recombinantes é uma importante ferramenta na identificação de proteínas específicas do M. leprae com potencial para utilização futura em testes imunodiagnósticos, em imunoprofilaxia e imunoterapia. O objetivo desse trabalho foi avaliar a resposta imune a antígenos de M. leprae e M. tuberculosis na proteção e patogênese da hanseníase, utilizando um ensaio simples com sangue total. Pacientes com diagnóstico confirmado de hanseníase utilizando critérios clínicos, baciloscópico e histopatológico foram selecionados. A classificação operacional dos pacientes e o exame neurológico para avaliação do grau de incapacidade física foram realizados. Os pacientes foram acompanhados e alguns deles evoluíram com reações hansênicas. Os controles intradomiciliares contactantes dos pacientes foram também selecionados. O sangue periférico de 55 pacientes com hanseníase, sem tratamento (39 paucibacilar e 16 multibacilar) e 31 controles foram estimulados com o antígeno bruto sonicado de M. leprae (MLCS), antígeno purificado derivado de M. tuberculosis (PPD), 12 antígenos recombinantes de M. leprae (ML0276, ML2028, ML2055, ML2258, ML2531, ML2629, ML82F, ML2044, ML2380, ML2331, LID1 e PADL) e 2 de M. tuberculosis (ID93, ID83). Após 24h de incubação os sobrenadantes foram coletados e foram determinadas as concentrações das citocinas IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13 IL-15, 1L-17A, IL23, IL-27, IFN-γ, TNF-α e TGF-β, e das quimiocinas eotaxina, MCP-1 e MIP-1α, pela técnica de Luminex. Foi observada uma elevada concentração de IFN-γ e IL-2 (resposta Th1) em resposta aos antígenos MLCS e PPD em pacientes com as formas paucibacilares e nos controles contactantes dos doentes, quando comparados àqueles com as formas multibacilares da doença. Porém, não foi observado diferenças estatisticamente significativas quando analisada a resposta a esses mesmos antígenos em pacientes que posteriormente evoluíram com reações hansênicas (n=26) e não evoluíram com reação hansênica (n=16) e que tinham ao início do tratamento, grau de incapacidade física 0 (n=22) em comparação com 1 e 2 (n=33). Maiores concentrações de IFN-γ foram detectadas em pacientes paucibacilares em resposta ao antígeno PADL, quando comparado com os pacientes multibacilares. Houve também maior produção de MCP-1 em resposta ao ID93 e ML2531 nos pacientes que evoluíram com reações hansênicas. Em conclusão, a produção de MCP1 em resposta aos antígenos ID93 e ML 2531 pode ser testada como marcador de reações hansênicas, o antígeno MLCS apresenta um comportamento semelhante ao antígeno PPD e pode ser um marcador de resposta protetora na hanseníase. O antígeno PADL pode estar associado à indução de resposta protetora, sugerindo que MLCS e PADL são antígenos promissores para utilização em imunoterapia ou imunoprofilaxia na hanseníase. Palavras chave: Hanseníase; Mycobacterium leprae; antígenos; resposta imune. vi.

(8) ABSTRACT. Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, intracellular bacterium that causes skin lesions and neurological disorders with sensory loss. The disease constitutes a major public health problem, including Brazil. Many aspects of its immunopathogenesis are still unclear. The inability of growth in culture of bacillus impedes a greater number of experimental studies. The use of recombinant antigens is an important tool for the identification of specific proteins of M. leprae with potential for future use in immunodiagnostic tests in immunoprophylaxis and immunotherapy. The aim of this study was to evaluate the immune response to antigens of M. leprae and M. tuberculosis in protection and pathogenesis of leprosy, using a simple assay with whole blood. Patients with confirmed diagnosis of leprosy using clinical, bacteriological and histological were selected. The operational classification of patients and neurological examination to evaluate the degree of disability were performed. Patients were followed up and some of them have evolved with reactions. The controls household contacts of patients were also selected. The peripheral blood of 55 patients with leprosy, without treatment (39 paucibacillary and 16 multibacillary) and 31 controls were stimulated with antigen crude sonicate of M. leprae (MLCs), purified antigen derived from M. tuberculosis (PPD), 12 recombinant antigens of M. leprae (ML0276, ML2028, ML2055, ML2258, ML2531, ML2629, ML82F, ML2044, ML2380, ML2331, and LID1 PADL) and 2 M. tuberculosis (ID93, ID83). After 24 hours of incubation supernatants were collected and concentrations were determined cytokines IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12p70, IL-13, IL-15, 1L-17A, IL-23, IL-27, IFN-γ, TNF-α and TGF-β, and the chemokine eotaxin, MCP-1 and MIP-1α by Luminex technique. We observed a high concentration of IFN-γ and IL-2 (response Th1) in response to antigens MLCs and PPD in patients with paucibacillary forms and controls in contacts of patients, compared to those with multibacillary forms of the disease. However, no statistically significant differences were observed when analyzing the response to such antigens in patients who subsequently developed with leprosy reactions (n=26) and did not develop leprosy reaction (n = 16) and had the beginning of treatment, degree of disability Physical 0 (n=22) in comparison with the first and second (n=33). Higher concentrations of IFN-γ were detected in patients paucibacillary PADL in response to antigen when compared with patients multibacillary. There was also increased production of MCP-1 in response to ML2531 ID93 and in patients who developed reactions. In conclusion, the production of MCP1 in response to antigens ML 2531 and ID93 can be assayed as a marker of leprosy reactions, antigen MLCs shows a behavior similar to PPD antigen and may be a marker of protective response in leprosy. The PADL antigen may be associated with induction of protective response, suggesting that PADL and MLCs are promising antigens for use in immunotherapy or immunoprophylaxis in leprosy. Keywords: leprosy; Mycobacterium leprae; antigens; immune response. vii.

(9) LISTA DE TABELAS. Tabela 1.. Características dos antígenos de M.leprae ......................................... 33. Tabela 2.. Descrição dos dados demográficos e clínicos dos pacientes e controles em que foram avaliadas as respostas imunes .................... 42. viii.

