UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Instituto de Biologia
MARIANA SILVEIRA DERAMI
COMPARAÇÃO ENTRE O MICROBIOMA DO TRATO RESPIRATÓRIO DE AVES SAUDÁVEIS E AVES DIAGNOSTICADAS COM COLIBACILOSE
CAMPINAS 2019
MARIANA SILVEIRA DERAMI
COMPARAÇÃO ENTRE O MICROBIOMA DO TRATO RESPIRATÓRIO DE AVES SAUDÁVEIS E AVES DIAGNOSTICADAS COM COLIBACILOSE
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Genética e Biologia Molecular, na Área de Microbiologia.
Orientador: WANDERLEY DIAS DA SILVEIRA Coorientador: RENATO PARIZ MALUTA
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA MARIANA SILVEIRA DERAMI, E ORIENTADA PELO PROF. DR. WANDERLEY DIAS DA SILVEIRA.
CAMPINAS 2019
Campinas, 14 de novembro de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA Dr. Renato Pariz Maluta (Coorientador)
Prof. Dr. Domingos da Silva Leite Prof. Dr. Márcio André Miranda
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da Unidade.
Dedico esse trabalho a minha mãe Aparecida, ao meu pai Brasilino, a minha irmã Luciana e ao meu namorado Henrique.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Wanderley Dias da Silveira e ao meu coorientador Renato Pariz Maluta pela orientação e suporte durante o desenvolvimento desse projeto de mestrado.
Aos veterinários do Serviço de Inspeção Federal: Ricardo Vinicius Santana e Izabelle Silva Rehfeld, pela disposição e auxílio na seleção das aves e coletas de amostras.
Aos colaboradores Douglas Antonio Alvaredo Paixão, Emerson Rodrigo Machi Gomes e Gabriela Felix Persinoti, pelo auxílio nos experimentos e análise dos resultados obtidos. À Mariela, Natália, Janaína, Bruna e Dona Neuza, obrigada pela amizade e conversas.
Às amizades do Laboratório de Virulência Bacteriana. Taila, Marina e Thiely, obrigada por toda amizade e companheirismo. Certamente, vocês trouxeram brilho aos meus dias.
Aos meus queridos amigos de graduação: Jéssica, Bruna, Marina, Bianca, Márcio, Tomás, Felipe e Carlos. Obrigada pela maravilhosa turma que nos tornamos e por todas as risadas, festas e palavras de apoio, quando foi preciso. Vocês são muito especiais!
Aos meus pais, Aparecida e Brasilino pelo apoio e amor incondicional em todas as minhas escolhas e momentos de vida. Obrigada por sempre priorizarem e estimularem os estudos. Ser bióloga e todas as demais realizações profissionais só foram possíveis pois, em todos os momentos vocês estiveram ao meu lado, como meu porto seguro. Obrigada por acreditarem nos meus planos de vida. Por serem positivos quando eu mesma já não tinha mais forças.
À minha irmã Luciana - química e bailarina -, que através de toda a sua dedicação e determinação tem sido um exemplo e me inspira a sempre batalhar para conquistar meus objetivos e sonhos. Obrigada por ser tão leve e engraçada. Que nossas risadas sem sentido, piadas e brincadeiras nunca deixem de existir.
Ao meu namorado Henrique, por todo companheirismo e amor. Sou muito grata ao destino por ter te colocado na minha vida, mesmo que da maneira mais inesperada e divertida. Com o seu jeito único, você veio somar à minha vida. Obrigada por todo o apoio, compreensão e por estar ao meu lado e acreditar nos meus sonhos e planos. Certamente, juntos iremos ainda mais longe! Aos membros da banca de qualificação, Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, Prof. Dr. Márcio André Miranda e Prof. Dra. Cristina Elisa Alvarez-Martinez e aos membros da banca de defesa, Prof. Dr. Domingos da Silva Leite, Prof. Dr. Márcio André Miranda, pelos conselhos.
À Universidade Estadual de Campinas e ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, do Instituto de Biologia, por toda a excelente estrutura e oportunidades que permitiram de maneira ética e imparcial, o meu desenvolvimento em ensino e pesquisa.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de mestrado concedida (2017/21904-6) como item orçamentário em auxílios, proveniente do Programa Jovens Pesquisadores em Centros Emergentes (2016/17421-7), que permitiu a realização deste trabalho. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
“Dedique-se de coração, mente e alma mesmo às menores ações. Esse é o segredo do sucesso.”
RESUMO
A presença de doenças nos pulmões altera as condições necessárias para o crescimento microbiano no trato respiratório, podendo alterar a composição da microbiota residente. Em aves, linhagens de Escherichia coli patogênicas (APEC - Avian Pathogenic Escherichia coli) estão associadas a doenças no trato respiratório. Pouco se conhece a respeito da microbiota do trato respiratório de aves. Neste trabalho, o microbioma do trato respiratório de aves saudáveis (n = 6) e aves diagnosticadas com colibacilose (n = 14) foi identificado e comparado através da coleta de fragmentos do pulmão e traqueia. O microbioma foi acessado através da técnica de 16S rRNA next-generation sequencing (NGS). Não se observou diferença significativa na comparação da média do número de táxons detectados no grupo de aves saudáveis (153,5 ± 64,22) em comparação com o grupo de aves doentes (101,57 ± 58,43) (p = 0,0935), assim como na avaliação da riqueza e diversidade, pelos índices de Chao1 e Shannon. Os táxons mais abundantes encontrados em amostras de aves doentes, foram Eschericha/Shigela e Lactobacillus com uma abundância de 36,6 e 50,3 vezes em relação às aves saudáveis, respectivamente. Em amostras de aves saudáveis o táxon mais presente foi Staphylococcus. Os resultados demonstram que há uma tendência na diminuição da riqueza e diversidade microbiana no trato respiratório de aves diagnosticadas com colibacilose. Através da técnica de eletroforese de campo pulsado (PFGE), o perfil genômico de 22 isolados de E. coli positivos para todos os marcadores de APEC (ompT, iss, hlyF, iroN e iutA) foram distribuídos em 14 pulsotipos. O sequenciamento de um isolado de cada pulsotipo permitiu a montagem de uma árvore filogenética que em comparação com o dendrograma, apresentou padrão diferente no agrupamento das amostras.
