Efeitos cardíacos e sistêmicos do pré-tratamento com estatina em modelo de sepse abdominal em ratos: avaliação através da biodistribuição do sestamibi-Tc99m

Texto

(1)MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. EFEITOS CARDÍACOS E SISTÊMICOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM ESTATINA EM MODELO DE SEPSE ABDOMINAL: AVALIAÇÃO ATRAVÉS DA BIODISTRIBUIÇÃO DO SESTAMIBI-Tc99m EM RATOS. ROBSON DE MACEDO FILHO. NATAL/RN 2015.

(2) ROBSON DE MACEDO FILHO. EFEITOS CARDÍACOS E SISTÊMICOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM ESTATINA EM MODELO DE SEPSE ABDOMINAL: AVALIAÇÃO ATRAVÉS DA BIODISTRIBUIÇÃO DO SESTAMIBI-Tc99m EM RATOS. Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em. Ciências. da. Saúde da. Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros. NATAL/RN 2015.

(3) CATALOGAÇÃO NA FONTE Macedo Filho, Robson de. Efeitos cardíacos e sistêmicos do pré-tratamento com estatina em modelo de sepse abdominal: avaliação através da biodistribuição do sestamibi-Tc99m em ratos / Robson de Macedo Filho. – Natal, 2015. 66f. : il. Orientador: Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros Tese (Doutorado) – Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Centro de Ciências da Saúde. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. 1. Sinvastatina – Tese. 2. Sepse – Tese. 3. Coração – Tese. 4. Inflamação – Tese. I. Medeiros, Aldo da Cunha. II. Título. RN-UF/BS-CCS. CDU: 615.22.

(4) UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. Coordenador do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde: Prof. Dr. Eryvaldo Sócrates Tabosa do Egito. iii.

(5) ROBSON DE MACEDO FILHO. EFEITOS CARDÍACOS E SISTÊMICOS DO PRÉ-TRATAMENTO COM ESTATINA EM MODELO DE SEPSE ABDOMINAL: AVALIAÇÃO ATRAVÉS DA BIODISTRIBUIÇÃO DO SESTAMIBI-Tc99m EM RATOS. Aprovado em:___/___/___ Banca examinadora: Presidente da Banca: Prof. Dr.Aldo da Cunha de Medeiros – UFRN ______________________________ Membros internos: Profª Dra. Ivonete Batista de Araújo ______________________________ Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior ______________________________ Membros externos: Profa Dra.Amália Cínthia Meneses do Rêgo– UnP ______________________________ ProfªDrª.Maria Goretti Freire de Carvalho – UnP ______________________________. iv.

(6) Aos meus pais, pelos seus exemplos e ensinamentos de vida.. v.

(7) AGRADECIMENTOS Durante esse período de formação acadêmica muitas pessoas foram importantes, minha gratidão ficará aqui registrada. Primeiramente, ao meu orientador professor Dr. Aldo da Cunha de Medeiros, pela oportunidade, pelo exemplo de conduta acadêmica, pelo incentivo aos desafios e pelo interesse incessante pela ciência. Aos amigos Ítalo Medeiros de Azevedo, Som Mehrbod Javadi, Takahiro Higushi, Marília Daniela Ferreira de Carvalho, Vanessa de Fátima Lima Paiva Medeiros, Francisco Pignataro Lima, pela parceria acadêmica que possibilitou a realização de todo o projeto de pesquisa do Doutorado. Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, representado pelos seus professores, por primar pelo ensino de excelência embasado em um conceito desafiador de multidisciplinaridade. Ao acadêmico Rafael Pereira do Nascimento pela importante ajuda durante o recrutamento e coleta de dados para a pesquisa. Aos amigos que fiz durante todo o programa de Doutorado. Por final, à minha família, que sempre me apoiou, incentivou e alavancou a minha busca pelos meus objetivos.. vi.

(8) RESUMO Estudo com o objetivo de avaliar se o tratamento prévio com sinvastatina tem efeito sobre a biodistribuição cardíaca e sistêmica do sestamibi-Tc99m, utilizando modelo experimental de sepse abdominal em ratos. Ratos wistar foram randomicamente divididos em 4 grupos (n=6 por grupo): 1) sepse e tratamento prévio com sinvastatina, 2) sepse e tratamento prévio com solução salina 0,9%, 3) controle e tratamento prévio com sinvastatina and 4) controle e tratamento prévio com solução salina 0,9%. 24 horas após lligadura e punção do ceco (LPC), os ratos receberam 1,0MBq de sestamibi-Tc-99m i.v. e após 30min, foram sacrificados para contagem radioativa tecidual ex-vivo e análise histológica do miocárdio. Após 24 horas da sepse,não foram detectadas alterações histológicas no miocárdio de todos os animais.Houve aumento significativo da atividade cardíaca do sestamibi-Tc99m no grupo sepse que recebeu tratamento prévio com sinvastatina(1.9±0.3%ID/g, P<0.001) quando comparado com o grupo sepse + solução salina (1.0±0.2%ID/g), controle + sinvastatina (1.2±0.3%ID/g), controle + solução salina (1.3±0.2%ID/g). Aumento significativo da atividade hepática, renal e pulmonar do sestamibi-Tc99m também foi detectado no grupo sepse tratado previamente com sinvastatina quando comparado com os outros grupos. Em conclusão, o tratamento com estatina alterou a biodistribuição do sestamibi-Tc99m, aumentando a atividade cardíaca e de órgãos sólidos em ratos com sepse abdominal, sem impacto em controles. O aumento da atividade cardíaca do sestamibi-Tc99m pode ser resultado de provável efeito protetor secundário a aumento da perfusão tecidual mediada por estatinas. Mais experimentos confirmatórios serão necessários para entender o mecanismo terapêutico na sepse. Palavras-chave: Sinvastatina, Sepse, Inflamação, Coração, Tc99m-Sestamibi, Ratos.. vii.

(9) ABSTRACT This study had the aim to evaluate the heart biodistribution of Tc-99m-sestamibi after statin pretreatment in a rat model of abdominal sepsis. Wistar rats were randomly divided into 4 groups (n=6 per group): 1) sepsis with simvastatin treatment, 2) sepsis with vehicle, 3) sham control with simvastatin and 4) sham control with vehicle. 24 hours after cecal ligation and puncture rats received 1.0MBq of Tc-99m–sestamibi i.v. 30min after, animals were euthanized for exvivo tissue counting and myocardium histological analysis. Myocardial histologic alterations were not detected 24 hours post-sepsis. There was significantly increased cardiac Tc-99m-sestamibi activity in the sepsis group with simvastatin treatment (1.9±0.3%ID/g, P<0.001) in comparison to the sepsis group+vehicle (1.0±0.2%ID/g), control sham group+ simvastatin (1.2±0.3%ID/g) and control sham group (1.3±0.2%ID/g). Significant Tc-99m-sestamibi activity in liver, kidney and lungs was also detected in the sepsis group treated with simvastatinin comparison to the other groups. In conclusion, statin treatment altered the biodistribution of Tc-99m-sestamibi with increased cardiac and solid organ activity in rats with abdominal sepsis, while no impact on controls. Increased myocardial tracer activity may be a result of a possible protection effect due to increased tissue perfusion mediated by statins. Further confirmatory experiments may help to understand the mechanism of statin therapy in sepsis. Key words: Simvastatin. Sepsis. Inflammation. Heart. 99mTc-Sestamibi, Rats.. viii.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS HMG-CoA Redutase – 3-hidroxi-3-methyl-glutaril-Coa Redutase NO – Óxido nítrico eNOS – Óxido nítrico-sintetase endotelial Tc99m – Tecnécio 99 metaestável RNAm – Ácido ribonucléico mensageiro MDR – Resistência Múltipla a Drogas TNF – Fator de necrose tumoral IL – Interleucina LPS – Lipopolissacarídeo CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte IP – Intraperitoneal IM – Intramuscular IV – Intravascular LPC – Ligadura e punção do ceco DI – Dose injetada %DI/g – Percentual da dose injetada por grama CPM – Contagem por minuto ANOVA – Análise de variância. ix.

