UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
FATORES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli PATOGÊNICA PARA AVES
Tatiane Martins Rocha Orientadora: Prof. Dra. Maria Auxiliadora Andrade
GOIÂNIA 2010
TATIANE MARTINS ROCHA
FATORES DE VIRULÊNCIA DE Escherichia coli PATOGÊNICA PARA AVES
Seminário apresentado junto à Disciplina Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Goiás.
Nível: Doutorado
Área de Concentração Sanidade Animal, Higiene e Tecnologia de Alimentos
Linha de Pesquisa Etiopatogenia, Epidemiologia, Diagnóstico e Controle das doenças infecciosas dos animais
Orientadora Prof. Dra. Maria Auxiliadora Andrade -UFG
Comitê de orientação Prof. Dra Cíntia Silva Minafra e Rezende - UFG Prof. Dr. José Henrique Stringhini - UFG
GOIÂNIA 2010
SUMÁRIO
1.INTRODUÇÃO--- 1
2. REVISÃO DE LITERATURA--- 3
2.1 IMPORTÂNCIA DA APEC EM SAÚDE PÚBLICA--- 5
2.2 SOROGRUPOS DE E. coli--- 6
2.3 Fatores de Virulência--- 9
2.4 Resistência a antimicrobianos de amostras APEC--- 16
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS--- 20
REFERÊNCIAS--- 21
1. INTRODUÇÃO
E. coli é um bastonete Gram negativo, não esporulado, oxidase negativa, móvel por flagelos peritríquios ou imóvel (MOREIRA, 2007). Estas bactérias estão presentes no trato gastrintestinal dos animais, constituindo parte da microbiota normal do trato intestinal de humanos e de uma de variedade de animais (KASNOWSKI, 2004). Porém cepas de E. coli patogênica para aves (APEC) são responsáveis por vários processos patológicos nas aves (MELLATA et al., 2003).
Infecções causadas por estas bactérias, denominadas de colibacilose avícola, transformaram-se em ameaça econômica à produção de aves no mundo (ANTÃO et al., 2008), pelo fato de desencadearem níveis significativos de mortalidade e morbilidade na indústria avícola (SKYBERG et al., 2003). Na espécie avícola, as amostras de APEC, são responsáveis por uma doença sistemática que começa com infecção do trato respiratório e evolui para septicemia, com colonização de órgãos internos, como coração, fígado, baço (MOULIN-SCHOULEUR et al., 2007).
Um fator contribuinte para desenvolvimento da doença é que a produção intensiva no setor avícola possibilita a ocorrência e a disseminação de agentes infecciosos no trato respiratório (MINHARRO et al., 2001). A indústria avícola é viável apenas por meio da criação em alta densidade. Como consequência, a qualidade do ar respirado piora causando lesão do trato respiratório que propiciam condições ideais para a instalação e a multiplicação de agentes infecciosos (GAMA, 2004).
Desta forma, é necessário considerar que fatores ambientais como altas concentrações de amônia no galpão, deficiência na ventilação de ambientes avícolas, variações climáticas, umidade da cama, criações com alta densidade e deficiência no processo de desinfecção são fatores de risco para disseminação deste patógeno e devem ser avaliados para promoção de medidas de controle eficazes (ANDREATTI FILHO, 2006).
Apesar da importância conferida a enfermidade, pouco se conhece sobre os mecanismos de virulência das cepas APEC. Fatores de virulência têm sido associados à patogenicidade de Escherichia coli em aves, mas nenhum gene específico da virulência foi identificado como sendo inteiramente responsável pela sua patogenicidade (SKYBERG et al., 2003; ANTÃO et al., 2008). Cepas patogênicas desta bactéria são responsáveis promovem doenças nos seres humanos e animais, incluindo infecções de aparelho urinário, a meningite neonatal, septicemia e pneumonia, constituindo-se desta forma questão de saúde pública (RUSSO E JOHNSON, 2003).
Este fato é agravado pela circunstância de que a E. coli poder tornar-se resistente a antimicrobianos utilizados na terapêutica de algumas doenças. Esta resistência pode ser transferida para outros membros da família Enterobacteriaceae dificultando o tratamento das enfermidades causadas por estas bactérias, tanto no homem como nos animais (SHERLEY et al., 2004;
COSTA, 2007).
Diante do exposto, o presente trabalho visa abordar os principais fatores de virulência, o efeito do uso indiscriminado de antimicrobianos, em isolados de APEC, além de destacar a importância desta bactéria em saúde pública.
2. REVISÃO DE LITERATURA
Escherichia coli é uma bactéria pertencente à família das Enterobateriacea, considerada um dos integrantes da microbiota intestinal de animais e humanos (PIATTI & BALDASSI, 2007). Este microrganismo geralmente é eliminada nas fezes das aves e a colonização do trato intestinal ocorre logo após o nascimento, permanecendo como componente importante da microbiota normal do intestino por toda a vida do seu hospedeiro (MOREIRA, 2007).