ABSTRACT
The presence of diseases in the lungs alters the conditions necessary for microbial growth in the respiratory tract and may change the composition of the resident microbiota. In birds, Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) strains are associated with diseases of the respiratory tract. Little is known about the microbiota of the respiratory tract of birds. In this study, we identified and compared the respiratory tract microbiome of healthy chickens (n = 6) and chickens diagnosed with colibacillosis (n = 14) by collecting lung and tracheal fragments. The microbiome was accessed using the amplification of 16S rRNA gene and next-generation sequencing (NGS) technique. No significant difference was observed when comparing the average number of taxa detected in the healthy chickens (153.5 ± 64.22) to the chickens diagnosed with colibacillosis (101.57 ± 58.43) (p = 0, 0935), as well as in the evaluation of richness and diversity by Chao1 and Shannon indices. The most abundant taxa found in samples from diseased chickens were Eschericha / Shigela and Lactobacillus with an abundance of 36.6 and 50.3 times compared to healthy chickens, respectively. In healthy chickens’ samples the most common taxon was Staphylococcus. The results show that there is a tendency to decrease microbial richness and diversity in the respiratory tract of chickens diagnosed with colibacillosis. Through the pulsed field electrophoresis (PFGE) technique, the genomic profile of 22 positive E. coli isolates for all APEC markers (ompT, iss, hlyF, iroN and iutA) were distributed in 14 pulsotypes. The sequencing of one isolate from each pulsotype allowed the assembly of a phylogenetic tree. Comparison between the phylogenetic tree to the dendrogram presented a different pattern in the assembling of the samples.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Montagem de pools em placas TSA. ... 21
Figura 2. Fluxograma do desenho experimental. ... 26
Figura 3. Dendrograma dos isolados de APEC em aves doentes. ... 29
Figura 4. Árvore filogenética para isolados de APEC, cada um representando um único pulsotipo. ... 30
Figura 5. Indexação da biblioteca 16S rRNA. ... 31
Figura 6. Curva de rarefação. ... 33
Figura 7. Filos bacterianos. ... 34
Figura 8. Gêneros bacterianos. ... 35
Figura 9. Distribuição de gêneros por grupo amostral. ... 41
Figura 10. Análise de PCR dos isolados para o gene iroN. ... 54
Figura 11. Análise de PCR dos isolados para o gene hlyF. ... 54
Figura 12. Análise de PCR dos isolados para o gene ompT. ... 55
Figura 13. Análise de PCR dos isolados para o gene iss. ... 56
Figura 14. Análise de PCR dos isolados para o gene iutA. ... 57
Figura 15. Gel de agarose por PFGE (amostras de 65 a 78). ... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Genes de virulência de APEC... 22
Tabela 2. Detecção de genes de virulência. ... 27
Tabela 3. Eletroforese de campo pulsado. ... 28
Tabela 4. Quantificação da biblioteca 16S rRNA de amostras de aves doentes. ... 30
Tabela 5. Quantificação da biblioteca 16S rRNA de amostras de aves saudáveis. ... 31
Tabela 6. Número de reads por amostra... 32
Tabela 7. Número de OTUs. ... 33
Tabela 8. Índice de Chao1 e índice de Shannon. ... 34
Tabela 9. Microbiota de aves saudáveis. ... 36
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus Celsius
µL Microlitro
cm Centímetro
DNA Ácido Desoxirribonucleico g Grama h Hora g Micrograma L Microlitro mA Miliampère mL Mililitro mM Milimolar ng Nanograma nM Nanomolar pM Picomolar
RNA Ácido ribonucleico
rRNA RNA ribossômico
pb Pares de base
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 14 2. OBJETIVO ... 19 2.1. Geral ... 19 2.2. Específicos ... 19 3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 20 3.1. Coleta de amostras ... 20
3.2. Controle de presença ou ausência de colônias típicas de E.coli ... 20
3.3. Detecção de genes marcadores de APEC por PCR em colônias isoladas ... 20
3.4. Eletroforese em campo pulsado ... 22
3.5. Extração de ácidos nucleicos do microbioma... 23
3.6. Amplificação e preparo da biblioteca 16S rRNA ... 23
3.7. Biblioteca Nextera XT® DNA ... 24
3.8. Normalização e sequenciamento das amostras ... 24
3.9. Análise de dados quantitativos de sequenciamento ... 25
3.10. Fluxograma do procedimento experimental ... 26
4. RESULTADOS ... 27
4.1. Confirmação microbiológica e molecular do diagnóstico de colibacilose ... 27
4.2. Eletroforese em campo pulsado e sequenciamento de isolados de APEC ... 28
4.3. Sequenciamento 16S rRNA das amostras de órgão de aves. ... 30
4.4. Análise de diversidade alfa através do número de OTUs ... 33
4.5. Descrição dos táxons nos grupos de aves saudáveis e doentes ... 34
4.6. Descrição de gêneros entre aves saudáveis e doentes ... 39
5. DISCUSSÃO ... 42
6. CONCLUSÃO ... 47
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 48
8. APÊNDICE ... 54
9. ANEXO ... 59
9.1. Certificado de aprovação do projeto...59
9.2. Declaração de direitos autorais ...60
1. INTRODUÇÃO
Durante muitos anos os pulmões de indivíduos saudáveis foram considerados locais livres de microrganismos. Entretanto, recentemente, através do uso de técnicas de identificação de microrganismos independente de cultivo pode-se verificar que os pulmões possuem uma microbiota residente que varia entre indivíduos saudáveis e doentes (Dickson et al., 2016), de acordo com a idade, tanto em humanos (Biesbroek et al., 2014) quanto em animais (Glendinning et al., 2017).
O conceito de esterilidade dos pulmões é devido a provável ausência de microrganismos residentes capazes de se multiplicarem, mas esta não leva em conta o balanço da entrada e eliminação de microrganismos no trato respiratório (Dickson et al., 2014). Parâmetros fisiológicos, tais como temperatura, pH e pressão de oxigênio, apresentam variações nos compartimentos anatômicos (lobos) dos pulmões (Dickson et al., 2016). A presença de doença pulmonar aguda ou crônica altera dramaticamente as condições necessárias para o crescimento microbiano no trato respiratório. Segundo Dickson et al. (2016), a inflamação do trato respiratório leva a um incremento da produção de muco, fazendo com que certas regiões do trato respiratório apresentem baixa pressão de oxigênio e aumento de temperatura, favorecendo a multiplicação de certos microrganismos em detrimento de outro.
O acesso a microbiota presente no trato respiratório tem possibilitado a compreensão e o delineamento de novas perspectivas sobre a dinâmica do ecossistema microbiano e estabelecimento de doenças pulmonares.
O termo microbioma foi proposto pela primeira vez em 2001, por Joshua Lederberg, referindo-se à “comunidade ecológica de microrganismos comensais, simbióticos e patogênicos que, literalmente, compartilham o espaço do nosso corpo” (Lederberg e McCray, 2001). O termo engloba a composição da comunidade de microrganismos, assim como, células do hospedeiro e fatores bióticos e abióticos, os quais modulam a interação e regem a dinâmica do local de interesse. Reconhecendo a importância do microbioma e sua relação com a saúde, em 2007 foi criado o Human Microbiome Project, pelo National Institutes of Health (NIH), visando a identificação os microrganismos presentes na pele, boca, nariz e vagina.
Por muito tempo, a identificação de microrganismos foi realizada através de técnicas tradicionais dependentes de cultivo que englobam as etapas de isolamento e obtenção de cultura pura que ocorrem através da utilização de meios de cultura diferencial e ou seletivo e, etapa de identificação, que depende da análise morfológica, coloração de Gram e ensaios bioquímicos (Lagier et al., 2015). Entretanto, o cultivo de microrganismos por métodos
tradicionais se mostra um desafio devido ao longo tempo de cultivo e limitação da avaliação fenotípica para identificação a nível de gênero e espécie (Bochner, 2009). Como exemplo, foi descrita a classificação inapropriada entre Lactobacillus acidophilus e Lactobacillus casei realizada através de técnicas baseada em análise fenotípica. Ademais, muitos microrganismos são não cultiváveis e não podem ser detectados através das técnicas fenotípicas tradicionais (Yeung et al., 2002).
No final do século XX, o desenvolvimento de ferramentas moleculares e criação de bancos de dados contribuíram para a expansão da microbiologia e aumento da identificação de espécies microbianas (Drancourt et al., 2000). A técnica de PCR (polymerase chain reaction), criada em 1985, foi a principal ferramenta nos estudos de identificação de bactérias baseado em sequências de DNA. Entretanto, essa ferramenta molecular possuía suas limitações, pois em geral era realizada em associação com sequenciamento do tipo Sanger, no qual há a necessidade de colônias puras isoladas.
Desde 2005, as tecnologias de sequenciamento de nova geração, permitiram o sequenciamento de milhões de pares de base em menor espaço de tempo e custo e, com o diferencial que é a possibilidade do sequenciamento da região de interesse do genoma de várias bactérias em uma mesma amostra, de forma concomitante. Dentre as principais plataformas de sequenciamento encontra-se a Illumina, classificada como sequenciamento de segunda geração. Atualmente, uma das formas de identificação de bactérias envolve a amplificação do gene 16S rRNA, uma pequena região altamente conservada do genoma bacteriano que contém nove regiões hipervariáveis (V1 à V9) que podem ser utilizadas para diferenciar os microrganismos de uma mesma amostra, em associação com a montagem de bibliotecas de DNA para sequenciamento de nova geração. O processo de sequenciamento gera centenas de sequências curtas do genoma que, através de pipelines de bioinformática podem ser alinhadas, organizadas e classificadas de acordo com informações existentes em bancos de dados. As sequências são organizadas em clusters por similaridade, as quais devem apresentar 97% de homologia, sendo agrupadas como Unidade Taxonômicas Operacionais (OTUs).
