UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DA
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA
EDUARDO SANTOS DA SILVA
PROTEÍNA HÍBRIDA HIPOALERGÊNICA BTH2 E SEU USO
POTENCIAL NO TRATAMENTO DA ALERGIA AO ÁCARO Blomia
tropicalis
SALVADOR 2018
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO DA
REDE NORDESTE DE BIOTECNOLOGIA
EDUARDO SANTOS DA SILVA
PROTEÍNA HÍBRIDA HIPOALERGÊNICA BTH2 E SEU USO
POTENCIAL NO TRATAMENTO DA ALERGIA AO ÁCARO Blomia
tropicalis
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação da Rede Nordeste de Biotecnologia, do Instituto de Ciências da Saúde, da Universidade Federal da Bahia, como parte das exigências para obtenção do título de doutor.
Área de Concentração: Saúde
Orientadora: Neuza Maria Alcantara-Neves Co-orientadora: Carina Silva Pinheiro
SALVADOR 2018
AGRADECIMENTOS
À Deus, pois pelo que acredito, sem Ele, não teria o discernimento para avaliar as oportunidades e os riscos das mudanças;
À minha família, que sem o apoio nos momentos difíceis, nos quais minhas escolhas não pareciam ser o melhor caminho, eu certamente teria desistido; só eles sabem
realmente o quanto foi proveitoso me manter perseverante;
À Profª Drª Neuza, pela orientação integral e confiança nesses oito anos desde a iniciação tecnológica até o doutorado, bem como por todo o suporte necessário ao meu
desenvolvimento pessoal e profissional, nunca desistindo de mim em nenhum aspecto, mesmo com minhas dificuldades e erros durante a jornada;
À Profª Drª Carina, que desde 2012 vem possibilitando, não só a mim, mas a todo grupo do Laboratório de Alergia e Acarologia (LAA), avanços nos projetos com ênfase em Biologia Molecular, sendo uma pessoa fundamental para que muitos experimentos desta tese fossem desenvolvidos e tivessem resultados robustos; e agradecer também
as inestimáveis dicas de bancada;
A Profª Drª Fátima Ferreira, por ter me recebido em seu laboratório na Universidade de Salzburgo, permitindo a realização do meu estágio de doutorado sanduíche e, desse
modo, contribuindo para o sucesso fundamental desse trabalho;
Ao prof. Dr. Luís Pacheco a quem desde a graduação admirava como profissional e agora como colaborador em meu trabalho de tese só fez aumentar minha admiração;
A meus colegas e amigos do LAA, principalmente aqueles com quem trabalhei diretamente nesse projeto de doutorado ou projetos não relacionados, como Marina,
À Márcia e Alana, pessoas amigas com quem convivo no LAA praticamente desde os momentos iniciais de minha experiência na pesquisa, e que também foram apoios magníficos durante meu período como pós-graduando, com apoio em todo aspecto e
principalmente nas discussões de resultados;
À todos os meus queridos colegas do laboratório Christian Doppler for Allergy Diagnosis
and Therapy, da Universidade de Salzburgo, Lorenz, Claudia, Galber, Olivia e,
principalmente, Sara e Iris, que foram incentivadores de meu esforço por sucesso e orientadores de bancada excelentes durante meu período de doutorado sanduíche;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia que permitiu meu sustento durantes esses quatro anos de doutorado;
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico que possibilitou a frutífera experiência do intercâmbio;
“Não vinga o sonho da folha se não crescer incrustado no sonho que se fez árvore”.
LISTA DE ABREVIATURAS
3-D – Three-dimensional
AAA - Amino acid analysis (inglês); análise de aminoácidos (português) AEC - anion exchange chromatography
AI - avidity index
AIPN - Advanced industrial property network
AIT - allergen-specific immunotherapy (inglês); imunoterapia alérgeno-específica (português)
Ala – Alanine
AR - allergic rhinitis
Arg – Arginine (inglês); arginina (português)
Asn – Asparagine (inglês); asparagina (português) Asp – Aspartic acid (inglês); ácido aspártico (português) Asx – Asparagine/aspartic acid
BCIP – 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate
BTH – Blomia tropicalis hybrid (inglês); Proteína híbrida de Blomia tropicalis (português) CAPES - Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel
CD - Circular dichroism (inglês); dicroísmo circular (português) CIPO - Canadian intellectual property office
CNPq - National Council for Scientific and Technological Development of Brazil CPC - Cooperative patent classification
DATASUS – Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde
DLS - Dynamic light scattering (inglês); espalhamento dinâmico de luz (português) DNA - Deoxyribonucleic Acid
EAPO - Eurasian patent organization EBI – European Bioinformatics Institute ECLA - European classification system
ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay (inglês); ensaio de imunoabsorção enzimática (português)
EPO - European patent office
Fapesb - Research’s Foundation of the State of Bahia
FTIR - Fourier transform infrared spectroscopy (inglês); espectroscopia no infravermelho com transformadas de Fourier (português)
Glu – Glutamic acid (inglês); ácido glutâmico (português) Glx – glutamine/glutamic acid Gly – Glycine GST – Glutathione S-transferase His – Histidine HRP - streptavidin-horseradish peroxidase IgA – Imunoglobulina A
IgE - Immunoglobulin E (inglês); Imunoglobulina E (português) IgG – Immunoglobulin G (inglês); Imunoglobulina G (português) IgG4 – Imunoglobulina G4
IL-10 – Interleucina 10
IL-13 - Interleukin 13(inglês); Interleucina 13 (português) IL-4 - Interleukin 4 (inglês); Interleucina 4 (português) IL-5 - Interleukin 5 (inglês); Interleucina 5 (português) IL-9 - Interleukin 9
ILC2s - Group 2 innate lymphoid cells Ile – Isoleucine
IPC - International patent classification
IPTG – Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (inglês); Isopropil-β-D-tiogalactopirosídeo (português)
ISAAC - The international study of asthma and allergies in childhood IUIS – International Union of Immunological Societies
JPO - Japan patent office kDa – Kilodalton
KSCN – thiocyanate
LC – Liquid chromatography Leu – Leucine
Lys – Lysine (inglês); Lisina (português) MA - mild asthma
Met – Methionine
MHC - major histocompatibility complex (inglês); complexo principal de histocompatibilidade (português)
MS – Mass spectrometry (inglês); espectrometria de massas (português) MW – Molecular weight
NA - non-responsive NaP – sodium phosphate NBT – nitro blue tetrazolium
NMR – Nuclear magnetic resonance OMA – Organização mundial de alergia OMS – Organização mundial da saúde OPD - o-Phenylenediamine
PBS – Phosphate buffered saline PCT - Patent cooperation treaty PDB – Protein data bank
Phe - Phenylalanine
PNPP – fosfato de p-nitrofenilo Pro – Proline
ProAR - Bahia State Program for the Control of Asthma and Allergic Rhinitis (inglês); Programa de controle de asma e da rinite alérgica na Bahia (português)
PVDF – Polyvinylidene fluoride
RBL – rat basophil leukemia (inglês); basófilos leucêmicos de rato (português) RH – raio hidrodinâmico
SA - severe asthma
SCAALA – Social Change in Asthma and Allergy in Latin America)
SCIT – subcutaneous immunotherapy (inglês); imunoterapia subcutânea (português) SDS-PAGE – sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
SEC – Size exclusion chromatography Ser – Serine
sIgE - specific IgE
SIT - Allergen-specific immunotherapy
SLIT - Sublingual immunotherapy (inglês); imunoterapia sublingual (português) SPT – skin prick test
Tc2 - Cytotoxic T lymphocytes 2
TGF-β – Fator de transformação do crescimento beta TH1 – T helper 1 (inglês); T auxiliar 1 (português) TH17 – T helper 17
TH2 – T helper 2 (inglês); T auxiliar 2 (português) Thr – Threonine
Tyr – Tyrosine
USA – United States of America Val – Valine
WHO – World Health Organization
LISTA DE FIGURAS
Introdução:
Figura 1 – Mecanismo da sensibilização a alérgenos..……….2
Figura 2 – Fase inicial da inflamação das vias aéreas induzida por alérgenos...3
Figura 3 – Mecanismos de AIT..………...6
Figure 4 – Alterações imunológicas durante o curso da AIT...7
Manuscrito 01: Figure 1. Search strategy using ‘Classification Search’ at Espacenet®..………14
Figure 2. Cumulative yearly evolution and geographical distribution of patent applications in allergen immunotherapy……….15