Porém, além das cepas comensais, existem cepas de E. coli patogênica para aves (APEC) que são responsáveis por vários processos patológicos extra-intestinais e que podem atuar como agente primário ou secundário (PIATTI & BALDASSI, 2007).
Por essa característica de causar infecções extra-intestinais e respiratórias, é considerado um patógeno relevante, pois contribui para o agravamento de doenças (TIVENDALE et al., 2004). Sendo então apontado como um dos principais agentes bacterianos da aerossaculite e de quadros septicêmicos (MINHARRO et al., 2001).
Ressalta-se que na maior parte dos casos, os problemas respiratórios diagnosticados em frangos de corte não envolvem apenas um agente. Diversos patógenos podem estar implicados com as enfermidades respiratórias em frangos, porém a E. coli participa com freqüência de tais enfermidades. Os vírus respiratórios, os imunossupressores, os fungos e as bactérias se relacionam de modo complexo o que facilita a invasão no trato respiratório pela E. coli (NASCIMENTO, 2000).
Como a colibacilose é iniciada no trato respiratório pela colonização da traquéia, sacos aéreos e pulmão, consequentemente os mecanismos de defesa preliminares do hospedeiro, incluem a filtragem aerodinâmica, defesa mucociliar e fagocitose. O Trato Respiratório superior é o principal alvo para doenças virais ou bacterianas das aves domésticas. O tecido linfóide brônquio-associado (BALT) no pulmão está ausente em aves recém-eclodidas, porém amadurecem gradualmente de 5 a 8 semanas de idade. São organizados em áreas de células
B e de célula T e são responsáveis por grande parte da imunidade das aves (REESE et al., 2006).
Embora o exato mecanismo que conduz à entrada das bactérias na circulação sanguínea não seja conhecido precisamente (CHOUIKHA et al., 2008), estudos histopatológicos demonstram que o principal local de entrada é o pulmão de aves, onde numerosos capilares sanguíneos são encontrados (POURBAKHSH et al., 1997a). E após a colonização do trato respiratório, as bactérias entram na circulação sanguínea e invadem órgãos tais como o fígado e baço. A septicemia frequentemente gera a morte do animal.
No caso de graves infecções causadas por esta bactéria, como meningite e septicemia, a entrada na circulação sanguínea, sobrevivência e multiplicação no sangue e em órgãos são etapas essenciais para desenvolvimento da doença em aves. Em aves, esta bactéria após invadir a circulação, determina uma síndrome complexa, denominada colibacilose, caracterizada por lesões em múltiplos órgãos com quadros de septicemia, aerossaculite, perihepatite, pericardite, salpingite, onfalite, celulite, síndrome da cabeça inchada, panoftalmite, artrite, problemas respiratórios severos e até morte (LAMARCHE et al., 2005).
Achados patológicos oriundos destas lesões, representam perdas consideráveis em abatedouros, principalmente quando a lesão é extensa, já que ocorre a condenação de vísceras e carcaças (BRASIL, 1998b).
Aliado a isso, aves com colibacilose podem apresentar menor conformação de carcaça, ocasionar uma série de falhas tecnológicas durante o abate, como cortes no trato digestivo, pois os equipamentos na linha de abate não se ajustam ao menor tamanho das carcaças. Este erro tecnológico leva a um aumento no percentual de contaminação fecal das carcaças e, portanto maior risco de contaminação das mesmas por bactérias patogênicas. Vários estudos têm demonstrado a associação entre a presença de aerossaculite e o aumento da microbiota bacteriana patogênica em lotes de frangos (RUSSEL, 2003).
2.1 E. coli PATOGÊNICA PARA AVES E SAÚDE PÚBLICA
Além da circunstância de cepas APEC gerarem doenças nas aves, outro fator de grande relevância se relaciona ao papel desempenhado por esta bactéria na saúde pública. A maior parte dos sorotipos de E. coli isolados de galinhas são patogênicos somente para aves, não causando infecção no homem, nem em outros mamíferos (MENÃO et al., 2002).
Porém, alguns isolados de lesões de aves têm uma semelhança genética com aqueles que causam enfermidades em humanos. Esta estreita relação é motivo de investigação sobre a doença, pois pode constituir risco a saúde do consumidor (ANDRADE, 2005). São vários estudos que sugerem a possibilidade de APEC estar relacionada a infecções extraintestinais em seres humanos (JOHNSON et al., 2007; EWERS et al., 2007).