Destacam-se também as tecnologias “ômicas” que implicam no acesso global, caracterização e quantificação de moléculas que geram informações acerca da composição, estruturas, funções e dinâmicas de um organismo ou comunidades (Hasin et al., 2017). A metagenômica permite a análise genômica de todos os microrganismos presentes em uma amostra, mesmo daquelas que o cultivo em placa não é viável, uma vez que o sequenciamento do tipo Shotgun, permite o acesso a todo o genoma microbiano e não somente de um gene alvo. Esse sequenciamento pode ser utilizado na determinação de potencial perfil taxonômico e
funcional de comunidades microbioanas (Sharpton, 2014). Além disso, o sequenciamento Shotgun pode ser usado para a identificação do genoma de isolados bacterianos.
Estudos recentes envolvendo técnicas independentes de cultivo dos microrganismos comprovaram que os pulmões de indivíduos saudáveis e doentes abrigam diversas comunidades microbianas (Dickson et al., 2016). Em 2010, técnicas independentes de cultivo foram utilizadas pela primeira vez em amostras do trato respiratório de indivíduos saudáveis e com asma, demonstrando que as vias aéreas de indivíduos com doença respiratória contêm comunidades distintas, nas quais o filo Proteobacteria é relativamente abundante (Hilty et al., 2010). Trabalhos seguintes demonstraram que em indivíduos saudáveis os filos mais abundantes foram Bacterioides e Firmicutes e os gêneros mais proeminentes foram Prevotella, Veillonella e Streptococcus (Morris et al., 2013; Segal et al., 2013). Há estudos que demonstraram a diferença da composição do microbioma de acordo com a região do trato respiratório. Indivíduos com fibrose cística apresentam comunidades bacterianas com composições distintas nos diferentes lobos pulmonares (Goddard et al., 2012; Willner et al., 2012). Enquanto nos indivíduos saudáveis, essa variação é pequena, sugerindo que o microbioma destes indivíduos é mais influenciado pela entrada e eliminação de microrganismos do que pelas condições locais de crescimento ou taxa de replicação bacteriana (Dickson et al., 2015).
Em aves, estudos envolvendo o trato respiratório, foram conduzidos com o objetivo de isolar os agentes associados a doenças bacterianas. Vários desses agentes já foram isolados no Brasil, como Mycoplasma gallisepticum (micoplasmose) (Fraga et al., 2013), Pasteurella multocida (cólera aviária crônica) (Rigobelo et al., 2013), Avibacterium paragallinarum (coriza infecciosa) (Blackall et al., 1994) e Ornithobacterium rhinotracheale (Canal et al., 2005). As linhagens de Escherichia coli (E. coli) associadas a doenças extra-intestinais em aves são conhecidas como E. coli patogênicas aviárias ou, em inglês, Avian Pathogenic E. coli (APEC) responsável pela doença denominada colibacilose (Dziva e Stevens, 2008).
A APEC é um bastonete gram-negativo, anaeróbico facultativo, não esporulado, oxidase negativa, podendo ser móvel ou não, pertencente à família Enterobacteriacea. É classificada como E. coli Extraintestinal Patogênica (ExPEC) por estar localizado ou causar infecção sistêmica fora do trato intestinal (Russo e Johnson, 2000).
A infecção causada por APEC é denominada colibacilose aviária. Uma infecção bacteriana complexa que se inicia através da inalação de partículas contaminadas, atingindo diretamente o trato respiratório. Pode ocorrer a nível sistêmico e apresenta sinais clínicos como pericardite, aerosaculite, salpingite entre outros (Lutful Kabir, 2010). A disseminação da APEC
pode ocorrer também através do contato de aves saudáveis com secreções de aves infectadas ou ingestão de água ou ração contaminadas (Dho-Moulin e Fairbrother, 1999). Dessa maneira, o controle da dispersão do patógeno deve ser realizada por ações profiláticas eficazes que visem fatores como deficiência na ventilação de ambientes avícolas, variações climáticas, umidade da cama, criações com alta densidade e deficiência no processo de desinfecção.
O papel de APEC como agente primário ou secundário em frangos é controverso. Cepas que apresentam genes de virulência (Dziva e Stevens, 2008) tem apresentado eficiência na indução do processo de infecção e desenvolvimento da colibacilose sem a necessidade de infecção prévia ou sistema imune debilitado (Collingwood et al., 2014). Entretanto, outros trabalhos demonstram que as condições ambientais e infecções primárias bacterianas ou virais, tornam as aves mais susceptíveis à infecção por APEC devido a alteração e destruição prévia do epitélio respiratório (Dho-Moulin e Fairbrother, 1999).
A colibacilose é uma infecção de relevância mundial, responsável por grandes perdas econômicas (Antão et al., 2008; Ewers et al., 2003). É umas das principais causas de morbidade, mortalidade e condenação parcial ou total de carcaças (Sesterhenn et al., 2011; Skyberg et al., 2003). Somente no Rio Grande do Sul, a perda econômica determinada para as condenações totais de carcaças de aves foi de R$131,55 milhões de reais no período de 2006 a 2016 (Fonseca et al., 2018).
As linhagens de E. coli associadas a colibacilose são extremamente diversas. No Brasil, por exemplo, 22 sorogrupos diferentes e 45 STs (sequence types determinados por MLST) foram encontrados em APEC (Maluta et al., 2014). Na América do Norte e Europa, a estrutura clonal é um pouco mais uniforme, pois existem três sorogrupos mais prevalentes (O1, O2 e O78). Entretanto, em geral, existe uma grande heterogeneidade em relação a presença de diversos genes de virulência. Poucas análises envolvendo genômica comparativa têm sido realizadas com APEC. Um estudo envolvendo os plasmídios de 12 isolados demonstrou que estes foram muito semelhantes, apresentando os genes/operons iss, traT, hlyF, eitABC, ompT, iroBCDEN, sitABCD, iutA e lucABCD (Olsen et al., 2012). Outro trabalho, este utilizando genomas, demonstrou que a linhagem APEC IMT5155 (O2:K1:H5) é profundamente relacionada com a linhagem APEC O1 (O1:K1) e linhagens de E. coli extra-intestinal de origem humana do sorotipo O18:K1 (Zhu Ge et al., 2014).
Como apresentado, o trato respiratório de aves é composto por uma microbiota complexa, a qual está diretamente ligada a saúde e performace das aves. Entretanto, na literatura, há somente quatro trabalhos cujo objetivos foram determinar o microbioma do trato respiratório de aves, de acordo com a variação temporal (aves em diferentes estágios de vida),
espacial (local de criação) e regiões diferente do trato respiratório (Glendinning et al., 2017; Johnson et al., 2018; Ngunjiri et al., 2019; Shabbir et al., 2015). Em 2017, Glendinning et al., verificou que a composição da microbiota difere em quantidade e tipo bacteriano entre as regiões bucal, nasal e brônquios, assim como, quando analisada a composição em tais regiões em estágios de vida distintos da ave. Entretanto, nenhum dos estudos prévios comparou a comunidade microbiana presente no trato respiratório de aves saudáveis e doentes.
Assim, devido à falta de informação sobre o microbioma do trato respiratório de aves e a relevância econômica da colibacilose na avicultura, o desenvolvimento do presente estudo visa contribuir para a identificação e comparação da microbiota presente no trato respiratório de aves saudáveis e aves diagnosticadas com colibacilose.
2. OBJETIVO 2.1. Geral
Esse trabalho tem como objetivo verificar se a presença da infecção pulmonar, colibacilose, altera o microbioma presente no trato respiratório de frangos diagnosticados com a doença quando comparado com o microbioma do trato respiratório de frangos saudáveis. Além disso, sequenciar e comparar cepas de APEC isoladas dos frangos diagnosticados com colibacilose.