(10) LISTA DE FIGURAS. Gráfico 1.. Gráfico 2.. Gráfico 3.. Gráfico 4.. Gráfico 5.. Gráfico 6.. Gráfico 7.. Gráfico 8.. Gráfico 9.. Comparação entre as concentrações de IFN-γ em resposta ao antígeno purificado de M. tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M.leprae de pacientes com as formas multibacilares e paucibacilares de hanseníase e controles contactantes ..................................................... 43. Correlação direta entre as concentrações de IFN-γ em resposta aos estímulos com o antígeno purificado derivado de M.tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M. leprae nos pacientes e controles contactantes....................................................................................... 44. Comparação entre as concentrações de IL-2 em resposta ao antígeno purificado de M. tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M.leprae de pacientes com as formas multibacilares e paucibacilares de hanseníase e controles contactantes...................................................... 45. Correlação direta entre as concentrações de IL-2 em resposta aos estímulos com o antígeno purificado derivado de M.tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M. leprae nos pacientes e controles contactantes......................................................................................... 45. Correlação direta entre as concentrações de IFN-γ e IL-2 em resposta ao estímulo com o antígeno purificado derivado de M.tuberculosis nos pacientes e controles contactantes......................................................... 46. Correlação direta entre as concentrações de IFN-γ e IL-2 em resposta ao estímulo com o antígeno sonicado bruto de M. leprae nos pacientes e controles contactantes.......................................................................... 46. Comparação entre as concentrações de IFN-γ em resposta ao antígeno recombinante de M.leprae PADL (fusão quimérica dos epítopos de linfócitos B de antígenos de M. leprae ML0405, ML2331, ML2055, ML0411, ML0091s) de pacientes com as formas multibacilares e paucibacilares de hanseníase e controles contactantes............................... 47. Concentração de MCP-1 em sobrenadantes de culturas estimuladas com o antígeno recombinante ID93 de M. tuberculosis, em pacientes que evoluíram ou não com reação hansênica e controles contactantes dos doentes............................................................................................. 48. Concentração de MCP-1 em sobrenadantes de culturas estimuladas com o antígeno recombinante ML2531 de M. leprae, em pacientes que evoluíram ou não com reação hansênica e controles contactantes dos doentes.............................................................................................. 48. ix.

(11) Gráfico 10.. Gráfico 11.. Gráfico 12.. Gráfico 13.. Gráfico 14.. Gráfico 15.. Comparação entre as concentrações de IFN-γ em resposta ao antígeno purificado de M. tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M.leprae entre pacientes que evoluíram ou não com reação hansênica e controles contactantes....................................................................................... 49. Comparação entre as concentrações de IL-2 em resposta ao antígeno purificado de M. tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M.leprae entre pacientes que evoluíram ou não com reação hansênica e controles contactantes........................................................................................ 49. Comparação entre as concentrações de IFN-γ em resposta ao antígeno purificado de M. tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M.leprae em pacientes com ou sem incapacidades físicas e controles contactantes....................................................................................... 50. Comparação entre as concentrações de IL-2 em resposta ao antígeno purificado de M. tuberculosis e o antígeno sonicado bruto de M.leprae em pacientes com ou sem incapacidades físicas e controles contactantes....................................................................................... 51. Comparação entre as concentrações de MCP-1 em resposta ao antígeno recombinante ID93 de M. tuberculosis em pacientes com ou sem incapacidades físicas e controles contactantes........................................ 51. Comparação entre as concentrações de MCP-1 em resposta ao antígeno recombinante ML2531 de M. leprae em pacientes com ou sem incapacidades físicas e controles contactantes........................................ 52. x.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS. M. leprae. Mycobacterium leprae. MS. Ministério da Saúde. OMS. Organização Mundial de Saúde. SINAN. Sistema de Informação de Agravos de Notificação. HU. Hospital Universitário. UFS. Universidade Federal de Sergipe. IB. Índice baciloscópico. EMG. Eletromiografia. BAAR. Bacilo Álcool-ácido-resistente. HI. Hanseníase Indeterminada. HT. Hanseníase Tuberculóide. HD. Hanseníase Dimorfa. HV. Hanseníase Virchowiana. HDT. Hanseníase Dimorfa Tuberculóide. HDD. Hanseníase Dimorfa Dimorfa. HDV. Hanseníase Dimorfa Virchowiana. PB. Paucibacilar. MB. Multibacilar. RR. Reação Reversa. ENH. Eritema Nodoso Hansênico. PQT. Poliquimioterapia. BCG. Bacilo Calmette-Guérin. PPD. Derivado Protéico Purificado. GIF. Grau de incapacidade Física. CMI. Imunidade mediada por célula. Th. T auxiliar. NK. Natural Killer (matadoras). T regs. T reguladoras. xi.

(13) TLR (Toll). Receptor Semelhante a Toll. MHC. Complexo Principal de Histocompatibilidade. PAMPs. Padrões Moleculares Associados ao Patógeno. DNA. Ácido Desoxirribonucléico. IL. Interleucina. TNF. Fator de Necrose Tumoral. TGF. Fator de transformação do crescimento. IFN. Interferon. MCP 1. Proteína Quimiotática de Monócito 1. MIP 1. Proteína Inflamatória de Macrófago 1. CD. Grupamento de Diferenciação. G-CSF. Fator de Estimulação de Colônia de Granulócitos. CCL-20. Quimiocina Ligante 20. FoxP3. Fator de Transcrição Box P3. NOD2. Domínio de Ligação de nucleotídeo 2. HIV. Vírus da Imunodeficiência Humana. HTLV. Vírus T Linfotrópico Humano. RPM. Rotações por minuto. µg. Micrograma. °C. Graus Celsius. CO2. Gás Carbônico. µl. Microlitro. pg/ml. Picogramas por mililitro. WBA. Amostra de sangue total. UI. Unidade Internacional. %. Porcento. xii.

(14) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 15. 2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 17. 2.1 O Mycobacterium leprae e sua transmissão........................................................... 17. 2.2 Epidemiologia................................................................................................... 18. 2.3 Diagnóstico e formas clínicas da hanseníase de acordo com a imunopatogênes........ 19. 2.4 Aspectos imunológicos envolvidos na resposta imune ao M. leprae....................... 21. 2.5 Complicações na Hanseníase.............................................................................. 26. 2.5.1.Reações hansênicas............................................................................................................ 26. 2.5.2.Incapacidades Físicas..................................................................................... 29. 2.6. Estudos avaliando a resposta imune a antígenos complexos e específicos do M. leprae e M. tuberculosis ........................................................................................................................... 30. 3. OBJETIVOS.................................................................................................................. 35. 3.1 Objetivo Geral................................................................................................... 35. 3.2 Objetivos Específicos.......................................................................................... 35. 4. METODOLOGIA......................................................................................................... 36. 4.1. Comitê de Ética ...................................................................................................................... 36. 4.2. Desenho do Objetivo 1............................................................................................................ 36. 4.2.1. Participantes do estudo....................................................................................................... 36. 4.2.2. Antígenos............................................................................................................................... 37. 4.2.3. Determinação da resposta imune celular pelo ensaio de sangue total (WBA).......................... 38. 4.3. Desenho do Objetivo 2........................................................................................................... 39. 4.3.1. Participantes do estudo.......................................................................................................... 40. 4.3.2. Antígenos............................................................................................................................... 40. 4.3.3. Determinação da resposta imune celular pelo ensaio de sangue total (WBA)...................... 40. 4.4. Desenho do Objetivo 3............................................................................................................ 40. 4.4.1. Participantes do estudo.......................................................................................................... 40. xiii.