As amostras avícolas mostram muitas similaridades com as humanas, sendo que a maioria dos genes de virulência possui similaridade àquelas identificadas em doenças causadas por extra-intestinais em humanos. Dentre estas, destacam-se as infecções do trato urinário, tecidos moles, meningite em recém-nascido e pneumonia. A importância desta bactéria em humanos é relatada pelo fato de que quase 80% das infecções do trato urinário são causados por cepas extra-intestinais e que a mesma é normalmente isolada de forma relevante em amostras de sangue (RUSSO & JOHNSON, 2003).
Salienta-se ainda, que as APEC partilham não somente idênticos fatores de virulência com as E. coli patogênicas para humanos, mas também sorotipos específicos, portanto seu potencial zoonótico deve ser considerado (EWERS et al., 2003).
Além disso, estudos demonstram que amostras de APEC podem pertencer ao mesmo clone que amostras de E. coli humana (MOULIN- SCHOULEUR et al., 2007; JOHNSON et al., 2007). A entrada de APEC em células epiteliais do pulmão de aves foi detectado por autores que usam técnicas da microscopia eletrônica (POURBAKHSH et al., 1997b) e assemelha-se ao que é observado em células microendoteliais de cérebro humano nos casos de meningite causadas por Escherichia coli (KIM et al., 2001).
CHANTELOUP et al. (2010) encontraram que uma amostra de E. coli extra-intestinal de origem avícola com capacidade de aderir e invadir pneumócitos humanos e hepatócitos aviários. A bactéria invadiu hepatócitos com maior eficiência do que pneumócitos. Esta diferença observada com relação à invasão de células específica pode estar relacionada ao tipo celular e/ou à origem da espécie das amostras. O importante é que este trabalho reforça os estudos precedentes e demonstram a proximidade filogenética amostra de APEC de origem avícola e humana e que indicam que esta cepa poderia representar um risco zoonótico (MOULIN-SCHOULEUR et al., 2007).
2.2 SOROGRUPOS DE E. coli
As cepas de E. coli são divididas em patótipos com base nas diferentes síndromes e características da enfermidade causada por este patógeno. Esses sorovares são classificados nos patótipos (QUADRO 1): Enteropatogênicos (EPEC), enterotoxigênicos (ETEC), enteroinvasivos (EIEC), enterohemorrágicos (EHEC), difusamente aderente (DAEC), neonatal (NMEC) e uropatogênicos (UPEC) (GERMANO & GERMANO, 2008).
A estrutura da E. coli patogênica para aves (APEC) é composta de segmentos antigênicos que contribuem para a diferenciação sorológica dos sorotipos de E. coli, baseada na identificação dos antígenos flagelares (H), capsulares (K), somáticos (O) e fimbrias (F) (FERREIRA & KNÖBL, 2009).
Os antígenos flagelares embora sejam auxiliares na locomoção bacteriana, não são utilizados com freqüência na identificação antigênica das amostras de E. coli, e a presença de flagelo não tem sido correlacionada com patogenicidade (FERREIRA & KNÖBL, 2009). Os antígenos capsulares K, por sua vez, possuem polissacarídeos capsulares que protegem a membrana externa da parede do ataque do sistema complemento e impedem a fagocitose (MOREIRA, 2007). Estudos sugerem que cápsulas K1, estão associadas com a resistência sérica ao sistema complemento e colonização de órgãos internos (MELLATA et al., 2003).
Já o antígeno somático “O” é constituído de uma cadeia de polissacarídeo que se projeta para o espaço extracelular e cuja composição é extremamente variável entre as bactérias da mesma espécie. Sendo que esta estrutura determina a existência de vários sorogrupos (FERREIRA & KNOBL, 2009).
QUADRO 1 – Características de virulência dos principais patotipos de Escherichia coli.
Patótipo Patologia Características De Virulência EPEC
enteropatogênica
Diarréia em humanos e animais
Presença do gene eae que determina um padrão de aderência por attaching and effacing.
Sorogrupos específicos: 055; 086; 0111; 0114;
0119; 0125; 0126; 0127; 0128; 0142.
ETEC
enterotoxigênica
Diarréia em humanos e animais
Produção de toxinas ST (termo estável) e LT (termo lábil). Sorogrupos específicos: 06, 08, 015, 025; 027; 078; 0128.
EIEC
enteroinvasora
Diarréia em humanos e animais
Plasmídio de virulência
Invasão e proliferação em células epitelial Sorotipos específicos: 028ac; 0112; 0136; 0143;
0144; 0173.
EHEC
enterohemorrági- ca
Disenteria em humanos e animais.
Doença edema em suínos
Produção de Verocitotoxina (toxina Shiga-like) Presença de gene eae (attaching and effacing) Produção de enterohemolisina Plasmídio Sorotipos específicos: 0157; H7; 0111; 05; 026;
055 e outros EaggEC
enteroagregativa
Diarréia em humanos e animais
Padrão de aderência e em agregados EAST – toxina estável enteroagregativa.