2.2. Específicos
I. Determinar o microbioma do trato respiratório de aves saudáveis e de aves diagnosticadas com colibacilose, através de sequenciamento de nova geração da região hipervariável do gene 16S rRNA.
II. Sequenciar e comparar isolados de APEC provenientes de aves diagnosticadas com colibacilose, através da técnica de eletroforese de campo pulsado e montagem de árvore filogenética a partir das sequências obtidas pela biblioteca Nextera XT DNA.
3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Coleta de amostras
A coleta de órgãos do trato respiratório (fragmento de pulmão e traqueia) de 30 aves saudáveis foi realizada no frigorífico JBS no município de Guapiaçu-SP, enquanto a coleta de órgãos de 26 aves doentes foi feita no frigorífico Ave Nova, em Betim-MG. O diagnóstico das aves (saudáveis ou com lesões típicas de colibacilose), foi realizado pelos veterinários Ricardo Vinicius Santana e Izabelle Silva Rehfeld do Serviço de Inspeção Federal (SIF), através da avaliação macroscópica de sinais clínicos como espessamento dos sacos aéreos, pericardite, artrite, celulite e presença de pústulas no fígado.
Os órgãos foram coletados diretamente da linha de inspeção durante o procedimento de evisceração, com pinça e bisturi estéreis e armazenados em tubo falcon estéril. Em seguida, os órgãos foram lavados vigorosamente com solução salina estéril 0,9% para a retirada de possível contaminação externa e, logo após, os órgãos de cada ave foram armazenados em tubos falcon com 10 mL de PBS estéril e identificados. As amostras foram mantidas em gelo durante o transporte para o laboratório na UNICAMP.
3.2. Controle de presença ou ausência de colônias típicas de E.coli
Para verificar a presença de E. coli em amostras de aves doentes e ausência nas amostras de aves saudáveis, os tubos falcon com as amostras foram agitados por 10 segundos. Em fluxo laminar, um volume de 100 L da solução de PBS com amostra foi inoculado em ágar MacConkey e espalhado com alça de Drigalski. As placas foram incubadas a 37°C por 18h.
Após a incubação, selecionou-se somente as amostras de aves doentes que apresentaram crescimento de colônias lactose positivas típicas de E. coli. Para as amostras de aves saudáveis, selecionou-se apenas as que não apresentaram crescimento de colônias nas placas. Em seguida, os tubos com os órgãos selecionados foram armazenados a -80°C para posterior extração total de DNA.
3.3. Detecção de genes marcadores de APEC por PCR em colônias isoladas
Pools de colônias de cada amostra das aves doentes com crescimento de colônia em ágar MacConkey foram testados por PCR para a detecção dos genes de virulência de APEC ompT, iss, hlyF, iroN e iutA (Johnson et al., 2008) (Tabela 1).
Inicialmente, os pools foram preparados através do estriamento em ágar TSA – em linha única –, a partir de uma colônia típica de E.coli em ágar MacConkey. Esse procedimento foi realizado para o máximo de cinco colônias por amostra (Figura 1).
Figura 1. Montagem de pools em placas TSA. Procedimento para montagem dos pools provenientes das
amostras de frangos diagnosticados com colibacilose. (A) Placa de MacConkey com colônias típicas e isoladas de
E. coli (círculos 1, 2 e 3). (B) Placa de ágar TSA com até 5 colônias isoladas de E. coli (pool) para cada amostra.
Utilizando um swab estéril transferiu-se uma amostragem de cada pool em ágar TSA para um tubo falcon contendo 5 mL de caldo LB. Os tubos foram incubados a 37°C por 18h.
A extração do DNA por lise térmica foi realizada de acordo com o protocolo do laboratório de referência para E. coli (EcL – Faculté de Médecine Vétérinaire, Université de Montréal), disponível em http://www.apzec.ca/en/APZEC/Protocols/APZEC_PCR_en.aspx. O sobrenadante obtido ao final do procedimento foi usado para a realização de uma PCR de triagem para detecção dos genes de virulência ompT, iss, hlyF, iroN e iutA que estão relacionados ao patótipo APEC. Cada reação de amplificação foi conduzida conforme a seguir: 3 minutos a 98°C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 98°C, 45 segundos a 40°C, 30 segundos a 72°C e, em seguida, 5 minutos a 72°C e 10 minutos a 10°C. Foram usados como controle negativo a cepa de EHEC (Enterohemorrhagic Escherichia coli) e como controle positivo a cepa 353EC. Os produtos de PCR (amplicons) foram detectados e avaliados através de técnica de eletroforese em gel de agarose a 1,5%, a 90 V por 40 minutos.
As colônias dos pools positivos foram novamente testadas, para cinco genes de virulência, selecionando somente uma estria (representando um isolado) do pool por vez. As amostragens das estrias foram cultivadas em LB conforme descrito anteriormente. Para cada
A B
1
2
isolado positivo para os cinco genes de virulência, adicionou-se 1 mL do caldo LB (incubado “overnight”) em tubo criogênico contendo 1 mL de solução de glicerol 30%. Os tubos foram agitados e armazenados em freezer a -80º C para posterior teste de eletroforese de campo pulsado e sequenciamento de nova geração.
Tabela 1. Genes de virulência de APEC. Iniciadores utilizados para amplificação dos genes em isolados de E.
coli e condições das reações.
Genes Sequência de iniciadores (5’ – 3’) Amplicon
(pb) T (°C) Referência Aquisição de ferro iroN F- AAGTCAAAGCAGGGGTTGCCCG 667 58 Johnson et al., 2008 R- GATCGCCGACATTAAGACGCAG iutA F - GGCTGGACATCATGGGAACTGG 302 59 Johnson et al., 2008 R - CGTCGGGAACGGGTAGAATCG Protectinas/resistência ao soro iss F - CAGCAACCCGAACCACTTGATG 323 57 Johnson et al., 2008 R - AGCATTGCCAGAGCGGCAGAA Hemolisina hlyF F - GGCCACAGTCGTTTAGGGTGCTTACC 450 62 Johnson et al., 2008 R - GGCGGTTTAGGCATTCCGATACTCAG Variados ompT F - TCATCCCGGAAGCCTCCCTCACTACTAT 496 62 Johnson et al, 2008 R - TAGCGTTTGCTGCACTGGCTTCTGATAC
pb (tamanho do amplicon em pares de base); T(°C) Temperatura de anelamento; F sequência foward; R sequência reverse.
3.4. Eletroforese em campo pulsado
Um isolado positivo para os genes de E. coli (item 3.3) de cada amostra foi tipado através de eletroforese de campo pulsado. A preparação dos plugs (blocos) e digestão do DNA genômico com a enzima de restrição Xbal (Invitrogen, EUA) para tipagem foi realizada de acordo com o protocolo estabelecido pelo Center for Disease Control and Prevention (CDC) (Ribot et al., 2006), usando a cepa Salmonella Braenderup H9812 (ATCC BAA-664) como controle de referência de peso molecular. As condições de eletroforese foram: tempo inicial de
2,2 segundos; tempo final de 54,2 segundos em um gradiente de 6 V e ângulo de 120°. Os géis foram submetidos a eletroforese por 16h. Posteriormente, o gel foi incubado em solução aquosa de brometo de etídeo a 1 g/mL por 30 minutos e descorado em água ultrapura por 20 minutos. Com o auxílio da doutoranda Taila Alves do Santos, do Laboratório de Virulência Bacteriana, as fotos dos géis foram analisadas usando-se o programa GelCompar versão 5.1 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Bélgica) para produzir o agrupamento das amostras. A similaridade dos fragmentos foi comparada utilizando o coeficiente de Dice a 1% de tolerância e 1% de otimização e o dendrograma foi construído com o método de agrupamento Unweighted Pair Group Method Using Arithmetic Average (UPGMA). Um coeficiente de similaridade acima de 80% foi selecionado como ponto de corte para a definição dos clusters.