(15) 4.4.2. Comparação da resposta imune entre pacientes que apresentaram ou não do grau de incapacidade física ao diagnóstico.................................................................................................. 41. 4.5. Análises Estatísticas................................................................................................................ 41. 5. RESULTADOS.......................................................................................................................... 42. 5.1. Descrição da amostra estudada............................................................................................. 42. 5.2. Resposta imune em resposta a antígenos de M. leprae e M. tuberculosis dos pacientes com hanseníase subdivididos de acordo com a classificação operacional (Objetivo 1) ........ 43. 5.2.1. Produção de IFN-γ................................................................................................................. 43. 5.2.2. Produção de IL-2................................................................................................................... 43. 5.3. Resposta imune em resposta a antígenos recombinantes de M. leprae e M. tuberculosis ..... 47. 5.4. Resposta imune em resposta a antígenos de M. leprae e M. tuberculosis dos pacientes com hanseníase subdivididos de acordo com o desenvolvimento de reação hansênica (Objetivo 2) ... 47. 5.5. Resposta imune em resposta a antígenos de M. leprae e M. tuberculosis dos pacientes com hanseníase que apresentaram algum grau de incapacidade (Objetivo 3) ....................... 55. 6. DISCUSSÃO ................................................................................................................. 53. 7. CONCLUSÕES............................................................................................................. 59. 8. PERSPECTIVAS………………………………………………………………….... 60. 9. FONTE DE FINANCIAMENTO …………………………………………………... 61. 10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………….... 62. APÊNDICE A - Termo de consentimento livre esclarecido.......................................... 74. APÊNDICE B - Questionário clínico epidemiológico................................................................. 80. APÊNDICE C - Artigo 1: Clinical, immunological and genetics aspects in leprosy…………. 84. APÊNDICE D - Artigo 2: Physical impairment are frequent and inadequately treated in leprosy patients …………………………………………………………………………………... 103. ANEXO A: Documento de aprovação da pesquisa pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital Universitário da Universidade Federal de Sergipe e Comissão Nacional de Ética em Pesquisa/ CONEP/Brasil……………………………………………………................................................. 123. ANEXO B - Ficha de avaliação neurológica……....………………………………...................... 124. Anexo C - Formulário de avaliação do grau de incapacidade ....................................................... 126. Anexo D - Protocolo Luminex ………………………………………………………………….. 127. xiv.

(16) 15. 1. INTRODUÇÃO. Hanseníase é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium leprae ou bacilo de Hansen, uma micobactéria intracelular álcool-ácido-resistente (BAAR) que infecta células endoteliais/periendoteliais e monócitos/macrófagos da pele, e células de Schwann dos nervos periféricos (ABULAFIA E VIGNALE, 1999). No mundo, estima-se que existam 2 milhões de casos da doença (NSAGHA, 2011), e segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), no início de 2011 foram detectados cerca de 192.246 novos casos (OMS, 2011). No Brasil, a prevalência da hanseníase é de 1,54 casos para 10.000 habitantes e em Sergipe a prevalência da doença é ainda maior, 2,07 doentes para cada 10.000 habitantes, segundo dados do Ministério da Saúde (MS, 2011), configurando um sério problema de saúde pública. Estima-se que apenas um terço dos casos seja notificado, e que muitos pacientes não cumprem o tratamento ou interrompem a terapia, aumentando o impacto da doença (MIRANZI et al., 2010). Alguns fatores justificam o difícil controle da hanseníase. A impossibilidade atual de cultivo in vitro do seu agente etiológico, dificultando a realização de estudos experimentais e o desenvolvimento de vacinas, a propagação do bacilo que se dá principalmente por via aérea (NOORDEEN, 1994), sua alta infectividade e baixa virulência e patogenicidade com período de incubação longo variando de 2 a 5 anos, dificultando a identificação de indivíduos transmissores na população (MODLIN E REA, 1987), seu tropismo pelas células do sistema nervoso periférico, o que possibilita sua multiplicação em um ambiente pouco permissivo à ação de medicamentos e dos produtos da resposta imune (MS, 2009). No entanto, a maioria da população é resistente à infecção que pode ser avaliada pela reação intradérmica positiva ao antígeno bruto de M. leprae (lepromina) ou teste de Mitsuda. Na população adulta, o índice de positividade deste teste é de 70% a 90% (JOB et al., 1982). O indivíduo infectado, na dependência de sua resistência natural pode desenvolver uma das formas da doença, que tem uma expressão espectral, refletindo os variáveis graus de resposta imune mediada por células (CMI) dos pacientes (MYRVANG et al., 1973). O controle de uma infecção depende da habilidade do organismo produzir uma resposta imune eficiente que controle o agente infeccioso, mas não induza muito dano tecidual. A ação coordenada do sistema imune com produção e mobilização de vários tipos de citocinas e quimiocinas envolvidas nos mecanismos inflamatórios, anti-inflamatórios ou moduladores da.

(17) 16 resposta imune é crítica para que ocorra o estabelecimento ou cura da infecção. Entretanto, a falta de controle sobre uma resposta inflamatória exacerbada pode ser a maior causa de morbidade. A exemplo do que foi descrito em leishmaniose mucosa (CARVALHO et al.,2007; FARIA et al., 2005) e tuberculose (FERRARA et al., 2006; ZHANG et al., 1995), na hanseníase a ausência de resposta imune ou a hipersensibilidade ao M. leprae está diretamente ligada à patogênese da doença, explicando as diversas formas clínicas de lesão, bem assim as complicações da doença, como as reações hansênicas e lesões neurológicas (SCOLLARD, 2008; LOCKWOOD et al., 2011). A impossibilidade de crescimento do M. leprae em cultura inviabiliza a obtenção de antígenos brutos que possam ser usados em larga escala na avaliação da resposta imune, por isso, o uso de ferramentas da biologia molecular para obtenção de proteínas produzidas a partir da clonagem de fragmentos de DNA (proteínas recombinantes) é uma importante estratégia para facilitar a obtenção desses antígenos (proteínas imunogênicas) para uso em diversos estudos que envolva a avaliação da resposta imune em hanseníase, assim como, na identificação de antígenos com potencial para uso futuro em testes imunodiagnósticos, imunoprofilaxia e imunoterapia (DUTHIE et al., 2008a; DUTHIE et al., 2008b; DUTHIE et al., 2007a; DUTHIE et al., 2007b; REECE et al., 2006). Apesar de alguns aspectos da resposta imune, relacionados com as diferentes formas clínicas da hanseníase, serem conhecidos, outros ainda são obscuros, a exemplo da influência de antígenos específicos do M. leprae na supressão da resposta imune ou na patogênese das reações de hipersensibilidade que ocorrem na doença. Além disso, torna-se necessário esclarecer o papel de alguns elementos da resposta imune inata e adaptativa mais recentemente descritos que podem se apresentar como marcadores ou mesmo indutores das reações hansênicas e lesões neurológicas. Conhecer os diferentes antígenos do M. leprae e os produtos da resposta imune na patogênese das diferentes formas clínicas e de suas complicações, como as reações hansênicas e lesões neurológicas é de suma importância para que medidas de controle, prevenção e terapia possam ser desenvolvidas. Assim, este trabalho busca avaliar a resposta imune inata e adaptativa a antígenos brutos e recombinantes de M. leprae e M tuberculosis na proteção e na patogênese da hanseníase. Nossa hipótese é que existam antígenos que sejam utilizados como marcadores das formas clínicas mais brandas e que no futuro sejam utilizados como imunoprofilaxia ou imunoterapia, assim como antígenos que sejam marcadores ou estejam envolvidos na patogênese das complicações da doença..