Figure 3. Worldwide distribution of patents by type of applicant and top companies in patent applications related to allergen immunotherapy……….16
Figure 4. Worldwide distribution of patients related to allergen immunotherapy for the treatment of allergy caused by food or environmental allergens…..……….18
Figure 5. Distribution of patents that claim hypoallergenised proteins to treat allergies caused by environmental allergens……….19
Manuscrito 02: Figure 1. Tertiary structures of Blomia tropicalis allergens..……….27
Manuscrito 03: Figure 1. Identification of degradation pattern in the N-terminal motif of nBlo t 5, prediction of Blo t 5 signal peptide, and heterologous expression and purification of recombinant Blo t 5 variants……….……….58
Figure 2. Physicochemical characterization of recombinant Blo t 5 variants……....59 Figure 3. Endolysosomal proteolysis profile of recombinant Blo t 5 variants……...60 Figure 4. Blo t 5 variants peptide cluster pattern derived from in vitro
endolysosomal degradation.……….……….61
Figure 5. Immunological characterization of recombinant Blo t 5 variants………….62 Figure 6. IgE cross-inhibition evaluation of rBlo t 5 and rDer p 5……….63 Figure S1. Sequence chain representation of recombinant Blo t 5 variants………...73 Figure S2. Mass spectrometry analysis of rBlo t 5short (A) and rBlo t 5long (B)……….74 Figure S3. Experimental determination of amino acid residues numbers in rBlo t 5
variants……….………..…….75
Figure S4. Temporal folding CD-analysis and FTIR spectra of rBlo t 5 variants…....76 Figure S5. The allergenic activity of rBlo t 5 variants….……….……….77 Figure S6. IgE response to group 5 mite allergens………...78
Figure S7. IgE cross-inhibition curves...……….….79
Manuscrito 04:
Figure 1. Sequence and model of BTH1 and BTH2……….….114
Figure 2. Expression, purification and physico-chemical features of B. tropicalis
hybrid recombinant-proteins...……...………..….….115
Figure 3. Endolysosomal proteolysis profile of B. tropicalis wild-type and hybrid
recombinant-proteins...………..……….….….116
Figure 4. BTH1 peptide cluster pattern derived from in vitro endolysosomal
degradation...……….……….….117
Figure 5. BTH2 peptide cluster pattern derived from in vitro endolysosomal
degradation...……….………….….118
Figure 6. Immunological characterization of parental and hybrid
recombinant-allergens...………..……….….119
Figure 7. In vivo therapeutic evaluation of B. tropicalis hybrid
Figure S1. Expression, purification and structural features of rBlo t 5 and rBlo t
21……….………136
Figure S2. Primary and secondary structure of B. tropicalis wild-type and hybrid
recombinant-allergens...……….….….137
Figure S3. rBlo t 5 peptide cluster pattern derived from in vitro endolysosomal
degradation....……….….138
Figure S4.rBlo t 21 peptide cluster pattern derived from in vitro endolysosomal
degradation....……….….139
Figure S5. The allergenic activity of B. tropicalis parental and hybrid
recombinant-allergens....……….…….….140
Figure S6. IgE reactivity profile of B. tropicalis parental and hybrid
recombinant-allergens....……….………...141
Patente:
Figura 1. Expressão das proteínas híbridas tipo-selvagem e hipoalergênicas em 5 mL de cultura e diferentes temperaturas de expressão avaliadas por
SDS-PAGE...……….……….….176
Figura 2. Ensaios-piloto para escolha das proteínas híbridas hipoalergênicas com
a mais reduzida ligação à IgE....………..….177
Figura 3. Expressão e purificação de BTH1 (A) e BTH2 (B) em E. coli BL21 (DE3)
star usando SDS-PAGE....………...….177
Figura 4. Identificação de BTH1 por espectrometria de massa……..…………..….178 Figura 5. Identificação de BTH2 por espectrometria de massa……..…………..….179 Figura 6. Investigação da identidade de BTH1 e BHT2 por análise de
aminoácidos…..………..….180
Figura 7. Avaliação do enovelamento e estabilidade térmica de BTH1, BHT2 e dos
Figura 8. Quantificação de elementos de estrutura secundária de BTH1, BHT2 e dos alérgenos recombinantes nativos por espectroscopia no infravermelho com
transformadas de Fourier (FTIR)……..…………..………..…..182
Figura 9. Investigação do comportamento de agregação de BTH1 e BHT2…..…..183
Figura 10. Reatividade de IgE de BTH1 e BHT2…..………..183
Figura 11. Atividade biológica de BTH1 e BHT2.…..………...184 Figura 12. Avaliação estatística da concentração de antígenos necessária para liberação de 50% de mediador inflamatório em células huRBL………...……...185 Figura 13. Análise temporal e perfil de proteólise endolisossomal de BTH1 e
LISTA DE TABELAS
Manuscrito 01:
Table 1. Patents related to allergen immunotherapy stratified by type of technology.…...14 Table 2. Scope of technological prospecting and CPC codes for patents related to allergen immunotherapy……….………...……...15
Manuscrito 02:
Table 1. Molecular properties of the Blomia tropicalis allergens.………...……...26 Table 2. Sequence alignment of Blomia tropicalis and Dermatophagoides pteronyssinus allergens.………...………...28
Manuscrito 03:
Table S1. Responsive characteristics of donors included in the present study....……...80 Table S2. Molecular properties of Blomia tropicalis allergens and their isoforms identified by MS-analysis. ………...………...84
Manuscrito 04:
Table S1. Responsive characteristics and allergy phenotypes of the donors...………...140 Table S2. IgE avidity indexes.………...………...144 Table S3. IgE binding characteristics among allergic manifestation phenotypes…..…145 Table S4. IgE reactivity differences between SA, MA and AR donors……...………...146
RESUMO
Introdução: Blomia tropicalis é considerada a espécie de ácaro mais proeminente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. Um aumento nas taxas de sensibilização a esse ácaro tem sido observado, principalmente com altos níveis de IgE contra dois alérgenos maiores: Blo t 5 e Blo t 21. Atualmente, os protocolos de imunoterapia com alérgenos (AIT) nessas regiões têm sido realizados usando extratos brutos, que apresentam desvantagens quando comparados com as novas abordagens: os derivados hipoalergênicos. Objetivo: Mapear o panorama tecnológico da produção de preparações alergênicas para AIT e definir qual a tecnologia mais vantajosa para desenvolver uma molécula híbrida hipoalergênica Blo t 5/Blo t 21, que possa potencialmente ser usada para combater reações alérgicas causadas por B. tropicalis. Métodos: Uma análise proteômica do extrato de B. tropicalis foi realizada para encontrar isoformas ou variantes do Blo t 5. Duas variantes denominadas rBlo t 5short e rBlo t 5long e uma versão curta de Blo t 21 foram
expressas em suas formas recombinantes. O desenho in silico das proteínas híbridas de B. tropicalis foi realizado utilizando o software MAESTRO® e quatro proteínas híbridas foram escolhidas para expressão heteróloga. Todas as proteínas avaliadas neste trabalho foram purificadas por cromatografia de troca iônica e exclusão por tamanho, bem como caracterizadas através de múltiplos experimentos físico-químicos e imunológicos. Resultados: A análise proteômica revelou um padrão de degradação específico no motivo N-terminal de Blo t 5. A ausência deste motivo não influenciou o potencial alergênico da molécula, mas a variante curta apresentou mudanças na estabilidade de enovelamento e resistência a proteólise endolisossomal. Entre os híbridos hipoalergênicos, BTH2 apresentou a menor reatividade de IgE e capacidade de induzir degranulação de basófilos, bem como atenuou a inflamação das vias áreas em camundongos, sem a necessidade de mudanças drásticas nos parâmetros estruturais da molécula. Conclusões: Os tipos de tecnologia mais inovadoras para a produção de hipoalérgenos são as abordagens in silico. Blo t 5short é o melhor modelo para o desenho de um
hipoalérgeno. BTH2 foi o candidato vacinal mais promissor e tem o potencial de ser usado para tratar pacientes co-sensibilizados com dois alérgenos maiores. No entanto, estudos futuros sobre sua imunogenicidade, usando células mononucleares do sangue periférico de pacientes atópicos e modelos in vivo de murinos, são necessários para considerar este alérgeno híbrido como um novo candidato vacinal em imunoterapia com alérgeno.