3.5. Extração de ácidos nucleicos do microbioma
Para aumentar a superfície de contato dos fragmentos de órgãos, adicionou-se a cada tubo falcon três beads metálicos estéreis. A homogeneização foi feita em vórtex, com agitação por 10 minutos, com intervalos regulares de 2 minutos em gelo para evitar o aquecimento da amostra.
A partir da amostra homogeneizada, aliquotou-se 1 mL da suspensão para início da extração de DNA com ZymoBiomics DNA Miniprep Kit (Zymo, EUA), segundo instruções do fabricante. O restante da suspensão foi imediatamente re-armazenada em -80ºC. Ao final, obteve-se 50 L de DNA extraído de cada amostra e do controle microbiano padrão (ZymoBIOMICS™ Microbial Community Standard, Zymo Research, EUA), que foi utilizado para validação do processo de extração de ácidos nucleicos e sequenciamento. Em seguida, as amostras e controle foram quantificados pelo método fluorimétrico (Qubit dsDNA HS, Thermo, EUA) e armazenado a -20ºC para posterior preparo da biblioteca 16S rRNA e sequenciamento.
3.6. Amplificação e preparo da biblioteca 16S rRNA
A partir das amostras de aves doentes e saudáveis selecionadas anteriormente (itens 3.2 e 3.3), realizou-se PCR para amplificação das regiões V4 do 16S rRNA utilizando os
primers F515 (5′-CACGGTCGKCGGCGCCATT-3′) e R806
(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) (Caporaso et al., 2011).
A reação continha 10 µL (input de 150 ng) de DNA; 0,6 µL (10 pmol) de cada primer 16S-F e 16S-R; 0,5 µL (1.5 U) de Phusion polimerase; 10 µL de HF buffer; 1 µL (10mM) de dNTP e 27.3 µL de água miliq autoclavada. Reação com volume final de 50 µL.
A amplificação foi realizada em termociclador (Applied Biosystem) programado com o regime de ciclo seguindo as seguintes condições: 3 minutos a 98°C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 98°C, 45 segundos a 40°C, 30 segundos a 72°C e, em seguida, 5 minutos a 72°C e 10 minutos a 10°C. Controle negativo (água miliq autoclavada) e positivo (DNA extraído da cultura comercial - ZymoBIOMICS™ Microbial Community Standard) foram incluídos no ciclo de cada reação de PCR. Os amplicons foram detectados e avaliados através de gel de agarose 1,5% e técnica de eletroforese, a 90 V por 40 minutos.
Em seguida, os fragmentos de 16S amplificados (292-pb) foram purificados utilizando esferas magnéticas Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) em uma proporção Bead/DNA de 1:1. O DNA foi ressuspendido em 25 μL de água ultrapura estéril. Todos amplicons 16S foram duplamente indexados com o Nextera Index Kit (Illumina), Index 1 (N7XX) e Index 2 (S5XX) e novamente purificados de acordo com o protocolo do fabricante (https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_documentation/16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf).
3.7. Biblioteca Nextera XT ® DNA
Paralelamente ao preparo da biblioteca de 16S rRNA, foi montada a biblioteca Nextera XT® DNA. Um isolado de APEC de cada pulsotipo, previamente identificado, foi selecionado para sequenciamento de acordo com o protocolo de preparo da biblioteca (https://support.illumina.com/content/dam/illuminasupport/documents/documentation/chemist ry_documentation/samplepreps_nextera/nextera-xt/nextera-xt-library-prep-reference-guide-15031942-05.pdf).
3.8. Normalização e sequenciamento das amostras
As etapas de normalização e sequenciamento das amostras foram realizadas no Laboratório Nacional de Ciência e Tecnologia do Bioetanol (CTBE/CNPEM), com auxílio do biólogo Douglas Antonio Alvaredo Paixão e do analista de desenvolvimento tecnológico Emerson Rodrigo Machi Gomes.
Após quantificação com o método fluorimétrico (Qubit dsDNA HS, Thermo, EUA), as bibliotecas 16S rRNA e Nextera XT® DNA, foram normalizada a 10 nM, diluídas em TRIS-HCl pH 8.0 a 10 nM e posteriormente diluídas a 10 pM para que suas concentrações atingissem os pontos da curva que compõe o Kit KAPA de quantificação em PCR em tempo real (RT-PCR). O pool de amostras foi preparado a 2,5 nM para então serem sequenciadas na plataforma MiSeq Illumina com o MiSeq Reagent Kit v3 (2x 300). Após as corridas, os reads foram demultiplexados no ambiente BaseSpace da Illumina.
3.9. Análise de dados quantitativos de sequenciamento
As análises de bioinformática foram feitas em parceria com a especialista de bioinformática Gabriela Felix Persinoti, do Laboratório Nacional de Biorrenováveis (LNBR/CNPEM).
Após serem demultiplexados, os reads foram filtrados para retirada dos indexes e primers e remoção de bases com baixa qualidade com Trimmomatic 0.36 (Bolger et al., 2014). Para a análise de microbioma, os reads que passaram no controle de qualidade foram combinados (“merged”) e clusterizados em OTUs utilizando a função unoise do software USEARCH v11. Para a classificação taxonômica, utilizou-se o banco de dados RDP database formatado para a função utax também do software USEARCH (Edgar, 2010). Ao final, as análises estatísticas foram feitas usando o R com os pacotes phyloseq 1.22.3 (McMurdie e Holmes, 2013) e vegan 2.5-3 (Dixon, 2003). O teste t unpaired foi feito com o programa Prism (disponível em https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/).
O teste de Kruskal-Wallis foi realizado para detectar se havia diferença significante na Riqueza (índice de Chao1) e Diversidade (índice de Shannon) entre as comunidades bactérias de ambos os grupos, considerando-se o valor de p < 0,05 como estatisticamente significativo.
Para as análises de genomas bacterianos, os reads que passaram no controle de qualidade foram utilizados para montagem de novo com SPAdes (Bankevich et al., 2012). Em seguida, os contigs maiores que 500 nucleotídeos foram anotados com Prokka (Seemann, 2014). Os genes presentes em todos os genomas em cópia única foram selecionados e alinhados com MAFFT (Katoh et al., 2009). Os alinhamentos foram concatenados com FASconCAT-G (Kück e Longo, 2014). Em seguida, as concatenações foram comparadas com FastTree 2 (Price et al., 2010), que gerou uma árvore filogenética.
3.10. Fluxograma do procedimento experimental
Figura 2. Fluxograma do desenho experimental. Procedimentos adotados para obtenção e caracterização dos
4. RESULTADOS
4.1. Confirmação microbiológica e molecular do diagnóstico de colibacilose
As amostras de aves doentes e saudáveis foram submetidas a confirmação fenotípica em ágar MacConkey para presença ou ausência de colônias lactose positiva de E. coli. A confirmação molecular das amostras de aves doentes foi através da detecção dos genes de virulência de APEC.
Tabela 2. Detecção de genes de virulência. Avaliação da presença dos cinco genes de virulência de APEC em
23 isolados de E. coli provenientes de frangos com lesões típicas de colibacilose.