(18) 17. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 O Mycobacterium leprae e sua transmissão Descrito em 1873 pelo norueguês Amauer Hansen, o M. leprae é uma bactéria intracelular gram-positiva e álcool-ácido-resistente (BAAR) que mede de 1 a 8µm de comprimento por 0,3 µm de largura, que infecta três tipos de células: endoteliais/ periendoteliais, monócitos/macrófagos e células de Schwann dos nervos periféricos (PENNA E PONTES, 2005). A transmissão da hanseníase ocorre pela via aérea entre pacientes com a doença para indivíduos susceptíveis. Pacientes que apresentam grande número de bacilos em seu organismo, ditos multibacilares, são a principal fonte de infecção, sendo os seus contatos domiciliares, independente do gênero, os maiores susceptíveis ao contágio (SALES et al., 2001). Esses pacientes abrigam grande quantidade de bacilos, tanto nas fossas nasais quanto na pele, e permanecem como fonte de transmissão da doença até que seja instituído o tratamento adequado (JOB, 2008; LOCKWOOD, 2005; BAKKER et al., 2006; ARAUJO, 2003). Quanto mais íntimo e prolongado for o contato inter-humano, maior a probabilidade de se adquirir a infecção (BRUCE et al, 2000). O M. leprae é capaz de infectar um grande número de pessoas, porém possui uma baixa patogenicidade e um grande tempo de persistência no hospedeiro produzindo poucos sintomas (ARAÚJO, 2003). Por isso o ser humano é considerando um importante reservatório natural do bacilo. Além disso, animais como tatus e macacos podem ser uma importante fonte de transmissão da infecção (NEVES, 1997). Evidências de infecção por M. leprae transmitida pelo tatu em algumas regiões da América Central e do Sul, foram descritas por Truman, (2005). As condições ambientais, assim como o elevado número de animais, podem ser fatores que contribuem para detecção da hanseníase nessas localidades. Portanto, tatus infectados constituem reservatório do bacilo e podem ser a origem da contaminação de alguns seres humanos (TRUMAN, 2005). A infecção, avaliada pela reação intradérmica positiva a antígeno bruto de M. leprae (lepromina) ou teste de Mitsuda tem frequência elevada (70% a 90%) na população adulta. No entanto, a doença só ocorre em um pequeno percentual dos infectados e após um longo período de incubação, estimado em 5 a 10 anos, devido ao crescimento lento do bacilo e sua.

(19) 18 baixa indução de resposta inflamatória nos tecidos. As carências nutricionais, condições higiênicas desfavoráveis e movimentos migratórios, são premissas sociais relacionadas à enfermidade. A dificuldade no seu controle está associada, com frequência, a baixa renda familiar per capita, ao reduzido nível de escolaridade e a falta de condições básicas de saúde (MAGALHÃES; ROJAS, 2007). 2.2 Epidemiologia Doença infectocontagiosa crônica, de ocorrência milenar, a hanseníase é considerada um importante problema de saúde pública, estando sua eliminação entre as prioridades do Ministério da Saúde (MAGALHÃES; ROJAS, 2007). Entre os anos de 1995 e 2005, mais de 14 milhões de pacientes com hanseníase foram diagnosticados e tratados em todo mundo. Dados recentes da Organização Mundial de Saúde (OMS) revelam que 228.474 novos casos de hanseníase foram detectados em todo o mundo em 2010 (OMS, 2011). O Brasil ultrapassou a Índia em número de detecção de casos da doença, que atinge regiões de clima tropical de países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, estando associada às condições precárias de vida da população (PENNA E PONTES, 2005; SOBRINHO et al, 2007). Apesar da redução do número de casos em todo o mundo, o Brasil aponta com uma prevalência de 1,54 casos por 10.000 habitantes (MS, 2011), só perdendo para a Índia (OMS, 2011). A situação epidemiológica da hanseníase no Brasil é considerada heterogênea devido à grande variação no número de casos nas diferentes regiões do país. No ano de 2009, 37.910 casos novos da doença foram registrados, com maior coeficiente de detecção nas regiões Norte e Centro-Oeste seguido do Nordeste, Sudeste e Sul. Em virtude disso, a hanseníase é considerada um importante problema de saúde pública, estando sua eliminação entre as prioridades do Ministério da Saúde (MAGALHÃES; ROJAS, 2007). O Estado de Sergipe esteve na 15ª posição em detecção do país entre os anos de 2005 e 2010, apresentando um total de 3.039 casos diagnosticados da doença (MS, 2010) e um coeficiente de detecção de casos novos, em 2011, de 2,07 casos/10.000 habitantes (MS, 2011), acima da média nacional. A hanseníase é uma doença de notificação compulsória e investigação obrigatória. O seu diagnóstico é realizado por meio da busca ativa de casos ou demanda espontânea à unidade básica de saúde. As situações mais complexas (de difícil condução do tratamento) são encaminhadas aos centros de referência, formados por médicos especialistas. Assim que.