Palavras-chave: Ácaros da poeira doméstica, hipoalérgenos, imunogenicidade, proteína híbrida, candidato vacinal, imunoterapia de alergia
ABSTRACT
Introduction: Blomia tropicalis is considered the most prominent mite species in the tropical
and subtropical regions of the world. An increase in sensitization rates to this mite has been reported, mainly with high IgE levels against the two major allergens: Blo t 5 and Blo t 21. Currently, allergen immunotherapy protocols in these regions have been performed using crude extracts, which have disadvantages when compared to the new approaches: the hypoallergenic derivatives. Aim: We aimed to map the technology landscape of the production of allergen preparations for AIT and determine the most advantageous technology for the development of a hypoallergenic Blo t 5/Blo t 21 hybrid molecule, that can potentially be used to tackle allergic reactions caused by B. tropicalis. Methods: A proteomic analysis of
B. tropicalis extract was performed to find isoforms or variants of Blo t 5. Two variants termed
rBlo t 5short and rBlo t 5long and a shortened version of Blo t 21 were expressed in their
recombinant forms. In silico design of B. tropicalis hybrid proteins was performed using MAESTRO software and four hybrid proteins were chosen for heterologous expression. All proteins in this work were purified by ion exchange and size exclusion chromatography, as well as characterized through several physicochemical and immunological experiments.
Results: MS-analysis revealed a specific degradation pattern at the N-terminal motif of Blo t
5. The absence of this motif did not influence its allergenic potential, but the shortened variant displayed changes in folding stability and endolysosomal proteolysis resistance. Among the hypoallergenic hybrids, BTH2 has shown the lowest IgE reactivity and ability to induce basophil degranulation, as well as it attenuated the induced airway inflammation in mice, without the need of drastic changes in structural parameters of the molecule. Conclusions: The most innovative types of technology for the production of hypoallergens are knowledge-based in silico approaches. Blo t 5short is the best template for the design of a hypoallergen.
BTH2 was the most promisor vaccine candidate and has the potential to be used to treat patients co-sensitized with these major allergens. Nevertheless, future studies on BTH2 immunogenicity, using peripheral blood mononuclear cells of atopic patients and murine in
vivo models evalutating T-cell priming, are required to consider this hybrid allergen as a novel
allergen immunotherapy/vaccine candidate.
Keywords
House dust mite, hypoallergen, immunogenicity, hybrid protein, vaccine candidate, allergen immunotherapy
Sumário
INTRODUÇÃO ... 1
OBJETIVOS ... 9
CAPÍTULO I ... 11
Manuscrito 01 – Revisão publicada na Expert Opinion on Therapeutic Patents ... 11
Advances in patent applications related to allergen immunotherapy ... 11
CAPÍTULO II ... 24
Manuscrito 02 – Revisão publicada na International Archives of Allergy and Immunology ... 24
Allergens of Blomia tropicalis: An Overview of Recombinant Molecules ... 24
CAPÍTULO III ... 37
Manuscrito 03 – A ser submetido na Allergy ... 37
Immunological and physicochemical features of a new variant of Blo t 5, a major allergen of Blomia tropicalis ... 37
CAPÍTULO IV ... 85
Manuscrito 04 – A ser submetido na Clinical and Experimental Allergy... 85
Two major Blomia tropicalis allergens on a single protein: the potential of BTH2 hybrid as a therapeutic molecule ... 85
CAPÍTULO V ... 147
Patente BR 10 2018 013244 0 – Submetida ao INPI ... 147
Desenho e produção de proteínas híbridas recombinantes hipoalergênicas construídas a partir de alérgenos dos grupos 5 e 21 de Blomia tropicalis para uso profilático e tratamento de doenças alérgicas ... 147
CONCLUSÕES ... 193
REFERÊNCIAS ... 195
INTRODUÇÃO - 1
A asma alérgica e outras doenças alérgicas, consideradas inicialmente como doenças do primeiro mundo, hoje, ocorrem também em países em desenvolvimento e suas incidência e prevalência vêm aumentando constantemente nas últimas décadas (PAWANKAR, 2014; PLATTS-MILLS, 2015; LUNDBACK et al., 2016). Uma das explicações para tal ampliação na América Latina, pode ser dada através de associações às mudanças de hábitos da população nos países em desenvolvimento. Entre essas transformações, o maior uso de antibióticos, as melhorias no saneamento, campanhas de vacinação, aumento da obesidade e de poluição ambiental são fatores que têm sido descritos como associados ao desenvolvimento de enfermidades alérgicas (YAZDANBAKHSH et al., 2002; FIGUEIREDO et al., 2013; ALCANTARA-NEVES et al., 2017).
Como consequência, a Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Organização Mundial de Alergia (OMA) estimam que 334 milhões de pessoas têm asma no mundo, e que 14% das crianças apresentam sintomas desta doença. Além disso, foi estimado que 250 mil pessoas morrem por ano devido a asma. No mundo, 80% destas mortes ocorreram em países de baixa e média renda (ASHER e PEARCE, 2014; PAWANKAR, 2014; COLLABORATORS, 2017). No Brasil, o ISAAC (The International Study of Asthma
and Allergies in Childhood) constatou, na fase I do estudo, que o país está entre os oito
de maior prevalência de asma no mundo (SOLE et al., 2007). Tais dados foram posteriormente corroborados, nos quais cerca de 23,2% dos indivíduos, numa avaliação nacional, apresentaram sintomas de asma (BARRETO et al., 2014), confirmando uma alta prevalência em diferentes cidades do país (COELHO et al., 2016; MASCARENHAS
et al., 2016; TOLEDO et al., 2016).