Identificação dos isolados Genes de virulência
ompT iss hlyF iroN iutA
65a + + + + + 66a + + + + - 67a + + + + + 69a + + + + + 70a + + + + + 71a + + + + + 73a + + + + + 74a + + + + + 75a + + + + + 76a + + + + + 77a 78a + + + + + + + + + + 79a + + + + + 81a + + + + + 82a + + + + + 83a + + + + + 84a + + + + + 85a + + + + + 86a + + + + + 87a + + + + + 88e + + + + + 89b + + + + + 90a + + + + +
A partir das 26 amostras de aves com lesões compatíveis com colibacilose identificados no frigorífico, 23 (88.5%) das amostras apresentaram colônia típica de E. coli em ágar MacConkey. Dentre essas, 22 isolados apresentaram colônias positivas para todos os genes de virulência de APEC (ompT, iss, hlyF, iroN e iutA) (Apêndice 1). A amostra 66a
apresentou colônias positivas somente para quatro genes de virulência (ompT, iss, hlyF e iroN) sendo eliminada do trabalho (Tabela 2). De 30 amostras de aves saudáveis, 24 (80%) foram descartadas do trabalho pois apresentaram cultura positiva para E. coli em ágar MacConkey. A presença de E. coli em amostras de aves saudáveis, indica a possível contaminação das amostras devido ao ambiente contaminado dos frigoríficos ou mesmo a presença latente de APEC.
4.2. Eletroforese em campo pulsado e sequenciamento de isolados de APEC
Os 22 isolados de E. coli positivos para todos os marcadores de APEC (um por amostra de ave) (item 4.1) foram tipáveis utilizando-se a enzima de restrição Xbal (Apêndice 2). Os 22 isolados foram distribuídos em 14 perfis diferentes de PFGE, também denominados de pulsotipo.
Para fins de organização, os pulsotipos foram classificados de A à N. Os pulsotipo H e D foram os mais prevalentes com 5 e 4 isolados, respectivamente. O pulsotipo G apresentou 2 isolados e demais pulsotipos A, B, C, E, F, I, J, K, L, M e N possuíram um único isolado (Tabela 3), demonstrando um grau elevado de heterogeneidade entre as E. coli das amostras coletadas. O dendrograma gerado por PFGE apresentou 4 clusters e é mostrado na figura 3.
Tabela 3. Eletroforese de campo pulsado. Pulsotipos obtidos por eletroforese de campo pulsado realizada em
isolados de E. coli provenientes de aves diagnosticadas com colibacilose.
Pulsotipo Identificação dos isolados
A 65a
B 67a
C 69a,
D 70a, 73a, 75a, 78a,
E 71a
F 74a
G 76a, 77a
H 79a, 82a, 83a, 86a, 87a
I 81a J 84a K 85a L 88e M 89b N 90a
Figura 3. Dendrograma dos isolados de APEC em aves doentes. Dendrograma mostrando relação de
similaridade estabelecida por PFGE das 22 amostras de isolados de E. coli provenientes de fragmentos de pulmão e traqueia de aves diagnosticas com colibacilose positivas para os cinco genes de virulência de APEC, por meio da digestão com XbaI e submetidos à eletroforese em gel sob campo elétrico pulsado (PFGE). Similaridade genética acima de 80%.
Um representante de cada pulsotipo (A, B, C, D, E, F, G, J, K, L e N) foi selecionado para montagem da biblioteca Nextera XT® DNA e posterior sequenciamento. A partir das sequências obtidas foi possível montar a árvore filogenética com base nos ortólogos, que apresentou 5 clusters (Figura 4). Além disso, a árvore apresentou padrão distinto em comparação com o dendrograma.
1
2
3
Figura 4. Árvore filogenética para isolados de APEC, cada um representando um único pulsotipo. Análise
filogenética a partir das sequências de isolados de aves diagnosticadas com colibacilose. Presença de cinco
clusters, de acordo com o ponto de corte de 80%.
4.3. Sequenciamento 16S rRNA das amostras de órgão de aves.
Ao final do preparo da biblioteca 16S rRNA (item 3.7), 19 amostras de aves doentes e 6 amostras de aves saudáveis continham a quantificação mínima de DNA esperada (10 ng/L) e foram selecionadas para a etapa de sequenciamento (Tabela 4 e Tabela 5). A amostra 69 foi mantida no estudo pois, sua quantificação foi próxima a quantificação mínima estipulada e assim como para as demais amostras, a etapa de normalização irá padronizar a concentração (ng/L) de DNA por amostra que será necessária para a etapa de sequenciamento.
Tabela 4. Quantificação da biblioteca 16S rRNA de amostras de aves doentes. Quantificação de DNA dos
amplicons purificados e indexados da biblioteca 16S rRNA. Grupo experimental Identificação Concentração (ng/ μL) DOENTES 69 8,2 70 37,9 71 15,9 73 29,8 74 28,3 75 38,2 76 35,0 77 30,7 78 20,0 81 33,8 82 23,8 83 26,1 84 12,7 85 36,6 86 26,0 87 25,4 88 20,0 89 25,8 90 21,0 1 2 //3 4 5
Tabela 5. Quantificação da biblioteca 16S rRNA amostras de aves saudáveis.Quantificação de DNA dos amplicons purificados e indexados da biblioteca 16S rRNA.
Grupo experimental Identificação Concentração (ng/ μL) SAUDÁVEIS 104 22,9 106 34,4 107 38,9 109 44 116 30,1 118 42,9
Ao final um gel de agarose 1,5% foi realizado com algumas amostras indexadas e não indexadas, paralelamente, para certificação de que a indexação foi eficiente (Figura 5). Conforme esperado, as amostras indexadas apresentaram amplicons com peso molecular maior do que das amostras não indexadas.
Figura 5. Indexação da biblioteca 16S rRNA. Eletroforese em gel de agorose (1,5%) para verificação da etapa
de indexação da biblioteca Nextera ® XT DNA (amostras Mock 2; 77-2; 8-2; 84-2 e 87-2), em comparação com a etapa de amplificação da região 16S rRNA (amostras Mock 1; 77-1; 81-1; 84-2 e 87-2). Ladder de 100bp.
Após o sequenciamento, cinco amostras de aves doentes (65, 67, 88, 89 e 90) não apresentaram reads aproveitáveis. Portanto, ao final, amostras de 14 aves doentes e 6 aves saudáveis foram utilizadas para as análises posteriores.
Em aves saudáveis, o número de reads após o merging e controle de qualidade variou entre 938 e 13647, com média 5495,7 (Tabela 6). Para amostras de aves doentes, o reads
merged variaram entre 441 e 37890, com média 6331,5. Somente os reads que passaram no controle de qualidade foram utilizados nas análises de diversidade (item 3.9).
A variação do valor mínimo e máximo de reads encontrados em ambos os grupos experimentais refletiram a quantidade de OTUs associadas as amostras. Dessa forma, ao se observar a curva de rarefação (Figura 6), nota-se que somente a amostra 85 tende a atingir a curva de saturação (em relação ao eixo x). Assim, tem-se que a diversidade microbiana da maior parte das amostras não foi totalmente acessada. Entretanto, os organismos mais abundantes foram provavelmente identificados.
Tabela 6. Número de reads por amostra. Dados quantitativos das amostras 16S do sequenciamento Miseq V3.
Grupo Identificação da amostra Nº de reads após trimagem e merging Doente 69 447 Doente 70 1783 Doente 71 655 Doente 73 9940 Doente 74 4048 Doente 75 1204 Doente 76 634 Doente 77 1557 Doente 78 7333 Doente 81 17184 Doente 82 4578 Doente 83 441 Doente 84 947 Doente 85 37890 Saudável 104 2911 Saudável 106 938 Saudável 107 3918 Saudável 109 13647 Saudável 116 9519 Saudável 118 2041
Figura 6. Curva de rarefação. Curva de rarefação das amostras do trato respiratório de aves saudáveis e aves
diagnosticadas com colibacilose.
4.4. Análise de diversidade alfa através do número de OTUs
Um total de 367 OTUs bacterianas foi identificado em ambos os grupos experimentais. Em seis aves saudáveis obteve-se 153,5 ± 64,22 (média± desvio padrão). Em quatorze aves doentes o valor foi de 101,57 ± 58,43 (Tabela 7). Não houve diferença significativa pelo teste t (p = 0,0935).
Tabela 7. Número de OTUs. Número médio e desvio padrão de OTUs por amostra de aves saudáveis e aves
diagnosticadas com colibacilose.