(20) 19 diagnosticado um caso novo, a vigilância epidemiológica deve realizar o registro e acompanhamento através do SINAN (Sistema de Informação de Agravos de Notificação). Este, implantado no ano de 1999, pelo Ministério da Saúde, é alimentado pela notificação e investigação de doenças que constam na lista nacional (SVS, 2010). OLIVEIRA et. al. (2012), mapearam a doença no estado de Sergipe utilizando os dados do SINAN, observando municípios com situação de hiper-endemicidade, como Canhoba, Amparo de São Francisco, Graccho Cardoso, Propriá, Santana de São Francisco, Pedra Mole, Itabaiana e Campo do Brito (incidência > 4/10.000). 2.3 Diagnóstico e formas clínicas da hanseníase de acordo com a imunopatogênese Na hanseníase, diferenças individuais no padrão de resposta imune do hospedeiro contra o bacilo produzem um largo espectro de fenótipos clínicos da doença, (ALTER et al., 2008). Critérios clínicos, histopatológicos e imunológicos serviram de base para que Ridley e Jopling (1966), classificassem a hanseníase dentro de dois polos, o da hanseníase tuberculóide (HT) e o da hanseníase virchowiana (HV), com formas clínicas intermediárias entre eles, as formas borderline, também denominadas dimorfas, (dimorfa tuberculóide (HDT), dimorfa dimorfa (HDD) e dimorfa virchowiana (HDV) (RIDLEY E JOPLING, 1966). A HT é uma forma considerada de resistência, relativamente estável e muito comum na Índia, Brasil e África. Ela se caracteriza por uma neuropatia periférica que se inicia com a infecção e a resposta imune inflamatória, perpetuando-se por vários anos após a cura clínica da infecção, podendo trazer sequelas que levam a debilidade física, social e psicológica (SCOLLARD et al., 2006a). Nesta forma de manifestação da doença, as lesões cutâneas são constituídas por pápulas ou placas delimitadas, cheias ou com elevação apenas nas bordas. As lesões são eritêmato-acastanhadas, únicas ou múltiplas, de tamanhos e formas variadas. Histopatologicamente, há poucas lesões contendo infiltrado inflamatório perivascular e perineural com organização em granulomas e escassez de bacilos. Imunologicamente, essas características estão relacionadas com a resposta imune mediada por células T auxiliares 1 (Th1), produtoras de Interferon–gama (IFN-γ), Linfotoxina ou fator de necrose tumoral-alpha (TNF-α) e Interleucina 2 (IL-2) que induzem a produção de granulomas que limitam com sucesso a replicação da bactéria. A esse nível, há comprometimento intenso de troncos nervosos com distúrbios de sensibilidade e da sudorese. Aqui, trata-se de uma forma não contagiosa da doença, (ALTER et al., 2008)..

(21) 20 A HV apresenta numerosas lesões cutâneas com limites imprecisos e uma tonalidade ferruginosa típica. Quando há uma infiltração acentuada na face, com acentuação dos sulcos naturais, configura-se a “fácies leonina”. Esta forma clínica da doença é multibacilar e a mais contagiosa. Histopatologicamente, há um infiltrado inflamatório rico em macrófagos com vacúolos dilatados, contendo inumerável quantidade de bacilos e uma associada deficiência da resposta imune Th1. Neste caso existe uma ativação da resposta imune mediada por células T auxiliares 2 (Th2), produtora de interleucina 4 (IL-4), interleucina 10 (IL-10) e interleucina 13 (IL-13) que suprime a resposta imune Th1, propiciando a replicação da bactéria com contínua infiltração na pele e nervos (ALTER et al., 2008). A baciloscopia apresenta um grande número de bacilos, que são também responsáveis pela forte positividade de anticorpos anti-PGL-1 (80-100%) no soro. Doentes com a forma virchowiana de hanseníase possuem um grande número de bacilos na cavidade nasal, o que pode representar uma fonte de transmissão e perpetuação da doença, até que o tratamento adequado seja fornecido. (BAKKER et al., 2006; BRITTON e LOCKWOOD, 2004; LOCKWOOD et al., 2007; MOURA et al., 2007; PENNA et al., 2008). Formas clínicas intermediárias: HDD, HDT e HDV, caracterizam-se pela presença de numerosas lesões na pele com um maior acometimento dos troncos nervosos. Nos pacientes com a forma HDD, aparecem placas com uma área central circular de pele hipocrômica bem delimitada, que se difunde na periferia, perdendo os seus limites (lesões “esburacadas” ou “em queijo suíço”). A carga bacilar tende a ser alta, sendo uma forma contagiosa da doença. Os nervos periféricos são comprometidos com frequência e esse comprometimento é intenso e extenso. Tem aspecto histopatológico variável com similaridades às duas formas polares a depender da área da lesão biopsiada, podendo se assemelhar à forma tuberculóide (HDT) ou se assemelhar à forma virchowiana (HDV) (NARAYANAN, 1988; GROSSMAN et al., 1994). Um número menor de lesões que na forma HDD com intenso comprometimento dos nervos periféricos e baciloscopia negativa caracteriza a forma HDT, ao contrário da forma HDV que se manifesta com numerosas lesões, embora com uma quantidade menor de células polimorfonucleares quando comparada com as encontradas na forma HV. A baciloscopia da forma HDV é sempre positiva e a histopatologia revela infiltração em volta dos anexos da pele e granulomas com linfócitos e macrófagos repletos de bacilos, assim como danos nos nervos que causam uma neuropatia periférica que pode se perpetuar por vários anos após a cura clínica da lesão, podendo evoluir com sequelas (LOCKWOOD, 2007; SCOLLARD, 2004; SCOLLARD et al., 2006a). Existe também a hanseníase indeterminada, que é classicamente a primeira lesão a se.

(22) 21 desenvolver, embora possa ser clinicamente negligenciada (SIMON et al., 2011). A hanseníase indeterminada é frequentemente reconhecida em regiões endêmicas (BROWNE, 1985). É considerado um estágio inicial da doença que se manifesta com única ou múltiplas máculas eritematosas fracamente pigmentadas, de limites imprecisos, com alterações de sensibilidade em áreas aparentemente sadias (MURRAY et al., 1984; SCOLLARD et al., 2006a). Na histopatologia há um infiltrado inflamatório perivascular discreto e inespecífico. A baciloscopia é negativa e, do ponto de vista imunológico, a reação de Mitsuda pode ser negativa ou positiva. Lesões indeterminadas frequentemente se curam espontaneamente, mas em aproximadamente 25% dos casos elas evoluem para uma das formas determinadas da doença, especialmente dimorfa (THANGARAJ e YAWALKAR, 1987). Hanseníase neural pura é uma forma da doença de difícil diagnóstico; esta forma pode ocorrer em 5 a 15% dos pacientes. Ela se caracteriza pela presença de um assimétrico envolvimento dos nervos periféricos com ausência de manifestações cutâneas. Disestesia ou alteração da força muscular é comumente associado com esta forma da doença, que pode ser avaliada por exame neurológico, eletromiografia (EMG), ou biópsia de nervo. Estes pacientes podem ser positivos ou negativos para o teste de Mitsuda e podem mais tarde desenvolver manifestações cutâneas (JARDIM et al., 2007). Posteriormente, a OMS, para fins práticos e operacionais, estabeleceu uma classificação complementar com duas categorias: - doentes paucibacilares (PB), com teste de Mitsuda positivo e índice baciloscópico (IB) < 2 correspondendo às formas HT e HDT – doentes multibacilares (MB), com teste de Mitsuda negativo e baciloscopia positiva (IB ≥ 2), que englobam as formas HDD, HDV e HV (MS, 2011). 2.4 Aspectos imunológicos envolvidos na resposta imune ao M. leprae O estabelecimento de uma infecção, em um hospedeiro susceptível, envolve vários mecanismos, sendo um dos mais relevantes o modo de interação do microorganismo com o sistema imune do hospedeiro e a resposta desse contra o agente invasor. A primeira linha de defesa envolve ativação da imunidade inata, cuja resposta é especializada para os diferentes tipos de patógenos. A resposta inata serve como um alerta para o sistema imune e permite uma resposta. ativa contra o patógeno, até que a ativação da resposta imune adaptativa esteja pronta para atuar. Ambas respostas ocorrem simultaneamente durante o controle de uma infecção. No entanto, diferente da resposta imune inata, a adaptativa responde especificamente contra os.