As doenças alérgicas são caracterizadas por um padrão de inflamação que é em grande parte impulsionado por mecanismos dependentes do anticorpo IgE. Inicialmente, na fase de sensibilização (Figura 1), células dendríticas presentes no lúmen das vias aéreas ou das submucosas entram em contato com o alérgeno, já que alguns alérgenos com atividade de protease podem atravessar as junções entre as células epiteliais. Assim, estas células, quando ativadas amadurecem e migram para linfonodos centrais ou da mucosa local, onde, no contexto das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II, apresentam os peptídeos derivados do alérgeno às
INTRODUÇÃO - 2
células T naives. Na presença da interleucina 4 (IL-4), esses linfócitos T naives adquirem características de células T helper 2 (Th2), produzindo IL-4 e IL-13, que, por sua vez, promovem a troca de classe de imunoglobulina nas células B para IgE, os quais difundem-se localmente e entram nos vasos linfáticos. Em seguida, essas imunoglobulinas E entram no sangue e são distribuídos de forma sistêmica. Depois de ter acesso ao fluido intersticial, a IgE específica ou não específica para um alérgeno se liga aos receptores de alta afinidade (FcεRI) dos mastócitos, basófilos, e de baixa afinidade (FcεRII) de eosinófilos, linfócitos B, macrófagos ativados, células dendríticas foliculares e plaquetas (GALLI et al., 2008; BARNES, 2011).
Figura 1 – Mecanismo da sensibilização a alérgenos. Figura obtida em publicação (GALLI et al., 2008).
Numa exposição repetida, o alérgeno se liga a duas moléculas de IgE específicas para o mesmo alérgeno que se encontram ligadas ao seu receptor FcεRI de alta afinidade (cross-linking) na superfície das células efetoras, o que leva a uma cascata de sinalização que culmina na liberação de vários mediadores celulares, incluindo histamina, leucotrienos, prostaglandinas, proteases e citocinas (Figura 2). Esses mediadores são os responsáveis pela reação de hipersensibilidade imediata tipo 1. A exposição frequente ao alérgeno ocasiona inflamação crônica que culmina, quando nas vias aéreas, no espessamento dos bronquíolos, aumento da produção de muco, fibrose e remodelamento brônquico (GALLI et al., 2008; BARNES, 2011). Ademais existem outras
INTRODUÇÃO - 3
citocinas, tais como a IL-5 que é secretada pelas células Th2 e ativa os eosinófilos, um tipo de célula que é abundante em reações de hipersensibilidade tipo I e IV (TAKATSU e NAKAJIMA, 2008; KIM et al., 2017). A IL-13, por sua vez, estimula as células epiteliais a secretar quantidades aumentadas de muco, característica comum das reações imediatas de hipersensibilidade tipo I em mucosas (GOUR e WILLS-KARP, 2015; KIM et al., 2017). Mais recentemente, foi observado que as células linfoides inatas GATA-3+ tipo-2 (ILC2s) também estão envolvidas no desenvolvimento de alergias. Verificou-se que as ILC2s produzem citocinas Th2 nos tecidos e foram encontradas na pele e superfícies mucosas, incluindo trato respiratório (DOHERTY e BROIDE, 2015; MARTINEZ-GONZALEZ et al., 2015; KUBO, 2017). Além disso, as células Th17 têm se apresentado como células participantes nas respostas das vias aéreas induzidas por alérgenos (NAJI et al., 2014).
Figura 2 - Fase inicial da inflamação das vias aéreas induzida por alérgenos. Figura obtida em publicação (GALLI
INTRODUÇÃO - 4
As manifestações clínicas oriundas destas reações são distintas a depender do órgão alvo. Dentre as quais, destacam-se: dermatite atópica, rinite atópica, asma, anafilaxia e distúrbios do aparelho digestivo. A partir desses quadros clínicos, os indivíduos buscam repetidamente clínicas e hospitais para o tratamento dos sintomas, resultando em enormes custos pessoais e para a saúde pública. De fato, estimativas de custos médios revelaram que pacientes asmáticos na Europa podem gastar cerca de U$ 1.900/ano, valor abaixo do encontrado nos Estados Unidos da América com U$ 3.100/ano (NUNES et al., 2017). Estes custos podem variar de país para país. Como exemplo, na Espanha foi observado um custo anual médio de € 2.326,70 por pacientes com rinite alérgica, sendo € 553,80 de custos diretos e € 1.772,90 de custos indiretos (COLAS et al., 2017). Normalmente, os custos diretos são os que resultam diretamente das intervenções por conta dos sintomas, enquanto que os indiretos resultam da perda de produtividade associada ao absenteísmo ao trabalho/escola ou à mortalidade precoce. Levando-se em consideração os salários mínimos nesses países, tais custos podem ultrapassar orçamentos básicos mensais para estes pacientes (DAMASCENO et al., 2012; COLAS et al., 2017; NUNES et al., 2017).
Além disso, ainda não existem tratamentos curativos para estas enfermidades e os medicamentos de controle disponíveis no momento, como os corticosteróides, são acompanhados de efeitos colaterais sérios (CIRIACO et al., 2013; HOSSNY et al., 2016). Diante da importância médica da asma e de demais doenças alérgicas, é imprescindível o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento para estas enfermidades, sobretudo visando tanto a melhoria da qualidade de vida dos pacientes, como a redução de custos pessoais e para a saúde pública.
No Brasil, dados do Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS) do Ministério da Saúde, apontam altos índices de asma e óbitos associados, sendo esta doença responsável por gastos acima dos R$ 106 milhões anuais em internações relacionadas aos sintomas (DAMASCENO et al., 2012). Recentemente, notou-se no Rio de Janeiro um custo anual médio de aproximadamente dois mil reais por pacientes com asma (SILVA et al., 2015). Na Bahia, apesar do Programa de Controle de Asma e da Rinite Alérgica na Bahia (ProAR) ter reduzido o custo direto e indireto total dos pacientes com asma grave de R$ 181.652,94/ano para R$ 59.345,41/ano, após um
INTRODUÇÃO - 5
ano de atendimento dos pacientes no ProAR (FRANCO et al., 2007), tais custos ainda são altos e torna-se imprescindível o início de uma imunoterapia alérgeno-específica, cuja eficácia e segurança, associadas ao custo-benefício, têm se mostrado vantajosas em muitos países.
A abordagem terapêutica alternativa para a farmacoterapia em alergia é a imunoterapia alérgeno-específica (AIT). Esse tipo de tratamento vem sendo usado para tratar alergias, possuindo tempo de tratamento entre três a cinco anos, cujo objetivo fundamental é a indução de tolerância imune como alvo primário para o tratamento ou prevenção de enfermidades alérgicas (BERINGS et al., 2017). As diversas vantagens da AIT foram descritas em diversas publicações (WALLNER et al., 2013; FERREIRA et al., 2014; AKDIS e AKDIS, 2015), dentre as quais destacamos uma prospecção tecnológica realizada por nosso grupo (SILVA et al., 2016).
Usualmente, dois tipos de AIT estão sendo usadas na prática clínica: (i) a imunoterapia subcutânea (SCIT); e (ii) a imunoterapia sublingual (SLIT); porém várias novas abordagens de AIT estão sendo avaliadas em triagem clínicas (AKDIS e AKDIS, 2014; AKDIS e AKDIS, 2015). SCIT envolve injeções semanais de doses crescentes do extrato total (o qual o paciente é alérgico) inicialmente bastante diluídos, seguidas de injeções mensais de manutenção por pelo menos 3 anos. Em vista de efeitos anafiláticos ocasionais, SCIT requer administração em uma clínica especializada em alergia com acesso a medidas de ressuscitação. Diferentemente, SLITé mais eficaz e segura, de modo que pode ser autoadministrada pelo paciente. Trata-se do uso de gotas diárias ou comprimidos colocados sob a língua para alcançar tolerância. Seja em solução ou pastilhas, SLIT implica o mesmo princípio de SCIT de concentrações inicialmente bastante diluídas para mais concentradas de extratos. Todavia, enquanto em SCIT a fase inicial do esquema de tratamento é semanal, em SLIT é diária. Já na fase de manutenção, as doses em SLIT passam a ser ocasionais durante a semana e é continuada por pelo menos 3 anos (FUJITA et al., 2012; AKDIS e AKDIS, 2014; AKDIS e AKDIS, 2015; BERINGS et al., 2017; SHAMJI e DURHAM, 2017).