Amostragem OTUs (média ± desvio padrão)
Saudáveis 153,5 ± 64,22
Doentes 101,57 ± 58,43
Foi notado que os valores de riqueza (índice de Chao1) e diversidade (índice de Shannon) apresentaram uma tendência de serem maiores para as amostras de aves saudáveis em comparação com as aves doentes. Entretanto, quando os valores de ambos os índices são
analisados estatisticamente, nota-se que não há diferença significativa entre os grupos experimentais (Tabela 8).
Tabela 8. Índice de Chao1 e índice de Shannon. Resultados do cálculo de riqueza pela análise de índice de
Chao1 e diversidade pelo Índice de Shannon, para as amostras de aves saudáveis e doentes.
Amostragem Índice de Chao1 Índice de Shannon
Saudáveis 184,4 ± 69,2 3,12 ± 0,71
Doentes 127,16 ± 62,30 2,30 ± 0,86
p = 0,0847 p = 0,0567
4.5. Descrição dos táxons nos grupos de aves saudáveis e doentes
Foram identificados um total de 7 filos em ambos os grupos experimentais. O filo com maior abundância relativa em aves saudáveis foi Firmicutes. Enquanto, em aves diagnosticadas com colibacilose foram os filos Proteobacteria e Fusobacteria (Figura 7).
Figura 7. Filos bacterianos. Filos bacterianos presentes em amostras do trato respiratório frangos. (A) Amostras
de aves doentes e (B) amostras de aves saudáveis.
Em relação aos gêneros, na análise obteve-se que 44 OTUs bacterianas estavam associadas as amostras de aves saudáveis e 3 OTUs a aves doentes (Figura 8). Os gêneros mais comuns (maior presença de reads entre todas as amostras do trabalho) encontrados em amostras
de aves doentes, foram Eschericha/Shigela (OTU_1) e Lactobacillus (OTU_29), com uma abundância de 36,6 e 50,3 vezes em relação às aves saudáveis, respectivamente (Tabela 9). Em amostras de aves saudáveis o gênero mais presente foi Staphylococcus, (OTU_4, OTU_16, OTU_50 e OTU_78) (Tabela 10).
Figura 8. Gêneros bacterianos. Gêneros bacterianos em amostras do trato respiratório frangos mais abundantes
amostras do trato respiratório de (A) aves diagnosticadas com colibacilose e (B) aves saudáveis.
Tabela 9. Microbiota de aves saudáveis. Microrganismos mais abundantes no trato respiratório de aves diagnosticadas com colibacilose (p < 0,01). OTU Abundância
(fold change)
Domínio Filo Classe Ordem Família Gênero
OTU_1 36,3 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Enterobacteriales Enterobacteriaceae Escherichia/Shigella OTU_29 50,3 Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Lactobacillaceae Lactobacillus OTU_17 60,7 Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Methylocystaceae Unclassified
Tabela 10. Microbiota de aves diagnosticadas com colibacilose. Microrganismos mais abundantes no trato respiratório de aves saudáveis (p < 0,01). OTU Abundância
(fold change)
Domínio Filo Classe Ordem Família Gênero
OTU_4 209,2 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Staphylococcus
OTU_16 8,9 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Staphylococcus
OTU_50 707,2 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Staphylococcus
OTU_78 22,8 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Staphylococcus
OTU_10 1
20,1 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Macrococcus
OTU_14 1
22,1 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Staphylococcaceae Unclassified
OTU_13 6368,2 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae_1 Unclassified
OTU_28 0
190,1 Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae_1 Unclassified
OTU_33 8
59,2 Bacteria Firmicutes Unclassified Unclassified Unclassified Unclassified
OTU_63 18,3 Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Corynebacteriaceae Corynebacterium OTU_14 2390,7 Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Hydrogenophilale
s
Hydrogenophilaceae Hydrogenophilus OTU_27
5
119,3 Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Hydrogenophilale s
Hydrogenophilaceae Hydrogenophilus OTU_81 166,5 Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Hydrogenophilale
s
Hydrogenophilaceae Tepidiphilus OTU_20
5
67,0 Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Burkholderiales_incertae_sedis Tepidimonas OTU_37 465,5 Bacteria Synergistetes Synergistia Synergistales Synergistaceae Thermanaerovibrio OTU_48 29,6 Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Nocardiopsaceae Nocardiopsis OTU_83 13,9 Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Nocardiopsaceae Nocardiopsis
OTU_79 51,4 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Bacteroidaceae Bacteroides
OTU_97 31,3 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Bacteroidaceae Bacteroides
OTU_44 855,6 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Porphyromonadaceae Barnesiella OTU_69 299,4 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Porphyromonadaceae Barnesiella OTU_56 124,2 Bacteria Proteobacteria Epsilonproteobacteri
a Campylobacterale s Helicobacteraceae Helicobacter OTU_10 6
79,9 Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Desulfovibrionale s
Desulfovibrionaceae Bilophila OTU_13
7
23,4 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Lachnospiraceae Clostridium_XlVa
OTU_11 7
41,4 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Lachnospiraceae Blautia
OTU_88 111,0 Bacteria Bacteroidetes Unclassified Unclassified Unclassified Unclassified
OTU_18 1
48,4 Bacteria Bacteroidetes Unclassified Unclassified Unclassified Unclassified
OTU_13 2
58,0 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Rikenellaceae Alistipes
OTU_17 4
52,5 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Rikenellaceae Alistipes
OTU_19 2
40,4 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Rikenellaceae Alistipes
OTU_18 9
55,8 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Rikenellaceae Alistipes
OTU_95 31,8 Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Micrococcaceae Rothia
OTU_96 175,2 Bacteria Unclassified Unclassified Unclassified Unclassified Unclassified
OTU_17 9
29,9 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Ruminococcaceae Pseudoflavonifractor OTU_23
9
37,3 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Ruminococcaceae Unclassified
OTU_15 8
20,3 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Ruminococcaceae Unclassified
OTU_13 3
75,0 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Unclassified Unclassified
OTU_13 8
129,4 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Unclassified Unclassified
OTU_14 0
54,9 Bacteria Verrucomicrobia Verrucomicrobiae Verrucomicrobial es
Verrucomicrobiaceae Akkermansia OTU_17
8
43,5 Bacteria Firmicutes Clostridia Clostridiales Ruminococcaceae Unclassified
OTU_16 2
21,1 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales Porphyromonadaceae Parabacteroides OTU_19
1
4.6. Descrição de gêneros entre aves saudáveis e doentes
Ao analisar estatisticamente cada um dos 26 gêneros identificados em relação a sua presença nos grupos de aves saudáveis e doentes, obteve-se que 22 gêneros foram estatisticamente significativos (q<0,05). Os 19 gêneros presentes em aves saudáveis foram: Barnesiella, Tepidiomonas, Tepidiphilus, Nocardiopsis, Staphylococcus, Helicobacter, Clostridium, Akkermansia, Thermanaerovibrio, Weissella, Bilophila, Macrococcus, Parasutterella, Pseudoflavonifractor, Alistipes, Gallibacterium, Blautia, Hydrogenophilus e Facklamia. Enquanto em aves doentes foram Escherichia/Shigella, Listeria, Propionibacterium. Os q-valores e a distribuição das amostras de ambos os grupos são apresentados na figura 9.
Figura 9. Distribuição de gêneros por grupo amostral. Distribuição gráfica com base na presença relativa
normalizada (q-valor) do gênero em cada amostras de aves saudáveis e doentes. Amostras em vermelho referentes a aves diagnosticadas com colibacilose. Amostras em azul referente a aves saudáveis.