Doença do edema dos suínos: 0138; K81; 0139;
K82; 0141; K85.
UPEC
uropatogênica
Infecções urinárias em humanos e animais (cistite e pielonefrite)
Presença de antígeno capsular (K) Produção de hemolísina
Presença de fímbria P
Sorogrupos específicos: 01; 02; 04; 06; 07; 08;
025; 062; 075.
NMEC-meningite neonatal
Meningite em
crianças recém nascidas
Presença de cápsula K 1 e Fímbrias S.
APEC Doenças extra-
intestinais nas aves
Quadro 2
FONTE: FERREIRA & KNOBL,(2009).
Existem cerca de 170 sorotipos de E. coli. O1, O2, O5 e O78 são considerados sorotipos patogênicos, entre outros (BOPP et al., 2005). Dentre estes, para aves o mais frequente é o O78:K80, que além de infectar as aves,
podem determinar doença em outras espécies animais como humanos (GOPHNA et al.,2001).
Também PIATTI & BALDASSI (2007), com objetivo de detectar sorogrupos de E. coli isolada de frangos com doença respiratória crônica de amostras isoladas em granjas de produção comercial de frangos, verificaram uma prevalência total de 7,79% de E. coli O78:K80 dentre os isolados e de aproximadamente, 1% em órgãos, da região oeste do Estado de São Paulo.
O objetivo de trabalho desenvolvido por PEIGHAMBARI et al.(1995) foi caracterizar cepas de Escherichia coli isoladas de celulite avícola e pesquisar a ocorrência de potenciais fatores da virulência. Em abatedouro, cinco frangos com celulite foram selecionados, de 20 granjas no total, sendo que 100 cepas de Escherichia coli foram caracterizadas. As mesmas propriedades foram determinadas em 25 cepas de E. coli isoladas de fezes de frangos. Concluiu-se que os estoques de Escherichia coli isolados da celulite foram predominantemente dos mesmos grupos (O78, O2), similar a cepas associadas com as doenças septicêmicas e respiratórias em aves (PEIGHAMBARI et al., 1995).
Em estudo conduzido por MENÃO et al. (2002), com objetivo de detectar sorogrupos de E. coli isolada de frangos com doença respiratória crônica de amostras isoladas em granjas de frangos no Estado de São Paulo, foram isoladas 88 espécimes desta bactéria. Destas, verificou-se os sorogrupos O2, O21, O36, O45, O50, O78, O88, O119, sendo que 21 amostras (23,86%) pertenciam ao sorogrupo O78 e 13 delas (14,77%) pertenciam ao sorogrupo O2.
E KNOBL et al. (2008), com objetivo de detectar sorogrupos de E. coli isolada de aves identificaram seis sorogrupos distintos: O23; O54; O64; O76;
O128 e O152. Enquanto, SCREMMER et al. (1999), identificaram em aves os sorogrupos O110, O63, O131 e O15.
Embora a distribuição e a frequência dos sorogrupos possam variar devido a fatores geográficos e temporais (YANG et al., 2004), deve-se ressaltar que cepas de E. coli O78 patogênicas e O157: H7 de origem animal representam alto risco de infecções para humanos (ADIRI et al., 2003).
O sorogrupo O157: H7, é enquadrado no patótipo EHEC e sua importância se deve principalmente ao fato que durante o abate, ocorre a contaminação de carcaças em plantas com condições higiênico-sanitárias precárias, e esta é apontada como uma das principais fontes de contaminação por E. coli O157:H7 em carnes (GERMANO & GERMANO, 2008).
Este sorogrupo tem emergido como causa de graves manifestações clínicas de colite hemorrágica, trombocitopenia e distúrbios renais no homem, freqüentemente fatais em crianças. Estudos epidemiológicos relacionam os casos de doença humana pelo sorotipo O157: H7, com o consumo de produtos de origem animal. Alguns pacientes podem apresentar grave acometimento renal denominado síndrome urêmica hemolítica, provocado por lesões no endotélio vascular renal, atribuídas à ação de verotoxinas absorvidas no epitélio intestinal (RIBEIRO ET AL., 2006).
A verotoxina é uma proteína codificada por um gene cromossômico facilmente transferido por bacteriófagos para cepas de E. coli (ROBINS-BROWNE
& HARTLAND, 2002). É mediadora das complicações sistêmicas das infecções causadas por EHEC e também induz lesões no epitélio intestinal, ao qual a bactéria adere intimamente à superfície apical dos enterócitos através da formação de pedestais e destruição das microvilosidades (NATARO & KAPER, 1998).