O mecanismo subjacente a esses tipos de terapias (Figura 3) envolve uma troca na resposta imune do paciente de uma resposta predominantemente alérgica de linfócitos T (Th2) para uma resposta "não-alérgica" de linfócitos T (Th1), bem como uma maior
INTRODUÇÃO - 6
produção de linfócitos T reguladores (Treg). Esses últimos têm um papel chave pois regulam a resposta imune alérgica através, dentre outros mecanismos, da liberação de duas importantes citocinas: IL-10 e TGF-β. A IL-10 induz uma mudança do isotipo da IgE específica para IgG4 específica, que se liga ao alérgeno antes do mesmo formar o
cross-linking com a IgE presente nos receptores de alta afinidade das células efetoras, agindo
assim como um anticorpo bloqueador. O TGF-β foi associado não só com a inibição da proliferação e diferenciação das células B, mas também com a diminuição da produção de imunoglobulinas, exceto de IgA específica para alérgeno. Esta citocina está ainda envolvida na indução de fibrose contribuindo para o remodelamento brônquico (FUJITA
et al., 2012; AKDIS e AKDIS, 2014; OJIAKU et al., 2017; SHAMJI e DURHAM, 2017).
Figura 3 – Mecanismos de AIT. Figura obtida em publicação (SHAMJI e DURHAM, 2017).
Atualmente uma variedade de abordagens e formulações têm sido utilizadas em AIT, embora o uso de moléculas recombinantes e hipoalergenizadas de alérgenos tenham ganhado destaque (JONGEJAN et al., 2016; SILVA et al., 2016; WAI et al., 2017). Estas moléculas são produzidas a partir de diferentes fontes, como pólen, pelos de animais, alérgenos alimentares e ácaros (HOFMANN et al., 2013; BANERJEE et al., 2014; CURIN et al., 2014; KINACIYAN et al., 2016; MARTINEZ et al., 2018). A principal característica para definir uma proteína como hipoalergênica éredução significativa da
INTRODUÇÃO - 7
ligação da IgE a partir de uma modificação estrutural da molécula selvagem. Entretanto, para ser considerado, de fato, um imunoterápico, o hipoalérgeno deverá apresentar também as seguintes características: (i) indução de proliferação de células T semelhante aos alérgenos nativos; (ii) aumento da produção de anticorpos IgG bloqueadores e específicos para alérgenos, em particular IgG4; e (iii) reduzida capacidade de indução da degranulação de células efetoras. Tais parâmetros têm sido observados durante o curso da AIT, cuja hipótese de mecanismos regulatórios já foi mencionada anteriormente como a razão para tais mudança no perfil de resposta imune. A Figura 4 ilustra as mudanças imunológicas esperadas durante o curso da AIT.
Figure 4 - Alterações imunológicas durante o curso da AIT. Em A: mudanças celulares. Em B: anticorpos e sintomas. Figura obtida em publicação (AKDIS e AKDIS, 2015).
Para realizar modificações estruturais em um alérgeno, a determinação de epítopos de células B e T é fundamental. No caso de epítopos de células T, como tais epítopos são tipicamente lineares, peptídeos sintéticos são usados para o mapeamento de epítopos. Estes peptídeos têm, geralmente, 15 a 20 aminoácidos de comprimento, abrangendo o comprimento da molécula para mapear regiões alvo de ligação de células T. Usualmente, esses peptídeos são então testados em cultura de células T, obtidas a partir de modelos animais ou de células mononucleares do sangue periférico de indivíduos atópicos (WOODFOLK, 2007; LIU e SATHE, 2018).
Semelhante ao mapeamento em células T, os peptídeos sintéticos sobrepostos são os mais comumente usados para o mapeamento de epítopos lineares de células B, em combinação com ELISA avaliando a ligação da IgE. Por outro lado, a identificação de epítopos conformacionais requer uso de métodos mais elaborados, como mutagênese sítio-dirigida, cristalografia de raios X, tecnologia Phage Display e ressonância magnética
INTRODUÇÃO - 8
nucluear (NMR). Além disso, a mutação de peptídeos e a modificação química são por vezes utilizadas para identificar os resíduos de aminoácidos chaves para ligação da IgE (CHAN et al., 2008; TAN et al., 2012; LUZAR et al., 2016; PATEL e MEHER, 2016; LIU e SATHE, 2018).
Como tais técnicas requerem, por vezes, um número extensivo de ensaios, análises alternativas in silico emergiram como forma de predizer tais epítopos (DALL'ANTONIA et al., 2014). Inclusive, um banco de dados de epítopos (IEDB,
http://www.iedb.org/) foi criado e cataloga epítopos B e T experimentalmente
determinados (BUI et al., 2005; NIELSEN et al., 2007). Tais abordagens in silico têm sido usadas não só para predição de epítopos, mas como uma via de obtenção de hipoalérgenos, principalmente de alérgenos de pólen e ácaros da poeira (WALLNER et
al., 2013; FERREIRA et al., 2014; SILVA et al., 2016).
Os ácaros da poeira doméstica são, de fato, uma das mais importantes fontes de aeroalérgenos no mundo. Enquanto o gênero Dermatophagoides é amplamente distribuído a nível global, o Blomia tropicalis pode ser considerado o agente sensibilizador mais importante nas áreas de clima subtropical e tropical (CALDERON et al., 2015; GUILLEMINAULT e VIALA-GASTAN, 2017). Em trabalhos realizados pelo nosso grupo detectamos o ácaro B. tropicalis como o agente mais alergênico em adultos e em crianças de Salvador (BAQUEIRO et al., 2006; NEVES et al., 2010; ALCANTARA-NEVES et al., 2017). Nosso grupo demonstrou também que os alérgenos Blo t 5 e Blo t 21 juntos reagiam em 90% das amostras de soros positivos para o extrato de B. tropicalis (CARVALHO et al., 2013), e em uma recente revisão de literatura confirmamos que Blo t 5 e Blo t 21 são considerados alérgenos maiores em diversas populações (SANTOS DA SILVA et al., 2017).
Como esses dois alérgenos apresentam uma similaridade estrutural ímpar (CHAN
et al., 2008; NAIK et al., 2008; TAN et al., 2012) e outras populações no mundo possuem
alta reatividade de IgE para tais, nosso grupo vislumbrou uma oportunidade no desenvolvimento de um imunoterápico, na forma de uma proteína híbrida hipoalergênica Blo t 5/Blo t 21,que possa potencialmente ser usada para combater reações alérgicas causadas por B. tropicalis.
OBJETIVOS - 10
Objetivo geral:
o Mapear o panorama tecnológico da produção de preparações alergênicas para AIT e definir qual a tecnologia mais vantajosa para desenvolver uma molécula híbrida hipoalergênica Blo t 5/Blo t 21, que possa potencialmente ser usada para combater reações alérgicas causadas por B. tropicalis.
Objetivos específicos:
o Determinar a tecnologia mais vantajosa para desenvolvimento de derivados hipoalergênicos através de revisão de literatura.
o Utilizar analise proteômica a fim de encontrar isoformas ou variantes de Blo t 5 o Realizar a produção heteróloga, purificar e avaliar a purificação de Blo t 5 e Blo
t 21.
o Desenvolver a partir de Blo t 5 e Blo t 21 moléculas híbridas e hipoalergenizá-las in silico.
o Induzir a produção heteróloga, purificar e avaliar a purificação das proteínas híbridas hipoalergênicas.
o Caracterizar físico-quimicamente e imunologicamente todos alérgenos recombinantes do presente estudo.
o Testar o potencial terapêutico das proteínas híbridas hipoalergênicas em modelo experimental murino de alergia.