(23) 22 diferentes agentes invasores e, após o primeiro contato, em geral, gera linfócitos T e linfócitos B (COELHO-CASTELO et al., 2009). Ao atravessar as barreiras naturais do organismo, os agentes infecciosos proliferam e produzem substâncias prejudiciais que desencadeiam uma reação inflamatória nos tecidos ativando o sistema imune (ABBAS et al., 2008) A imunidade inata é a resposta inicial para a infecção, que envolve células fagocíticas, células natural killer (NK), complemento, proteínas de fase aguda, quimiocinas e citocinas. Os fagócitos reconhecem específicos padrões moleculares associados ao patógeno (PAMPS), através de ligações a receptores de baixa diversidade (rPAMP), como receptores semelhantes a Toll, manose lectina e NOD2 localizado na superfície da célula ou secretado em compartimentos intracelulares. A ligação dos patógenos com estes receptores induz a ativação da fagocitose, aumentando a sua capacidade microbicida. Como resultado da ativação de receptores semelhantes a Toll (TLRs), ocorre produção de mediadores de imunidade (quimiocinas e citocinas) e indução da expressão de marcadores de ativação de fagócitos (B7.1/B7.2) assim como moléculas de MHC classe I e II. Os sinais induzidos pela ativação do TLR possuem um importante papel nos eventos iniciais da resposta imune específica, porque a expressão de sinais co-estimulatórios (B7.1/B7.2) são necessários para a ativação de células T e produção de citocinas que atuarão na diferenciação dessas células. A resposta imune inata pode eliminar o agente infeccioso mas algumas células fagocíticas podem também atuar como células apresentadoras de antígenos, que processam o patógeno carregando os antígenos para os órgãos linfóides, onde eles podem ativar células T, promovendo a ligação entre as respostas imune inata e a resposta imune adaptativa (BEUTLER, 2003; HOTTAT et al., 1988). Na hanseníase os TLRs são cruciais para o reconhecimento de patógenos pelos macrófagos e células dendríticas. Células dendríticas podem ser ativadas por patógenos com subsequente produção local de citocinas e quimiocinas, regulando a inflamação e influenciando o curso da imunidade adaptativa. Embora as células dendríticas sejam efetivamente células apresentadoras de antígenos, a expressão de antígenos do M. leprae pelo complexo de histocompatibilidade maior (MHC) de classe I e II é diminuida em células dendríticas derivadas de monócitos infectados com o bacilo do M. leprae. Por outro lado, células dendríticas infectadas com antígenos de membrana do M. leprae aumentam a produção de MHC de classe II e CD40 ligante associado a interleucina 12 (IL-12), sugerindo que os bacilos vivos podem suprimir a interação entre as céluas dendríticas e as células T (GOULART E GOULART, 2009; GULIA et al., 2010)..

(24) 23 A interação entre o patógeno e o hospedeiro determina o padrão de resposta imune e a evolução da infecção. A regulação da função de outras células da resposta imune pelo aumento da resposta inflamatória, é extremamente importante no controle da infecção, limitando a doença (BERRINGTON et al., 2010; PINHEIRO et al., 2011). Após a apresentação de antígenos as células da resposta adaptativa são ativadas. A resposta imune adaptativa é altamente específica e capaz de proteger o indivíduo contra reinfecções pela indução e expansão de células de memória. Várias células efetoras estão envolvidas na resposta imune adaptativa, células T auxiliares CD4+ e células T citotóxicas CD8+ que não somente exercem atividades efetoras diretas mas também modulam a resposta imune inata. Células T auxiliares CD4+ estão subdivididas em quatro subtipos distintos: células Th1, Th2, Th17 e T reguladoras (Tregs). Cada subtipo está envolvido na proteção contra tipos específicos de microrganismos. Células Th1 são essenciais na resposta contra microrganismos intracelulares, a exemplo da micobacteria pela ativação da resposta inflamatória nos macrófagos (ABBAS et al., 2008). Células Th2 estão envolvidas na resposta imune contra agentes extracelulares e multicelulares, a exemplo dos helmintos (pelo suporte da resposta humoral e pela citotoxicidade mediada por anticorpos); Células Th17 são eficientes no controle de bactérias e fungos patogênicos, por induzirem células epiteliais que secretam fatores granulopoietico, como G-CSF e CCL20, recrutarem um grande número de neutrófilos e atuarem em sinergia com as citocinas IL-1, IL-6 e TNF, as quais promovem a atração e ativação de neutrófilos nos tecidos para a eliminação de patógenos extracelulares. Células Tregs diminuem a resposta imune a antígenos próprios e a patógenos persistentes, prevenindo danos imunológicos crônicos no hospedeiro (CUA e TATO, 2010; PACE et al., 2010; TATO e O’SHEA, 2006). O M. leprae por sua vez, possui mecanismos para escapar das defesas imunes, incluindo métodos que envolvem as barreiras naturais, produção de substâncias supressivas que alteram a resposta imune inata, interrupção da apresentação de antígenos e indução de citocinas supressivas, a exemplo de IL-10 e TNF-β, para promover sua sobrevivência. O desequilíbrio entre os mecanismos adaptativos do hospedeiro e do patógeno, pode levar tanto a uma excessiva proliferação do agente infeccioso (deficiência da resposta) como a uma excessiva. resposta. imune. pelo. hospedeiro,. causando. uma. resposta. inflamatória. (hipersensibilidade) e promovendo a doença (McNICHOLL et al., 2000). O M. leprae tem interagido com os seres humanos a muitos anos e por isso tem desenvolvido vários mecanismos adaptativos que permitem sua persistência dentro do corpo humano, em muitos casos, causando significantes danos ao tecido. Indivíduos infectados.