(11) LISTA DE FIGURAS Figura 1: Delineamento experimental ............................................................... 19. x.

(12) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 12. 2. JUSTIFICATIVA................................................................................................... 17. 3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 18. 3.1. OBJETIVO GERAL .............................................................................................. 18 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................ 18 3.3. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS .............................................................................. 18 4. MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................... 19. 4.1. INDUÇÃO DA SEPSE.......................................................................................... 20 4.2. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA ........................................................................... 21 4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................... 22 5.0. ARTIGO PRODUZIDO ......................................................................................... 21 6. COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES................................................... 35. 7. REFERÊNCIAS ................................................................................................... 39. ANEXOS..................................................................................................................... 43 ANEXO 1 – Artigo publicado no periódico “Journal Surgical Clinical Research – J Surg Cl Res Vol 5 (2) 2014”. ............................................................................................... 43 ANEXO 2 – Artigo publicado no periódico “Journal Surgical Clinical Research – J Surg Cl Res Vol 4 (2) 2013”. ............................................................................................... 54 ANEXO 3 – Parecer da comissão de ética no uso de animais .................................... 66. xi.

(13) 12. 1 INTRODUÇÃO Apesar dos recentes avanços na antibioticoterapia e nas medidas de suporte, a mortalidade dos pacientes com sepse continua muito elevada 1. Nos últimos anos, diversos medicamentos foram testados para prevenção e tratamento da sepse, com resultados quase sempre pouco animadores. Estudos recentes passaram a mostrar benefícios com os inibidores da HMGCoA redutase (enzima responsável pela biossíntese do colesterol). Alguns estudos têm mostrado que os inibidores da HMG-CoA redutase, as estatinas, reduzem mortalidade em pacientes com aterosclerose2,3, inclusive com evidências de redução do volume da placa aterosclerótica 4 e controle dos mecanismos de inflamação associados à gênese de ateroma 5. Outras ações das estatinas, colesterol independentes, como a ação antiinflamatória, inibindo a trombogênese e, até mesmo, imunomodulador6-9 estão sendo cada vez mais descobertas. Dentre as diversas linhas de pesquisa visando explicar suas ações sobre a inflamação, destaca-se a modulação (estimulação) da óxido nítrico sintetase derivada do endotélio (eNOS), onde estatinas atuariam aumentando as concentrações de óxido nítrico (NO)10,11. Em 1997, Laufs et al demonstraram que as estatinas atuavam de forma direta sobre a via do NO, aumentando sua regulação. Esse trabalho, que foi um passo inicial no estudo dessas funções das estatinas, mostrou que a sinvastatina aumentava de 13 a 38 horas a vida média do mRNA que codifica a eNOS11. Após a descoberta de que as estatinas regulam a função da eNOS, alguns estudos têm relatado potentes ações antiinflamatórias dessas drogas, que são eNOS dependentes. Lefer et al foram os primeiros a relatar efeitos antiinflamatórios. das. estatinas. em. um. modelo. experimental. de. isquemia/reperfusão miocárdica12. Subseqüentemente foi demonstrado que elas. inibem. significativamente. a. interação. célula. endotelial-leucócito,. independente de suas ações anticolesterolêmicas13,14. Efeitos antiinflamatórios significantes têm sido demonstrados em situações. como. infarto. normocolesterolêmicos,. do. miocárdio. em. hipercolesterolêmicos. modelos e. experimentais. diabéticos12,15.. Foi.

(14) 13. demonstrado que o tratamento com estatinas inibe o acúmulo de leucócitos no tecido submetido à isquemia e reperfusão, sendo esta ação altamente dependente de eNOS12,14,15. Nesse aspecto, confere-se um papel relevante aos monócitos ativados na reação inflamatória, que liberam uma série de fatores pró-inflamatórios, que incluem fator tissular e vários tipos de citocinas, entre elas o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina-6 (IL-6)16,17. A terapêutica com esses fármacos atenua a inflamação vascular em pacientes, como foi evidenciado pela significante redução de marcadores inflamatórios tais como a proteína Creativa18-20. Ando H et al revelaram que sepse em ratos desencadeada através de injeção de lipopolissacáride (LPS) pode ser prevenida com o uso de estatina com melhora significativa na sobrevida21. Pruefer et al demonstraram consistentes propriedades antiinflamatórias da sinvastatina na vigência de infecção pela toxina do Staphilococcus aureus. Partindo do principio de que a endotoxemia representa um potente estímulo para a inflamação vascular, ficou demonstrado pelo trabalho de Pruefer et al que o pré-tratamento com doses clinicas de sinvastatina 18 horas antes da injeção de endotoxina atenua a rolagern de leucócitos induzida pela endotoxina e a sua migração para o mesentério22. Segundo Stefanec et al, sepse e fenômenos relacionados (bacteremia, síndrome da resposta inflamatória sistêmica, coagulação intravascular disseminada) têm como evento central a apoptose. É argumentado que LPS, fator de necrose tumoral e ligadura e punção do ceco desencadeiam apoptose endotelial in vivo. O endotélio ativado por estes fatores tende a disseminar o processo indiscriminadamente, tornando sistêmica uma condição inicialmente localizada. Medicamentos com ação puramente antiinflamatória não têm um efeito satisfatório sobre a sepse, pois não agem no evento central (apoptose), porém as estatinas revelaram efeito antiapoptose através da estimulação da eNOS23..

(15) 14. Liappis et al realizaram estudo retrospectivo onde foi avaliado o efeito das estatinas em pacientes com bacteremia e evidenciaram que as taxas de mortalidade foram menores nos pacientes que receberam os fármacos em questão. Os autores acreditam ser a ação antiinflamatória a responsável por tal efeito inesperado e recomendam a necessidade de estudos prospectivos. Discordam que a apoptose tenha papel central e preferem compreender o efeito das estatinas como sendo decorrente de múltiplas ações (inibição da expressão. de. moléculas. de. adesão. importantes. na. integração. leucócito/endotélio, regulação de proteínas quimiotáticas entre outras)24. A mortalidade devida à sepse é altamente dependente da resposta inflamatória e da produção de citocinas25-27. Disfunção cardíaca é uma das complicações da sepse 28-30, estando presente em mais de 40% dos casos31, sendo capaz de aumentar a mortalidade em até 70%32. Existem cada vez mais evidências mostrando provável papel protetor das estatinas também sobre o coração. Merx et al33, utilizando modelo de sepse por ligadura e punção do ceco em ratos, mostraram que a sobrevida média do grupo previamente tratado com estatina foi significativamente maior do que o grupo sem tratamento prévio. A sobrevida média no grupo placebo foi de 28h e no grupo tratamento de 108h (p< 0,005). Após 20 h do procedimento, o débito cardíaco diminuiu de 1,24 ± 0,09 mL/min/g para 0,87 ± 0,11 mL/min/g nos não tratados e permaneceu inalterado (1,21 ± 0,08 para 1,15±0,10) nos tratados. O uso de dobutamina aumentou o débito cardíaco nos grupos tratado e controle, sem aumento significativo no grupo placebo, sugerindo recuperação na capacidade da reação às catecolaminas com o uso da sinvastatina. Induzindo choque circulatório com endotoxina (LPS) em cobaias, GiustiPaiva et al 34 avaliaram a produção de óxido nítrico e a resposta cardiovascular à infusão de fenilefrina em grupos tratados ou não com sinvastatina em diferentes doses (10, 20, 40, 80 mg/kg). Os níveis de óxido nítrico elevaram-se significativamente em 2h após a injeção de LPS quando comparados com o grupo em que se administrou solução fisiológica, no grupo que recebeu o pré-.