Por isso, é necessário o rígido controle durante o processamento de alimentos, visto que os de origem avícola estão envolvidos também na veiculação deste patótipo (NASCIMENTO &STAMFORD, 2000).
2.3 Fatores de virulência
Amostras patogênicas de E. coli, muitas vezes auxiliadas por condições ambientais ou outros agentes infecciosos, atuando como fatores predisponentes, acabam determinando a invasão do sistema respiratório pela bactéria (ANDREATTI FILHO, 2006). A severidade do quadro anatomopatológico depende do potencial de virulência do agente que é determinado pelo conjunto de
genes localizado nas ilhas de patogenicidade (PAIs) (KARIYAWASAM et al., 2006). Essas estruturas são constituídas de segmentos de DNA inseridos no cromossomo bacteriano que possuem mecanismos de virulência determinados pelos genes que o microrganismo em questão possui (VIEIRA, 2009).
O mecanismo de virulência das amostras de Escherichia coli potencialmente patogênicas para aves (APEC) têm sido continuamente estudado e acredita-se ser multifatorial. Certas propriedades associadas a amostras virulentas vêm sendo identificadas em amostras de E. coli isoladas de aves (ROCHA et al., 2008; KNÖBL et al., 2008).Em exame de microscopia eletrônica, bactérias dos isolados mais patogênicos, foram observadas frequentemente associadas com ou dentro dos macrófagos, nos sacos aéreos e nos pulmões (POURBAKHSH et al., 1997a).
A adaptação ao hospedeiro e a virulência de alguns patótipos de E. coli são atribuídos à aquisição horizontal de genes específicos por cepas não patogênicas que, então, tornam-se patogênicas (DOZOIS et al., 2003). GINNS et al. (2000) isolaram a cepa de E. coli em surto de doença respiratória em frangos de corte. Ao inocularem suspensões desta bactéria por via respiratória, as aves desenvolveram uma doença semelhante a que ocorreu em campo, se tornando patogênicas.
ANTÃO et al. (2008), conduziram experimento com aves SPF inoculadas via traquéia com amostra de APEC (O2: K1: H5) com diferentes doses. Dois modelos representaram as etapas cruciais na patogênese de infecções por APEC, incluindo a colonização do epitélio do pulmão e a propagação das bactérias pela circulação sanguínea. Os dados obtidos demonstraram a ocorrência de lesão nos órgãos 24 horas após a inoculação da cepa patogênica, significativamente mais elevada em comparação àqueles vistos nas aves contaminadas com cepas não patogênicas, demonstrando desta forma, a importância dos fatores de virulência para ocorrência de colibacilose.
O fato é que a E. coli está presente na microbiota de aves sadias, por isso, faz-se necessário a diferenciação de amostras patogênicas de não patogênicas. A identificação dos fatores de virulência das APEC colabora para o conhecimento dos seus mecanismos de patogenicidade (GONÇALVES, 2005).
Estudos envolvendo cepas de APEC (QUADRO 2) apontam os fenômenos de endotoxinas, aderência bacteriana, crescimento em restrição do íon ferro, e a resistência sérica como principais responsáveis pela patogenia da doença (KNÖBL et al., 2008; FERREIRA & KNÖBL, 2009).
QUADRO 2 – Fatores de virulência associados a amostras de E. coli isoladas de aves (APEC).
Fator de virulência Referência Bibliográfica Sorogrupos 01, 02, 021, 036, 045, 078 Blanco et al., 1998
Presença de cápsula K1, K80 Pourbakhsh et al., 1997; Jann & Jann, 1997
Produção de Sideróforos (Aerobactina) Dho-Moulin & Fairbrother, 1999 Presença de fímbrias (fímbria P, S,
Tipo1)
Vidotto et al., 1997; Knobl, 1999 Endotoxina (LPS) Hewtt & Roth, 1993
Resistência sérica Dho-Moulin & Fairbrother, 1999.
FONTE: FERREIRA & KNÖBL, (2009).
2.3.1 Endotoxinas e aderência bacteriana
As endotoxinas da APEC são importantes na patogenia da colibacilose sendo importantes em doenças respiratórias e síndrome da cabeça inchada das aves (CARDOSO ET AL., 2002). O fato desta bactéria ser Gram negativa, faz com que ocorra liberação de complexos lipopolissacarídeos de suas paredes celulares durante a lise. Estas endotoxinas podem causar febre e morte caso a E.
coli migre do intestino para a corrente sanguínea (MOREIRA, 2007).
Outro importante fator envolvido na colonização é a aderência bacteriana, geralmente mediada por adesinas fimbriais manosesensíveis (pili tipo I) e manoseresistentes (fímbrias P e S) (KNÖBL et al., 2006). Os antígenos fimbriais (F) são denominados pelos termos adesinas, pili ou fímbrias, e correspondem a moléculas de natureza protéica, que recobrem a superfície
bacteriana, capazes de reconhecer receptores específicos na superfície de células eucarióticas (FERREIRA &KNÖBL, 2009).