(25) 24 podem ser assintomáticos, ter sintomas leves ou apresentar diferente espectro de gravidade clínica da doença. Em hanseníase, o padrão individual de secreção de citocinas em resposta a infecção ao M. leprae influencia a forma clínica da doença. O perfil de citocinas presentes na lesão está relacionado com a função TLR: Citocinas Th1 estão associadas com a ativação de TLR1 e TLR2 e o perfil de citocinas Th2 está associado com a inibição da ativação (KRUTZIK et al., 2005). A expressão de TLR1 e TLR2 é maior em monócitos e células dendríticas em lesões tuberculóides que em lesões virchowianas. Além disso, estudos in vitro indicam que lipoproteínas de 19-kDa e 33k-Da do M. leprae ativam células dendríticas derivadas de monócitos por meio da interação TLR2 (KRUTZIK et al., 2003, 2005; SIELING et al.,2008). Células Th1 são essenciais para respostas protetoras contra os microrganismos intracelulares, a exemplo do M. leprae, através da produção de IFN-γ e TNF-α. Estas citocinas induzem a ativação de macrófagos e atividades microbicidas que ajudam a erradicar microrganismos intracelulares. Elas também promovem a ativação de células T citotóxicas que matam células infectadas (GOULART e GOULART, 2009). Indivíduos que desenvolvem a resposta Th1 têm formas mais brandas de hanseníase, com poucos bacilos presentes na linfa e nas lesões de pele, classificadas como PB, representadas pela hanseníase tuberculoide (HT) e dimorfa tuberculóide (HDT). Histopatologicamente, estas formas clínicas são caracterizadas pela formação de granulomas. Os granulomas são comumente encontrados em infecções com microrganismos intracelulares, quando a resposta imune celular não pode rapidamente eliminar o organismo infeccioso, principalmente pelo acúmulo de macrófagos e células T em torno de macrófagos infectados. A reação granulomatosa é uma hipersensibilidade do tipo IV ou celular. Assim, células Th1 são pró-inflamatórias e podem ser importantes na patogênese e nos danos teciduais em algumas formas de doenças infecciosas, como demonstrado em leishmaniose (CARVALHO et al., 2007). Em hanseníase, este tipo de resposta está envolvida em danos neurológicos, uma importante complicação desta doença (LOCKWOOD et al., 2011) Quando a resposta imune à infecção pelo M. leprae é do tipo Th2, o paciente não consegue montar uma resposta imune mediada por células suficiente para controlar o patógeno, havendo dissiminação do bacilo e o desenvolvimento das formas multibacilares da doença, como a hanseníase virchowiana (HV) ou dimorfa dimorfa (HDD) ou ainda dimorfa virchowiana (HDV). A diferenciação de linfócitos T para um perfil Th2 é influenciada pela IL-4, que é secretada pelos linfócitos T, mastócitos, eosinófilos e células NK (ALTER et al., 2008; FLESCH et al., 1997; MOCHIZUKI et al., 1998)..

(26) 25 A resposta Th2 é o principal fator de inibição e supressão da resposta imune celular (HUBER et al., 2010; KHAN et al.,2008). Células Th2 secretam IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, estimulando a produção de anticorpos que são importantes no controle de agentes extracelulares. A IL-10 é uma citocina imunossupressora que desempenha um papel importante na diminuição da resposta imune específica ao M. leprae. Além disso, a resposta mediada por células Th2 é estimulada em algumas infecções parasitárias causadas por helmintos, diminuindo a resposta imune de células Th1. Na hanseníase existem evidências de que a resposta mediada por células Th1 diminui durante as infecções intestinais por helmintos, pelo fato de que níveis intracelulares de IFN-γ em pacientes com ambas as formas tuberculóide e virchowiana da doença livres de infecções causadas por helmintos foram 2 vezes maiores do que em pacientes infectados por helmintos. Do mesmo modo, pacientes com a forma virchowiana da doença infectados por helmintos produzem quase 2 vezes mais IL-4 e IL-10 que os pacientes que não estão parasitados. Sugerindo que uma infecção pré-existente por helmintos intestinais pode facilitar a infecção inicial pelo M. leprae ou sua progressão para as formas clínicas mais graves da doença (DINIZ et al., 2010). Células T regs têm sido descritas em algumas doenças, participando na patogênese ou controlando a inflamação e os danos teciduais. Entre os diferentes tipos de células Tregs, algumas são formadas no timo (CD4+ CD25+ Foxp3+) e outras se diferenciam na periferia, onde dois subtipos têm sido descritos, Tr1 e Th3 (BANHAM et al., 2006; POWRIE, 2004; THOMPSON e POWRIE, 2004; UHLIG et al., 2006). Embora estas células ainda estejam em estudo, a IL-10 aparece como indutora de diferenciação de células Tregs periféricas. Células Tregs participam na tolerância imunológica por regular outras células T através da produção de citocinas regulatórias (IL-10 e TGF-β) e sinalização via o contato célula-célula. Na hanseníase o papel das células Tregs ainda é controverso. Attia et al.(2010) observaram uma maior frequência de células Tregs e de expressão de FoxP3 em pacientes com HT quando comparado com controles normais e com as quatro outras formas clínicas da doença. Pacientes com as forma HV e Eritema nodoso hansênico (ENH) exibem significantemente baixas frequências de Tregs, dados consistentes com a progressão e imune hiperativação nessas categorias da doença (ATTIA et al., 2010). Porém, Massone et al., (2010) encontraram a presença de células FoxP3+ em 95% das biópsias, não existindo diferenças na expressão de FoxP3 entre as formas estudadas HT, HDT, HDD, HDV e HV. Uma significante alta frequência de Tregs em pacientes afetados pela reação reversa ou reação tipo 1 (HDT-RR e HDD-RR) foi observada, quando comparados com pacientes afetados pelo ENH e pacientes com formas não reacionais da doença HDV, HV, HDT e HT (MASSONE et al., 2010)..

(27) 26 Palermo et al, (2012) descreveram a presença de maior número de células T reguladoras (Treg) na forma virchowiana, indicando a participação dessas células na imunossupressão específica e proliferação bacilar observadas nesta forma clínica da doença. Apesar do conhecimento atual da hanseníase, existem algumas lacunas na compreensão dos determinantes envolvidos no estabelecimento dos fenótipos imunológicos da doença, incluindo o papel das células Th17 e citocinas descritas mais recentemente (IL-22, IL-23, IL-27) por serem importantes em outras doenças infecciosas incluindo as doenças causadas por patógenos intracelulares (FEDELA et al., 2008; GAFA et al., 2006; KASTELEIN et al., 2007; PITTA et al., 2009). Células Th17 secretam IL-17A e IL-17F, que induz a produção de citocinas próinflamatórias e quimiocinas que contribuem para o recrutamento de neutrófilos. Elas parecem estar envolvidas em uma rápida resposta para alguns patógenos extracelulares incluindo bactérias e fungos. Acredita-se que durante a infecção por M. tuberculosis, a IL-17 possa controlar o processo inflamatório por modular o acúmulo de células mononucleares e polimorfonucleares. A ausência de células Th17 de memória resulta em uma menor resposta protetora do tipo Th1 (KHADER e COOPER, 2008; SCRIBA et al., 2008; TORRADO e COOPER, 2010). Contudo, essas células podem também participar na imunopatogênese da hanseníase como acontece em algumas doenças autoimunes (ex. Artrite, lupus eritematoso sistêmico, psoríase e uveite), com sua potente resposta imune inflamatória sendo o principal mecanismo determinador do dano tecidual (CUA e TATO, 2010). 2.5. Complicações na hanseníase 2.5.1 Reações hansênicas O curso crônico da hanseníase pode ser afetado em qualquer momento da infecção, seja antes durante ou após o tratamento adequado da doença, por eventos inflamatórios agudos denominados reações hansênicas ou estados reacionais. As reações hansênicas são complicações frequentes, imunomediadas, que ocorrem em 30 a 50% dos pacientes com hanseníase e acarretam grande morbidade (SCOLLARD et al., 2006 b). Elas são classificadas em dois tipos, a reação tipo 1, ou reação reversa (RR), e reação tipo 2, ou eritema nodoso hansênico (ENH), cada uma apresentando particularidades inerentes à fisiopatologia, ao quadro clínico e à terapêutica. A morbidade dos estados reacionais é consequência, principalmente, do comprometimento agudo e agressivo dos nervos periféricos. A reação.