(16) 15. tratamento com sinvastatina estes níveis foram reduzidos (p<0,001). A injeção de LPS produziu hipotensão arterial prolongada no grupo experimental; o prétratamento com sinvastatina não impediu este efeito hipotensor, porém a resposta ao uso da fenilefrina foi restabelecida no grupo tratado com estatina, o que não ocorreu no grupo tratado somente com solução fisiológica (p<0,01). Outro fator responsável pela disfunção cardíaca induzida é a má distribuição do fluxo sanguíneo regional causado pela sepse. A má distribuição do fluxo pode contribuir para disfunção miocárdica, gerando áreas de isquemia. Essas alterações isquêmicas foram detectadas no miocárdio de cães com sepse35. As estatinas possuem efeitos vasoprotetores36. Em estudo conduzido por Liuba et al37, velocidades de fluxo coronário foram medidas em suínos com infecção respiratória aguda após tratamento com sinvastatina. Os animais com infecção que não receberam tratamento prévio com sinvastatina tiveram queda significativa da velocidade de fluxo coronário, indicando vasoconstricção. A disfunção da microcirculação coronariana pode ser avaliada através da análise da perfusão miocárdica com sestamibi-Tc99m. O sestamibi foi o primeiro agente de perfusão miocárdica marcado com Tc99m (sestamibiTc99m) utilizado na rotina clínica. A cinética desse radiofármaco no miocárdio já está bastante estudada e validada em diversos modelos experimentais 38,39. Quando o sestamibi-Tc99m é administrado em condições basais, é captado pelo miocárdio em proporção ao fluxo sanguíneo regional40. Diante de injúria miocárdica. irreversível,. membranas. mitocondriais. são. despolarizadas,. alterando a captação do sestamibi-Tc99m41. A captação do sestamibi-Tc99m é dependente da viabilidade tecidual miocárdica42. Intervenções metabólicas que danificam membranas do sarcoplasma ou mitocrondriais resultam em perda da retenção celular do sestamibi-Tc99m43. Partindo. dos. princípios. de. que. disfunção. cardíaca. pode. ser. desencadeada ou agravada por infecção, que a inibição da inflamação é um dos muitos efeitos pleiotrópicos das estatinas e que a disfunção da.

(17) 16. microcirculação coronariana pode ser avaliada através da análise da perfusão miocárdica com sestamibi-Tc99m, no presente trabalho foi testada a seguinte hipótese: o tratamento prévio com sinvastatina tem efeito sobre o coração durante infecção, sendo capaz de alterar a biodistribuição sistêmica do sestamibi-Tc99m e consequentemente a perfusão cardíaca, utilizando modelo experimental de sepse abdominal em ratos..

(18) 17. 2 JUSTIFICATIVA A revisão bibliográfica demonstrou serem escassos trabalhos préclínicos e clínicos com investigação na linha de pesquisa que relaciona tratamento com estatinas para cardiopatia induzida pela sepse. A depender dos resultados do presente estudo, podem ser abertos novos horizontes para o tratamento da sepse através do emprego das estatinas como fármacos antiinflamatórios e imunomoduladores e no esclarecimento do problema com a detecção de possíveis alterações perfusionais ou metabólicas no miocárdio através da análise da biodistribuição do sestamibi-Tc99m..

(19) 18. 3 OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL Examinar os efeitos conferidos pela sinvastatina sobre o miocárdio durante infecção, que não se encontram relacionados à sua ação hipolipemiante, em modelo experimental de sepse abdominal em ratos. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Examinar a ação da sinvastatina na biodistribuição cardíaca do sestamibi-Tc99m. 3.3. OBJETIVOS SECUNDÁRIOS 1. Examinar a ação da sinvastatina na biodistribuição sistêmica (hepática, renal e pulmonar) do sestamibi-Tc99m. 2. Examinar alterações histopatológicas no miocárdio..

(20) 19. 4 MATERIAIS E MÉTODOS Vinte e quatro ratos Wistar – Rattus norvegicus (03 a 04 meses de vida, pesando 260 ± 28 g) foram randomicamente distribuídos em quatro grupos (6 animais por grupo): 1) sepse e tratamento prévio com sinvastatina, 2) sepse e tratamento com solução salina 0,9%, 3) controle e tratamento prévio com sinvastatina e 4) controle e tratamento com solução salina 0,9% (Figura 1). Os animais foram mantidos em gaiolas individuais com água e ração padrão para roedores (Presence®) ad libitum, passando previamente por um período de 7 dias para aclimatação no laboratório. Foram mantidos em temperatura controlada (22º C), ar condicionado, com ciclos de 12 h claro-escuro e manuseados de acordo com as normas da Lei 11.794, de 08/10/2008, sendo o projeto submetido e referendado pela Comissão de Ética no Uso de Animais (CEUA-UFRN) através do parecer 045/2014.. Figura 1: Delineamento experimental.

(21) 20. 4.1. INDUÇÃO DA SEPSE Os animais foram submetidos a 12 horas de jejum antes do experimento e anestesiados com xilazina na dose de 10 mg/kg de peso e cetamina 70 mg/kg de peso via intraperitoneal (IP). Foram mantidos em respiração espontânea em ar ambiente durante os procedimentos. Foi realizada depilação da parede abdominal e anti-sepsia com álcool etílico 70%, seguida de colocação de campo estéril fenestrado. Através de laparotomia mediana de 3 cm foi feita a ligadura e punção do ceco (LPC) utilizando-se fio de algodão 3-0, a 1 cm da penetração do íleo, procedendo-se 4 punções na parede do ceco com agulha estéril 25x8. Em seguida, o órgão foi recolocado na cavidade abdominal, sendo fechado em dois planos de sutura com fio de nylon 4-0. Terminadas as operações, a dor pós-operatória foi controlada com analgesia (meperidina i.m. na dose de 10 mg/Kg, uma dose diária). Os critérios para caracterização da sepse abdominal foram definidos segundo dados de publicações anteriores44, 45. Os animais foram manipulados na sala de cirurgia do Núcleo de Cirurgia Experimental-UFRN e no período de observação foram mantidos na sala de controle pós-operatório do mesmo Núcleo. Doze animais foram tratados com sinvastatina via oral e outros doze com solução salina 0,9%. Em 6 animais com sepse e 6 controles foram injetadas doses únicas diárias de sinvastatina 10 mg/kg/dia sob a apresentação de suspensão via oral, por gavagem, durante 3 dias antes da indução da peritonite e 2 horas antes do procedimento cirúrgico (LPC). Os demais animais receberam tratamento via oral de 1 ml de solução salina 0,9%, nos mesmos intervalos de tempo descritos para a sinvastatina. Decorridas 24 horas de observação pós-operatória, todos os animais foram anestesiados, e 1,0 MBq de sestamibi-Tc99m (Cardiolite®, Bristol-Myers.