A colonização se inicia por essas adesinas fimbriais. Dois grupos principais de fímbrias, F1 (tipo 1) e P, são associados com APEC. As fímbrias F1, codificadas por genes pil são encontrados geralmente em isolados comensais e patogênicos de Escherichia coli não estando relacionada à invasão das células CHANTELOUP et al. (2010). As Fímbrias P são codificadas pelo pap, prs, ou por gene relacionado ao conjunto (DOZOIS et al., 1995). Uma variação sorológica de fímbrias P foi expressa por amostras de Escherichia coli isoladas de aves com septicemia. As adesinas provavelmente mediam o reconhecimento inicial das células da traquéia pela bactéria (VIDOTTO et al., 1997).
Estudo abordando a expressão de genes da virulência de APEC, verificaram que a fímbria tipo 1 tem sido relacionada a colonização do trato respiratório superior, enquanto a expressão da fímbria P está associada a etapas posteriores da infecção, incluindo colonização dos órgãos internos (DOZOIS et al., 1994).
Esta afirmativa foi encontrada em trabalho conduzido por POURBAKHSH et al. (1997). Com intuito de investigar mecanismos da virulência de APEC, efetuou a inoculação em aves via saco aéreo torácico caudal esquerdo com cepas patogênicas e menos patogênicas de Escherichia coli. Seis horas após a inoculação, todos os isolados haviam colonizado o trato respiratório (traqueia, pulmões, e sacos aéreos) e órgãos internos (fígado, baço, e rins), sendo que as bactérias foram recuperadas do líquido pericardial e do sangue somente de aves inoculadas com isolados mais patogênicas. As fímbrias F1 foram expressas em elevada proporção em bactérias que colonizaram a traquéia.
As fímbrias P foram identificadas em bactérias presentes nos sacos aéreos, em pulmões, nos rins, sangue, e coração de aves inoculadas com o isolado mais virulento.
Também VIDOTTO et al. (1997), com o objetivo de verificar a função destes dois tipos fimbriais, investigou a aderência de cepas de APEC isoladas em Londrina (Brasil), às células traqueais de aves. 50 cepas de E. coli isoladas foram examinadas para verificar a aderência a células traqueais de aves. 22 amostras
destes foram hemaglutinantes sensíveis à manose (MSHA) de eritrócitos de cobaias, indicando que possuíram somente o pili tipo 1. Sete amostras foram pap+ (Fimbria P, demonstrando uma maior freqüência das fímbrias tipo 1 que tipo P em etapas iniciais de colonização.
Abordando a freqüência de genes relacionados as fímbrias VANDEMAELE et al. (2003) ao pesquisar fatores de virulência, encontraram que 29% das análises foram papG+ (sempre em associação com papC) com associação entre papG e sorotipos O1 e O115, sendo este gene considerado importante nas etapas de colonização.
Também dados do estudo de KNÖBL et al., (2008), mostraram a presença do gene pap em três de oito (37,5%) amostras estudadas. Estes resultados são semelhantes aos descritos por JANBEN et al. (2001) que identificaram 30% de amostras pap+ em isolados de E. coli de aves comerciais.
Destaca-se que a fímbria P é uma adesina manose-resistente frequentemente observada no patótipo UPEC presente em isolados de infecções do trato urinário (cistite e pielonefrite) em humanos. A expressão da fímbria P em E. coli de aves parece estar relacionada à colonização de órgãos internos (fígado e coração) nos estágios mais avançados da colibacilose (POURBAKHSH et al., 1997b).
Investigações confirmam que as fímbrias tipo 1 são as principais adesinas, mas sugerem que outros componentes menores estejam envolvidos igualmente na adesão e na invasão. Estes componentes não foram identificados até agora, porém indicaram que os genes pap que codificam fímbrias P estão envolvidos na adesão e/ou na invasão de células (ANTAO et al., 2009;
CHANTELOUP et al., 2010).
2.3.2 Invasão de células e crescimento em restrição do íon ferro
A capacidade de crescimento em meios sem ferro resulta da produção de substâncias quelantes, denominadas sideróforos. Amostras de E. coli avícolas usualmente seqüestram o ferro através da produção de aerobactina (MONROY et al., 2005). O sistema aerobactina é sistema de aquisição de ferro e é necessário
para o crescimento bacteriano em hospedeiros. Genes iutA estão envolvidos na aquisição de ferro e é conhecido por sua expressão ser induzida durante a infecção das aves, mas a extensão da indução permanece desconhecida (CHOUIKHA et al., 2008).