(28) 27 inflamatória neurológica pode desencadear alterações permanentes das funções dos nervos acometidos, denominadas sequelas neurológicas da hanseníase. Clinicamente as sequelas se apresentam de formas variadas, com dor neuropática crônica, paresias ou deformidades físicas incapacitantes. Tanto as reações hansênicas quanto as sequelas neurológicas estigmatizam os pacientes e se associam com significativo prejuízo da qualidade de vida destes (MARTINS et al., 2008). Ainda não se conhecem os mecanismos precisos que desencadeiam esses eventos. Contudo, uma série de variáveis clínicas foi associada, em maior ou menor grau, com sua ocorrência, persistindo algumas controvérsias. Fatores como gravidez, infecção, vacinação e estresse psicológico já foram considerados como precipitantes dos estados reacionais, porém, essas associações não se confirmaram em estudos prospectivos (KAHAWITA e LOCKWOOD, 2008; FOSS, 2003). a) Reação tipo 1 ou reação reversa Reação tipo 1 ou reação reversa (RR) é um típico exemplo de desordem imune que pode ser interpretada como uma reação atrasada de hipersensibilidade do tipo IV (COOMBS, 1971; GELL, 1967). A reação reversa está associada ao aumento súbito da resposta imune celular contra antígenos do M. leprae, com ativação da respostas Th1, levando a produção sistêmica e local de IL-2, IFN-γ e TNF-α, citocinas pró-inflamatórias importantes mediadores de danos nos nervos e a invasão de células mononucleares que levam à degeneração axonal (HARBOE et al.,2005), se manifestando como uma inflamação aguda na pele ou em nervos periféricos ou em ambos (KAHAWITA e LOCKWOOD, 2008). O aumento no número de células T CD4+ é também observado em lesões cutâneas reacionais. As reações reversas são clinicamente caracterizadas pelo eritema e infiltração de lesões preexistentes, embora novas lesões também possam se desenvolver (ANDERSSON et al., 2005; BELGAUMKAR et al., 2007; MENDONÇA et al., 2008; SCOLLARD et al., 2006a,b; WALKER E LOCKWOOD, 2008). Sintomas sistêmicos são incomuns, com manifestação de novas lesões eritematosas e infiltradas em área de pele sã ou em locais de lesões antigas. Nos nervos, em função da resposta granulomatosa, ocorre espessamento de um ou mais nervos periféricos, seguido de alteração das funções sensitivas e ou motoras, acompanhadas ou não de dor aguda de intensidade variável. O comprometimento dos nervos periféricos, denominado neurite, costuma ser grave e requer intervenção médica imediata, para prevenir o estabelecimento de incapacidades (FOSS, 2003). A reação tipo 1 é a mais frequente e ocorre em qualquer forma clínica da hanseníase, exceto na indeterminada, embora seja mais comum entre os pacientes com as formas dimorfas.

(29) 28 da doença (BALAGON, 2010; FOSS, 2003; KAHAWITA e LOCKWOOD, 2008; RANQUE et al., 2007), afetando 15 a 30% destes pacientes (SCOLLARD et al. 2006b) e rara entre os pacientes com a forma virchowiana (FOSS, 2003). Até o momento não são conhecidos os fatores que favorecem os eventos reacionais ou a razão desses eventos não afetar todos os pacientes (SCOLLARD et al., 2006b). Raros casos ocorrem após o tratamento e exigem diagnóstico diferencial com recidiva da doença (KAHAWITA e LOCKWOOD, 2008). b) Reação tipo 2 ou eritema nodoso hansênico Reação tipo 2 ou eritema nodoso hansênico (ENH) é uma reação de hipersensibilidade tipo III (COOMBS, 1971; GELL, 1967), que ocorre em pacientes com imunidade celular deficiente contra o M. leprae, com muitos bacilos e uma forte resposta humoral com produção de grande quantidade de imunoglobulinas circulantes (SCOLLARD et al., 2006b). Envolve a participação de imunocomplexos, de citocinas Th2 e de TNF-α (GOULART et al., 2002; KAHAWITA e LOCKWOOD, 2008; SCOLLARD et al., 2006b). A deposição de imune complexos em capilares leva a ativação do sistema complemento, assim como a quimiotaxia e ativação de células imunes, desencadeando um processo inflamatório agudo, principal causa de dano neural. O eritema nodoso hansênico é assim, associado com uma alta concentração de IL-12, infiltração de neutrófilos e ativação do complemento (BRITO et al., 2008; MODLIN et al., 1986; SCOLLARD et al., 1992, 2006b; SILVA et al., 2007), assim como, o aumento da expressão de RNAm de IL-6, IL-8 e IL-10 que pode ser observado nas lesões (BELGAUMKAR et al., 2007; SCOLLARD et al., 2006a). A maioria das reações severas está associada com o aumento da produção de TNF-α e IFN-γ que poderia ser explicado pela recuperação temporária da capacidade microbicida dos macrófagos (KAPLAN et al., 1991; MOTTA et al., 2010; PARTIDA-SANCHEZ et al., 1998). De acordo com a imunopatogênese de ENH, injeções de IFN-γ podem desencadear lesões do tipo ENH e a produção de imunomoduladores que diminuem a expressão do gene de TNF-α podendo ser usado como terapia (KAPLAN et al., 1989; PENNA et al., 2008; SCOLLARD et al., 2006a,b). O ENH é um quadro inflamatório sistêmico, com comprometimento potencial de múltiplos órgãos, que tem como critério diagnóstico a presença do eritema nodoso, caracterizado pela presença de nódulos subcutâneos eritematosos e dor local. Estas lesões têm evolução variável, podendo se apresentar como episódios únicos ou recorrentes com duração de meses (FOSS, 2003; GUERRA, 2002). As manifestações extra-cutâneas têm intensidade variável e incluem febre, dores no corpo, apatia, irite, hepatoesplenomegalia, adenomegalia,.