(22) 21. Squibb Medical Imaging, Massachusetts, USA)foi administrado por via i.v. A dose injetada (DI) foi calculada como a diferença entre a radioatividade medida na seringa antes e após a injeção, usando um curiômetro CRC-25R (Capintec.Inc., NJ, USA). Trinta minutos após a administração do radiofármaco, os animais foram rapidamente submetidos a eutanásia, com ressecção do coração, pulmão, rim e fígado. Os órgãos foram lavados em solução salina, pesados em balança de precisão (Mark 160, Bel Engeneering, Italy) e em seguida introduzidos em tubos de ensaio para a determinação da atividade radioativa, aferida com o emprego do contador gama automático Wizard Counter-1470, Perkin Elmer, Finland, com correção para o decaimento radioativo. A atividade em contagem por minuto (CPM), dos orgãos de interesse foi calculada como percentual da dose injetada por grama de tecido (%DI/g).. 4.2. ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA Após a obtenção dos valores de %DI/g de tecido, as peças dos corações a fresco foram seccionadas e lavadas em água corrente para permitir a ação rápida e uniforme da solução fixadora. Em seguida as amostras foram fixadas em formol tamponado a 10%, por um período de 48 horas, e processadas durante 18 horas em processador automático de tecidos, utilizando-se equipamento Leica TP 1020. Antes da inclusão em parafina, os ventrículos esquerdos dos corações fixados foram recortados com equipamento tipo punch, no diâmetro de 06 mm, para uniformização das amostras. Os cortes histológicos foram obtidos com micrótomo Leica RM 2125 RTS, na espessura de 03 micra, em lâminas previamente silanizadas. As amostras fixadas foram coradas pela técnica histoquímica da hematoxilina/eosina para análise morfológica em microscópio ótico, quando foi usado Microscópio CX41 (Olympus, Tóquio, Japão). As secções foram examinadas com aumento 200x para determinar a presença de neutrófilos aderentes e infiltrativos, eosinófilos, basófilos, monócitos, linfócitos e plaquetas. O total de células foi analisado em.

(23) 22. campos em número de 6 para cada amostra. A análise quantitativa foi obtida usando-se um software vídeo-assistido (Image ProPlus 6.0, Media Cyber). 4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA Todos os dados foram apresentados na forma de média±desvio padrão e comparados pela análise de variância ANOVA, e pelo teste de Tukey, utilizando o software SPSS 22.0. A diferença entre as médias foi considerada estatisticamente significante quando p<0,05..

(24) 23. 5 ARTIGO PRODUZIDO 1.1 O artigo produzido foi publicado no periódico “Acta Cirúrgica Brasileira” que possui fator de impacto 0,29 e Qualis B3 da CAPES para a área de Medicina II e Qualis A2 para a área de Medicina III..

(25) 24. Heart and systemic effects of statin pretreatment in a rat model of abdominal sepsis: assessment by Tc99m-sestamibi biodistribition Robson MacedoI, Som Mehrbod Javadi II, Takahiro Higuchi III,Marília Daniela Ferreira de CarvalhoIV, Vanessa de Fátima Lima Paiva MedeirosIV,Ítalo Medeiros AzevedoV, Francisco Pignataro LimaVI, Aldo Cunha MedeirosVII. I. Fellow PhD degree, Postgraduate Program in Health Sciences, Federal University of Rio Grande do Norte. (UFRN), Natal-RN, Brazil. Conception, design, intellectual and scientific content of the study; acquisition, interpretation and analysis of data; manuscript writing. II. MD,Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Johns Hopkins University, Baltimore, USA.. Interpretation and analysis of data; critical revision. III. MD,Department of Nuclear Medicine, Wuerzburg University, Wuerzburg, Germany. Interpretation and. analysis of data; critical revision. IV. Fellow PhD degree, Postgraduate Program in Health Sciences, UFRN, Natal-RN, Brazil.Acquisition,. interpretation and analysis of data; manuscript writing. V. Master, Statistician, Department of Surgery, UFRN, Natal-RN, Brazil. Acquisition, interpretation and analysis of. data; manuscript writing. VI. Associate Professor, Department of Patology, UFRN, Natal-RN, Brazil.Acquisition, interpretation and analysis of. data, critical revision. VIIPhD, Full Professor, Department of Surgery, UFRN, Natal-RN, Brazil. Study design and coordination, interpretation and analysis of data, draft the manuscript, critical revision, and financial support.. _____________________________________________________________________ ABSTRACT PURPOSE: We evaluated the heart and the Tc-99m-sestamibi biodistribution after statin pretreatment in a rat model of abdominal sepsis. METHODS: Wistar rats were randomly divided into 4 groups (n=6 per group): 1)sepsis with simvastatin treatment, 2)sepsis with vehicle, 3)sham control with simvastatin and 4)sham control with vehicle. 24 hours after cecal ligation and puncture rats received 1.0MBq of Tc-99m–sestamibi i.v. 30min after, animals were euthanized for ex-vivo tissue counting and myocardium histological analysis. RESULTS: Myocardial histologic alterations were not detected 24 hours post-sepsis. There was significantly increased cardiac Tc-99m-sestamibi activity in the sepsis group with simvastatin.

(26) 25. treatment (1.9±0.3%ID/g, P<0.001) in comparison to the sepsis group+vehicle (1.0±0.2%ID/g), control sham group+ simvastatin (1.2±0.3%ID/g) and control sham group (1.3±0.2%ID/g). Significant Tc-99m-sestamibi activity in liver, kidney and lungs was also detected in the sepsis group treated with simvastatinin comparison to the other groups. CONCLUSIONS: Statin treatment altered the biodistribution of Tc-99m-sestamibi with increased cardiac and solid organ activity in rats with abdominal sepsis, while no impact on controls. Increased myocardial tracer activity may be a result of a possible protection effect due to increased tissue perfusion mediated by statins. Further confirmatory experiments may help to understand the mechanism of statin therapy in sepsis. Key words: Simvastatin. Sepsis. Inflammation. Heart. 99mTc-Sestamibi. Rats. Introduction Sepsis is the leading cause of death in critically ill patients1, mainly as a result of multiple organ failure. Cardiac dysfunction is one of the complications of sepsis, being capable of increasing the mortality by 70%2. The mechanisms of sepsis-induced cardiac dysfunction have been studied extensively3. In recent years, several drugs have been tested for prevention and treatment of sepsis, with discouraging results. Some studies, however, are showing benefits with HMG-CoA reductase inhibitor (enzyme responsible for the biosynthesis of cholesterol). Currently it is consolidated that statins (HMG-CoA reductase inhibitors), reduce mortality in patients with atherosclerosis4, reduce the volume of atherosclerotic plaque inflammation and control mechanisms associated with the atheroma genesis5. Other effects of statins that are increasingly being reported are the imunomodulation effects6. It has also been established that statins can increase the expression of nitric oxide (NO)7. In sepsis induced cardiac dysfunction, a protective role for statins has been suggested. Using a circulatory shock model induced by lipopolysaccharide (LPS) in guinea pigs, GiuotiPaiva et al8 evaluated the production of NO and the cardiovascular response to the infusion of phenylephrine in simvastatin treated or non-treated groups. NO levels increased significantly 2 hours after the injection of LPS compared to the control group. In the group pre-treated with simvastatin the NO levels were significantly reduced. LPS injection produced prolonged hypotension in the experimental group; pretreatment with simvastatin did not prevent this hypotensive effect, but the response to phenylephrine was restored in the statin treated group. Another factor responsible for septic cardiac dysfunction is the poor distribution of regional blood flow induced by sepsis. Poor blood flow distribution can contribute to myocardial dysfunction, generating areas of ischemia. It is assumed that statins also have.