O gene iutA, codifica uma proteína de membrana externa envolvidas na alta afinidade ligação de Fe3þ-aerobactina. A expressão deste gene depende da disponibilidade de ferro no meio ambiente e é induzida quando há depleção de ferro (ESCOLAR et al., 2000).
Em estudo conduzido por CHOUIKHA et al. (2008) foram utilizadas aves livres de patógenos (SPF), inoculadas via saco aéreo torácico, com intuito de coletar dados para o estudo da expressão de iutA em estirpes de APEC.
Durante a infecção, a expressão dos genes iutA aumentou pelo menos 50 vezes nos sacos aéreos e pulmão três,seis, e 24 horas pós-infecção (P.I.) em comparação com as bactérias cultivadas in vitro.
2.3.3 Resistência sérica ao sistema complemento
A patogenicidade das cepas de Escherichia coli está relacionada à expressão de fatores de virulência encontrados em elementos genéticos denominados plasmídios de virulência. O patótipo APEC, responsável por diferentes tipos de doenças em aves, pode apresentar o gene iss que aumenta a resistência das cepas de E. coli aos efeitos líticos do soro, além da resistência a diversos antimicrobianos (EWERS et al. 2007; ABREU et al., 2010).
A habilidade em resistir aos fatores séricos inibitórios permite que a bactéria escape da ação do sistema complemento e da fagocitose nos processos de infecção sistêmica. A resistência sérica das bactérias tem sido codificada pelo gene iss (MONROY et al., 2005). Este apresenta-se como um relevante mecanismo, apesar de não ser o único mecanismo utilizado por essas bactérias para alcançar os órgãos internos das aves e causar uma infecção (MELLATA et al., 2003). TIVENDALE et al. (2004) ao estudarem cepas de APEC observaram que o gene iss estava associado com altos níveis de virulência.
O gene iss está localizado em um plasmídio conjugativo R, denominado de ColV, com um tamanho aproximado de 100 kilobases, juntamente com outros genes de virulência e de resistência a antimicrobianos. Este plasmídio pode ser transferido, por conjugação, para outras bactérias avirulentas, inclusive outras E. coli (JOHNSON et al.,2006). Através da conjugação, bactérias comensais, inclusive de espécies diferentes, podem se tornar mais patogênicas e resistentes (SKYBERG et al. 2003).
Esse gene codifica a proteína Iss, uma lipoproteína de 10-11 kDa da membrana externa bacteriana, resistente à hidrólise ácida e que contém 102 aminoácidos. (FOLEY et al., 2000). JEFFREY et al. (2002), em seus estudos, sugeriram que cepas de E. coli, associadas com casos de celulite em aves, possuem mecanismos de virulência semelhantes aos observados em cepas associadas a colisepticemia, pois o gene iss foi encontrado por eles em isolados bacterianos de aves com colibacilose e com celulite.
Embora FANTINATTI et al. (1994) tenham demonstrado que a presença do plasmídio, contendo o gene iss, não seja suficiente para determinar a capacidade patogênica de uma cepa de E. coli, este gene pode ser considerado como marcador de virulência, pois, comparado a outros fatores de virulência, o gene iss é citado como o mais prevalente em cepas patogênicas (OZAWA et al 2008). Comparando a presença do gene iss entre aves com manifestações relacionadas à colibacilose e aves saudáveis, o gene iss é mais prevalente nas aves doentes (MCPEAKE et al. 2005). Além disso, esse gene pode ser encontrado com freqüência em cepas extraintestinais isoladas de fontes humanas (EWERS et al. 2007; ABREU, 2010).
SKYBERG et al., (2003), desenvolveram um protocolo para detecção de quatro genes, iss. Utilizou-se 10 cepas de E. coli isoladas de aves que tinham colibacilose e dez de aves aparentemente saudáveis. Nove das aves saudáveis mostraram apenas um dos genes descritos. Oito cepas isoladas de aves doentes tinham três ou mais dos genes estudados.
O objetivo do estudo de GONÇALVES (2005) foi relacionar problemas respiratórios com a presença de Escherichia coli, em frangos de corte bem como verificar a virulência dos isolados de E. coli, pela detecção do gene iss. Foram
utilizados 120 frangos de corte. A interferência de E. coli no peso, nas manifestações respiratórias e nas lesões (aerossaculite, pericardite, traqueíte) encontradas foi significativa. A detecção do gene iss ocorreu em 10,2% (12/118) das aves positivas para E. coli. Os isolados de E. coli iss positivos exibiram resistência a pelo menos 10 dos 20 antimicrobianos testados.