CAPÍTULO I
Manuscrito 01 – Revisão publicada na Expert Opinion on Therapeutic PatentsCAPÍTULO II
Manuscrito 02 – Revisão publicada na International Archives of Allergy and ImmunologyCAPÍTULO III
Manuscrito 03 – A ser submetido na AllergyImmunological and physicochemical features of a new variant of Blo t 5, a major allergen of Blomia tropicalis
CAPÍTULO III - 38
Immunological and physicochemical features of a new variant of Blo t
5, a major allergen of Blomia tropicalis
E. S. Silva1,2,3, S. Huber3, C. Asam3, L. Aglas3, M. Wallner3, G. Gadermaier3, P. Briza3, I.
Karner3, J. R. U. Alvarez1,4, S. Wuenschmann5, M. D. Chapman5, F. Ferreira3, N. M.
Alcantara-Neves1,2, C. S. Pinheiro1,3*
1 Laboratório de Alergia e Acarologia, Departamento de Ciências da Biointeração, Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, BA, Brazil 2 Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), Natal, Brazil
3 Department of Biosciences, University of Salzburg, Salzburg, Austria
4 Department of Pharmaceutical Sciences, University of Cartagena, Cartagena, Colombia 5 Indoor Biotechnologies Inc, Charlottesville, VA, USA
*Corresponding author’s address: Laboratório de Alergia e Acarologia Instituto de Ciências da Saúde Universidade Federal da Bahia
Avenida Reitor Miguel Calmon, sem nº, Vale do Canela, Salvador, Bahia, Brazil CEP – 40110-100
E-mail: carina.pinheiro@ufba.br
CAPÍTULO III - 39
Abstract
Background: The mite Blomia tropicalis is an important source of allergens in countries with subtropical and tropical climate. Blo t 5 is considered a major allergen and by far the best-characterized Blomia tropicalis allergen. However, new insights on isoforms and variants of Blo t 5 are still needed. Therefore, we aimed to investigate the presence of isoforms and variants of Blo t 5 in a Blomia tropicalis extract. A second objective was to evaluate how modifications in Blo t 5 molecule would influence its structural and immunological features.
Methods: We carried out a proteomic analysis of a Blomia tropicalis extract, which was digested in-solution with trypsin and analyzed by mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC/MS/MS). Two variants termed rBlo t 5short and rBlo t 5long were
heterologously expressed and purified by ion exchange and size exclusion chromatography. Both variants were characterized through several physicochemical and immunological assays.
Results: Despite the absence of Blot 5 new isoforms in Blomia tropicalis extract, MS-analysis revealed a specific degradation pattern at the unstructured N-terminal motif of Blo t 5. The two rBlo t 5 variants presented a typical circular dichroism spectrum for proteins with α-helix content, further confirmed by Fourier transform infrared spectroscopy measurements. No aggregation was found in dynamic light scattering experiments. rBlo t
5short showed stronger resistance towards endolysosomal degradation than rBlo t 5long. No
significant differences were found regarding IgE reactivity or degranulation capacity in mediator release assay. rDer p 5 showed a moderate inhibitory capacity on IgE-binding to rBlo t 5.
Conclusions: The shortening of the N-terminal motif of native Blo t 5 indicates this unstructured region may be a pro-peptide. The absence of the N-terminal motif in Blo t 5 did not influence its allergenic potential, but the shortened variant displayed changes in folding stability and endolysosomal proteolysis resistance, making this new variant of Blo t 5 the most suitable template for the design of a hypoallergenic derivative.
Keywords
CAPÍTULO III - 40
1 Introduction
House dust mites are considered one of the most important sources of indoor allergens worldwide, and the cause of allergic disorders (1). In the temperate climate regions of the world, the most prominent species is Dermatophagoides pteronyssinus, whereas in subtropical and tropical areas Blomia tropicalis is considered the key sensitizer (1-3). B.
tropicalis was observed to be a highly frequent mite in residences of Brazilian cities (4, 5).
Furthermore, it is found to be the main source of indoor allergens in other countries with similar temperature and humidity levels such as Cuba, Hong Kong and Singapore (6-8). Among the 25 IgE-binding proteins from B. tropicalis identified hitherto, the group 5 allergen is known as the most significant trigger in B. tropicalis-associated allergy, with up to 96% IgE reactivity in individuals with atopy, asthma and eczema (3, 8-14).
In fact, Blo t 5 is by far the most studied and well-characterized allergen of B. tropicalis (15) and NMR experiments were performed to determine its three-dimensional (3D) structure, which is composed of three antiparallel α-helices, arranged in a helical bundle with a highly unstructured N-terminal motif (10, 13). Despite of such advances in Blo t 5 structural characterization, some data clearly need more insights, such as: (i) the conflicting data on IgE epitopes (10, 13) and its implication on cross-reactivity patterns; (ii) possibility of allergen polymorphism; (iii) as well as the structural and immunological relevance of the disordered N-terminal motif of Blo t 5.
To address, the question “iii” in the present work, we thus aimed to investigate the presence of isoforms and variants of Blo t 5 as well as the implication of changes on structural and immunological characteristics of this allergen. To achieve that, analysis of the B. tropicalis proteome using an extract obtained in Brazil was performed. Moreover, recombinant variants of Blo t 5 were produced, with and without the N-terminal region, and the proteins were characterized through several physicochemical and immunological assays.
2 Materials and methods
2.1 Mite culture and protein extract
B. tropicalis cultivation and the extract’s preparation were performed as previously
CAPÍTULO III - 41
cultured at 25°C and 75% humidity. A specific breed was obtained after the isolation of a unique pregnant female mite from a bed dust sample. After the breed culture, the mites were purified by flotation in saturated saline and washed using PBS until no sign of food was seen under microscopy. Using a blender (Waring Commercial, Torrington, Connecticut, USA), the mites were lysate in phosphate buffed saline, ph 7.4 (PBS) and then centrifuged at 4500 rpm, 20 min, 4°C. In order to remove lipids from the soluble supernatant, ether extractions’ steps were realized followed by centrifugations. The protein amount was determined by Lowry reagent method and the sample was stored at -70°C until use.
2.2 B. tropicalis extract in-solution digestion
In-solution digestion of the B. tropicalis extract was performed as described previously (17, 18). In short, the mite extract was digested with the ProteoExtract All-in-One Trypsin Digestion Kit (EMD Millipore, Billerica, MA, USA). After digestion, the sample was desalted using C18 ZipTips (EMD Millipore, Billerica, MA, USA) and the resulting peptides analyzed by mass spectrometry coupled to liquid chromatography (LC/MS/MS).
2.3 Proteomic analysis and identification of Blo t 5 variants
The proteomic data analysis of Blo t 5 variants were assessed as previously shown (17, 18). In short, survey and fragment spectra were analyzed using Proteome Discoverer version 1.4 with SequestHT as search engine (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) or Peaks Studio 8 (Bioinformatics Solutions, Waterloo, Canada), respectively. UniProt (SwissProt/TrEMBL) and NCBI were the database used for general searches. An in-house search for specific allergens of B. tropicalis was proceeded using IUIS database (http://www.allergen.org).
2.4 Expression and purification of Blo t 5 variants
The recombinant variants termed rBlo t 5short and rBlo t 5long were expressed as non-fusion
proteins in Escherichia coli strain BL21 StarTM (DE3) and purified by anion exchange chromatography (AEC) followed by size exclusion chromatography (SEC). A detailed protocol description is provided in Appendix S1.