(27) 26. vasoprotective effects. In a study by Liuba et al9, coronary flow was measured in pigs with acute respiratory infection after treatment with simvastatin. Animals with infection who have not received prior treatment with simvastatin had significant decrease in coronary flow velocity, indicating vasoconstriction. 99m. Tc-sestamibi is a radiopharmaceutical that is widely used for myocardial perfusion. imaging. The kinetics of this radiopharmaceutical in the myocardium and its biodistribution has been reported in several experimental models10,11. In the presence of irreversible myocardial injury, mitochondrial membranes are depolarized by changing the uptake of The uptake of. 99m. Tc-sestamibi12.. 99m. Tc-sestamibi is dependent on the myocardial tissue viability and regional. 13. blood flow . Assuming that cardiac dysfunction can be caused or aggravated by sepsis, and that the inhibition of inflammation is one of many pleiotropic effects of statins, we tested the following hypothesis: pretreatment with simvastatin have a protection effect on the heart, and can possibly have an impact on the cardiac uptake and biodistribution of. 99m. Tc-sestamibi using an. experimental model of abdominal sepsis in rats. Methods Twenty-four male Wistar rats (4 months old, weighing 260 ±28g) supplied by the Nucleus of Experimental Surgery of Federal University of RN, Brazil, were randomly distributed in two groups. Twelve rats with sepsis and 12 sham (without sepsis) were kept in individual cages with water and standard rodent chow (Presence®) ad libitum, previously passing through a period of 7 days acclimation on the laboratory. They were kept in a controlled temperature (22 C), with cycles of 12 h light-dark and handled in accordance with the Law 11.794, Brazil. The project was submitted and endorsed by the institutional Ethics Committee on Animal Use. Sepsis induction Animals were fasted 12 hr before the experiment and anesthetized with intramuscular injection of 0.1 mL/100g weight, of a solution prepared with 1.0 mL of ketamine (50mg/mL) and 1.0 mL of xilazine (20mg/mL). They breathed spontaneously throughout the procedures. After shaving, the abdominal skin was disinfected with 70% alcohol. All procedures were performed under sterile conditions. A 3 cm midline laparotomy was performed and cecal ligation and puncture (CLP) was performed. The cecum was exposed, ligated with cotton 3-0, one cm distally to the ileocecal valve to avoid intestinal obstruction. Four punctures were.

(28) 27. performed with a 22-gauge needle, squeezed gently to force out a small amount of feces, and then it was returned to the abdominal cavity. The abdominal incision was closed with 4-0 nylon sutures. Midline laparotomy (3 cm) and gentle manipulation of cecum was performed in the sham rats. Pain medication (meperidine 10 mg/body weight) and volume support (NaCl 0.9%, 0.05 mL/g body weight) were applied subcutaneously immediately after the induction of sepsis and every 12 hours thereafter. Twelve animals were treated orally with simvastatin and twelve with 0.9% saline. Six animals with sepsis and six sham were injected daily with oral suspension of simvastatin 10 mg/kg/day, (gavage) for 3 days prior to induction of peritonitis and 2 hours before the CLP. The other rats received oral 1 ml of 0.9% saline. After 24 hours postoperative observation the animals were anesthetized, and a dose of 1.0 MBq of. 99m. Tc-sestamibi was injected intravenously. The injected dose (ID) was calculated. as the difference between the measured radioactivity in the seringe before and after injection, using a curiemeter (Capintec CRC-25R). Thirty minutes after injection, animals were euthanized, and the heart, lung, kidney and liver were resected. The samples were quickly washed in saline, weighed on a precision balance (Mark 160®, Bel equipment, Italy) and then introduced into test tubes for the determination of biodistribution of. 99m. Tc-sestamibi in an. automatic gamma counter (Wizard 1470®, Perkin-Elmer, Finland). The decay corrected activity in counts per minute (CPM) in the tissues of interest was calculated as a percentage of the injected dose per gram of tissue (%ID/g). After obtaining the tissue biodistribution measurements, the fresh hearts were cut and washed in running water to enable rapid and uniform action of the fixative solution. Then the samples were fixed in 10% buffered formalin for 48 hours and processed for 18 hours in an automatic tissue processor, using Leica equipment TP 1020, German. Prior to embedding in paraffin, the left ventricles of fixed hearts were cut with punch (6 mm diameter), for standardization of samples. Histological sections were obtained with microtome Leica RM 2125 RTS, 03 microns thick. The fixed specimens were stained with hematoxylin/eosin for morphological analysis by optical microscopy, using the CX41 microscope (Olympus, Tokyo, Japan). Sections were examined in high magnification power fields (400x) to determine the presence of adherent and infiltrating neutrophils, eosinophils, basophils, monocytes, lymphocytes and platelets. The total number of cells was analyzed in six fields for each heart expressed in cells per square millimeter. The quantitative analysis was performed using a videoassisted software (Image ProPlus 6.0, Media Cyber)..

(29) 28. Data analysis All data were presented as mean±standard deviation and compared by ANOVA and Tukey test. The difference between the means was considered statistically significant when p <0.05. Results All animals survived the experiments. Coagulation necrosis or interstitial fibrosis was not seen in any of the evaluated hearts. Interstitial edema, mononuclear infiltrate, myocytolysis and tissue hemorrhage were found, but no differences were detected when comparing sepsis and sham groups, with and without treatment with simvastatin. The average time for resection of organs for weighing on a precision scale and measurements of the. 99m. Tc-sestamibi activities was 10 minutes per animal. Table 1 shows the. percentage of the injected activity per gram of tissue (% ID/g) detected in the heart, lung, kidney and liver, in each group. TABLE 1 – Percentage of injected dose of group.. 99m. Tc-sestamibi per gram of tissue (%ID/g) in each. %ID/g per group Organs Heart2 Liver2 Kidney2 Lung2. Sham simvastatin. Sham Saline. Sepsis simvastatin. Sepsis Saline. p-value(1). 1.19  0.33 0.38  0.12 1.38  0.35 0.26  0.14. 1.28  0.22¥ 0.46  0.11¥ 1.94  0.70¥ 0.26  0.06¥. 1.86  0.26 ¥ † 1.81  0.43 ¥ 4.99  0.82 ¥ 0.54  0.06 ¥ †. 1.04  0.21† 0.98  0.44 ¥ 3.31  1.71 0.18  0.08†. <0.001 <0.001 <0.001 <0.001. Meanstandard deviation 1 - p value from ANOVA. 2 - The values followed by equal symbols are significantly different by Tukey multiple comparisons test, at a significance level of 5%.. The highest %ID of. 99m. Tc-sestamibi per gram of tissue was detected in the heart and. kidney both in sham and in the sepsis groups (Table 1). The lowest %ID of. 99m. Tc-sestamibi per. gram of tissue was detected in the lungs in all groups (Table 1). There were no significant differences in the %ID/g 99mTc-sestamibi of per gram of tissue in the heart, liver, kidney and lung among sham groups treated with simvastatin and those treated with saline (Table 1). The %ID/g of the liver and the kidney was significantly higher in.

(30) 29. the sepsis groups, when compared with the sham groups (Table 1). The %ID/g in the heart and lung was lower in the sepsis group treated with saline when compared to sham, however with no significant difference (Table 1). The %ID/g of the heart was significantly higher in the sepsis group pretreated with simvastatin than in the sepsis group treated with saline. The myocardium activity was also significantly higher than in sham groups treated with simvastatin and with saline. There was also a significant %ID/g of tissue in the lung, kidney and liver in sepsis groups treated with simvastatin, when compared with the control groups, and when compared to the sepsis group treated with saline (Table 1). Discussion Recently, our group showed that simvastatin had significant anti-inflammatory effect in rats with abdominal sepsis, using the CLP model. The results showed that TNF-α, IL-1β and IL6 values in septic group previously treated with simvastatin were significantly lower than in the untreated sepsis group. The same occurred in total leukocytes and neutrophils14. In another study, our group showed that simvastatin also had important anti-inflammatory action in the abdominal sepsis in diabetic rats. Simvastatin reduced mortality in diabetic rats. Serum levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, C-reactive protein, procalcitonin, leukocytes, and neutrophils were significantly lower in diabetic and non-diabetic rats with sepsis treated with simvastatin, than in the group treated with saline15. In this study, cardiac and systemic effects of simvastatin pretreatment were analyzed in septic rats, using 99mTc-sestamibi as a specific substrate to assess biodistribution in the heart, liver, kidney and lung. The exact mechanism of cellular uptake of lipophilic nature of the. 99m. Tc-sestamibi is still unclear. Due to the. 99m. Tc-sestamibi cation, it is apparently distributed across biological. membranes in response to transmembrane potential12. Uptake likely occurs passively through the plasma and mitochondrial membranes, with. 99m. Tc-sestamibi being retained by the. mitochondria due to the large negative membrane potential. Tissues that have high concentration of mitochondria, such as the heart, retains a high proportion of. 99m. Tc-sestamibi16.. This radiopharmaceutical is distributed in the myocardium in proportion to the coronary blood flow11. Despite the effect of electrical potential and passive diffusion on. 99m. Tc-sestamibi. cellular distribution, there are also transporters responsible for tracer efflux and cellular excretion. Some studies have demonstrated that during inflammation, the expression of several carriers is modified in rodents. Previous studies have described downregulation of the expression of mRNA mdr1a, mdr1b, MRP2 and SPGP as well as lower activity of liver P-.