5. DISCUSSÃO
Os pulmões de indivíduos saudáveis foram considerados, por muito tempo, locais livres de microrganismos. Entretanto, recentemente, através do uso de técnicas de identificação de microrganismos independentes de cultivo pode-se verificar que os pulmões possuem uma microbiota residente (Dickson et al., 2016). Em estudos recentes, Shabbir et al., (2015) e Glendinning et al., (2018) demonstraram por métodos independentes de cultivo, a variação da presença e diversidade bacteriana nas vias áreas de aves em relação ao tempo de vida e local de criação. Por sua vez, o presente trabalho visou identificar e comparar o microbioma do trato respiratório de aves saudáveis e aves diagnosticadas com colibacilose utilizando sequenciamento do gene 16S rRNA, bem como traçar o perfil genômico de APEC em aves diagnosticadas com colibacilose.
A amostragem de fragmentos de pulmão e traqueia de aves saudáveis e aves diagnosticadas com colibacilose em frigoríficos foi realizada pelos veterinários do Serviço de Inspeção Federal Ricardo Vinicius Santana e Izabelle Silva Rehfeld, os quais utilizaram os mesmos critérios de avaliação de lesões de colibacilose para condenação parcial ou total das carcaças. Assim, diante a ausência e presença dos critérios as aves foram classificadas como saudáveis e doentes, respectivamente.
Em laboratório, observou-se que 80% das amostras de aves saudáveis apresentaram colônias típicas de E. coli em ágar MacConkey. Embora no momento da coleta tenha sido escolhida apenas aves sem sinais clínicos de colibacilose, uma possível hipótese para a alta frequência seria as aves serem hospedeiras assintomáticas de APEC. Embora, não se tenha informação sobre o comportamento latente de cepas de APEC no trato respiratório de frangos, é possível que esse patógeno tenha comportamento semelhante às cepas de Mycoplasma gallisepticum (Couto et al., 2015; McMartin, 1968), que são caracterizadas por frequentemente causarem infecção assintomática.
Outra possibilidade seria o ambiente altamente contaminado da sala de abate de frangos. A contaminação dos frigoríficos ocorre a partir da ruptura e exposição do conteúdo presente no sistema gastrointestinal dos animais (Stromberg et al., 2017). Estirpes de ExPEC são capazes de colonizar assintomaticamente o trato intestinal (Wold et al., 1992). Stromberg et al., (2017) reportou que de 304 isolados de E.coli provenientes de fezes frangos, 175 isolados continham genes de virulência associados à ExPEC de humanos ou à APEC. Assim, é possível que as amostras tenham sido contaminadas no momento da coleta, uma vez que essa foi realizada no ambiente aberto da linha de evisceração dos frigoríficos, na qual, as aves têm a
região ventral aberta pela mesma lâmina de corte e ficam com os órgãos exposto na linha até o momento da seleção e corte das carnes. Embora o processo de descontaminação dos fragmentos coletados (através da lavagem com PBS) tenha sido realizado, é possível que tal procedimento não tenha sido eficiente o suficiente para remover toda a contaminação em todas as amostras. Devido a essa possibilidade de contaminação do ambiente de coleta ou presença assintomática de APEC, determinou-se que as amostras com detecção de E. coli em ágar MacConkey seriam eliminadas do grupo de aves saudáveis.
Nas aves diagnosticadas com lesões de colibacilose era esperado o crescimento de colônias típicas de APEC em ágar MacConkey. A confirmação molecular do diagnóstico de colibacilose nas amostras de aves doentes foi realizado com base no estudo de Johnson et al., (2008) que após a investigação de 46 genes de virulência, concluiu que os 5 genes iutA, iss, ompT, iroN e hlyF são capazes de distinguir APEC de cepas de E.coli fecal. Assim, delineou-se que para a confirmação molecular as amostras deveriam delineou-ser positivas para os 5 genes de virulência testados, garantindo que o estudo fosse conduzido com amostras contendo isolados de APEC.
Uma baixa quantidade de biomassa bacteriana proveniente de fragmentos de pulmão e traqueia (trato respiratório inferior) ficou evidente ao se obter 1) uma ampla diferença entre o valor mínimo e máximo de reads em ambos os grupos experimentais e 2) baixa cobertura de diversidade de acordo com a curva de rarefação. Embora os avanços tecnológicos moleculares permitam o acesso a bactérias até então não cultiváveis pelos métodos tradicionais, é válido ressaltar que a região de estudo/amostra influencia na quantidade e qualidade da amostragem. A dificuldade de acesso ao microbioma do trato respiratório é devido a presença de uma pequena biomassa bacteriana (Charlson et al., 2012). Ao contrário da alta biomassa bacteriana obtida por exemplo, de regiões com o trato intestinal, cavidade oral e trato genital, amostragem provenientes do trato respiratório é caracterizada pela baixa biomassa bacteriana. Em pulmões de humanos, estima-se que lavados broncoalveolar apresentam um log de 4,5 a 8,25 cópias/mL (Erb-Downward et al., 2012). Além disso, o trato respiratório é composto por uma microbiota que descresse em quantidade de biomassa bactéria do trato respiratório superior para o trato inferior. Segundo Charlson et al., (2012), a comunidade presente nos pulmões, em humanos, é de 2 a 4 log menor em biomassa quanto comparado com a quantidade observada na via aérea superior, resultado que corrobora com o obtido no presente estudo.
A análise de alpha diversidade, pela comparação do número de táxons distintos presentes dentro de um mesmo grupo e entre os dois grupos experimentais realizado através do índice de Chao1 (riqueza) e Shannon (diversidade), demonstrou que não há diferença
significativa entre os grupos de aves saudáveis e doentes. A riqueza é baseada na quantidade de OTUs raras presentes nas amostras. Assim, quanto maior o índice, maior o número de OTUs raras. O cálculo do índice de diversidade leva em consideração a abundância e o número de OTUs presentes em uma amostra. O aumento do índice de Shannon indica o aumento da riqueza de espécies e uniformidade e, portanto, diversidade. O baixo número de reads por amostra, prejudicou a cobertura da diversidade microbiana, como foi possível verificar na curva de rarefação. O número médio de OTUs por grupo experimental, também não apresentou diferença significativa. Por consequência, é provável que os resultados obtidos para o índice de Chao1 e Shannon tenham sido influenciados uma vez que a riqueza e diversidade das microbiotas avaliadas não foram completamente acessadas.
Embora, de acordo com os parâmetros estatísticos estabelecidos não tenha sido notado uma diferença significante, é válido observar que há uma tendência dos valores obtidos. Para os três resultados apresentados (número médio de OTUs, índice de Chao1 e índice de Shannon), os valores foram maiores para o grupo de aves saudáveis em comparação com os valores do grupo de aves doentes. Alguns estados patológicos levam a perda de diversidade, com o aumento da concentração de alguns gêneros bacterianos em detrimento de outros. A presença de doença pulmonar aguda ou crônica altera dramaticamente as condições necessárias para o crescimento microbiano (Dickson et al., 2016), bem como a diversidade microbiana presente no trato respiratório (Wang et al., 2016). Conforme a doença pulmonar se torna mais severa, a composição do microbioma se torna mais dependente das condições de cada região dos pulmões e das taxas de replicação dos microrganismos. A inflamação do trato respiratório leva a um incremento da produção de muco. A presença de muco faz com que certas regiões do trato respiratório apresentem baixa pressão de oxigênio e aumento de temperatura, favorecendo a multiplicação de certos microrganismos em detrimento de outros (Dickson et al., 2016). Tal condição, corrobora para explicar a tendência de diminuição da riqueza e diversidade microbiana presente no trato respiratório de aves diagnosticadas com colibacilose.
A tendência que indica a diferença entre as microbiotas de aves saudáveis e aves diagnosticadas com colibacilose é reforçada ao se observar a composição dos filos e gêneros. Em relação aos filos, nota-se que o filo Firmicutes, foi o mais abundante em amostras de aves saudáveis, enquanto em aves doentes os filos predominantes foram Proteobacteria e Fusobacteria. Ao nível de gênero, é notável que o grupo de aves saudáveis é composta por 19 dos 22 gêneros estatisticamente significantes em relação a sua presença individual em ambos os grupos experimentais. Dessa maneira, esses dados reforçam a tendência apresentada