CAPÍTULO III - 42
2.5 Physicochemical characterization of recombinant Blo t 5 variants
As previously described (19, 20), the rBlo t 5 variants were analyzed physicochemically in terms of (i) quantity by means of amino acid analysis (AAA), (ii) identity via mass spectrometry (MS), (iii) thermal stability, folding and secondary structure element content using circular dichroism (CD) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR), and (iv) their aggregation behaviour was observed in solution by dynamic light scattering (DLS).
2.6 Evaluation of proteolytic stability of rBlo t 5 variants
The susceptibility to endolysosomal proteolysis was assessed by degradome assays (21). The protocol is minutely described in Appendix S1.
2.7 Donors’ sera
Sera from donors with specific IgE to B. tropicalis were selected by positive clinical history of allergy, positive skin prick test, and anti-B. tropicalis IgE reactivity detected by ImmunoCAP (Phadia Diagnostics AB, Uppsala, Sweden). The Ethics Committee on Research of the Faculty of Medicine of Federal University of Bahia has approved the present research (CAAE 45376814.0.0000.5577). Moreover, the Ethics Committee of the University of Salzburg (415-E/1398/4-2011) has approved the experiments with donors’ sera from Austria. More details are given in Appendix S1 and Table S1.
2.8 IgE reactivity and cross-inhibition analyses
IgE reactivity of the variants and the peptide comprising the N-terminal region was verified by ELISA and Dot-blot. Cross-inhibition ELISA assays were performed to evaluate the cross-reactivity between Blo t 5short and Der p 5. These experiments are minutely
described in Appendix S1.
2.9 Mediator release assay
Mediator release assays were performed using sera containing IgE antibodies from B.
tropicalis allergic donors and rat basophil leukemia (RBL)-2H3 cells which are transfected
with the α chain of the human high-affinity IgE receptor (FcεRI) (22). A complete description of this protocol is provided in Appendix S1.
CAPÍTULO III - 43
3 Results
3.1 Degradation pattern at the N-terminal motif of native Blo t 5
Figure 1A shows the superposition of Blo t 5 identified peptides after digestion with trypsin/chymotrypsin. It was observed that the mature native protein was shorter than the previous works (9, 10, 13). The predicted signal peptide of Blo t 5 is comprised by the amino acid residues 1-17 (MKFAIVLIACFAASVLA), while the highly flexible region, QEH KPKKDDFRNEFDHL, was considered the N-terminal region of the mature chain of Blo t 5 in a predictive analysis (Figure 1B). Our MS-analysis showed that this region presented a specific degradation pattern, indicating that this region, may be a pro-peptide of the native Blo t 5. No other isoforms or variants of Blo t 5 were found in our MS-analysis, as detailed in Table S2.
3.2 Expression, purification and primary structure of rBlo t 5 variants
Figure 1C and 1D shows the expression of rBlo t 5 variants as non-fusion proteins in E.
coli BL21 Star™ (DE3) (Lanes 1 and 2). Both proteins were obtained in the soluble fraction
(Lane 3). Under reducing conditions, rBlo t 5short and rBlo t 5long migrated as monomeric
proteins, with molecular weights of approximately 12 kDa and 14 kDa, respectively. The purification steps for the Blo t 5 variants are depicted in Figure 1 (Lanes 5 and 6). After size exclusion chromatography, the stability of rBlo t 5long was decreased, as indicated by
the generation of degradation products (Figure 1D, Lane 6).
As determined by mass spectrometry, rBlo t 5short was found to have a molecular mass of
11904.25 Da (Figure S2A) and thus is identical to the theoretical value, whereas intact mass measurements of rBlo t 5long resulted in a molecular weight of 13192.84 Da (Figure
S2B), and thus is different to the theoretical molecular weight of 14151.00 Da. The degradation of its N-terminal region and other degradation products visible as minor peaks are shown in Figure S2B. These results are comparable to the different bands seen in Figure 1D, Lane 6. The sequence representation of the variants is shown in Figure S1. The experimental number of amino acid residues was in good accordance with the theoretical number (Figure S3).
CAPÍTULO III - 44
3.3 While the absence of the disordered N-terminal motif changes folding, there is no effect on aggregation behaviour
The CD spectra of both proteins showed two typical minima at 208 nm and 222 nm and even after denaturation at 95 °C both protein variants refolded at 20 °C (Figures 2A and 2B). Despite these similarities, rBlo t 5short has shown a slightly higher thermal stability,
with a Tm of 56.26 °C ± 0.12 °C compared to rBlo t 5long with a Tm = 55.70 ± 0.56. Figures
2C and 2D show our temporal folding analysis, whose CD spectra clearly revealed a faster decreasing in rBlo t 5long-folding in comparation with Blot5short, when both were kept at
room temperature for 48h. Furthermore, the data derived from FTIR measurements (Figure S4A) showed comparable results for both variants. The measured high content of α-helices in rBlo t 5short (59.8%) and rBlo t 5long (56.7%) was not significantly different from
the theoretical values (Figure 2E).
In DLS analysis, the hydrodynamic radius (RH) observed for rBlo t 5short and rBlo t 5long
were 1.82 nm and 2.02 nm, respectively (Figure 2F). Thus, the rBlo t 5 variants were found to be monomeric molecules under the performed conditions.
3.4 The absence of the N-terminal peptide of Blo t 5 led to a reduced susceptibility to endolysosomal degradation
Degradome assays were performed to access the proteolytic stability of rBlo t 5 variants. At defined intervals, the susceptibility to endolysosomal proteolysis was monitored by SDS-PAGE and revealed that rBlo t 5long was completely degraded after 24 hours. In
comparison, rBlo t 5short was completely degraded after 48 h, indicating an increased
resistance of rBlo t 5short towards endolysosomal degradation (Figure 3A). In fact,
densitometric evaluation of the recombinant allergens allowed us to calculate a half-life of 9 h and 5 h for rBlo t 5short and rBlo t 5long, respectively (Figure 3B). Although some
differences occurred in the peptide clusters of both rBlo t 5 variants, which were determined by tandem MS-based analysis (Figure 4), the predominant peptide fragments were the same in both variants. These regions were around the following residues: (i) QHQLDELNENKSKELQEKIIRE; (ii) MIEGAQGALERELK; and (iii) RFNYEEAQTLSKI.
CAPÍTULO III - 45
3.5 The allergenic potential is similar in both rBlo t 5 variants
IgE reactivity and biological activity of rBlo t 5 variants were investigated by ELISA and mediator release assays. No statistical difference was found in ELISA (Figure 5A). Around 86.7% of the sera from B. tropicalis-allergic donors reacted with both rBlo t 5 variants. In addition, a dot blot assay revealed that the N-terminal region of Blo t 5 has no IgE reactivity, as shown in Figure 5B.
Regarding basophil degranulation, the rBlo t 5 variants have presented comparable curves for each donor (Figure 5C and Figure S5) and when the half-maximal activation was calculated, no statistical difference between the variants has been found (Figure 5D). However, while a total of 0.02 ± 0.02 ng/mL rBlo t 5short was necessary to trigger the
half-maximal release of β-hexosaminidase, 0.08 ± 0.05 ng/mL of rBlo t 5long were needed to
achieve the same effect.
3.6 Low/moderate cross-reactivity between rBlo t 5 and rDer p 5
The IgE reactivity of both allergens was performed prior to the cross-inhibition assays. In this case, the IgE reactivity of sera from Austrian donors to rBlo t 5 (n=20) was 80.0%, while 75.0% of those sera reacted to rDer p 5. Brazilian donors’ sera (n=43) had 90.7% positivity for IgE to rDer p 5 (Figure S6). Among those sera, four Brazilian and two Austrian donors were solely sensitized to rBlo t 5. Whereas six Brazilians and one Austrian donor reacted only to rDer p 5. The other donors were sensitized to both allergens. This reactivity profile was further confirmed by Western blot (Figure S6C). Then, dose-response inhibition studies were performed to assess the cross-inhibition level between Blo t 5 and Der p 5, using 19 representative sera (16 from Brazil and 3 from Austria). Only the short variant was used in this evaluation, since the protein was more stable and the N-terminal region, clearly, did not present any IgE reactivity in dot blot analysis.