(31) 30. glycoprotein17. It has been stated that the release of proinflammatory cytokines, including TNFα, IL-1β and IL-6 during the inflammatory response is primarily involved in mediating the downregulation18. Overall, the results of our study showed that CLP-induced abdominal sepsis was associated with increased retention of. 99m. Tc-sestamibi in the heart and in the liver, kidney and. lung samples, especially in sepsis group pretreated with simvastatin. Wang et al 19 showed similar results evaluating the activity of P-glycoprotein through the biodistribution of. 99m. Tc-. sestamibi in endotoxemic rats. These findings could possibly reflect low excretion and distribution of. 99m. Tc-sestamibi, secondary the lower activity of P-glycoprotein during sepsis.. The 99mTc-sestamibi is eliminated from the body primarily through active secretion mediated by the activity of P-glycoprotein. As such, high levels of. 99m. Tc-sestamibi in the blood of animals. treated with LPS possibly reflect altered biodistribution and depressed tracer clearance secondary to downregulation of the expression of P-glycoprotein in the presence of inflammation. There may be increased trapping of solid organ. 99m. Tc-sestamibi partly attributed. to increased blood concentration. A multicenter trial recently evaluated the use of rosuvastatin in patients with sepsis associated with adult respiratory distress20. The results showed that the rosuvastatin did not improve clinical response and may have contributed to increased hepatic and renal dysfunction. If statins are actually associated with more hepatic and renal dysfunction in sepsis, this may partially explain the results obtained in our study. We showed altered solid organ tracer biodistribution in cardiac, hepatic, renal and lung tissues in rats treated with simvastatin. This increased dose distribution of concentration of. 99m. Tc-sestamibi may be secondary to increased blood. 99m. Tc-sestamibi. However, Wang et al19 also showed that changes in blood. concentration could not fully explain changes in accumulation in vital organs. Importantly, no significant correlation between serum levels of. 99m. Tc-sestamibi and. accumulation were found in organs both in the group treated with LPS and control groups. It is therefore less likely that there is statin-induced liver and kidney dysfunction leading to increased 99mTc-sestamibi cardiac retention in the sepsis group with simvastatin. Also, different from Wang et al19, our results showed that the whole heart distribution of 99mTcsestamibi in sepsis pretreated with simvastatin was significantly higher than in the saline treated and sham groups. The mechanism for the increased cardiac distribution of 99mTc-sestamibi is unclear. One possible hypothesis is that simvastain could possibly be enhancing the intracellular accumulation of 99mTc-sestamibi due to presumable amplification of P-glycoprotein function.

(32) 31. inhibition. Mendes et al21 showed for example that cyclosporin A, an MDR modulator, modified the 99mTc-sestamibi biodistribution by inhibiting the P-glycoprotein function. Therefore, simvastatin in the presence of systemic inflammation during sepsis could possibly have similar effect modifying the P-glycoprotein function, besides the sepsis induced inflammatory effects. Previous studies have demonstrated that P-glycoprotein and mdr1 mRNA are expressed in the endothelium of arterioles and capillaries of the heart22. Wang et al19 detected mdr1a mRNA in heart, but at lower levels than those in the liver and kidney. However, mdr1a levels were significantly depressed in the heart of LPS-treated mice, but this decrease caused only slight changes in the cardiac biodistribution of. 99m. Tc-sestamibi. High affinity of heart tissue by. 99m. Tc-sestamibi and the relative low activity of P-glycoprotein may have contributed to these. findings. Therefore, changes in P-glycoprotein activity induced by inflammation are unlikely to cause significant impact of cardiac uptake of 99mTc-sestamibi. This finding is consistent with the findings of our study. Our results showed no significant changes in the levels of 99mTc-sestamibi in sepsis group treated with saline compared to the sham group. However, the whole heart distribution of 99mTc-sestamibi in sepsis rats pretreated with simvastatin was significantly higher than in the saline treated and sham groups. Another hypothesis to explain the increased cardiac biodistribution of. 99m. Tc-sestamibi. in the sepsis group previously treated with simvastatin is possibly due to increased tissue perfusion secondary to coronary vasodilation induced by increasing concentration of nitric oxide under the action of statins7. Merx et al23 showed an improved survival of rats with sepsis, justifying that this was due to cardiac and hemodynamic stability after treatment with statins. Their study also showed that the cardiac and hemodynamic stability was associated not only to sinvastatin, but with other statins as weel. The mechanisms were related to the better susceptibility to stimulation of nitric oxide synthase and reduction of leukocyte endothelial adhesion in animals treated with statins. To better assess this hypothesis experiments with microspheres labeled with raioactive isotopes or quantitative myocardium perfusion PET kinetic studies using ammonia N-13 or labeled water O-15 would be necessary. Therefore, a proven statin protection effect could have a major impact in sepsis induced cardiac dysfunction treatment. In conclusion, this study showed that simvastatin altered the biodistribution of. 99m. Tc-. sestamibi with increased whole heart and solid organ activity in a rat model of abdominal sepsis. Especially with regards to the altered cardiac distribution, further research is required to define.

(33) 32. whether statins are acting on the P-glycoprotein function or are actually inducing a protection effect by increasing coronary blood flow during sepsis in rats. References 1.. Hotchkiss RS, Karl IE. The pathophysiology and treatment of sepsis. New Eng J Med.. 2003 Jan 9;348(2):138-50. PubMed PMID: 12519925. 2.. Blanco J, Muriel-Bombín A, Sagredo V, Taboada F, Gandía F, Tamayo L, Collado J,. García-Labattut A, Carriedo D, Valledor M, De Frutos M, López MJ, Caballero A, Guerra J, Alvarez B, Mayo A, Villar J. Incidence, organ dysfunction and mortality in severe sepsis: a Spanish multicentre study. Crit care. 2008;12(6):R158-60. PubMed PMID: 19091069. Pubmed Central PMCID: 2646323. 3.. Tavener SA, Kubes P. Cellular and molecular mechanisms underlying LPS-associated. myocyte. impairment.. American journal. of. physiology Heart. Circ. Physiol.. 2006. Feb;290(2):H800-6. PubMed PMID: 16172157. 4.. LaRosa JC, Grundy SM, Waters DD, Shear C, Barter P, Fruchart JC, Gotto AM, Greten. H, Kastelein JJ, Shepherd J, Wenger NK. Intensive lipid lowering with atorvastatin in patients with stable coronary disease. New Eng J Med. 2005 Apr 7;352(14):1425-35. PubMed PMID: 15755765. 5.. Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation. 2002. Mar 5;105(9):1135-43. PubMed PMID: 11877368. 6.. Mach F. Toward a role for statins in immunomodulation. Mol Interv. 2002. Dec;2(8):478-80. PubMed PMID: 14993398. 7.. Laufs U, La Fata V, Plutzky J, Liao JK. Upregulation of endothelial nitric oxide. synthase by HMG CoA reductase inhibitors. Circulation. 1998 Mar 31;97(12):1129-35. PubMed PMID: 9537338. 8.. Giusti-Paiva A, Martinez MR, Felix JV, da Rocha MJ, Carnio EC, Elias LL, Antunes-. Rodrigues J. Simvastatin decreases nitric oxide overproduction and reverts the impaired vascular responsiveness induced by endotoxic shock in rats. Shock. 2004 Mar;21(3):271-5. PubMed PMID: 14770041. 9.. Liuba P, Pesonen E, Forslid A, Paakkari I, Kornerup-Hansen A, Kovanen P,. Pentikäinen M, Persson K, Østergård G. Protective effects of simvastatin on coronary artery function in swine with acute infection. Atherosclerosis. 2006 Jun;186(2):331-6. PubMed PMID: 16223501. 10.. Dahlberg ST, Leppo JA. Myocardial kinetics of radiolabeled perfusion agents: basis for. perfusion imaging. J Nucl Cardiol. 1994 Mar-Apr;1(2 Pt 1):189-97. PubMed PMID: 9420686..

(34) 33. 11.. Beller GA, Sinusas AJ. Experimental studies of the physiologic properties of. technetium-99m isonitriles. Am J Cardiol. 1990 Oct 16;66(13):5E-8E. PubMed PMID: 2145747. 12.. Piwnica-Worms D, Kronauge JF, Chiu ML. Uptake and retention of hexakis (2-. methoxyisobutyl isonitrile) technetium(I) in cultured chick myocardial cells. Mitochondrial and plasma membrane potential dependence. Circulation. 1990 Nov;82(5):1826-38. PubMed PMID: 2225379. 13.. Beller GA, Glover DK, Edwards NC, Ruiz M, Simanis JP, Watson DD. 99mTc-. sestamibi uptake and retention during myocardial ischemia and reperfusion. Circulation. 1993 Jun;87(6):2033-42. PubMed PMID: 8504518. 14.. Souza Neto JL, Araujo Filho I, Rego AC, Dominici VA, Azevedo IM, Egito ES,. Brandão-Neto J, Medeiros AC. Effects of simvastatin in abdominal sepsis in rats. Acta Cir Bras. 2006;21 Suppl 4:8-12. PubMed PMID: 17293958. 15.. Araujo-Filho I, Jacome DT, Rego AC, Azevedo IM, Egito ES, Medeiros AC. Effect of. the simvastatin in abdominal sepsis of diabetic rats. Rev Col Bras Cir. 2010 Feb;37(1):39-44. PubMed PMID: 20414574. 16.. Maffioli L, Gasparini M, Chiti A, Gramaglia A, Mongioj V, Pozzi A, Bombardieri E.. Clinical role of technetium-99m sestamibi single-photon emission tomography in evaluating pretreated patients with brain tumours. Eur J Nucl Med. 1996 Mar;23(3):308-11. PubMed PMID: 8599962. 17.. Piquette-Miller M, Pak A, Kim H, Anari R, Shahzamani A. Decreased expression and. activity of P-glycoprotein in rat liver during acute inflammation. Pharm Res. 1998 May;15(5):706-11. PubMed PMID: 9619778. 18.. Hartmann G, Kim H, Piquette-Miller M. Regulation of the hepatic multidrug resistance. gene expression by endotoxin and inflammatory cytokines in mice. Int Immunopharm. 2001 Feb;1(2):189-99. PubMed PMID: 11360920. 19.. Wang JH, Scollard DA, Teng S, Reilly RM, Piquette-Miller M. Detection of P-. glycoprotein activity in endotoxemic rats by 99mTc-sestamibi imaging. J Nucl Med. 2005 Sep;46(9):1537-45. PubMed PMID: 16157538. 20.. National Heart L, Blood Institute ACTN, Truwit JD, Bernard GR, Steingrub J, Matthay. MA, Liu KD, Albertson TE, Brower RG, Shanholtz C, Rock P, Douglas IS, deBoisblanc BP, Hough CL, Hite RD, Thompson BT. Rosuvastatin for sepsis-associated acute respiratory distress syndrome. New Eng J Med. 2014 Jun 5;370(23):2191-200. PubMed PMID: 24835849. 21. Mendes F, Gano L, Fernandes C, Paulo A, Santos I. Studies of the myocardial uptake and excretion mechanisms of a novel 99mTc heart perfusion agent. Nucl Med.

(35) 34. Biol. 2012 Feb;39(2):207-13. PubMed PMID: 22079035. 22.. Meissner K, Sperker B, Karsten C, Meyer Zu Schwabedissen H, Seeland U, Bohm M,. Bien S, Dazert P, Kunert-Keil C, Vogelgesang S, Warzok R, Siegmund W, Cascorbi I, Wendt M, Kroemer HK. Expression and localization of P-glycoprotein in human heart: effects of cardiomyopathy. J Histochem Cytochem. 2002 Oct;50(10):1351-6. PubMed PMID: 12364568. 23.. Merx MW, Liehn EA, Graf J, van de Sandt A, Schaltenbrand M, Schrader J, Hanrath P,. Weber C. Statin treatment after onset of sepsis in a murine model improves survival. Circulation. 2005 Jul 5;112(1):117-24. PubMed PMID: 15998696.. ____________________________________________________________________ Correspondence: Robson de Macedo Filho Nucleus of Experimental Surgery Av. Nilo Peçanha 620 59012-300 Natal, RN, Brazil robmacedo@yahoo.com Financial Source: CNPq – Grant 478600/2011-9 Conflict of interest: none 1 Research performed at Nucleus of Experimental Surgery, Department of Surgery, Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN), Brazil. Part of PhD degree thesis, Postgraduate Program in Health Sciences. Tutor: Aldo Cunha Medeiros.

(36) 35. 6 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES O desenvolvimento deste trabalho teve como base a associação dos conhecimentos da radiobiologia com a miocardiopatia séptica. Sua proposta foi verificar se o miocárdio sofre influência da sepse abdominal e se a sinvastatina é capaz de alterar possíveis efeitos da sepse. O protocolo experimental da tese foi iniciado em 2013 com o anteprojeto e os testes pilotos de biodistribuição do sestamibi-Tc99m em modelo experimental de sepse abdominal. A escolha do rato Wistar como modelo experimental para o estudo de biodistribuição do radiofármaco foi devida ao fato desse animal ser de fácil aquisição e manutenção em laboratório, com baixa mortalidade quando submetidos a modelo de sepse abdominal multibacteriana por ligadura e punção do ceco (LPC). O rato Wistar também tem-se mostrado satisfatório por um histórico de ter sido amplamente utilizado em estudos de biodistribuição de radiofármacos por vários autores46-50. O nosso grupo de pesquisa em cirurgia experimental tem trabalhado com linha de pesquisa relacionada com estatinas e seus efeitos na sepse. Estudo realizado em 2006 demonstrou que a sinvastatina tem ação antiinflamatória importante em ratos Wistar com sepse abdominal, utilizando o modelo de LPC. Os resultados mostraram que dosagens de TNF-α, IL-1β e IL6 no grupo com sepse abdominal, previamente tratado com sinvastatina, foram significantemente mais baixas do que no grupo sepse, sem tratamento prévio. O mesmo ocorreu na contagem de leucócitos totais e neutrófilos 44. Pouco tempo depois, um segundo estudo mostrou que a sinvastatina também tem ação antiinflamatória importante na sepse abdominal de ratos diabéticos. A sinvastatina reduziu a mortalidade e as dosagens de TNF-α, IL-1β, IL-6, proteína C reativa, procalcitonina, leucócitos e neutrófilos mostraram-se significativamente mais baixas nos ratos diabéticos e não diabéticos com sepse, tratados com sinvastatina, do que nos tratados apenas com solução salina45. No presente trabalho de tese, os efeitos cardíacos e sistêmicos da sinvastatina foram analisados em modelo de sepse abdominal em ratos,.