Using 13 representative double positive sera from Brazil, the heterologous inhibition of rBlo t 5, using rDer p 5 as inhibitor, had the following percentage ranges: (i) at 1 ng/mL, rDer p 5 has inhibited 0.2% to 16.1% of IgE reactivity to Blo t 5; (ii) at 1 µg/mL the inhibition was 2.9% to 38.7%; (iii) above this concentration the inhibition capacity of rDer p 5 was 14.2% to 74.8% (Figure 6 and Figure S7). In the highest concentration, rDer p 5 inhibition capacity was 55.2% in mean on rBlo t 5 IgE reactivity.
CAPÍTULO III - 46
Using rBlo t 5 as inhibitor, following percentage ranges of Der p 5 inhibition were determined: (i) at 1 ng/mL of rBlo t 5, the IgE reactivity to rDer p 5 was reduced to values between 0.1% to 58.1%; (ii) at 1 µg/mL, 7.9% to 58.0% of rDer p 5 inhibition was observed; (iii) in the highest concentration the inhibition has reached values between 13.9% to 97.2% (Figure 6 and Figure S7). Despite of this range, rBlo t 5 inhibition capacity was lower than 40% in mean on rDer p 5 IgE reaction.
The sera from Brazilian donors solely sensitized to rBlo t 5 have presented an inhibition rate between 20.7% to 63.3%, from 1 µg/mL to 100 µg/mL of rDer p 5 (Figure 6, #31 and #54). On the other hand, the sera that were positive to rDer p 5 alone (from both countries, Figure 6, #18 and #A8) showed negligible inhibition, using rBlo t 5 as inhibitor (Figure 6). In addition, we have investigated sera from two Austrian donors which were positive against to rBlo t 5 and rDer p 5 (Figure 6 and S7, #A20 and #A8). While almost no inhibition was observed by using rBlo t 5 as heterologous inhibitor on rDer p 5 IgE reactivity, in the opposite direction 61.5% to 70.4% of inhibition were observed at the highest concentration (Figure 6 and Figure S7), showing that Der p 5 can inhibit rBlo t 5.
4 Discussion
B. tropicalis is well recognized as an independent cause of sensitization in countries with
a subtropical and tropical climate, leading to a strong association with allergic diseases (1, 23). Although some reports showed B. tropicalis co-exposure with D. pteronyssinus (1, 2, 7, 24), higher IgE titers to B. tropicalis have been reported (23, 25, 26). Many studies also demonstrated that among the identified B. tropicalis allergens, Blo t 5 is one of the major allergens (3, 8-11, 13).
Our group has previously shown that the recombinant version of Blo t 5 had high IgE reactivity levels, including a lower IgE cross-reactivity with a highly prevalent helminth (Ascaris lumbricoides) in Brazil, thus making this allergen a relevant and more specific alternative compared to the whole extract for the diagnosis of B. tropicalis allergy (3). These findings prompted us to investigate Blo t 5, not only for B. tropicalis diagnosis, but also as a key molecule for allergen-specific immunotherapy. However, it is well documented that an extensive physicochemical and immunological characterization of
CAPÍTULO III - 47
candidate molecules for allergen-specific immunotherapy is fundamental to achieve the improvement of safety and efficacy in this approach of treatment (19, 20, 27).
In this regard, our proteomic analysis of B. tropicalis extract has revealed that some isoforms of allergens, identified in our proteomic analysis, have not been acknowledged by IUIS yet (15). This is an indication, as other authors have stated, that allergen polymorphisms can occur (11, 28, 29), influencing IgE reactivity, as well as providing information regarding which isoform sequence would be optimal for allergy diagnosis or for the design of allergy vaccines. Moreover, it was also showed by our proteomic analysis, the presence of a specific degradation pattern at the unstructured N-terminal motif of Blo t 5.
This finding suggests the possibility of a longer signal peptide sequence than the one previously published and predicted with the SignalP software (10, 13). However, a previous proteomic study has shown a similar degradation behaviour at the N-terminal motif of various native Blo t 5 isoforms. Curiously, all identified isoforms displayed different N-terminal amino acids sequences during Edman degradation analysis (9), implying that this region might be indeed prone to degrade. Since this shortening could influence structural and allergenic characteristics in this major allergen, we decided to produce and characterize two recombinant variants of Blo t 5.
Our results showed that we have successfully purified and obtained completely soluble non-fusion recombinant Blo t 5 variants. Moreover, the identity of rBlo t 5 variants was confirmed by MS and AAA. However, some degradation in rBlo t 5long, could be noticed
exactly in the N-terminal region, but the most abundant MS peak matches with the sequence that was previously used to determine the 3D-structure of rBlo t 5 (13). Nonetheless, this type of degradation seems to be non-specific rather than self-cleavage, an intrinsic property of some allergens, produced as zymogens (30, 31). So far, the biological function of Blo t 5 remains unknown and the prediction attempts were unsuccessful (13). Therefore, it is uncertain whether the Blo t 5-N-terminal motif is a pro-peptide. More studies are needed to be performed in order to confirm this hypothesis. N-terminal Edman degradation, for instance, is one of the most appropriate techniques to define an N-terminal region of a mature protein (32).
CAPÍTULO III - 48
Revealed by MS analysis, the degradation of rBlo t 5long, had no effect on folding, which,
like rBlo t 5short, was correctly folded and results are in line with other published results
(13). Although both variants have shown a refolding capacity, the deletion of the N-terminal region has caused a slight increase of 1°C in the thermal stability for rBlo t 5short.
Also, the absence of this region improved the folding capacity, as our temporal folding analysis showed. It was previously published, the deletion, mutation or truncation of an N-terminal domain of proteins can increase their thermal stability, for the following reasons: (i) decreased dynamic at the N-terminus terminal region; (ii) and the compactness of the molecule after deletion (33, 34).
It has been previously verified that the dimerization and/or aggregation of allergens has a direct influence on allergenicity, usually leading to a reduced IgE binding (19, 35, 36). The rBlo t 5 variants herein studied were found to be monomeric in solution, under the investigated conditions, which is comparable with a predictive work showing that Blo t 5 is not prone to form dimers (37). Moreover, Mueller et al. stated that Blo t 5 lacks a stabilizing hydrophobic surface necessary for dimer formation due to an alanine substitution. In contrast, Der p 5, a known dimeric allergen, is able to create a hydrophobic zipper domain due to a valine in such regions (38).
The link between strong resistance towards endolysosomal degradation and immunogenicity has also been used in the evaluation of candidate molecules for allergen immunotherapy (19, 21, 39). Our results showed that the shortening of Blo t 5 led to a reduced susceptibility to endolysosomal proteolysis. Thus, an increase in the immunogenicity of Blo t 5 through its N-terminal peptide deletion might be expected. Therefore, rBlo t 5short represents a more suitable template for a hypoallergenic derivative.
One can speculate that the absence of the unstructured N-terminal region in rBlo t 5short
has reduced the overall flexibility of the molecule and, in association with the slightly increased thermal stability, as well as its higher temporal folding capacity, the profile of endolysosomal degradation was then modified. In addition, Machado et al. demonstrated a decreased susceptibility to endolysosomal proteolysis, resulting in an increased fold stability (40). Moreover, Stojanovski et al. found out by in silico analysis that the proteolytic susceptibility of a protein might result from the structurally disordered N-terminal tail region, which would in turn increase the availability of cleavage sites (41).