(37) 36. utilizando o sestamibi-Tc99m como um substrato específico para avaliar a captação cardíaca e a biodistribuição sistêmica desse radiofármaco em outros órgãos vitais. A decisão de trabalhar com radiofármacos, seguindo a linha de pesquisa do grupo liderado por meu orientador, e mais especificamente com o sestamibi-Tc99m, deveu-se ao fato de que na minha atividade profissional como especialista em Medicina Nuclear, tenho trabalhado diariamente com este radiofármaco em exames de diagnóstico de distúrbios de perfusão miocárdica. Parte-se do princípio de que o sestamibi-Tc99m distribui-se no miocárdio proporcionalmente ao fluxo sanguíneo coronário 40. Estes detalhes funcionaram como facilitadores para viabilizar o trabalho experimental, ao mesmo tempo que foi altamente gratificante vivenciar no laboratório a contribuição que a Medicina Nuclear pode oferecer em pesquisa básica dessa natureza. A cooperação com o professor Francisco Pignataro do Departamento de Patologia da UFRN foi de suma importância para o aprendizado, execução e análise de técnicas de histopatologia miocardíaca na sepse, aliado ao fato de não termos detectado alterações significantes na estrutura histológica do miocárdio. Certamente o curto período de observação pós-sepse (24 horas) deve ter contribuído para este resultado. Outra cooperação que teve impacto significativo na nossa pesquisa foi a colaboração internacional com os colegas Som Javadi e Takahiro Higushi, respectivamente da Division of Nuclear Medicine, Department of Radiology, Johns Hopkins University, Baltimore USA, e do Department of. Nuclear. Medicine, Wuerzburg University, Wuerzburg, Germany. Foram feitas várias reuniões via teleconferência. Inúmeras contribuições foram dadas, sendo oferecidas idéias relevantes para interpretação dos resultados da nossa pesquisa. Os colegas Som Javadi e Takahiro Higushi contribuíram muito para a elaboração do texto do artigo científico e publicação. Essa parceria irá continuar e permitirá intercâmbio de conhecimentos da área de pesquisa com radioisótopos, principalmente para o laboratório cirurgia experimental da UFRN..

(38) 37. A nossa pesquisa proporcionou aquisição de conhecimentos importantes sobre os efeitos do uso da sinvastatina na captação cardíaca e biodistribuição do sestamibi-Tc99m durante a sepse. Houve também aumento da captação cardíaca e da concentração do Sestamibi-Tc99m no fígado, nos rins e no pulmão de ratos com sepse, quando comparados aos controles. Um dos possíveis mecanismos protetores da sinvastatina,que poderia explicar esses efeitos, seria o de indução de vasodilatação tecidual através das suas ações antiinflamatórias e imunomoduladoras. Dentre as limitações do estudo, a não utilização de métodos quantitativos absolutos de aferição da perfusão miocárdica talvez tenha sido a principal. Para determinar se a sinvastatina tem de fato efeito de vasodilatação coronariana na vigência de sepse, protegendo contra a isquemia induzida pela vasoconstricção, faz-se necessário quantificar perfusão tecidual. Uma das ferramentas fundamentais para quantificação da perfusão miocárdica é o PET. O nosso laboratório acaba de adquirir um microPET e novos estudos nessa mesma linha de pesquisa serão realizados para tentar minimizar essas limitações. As perspectivas futuras são de abrir novos horizontes para o tratamento da disfunção cardíaca sepse-induzida através do emprego das estatinas como drogas antiinflamatórias e imunomoduladoras. Mais estudos clínicos são necessários para comprovar o efeito protetor das estatinas sobre o coração diante da sepse. Em conclusão, por tudo que aprendi e vivenciei no decorrer do curso de Doutorado, considero que houve uma evolução bastante considerável dos meus conhecimentos. O processo de produção de idéias, o cumprimento de disciplinas. obrigatórias. e. complementares,. o. acompanhamento. e. desenvolvimento de diferentes protocolos dentro do Grupo de Pesquisa em Cirurgia Experimental e a interação e convívio com diferentes profissionais e colegas, além de contribuir enormemente para meu constante aprendizado, tiveram um valor inestimável no meu processo de formação e atuação. É pautada nessa rede de experiências, idéias e sentimentos que vem sendo desenvolvida a.

(39) 38. familiaridade com a pesquisa e o amadurecimento científico e profissional que poderão ser relevantes para ações em futuros projetos de pesquisa, cooperação científica com grupos de pesquisadores nacionais e internacionais, tudo visando a geração de novos conhecimentos..

(40) 39. 7 REFERÊNCIAS 1. Vincent JL, Sakr Y, Sprung CL, Ranieri VM, Reinhart K, Gerlach H, et al. Sepsis in European intensive care units: results of the SOAP study. Critical care medicine. 2006 Feb;34(2):344-53. PubMed PMID: 16424713. 2. Cannon CP, Braunwald E, McCabe CH, Rader DJ, Rouleau JL, Belder R, et al. Intensive versus moderate lipid lowering with statins after acute coronary syndromes. The New England journal of medicine. 2004 Apr 8;350(15):1495-504. PubMed PMID: 15007110. 3. LaRosa JC, Grundy SM, Waters DD, Shear C, Barter P, Fruchart JC, et al. Intensive lipid lowering with atorvastatin in patients with stable coronary disease. The New England journal of medicine. 2005 Apr 7;352(14):1425-35. PubMed PMID: 15755765. 4. Nissen SE, Nicholls SJ, Sipahi I, Libby P, Raichlen JS, Ballantyne CM, et al. Effect of very high-intensity statin therapy on regression of coronary atherosclerosis: the ASTEROID trial. JAMA. 2006 Apr 5;295(13):1556-65. PubMed PMID: 16533939. 5. Libby P, Ridker PM, Maseri A. Inflammation and atherosclerosis. Circulation. 2002 Mar 5;105(9):1135-43. PubMed PMID: 11877368. 6. Rosenson RS, Tangney CC. Antiatherothrombotic properties of statins: implications for cardiovascular event reduction. Jama. 1998 May 27;279(20):1643-50. PubMed PMID: 9613915. 7. Mach F. Toward a role for statins in immunomodulation. Molecular interventions. 2002 Dec;2(8):478-80. PubMed PMID: 14993398. 8. Veillard NR, Mach F. Statins: the new aspirin? Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2002 Nov;59(11):1771-86. PubMed PMID: 12530513. 9. Palinski W. Immunomodulation: a new role for statins? Nature medicine. 2000 Dec;6(12):1311-2. PubMed PMID: 11100105. 10. Laufs U, La Fata V, Plutzky J, Liao JK. Upregulation of endothelial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors. Circulation. 1998 Mar 31;97(12):1129-35. PubMed PMID: 9537338. 11. Laufs U, Fata VL, Liao JK. Inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl (HMG)-CoA reductase blocks hypoxia-mediated down-regulation of endothelial nitric oxide synthase. The Journal of biological chemistry. 1997 Dec 12;272(50):31725-9. PubMed PMID: 9395516. 12. Lefer AM, Campbell B, Shin YK, Scalia R, Hayward R, Lefer DJ. Simvastatin preserves the ischemic-reperfused myocardium in normocholesterolemic rat hearts. Circulation. 1999 Jul 13;100(2):178-84. PubMed PMID: 10402448. 13. Wolfrum S, Jensen KS, Liao JK. Endothelium-dependent effects of statins. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2003 May 1;23(5):729-36. PubMed PMID: 12615672. 14. Pruefer D, Scalia R, Lefer AM. Simvastatin inhibits leukocyte-endothelial cell interactions and protects against inflammatory processes in normocholesterolemic rats. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 1999 Dec;19(12):2894-900. PubMed PMID: 10591666. 15. Lefer DJ, Scalia R, Jones SP, Sharp BR, Hoffmeyer MR, Farvid AR, et al. HMG-CoA reductase inhibition protects the diabetic myocardium from.

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