Em trabalho desenvolvido por KNOBL et al., (2008), o gene iss foi detectados em amostras de E. coli (3/8) isoladas de animais com colibacilose. Em estudo conduzido por ABREU et al. (2010) com intuito de detectar E. coli em traquéias de aves destinadas ao abate e avaliar a presença do gene iss nos isolados desta bactéria, verificaram a detecção do gene iss em 55% (11/20) dos isolados.
2.4 Resistência a antimicrobianos de amostras APEC
Um dos grandes interesses na área de saúde pública é a existência de bactérias que colonizam os animais domésticos e que são resistentes a antimicrobianos. A utilização incorreta de antibióticos na medicina humana, o seu uso na alimentação animal com objetivos terapêuticos, profiláticos e de promoção de crescimento são apontados como responsáveis pela presença da resistência aos antibióticos em bactérias patogênicas para o homem (BARTON, 2000).
Sabe-se que a bactéria pode apresentar resistência a uma ou mais classes de agentes antimicrobianos ou pode adquirir resistência, por mutação ou aquisição de genes de resistência de outros microrganismos. Esta aquisição de material genético novo pode ocorrer por conjugação, que facilitam a incorporação de genes de múltipla resistência no genoma do hospedeiro ou plasmídio (McMANUS, 1997).
Outro fator relacionado ao uso de antimicrobianos é que cepas resistentes do trato intestinal podem contaminar as carcaças e desta forma, disseminar genes de resistência para a microbiota humana (VAN DEN BOGAARD et al., 2001). Tem-se ainda o fato de que como sorogrupos de E. coli que causam infecções em aves estão envolvidos com infecções em humanos e sua presença
em carcaças de aves pode constituir risco à saúde do consumidor (ANDRADE, 2005).
A legislação brasileira preconiza algumas medidas em relação ao uso dos antimicrobianos que são consideradas todas as substâncias utilizadas para combater os microrganismos. O período de carência deve ser em conformidade com a forma, a fórmula e a via de administração do produto (BRASIL, 1997). A Portaria n° 193 de 1998 considera a importância do uso adequado dos agentes antimicrobianos em medicina veterinária, no tratamento e na prevenção de doenças, visando à segurança para a saúde pública. Os antimicrobianos utilizados em terapêutica devem ser evitados na indicação de aditivos alimentares, promotores de crescimento ou como conservantes de alimentos para animais (BRASIL, 1998a).
Os antimicrobianos utilizados têm alta ação destrutiva nas células bacterianas, mas mesmo com este potencial, as cepas de E. coli estão se tornando resistentes à ação antimicrobiana (CARDOSO et al., 2002). Estes autores desenvolveram um experimento com objetivo de avaliar a resistência de cepas de E. coli isoladas de frangos de corte e de matrizes aos antimicrobianos.
Foi possível verificar que as amostras de E. coli, coletadas de aves jovens e matrizes com aerossaculite, apresentaram alta resistência aos antimicrobianos testados.
Também LAMBIE et al. (2000), verificaram uma forte tendência de resistência a amoxicilina, novas quinolonas e sulfazotrim e uma taxa significante à norfloxacina em cepas isoladas de frangos de corte. A resistência adquirida pela E. coli se deve a utilização inadequada de antimicrobianos e administração em doses sub-terapêuticas, pois selecionam os agentes bacterianos mais resistentes, e não debelam a infecção (FERREIRA & KNÖBL, 2000). YANG et al. (2004) encontraram, em seus estudos, isolados de E. coli avícola resistentes a vários antimicrobianos. Estes autores recomendam o uso controlado de antimicrobianos, precedido de teste de susceptibilidade, para evitar-se a resistência cruzada com patógenos entéricos de seres humanos.
Da mesma forma, em experimento desenvolvido por ZANATTA et al., (2004), com objetivo de verificar a suscetibilidade de cepas de Escherichia coli de
120 amostras de aves com quadro clínico suspeito de colibacilose, a dez drogas antimicrobianas. A tetraciclina apresentou resistência de 76% e 93 amostras demonstraram-se resistentes a várias drogas.
GONÇALVES (2005), com objetivo de diagnosticar problemas respiratórios com a presença de Escherichia coli, coletou em 120 frangos de corte amostras de suabes, fragmentos de sacos aéreos e traquéias para o isolamento e identificação de E. coli. As cepas de E. coli avícolas patogênicas foram identificadas e submetidas ao teste do antibiograma, sendo todos resistentes a ampicilina, clindamicina, eritromicina, penicilina, tetraciclina e vancomicina.
Uma forma de minimizar o desenvolvimento da resistência antimicrobiana é a implantação de programas de monitoramento bacteriológico.
Boas práticas de higiene e de manejo na cadeia produtiva (MC-EWIN &
FEDORKA-CRAY, 2002). JOHNSON et al (2005), da mesma maneira, salientam a importância da compreensão das origens e trajetórias de transmissão de resistência antimicrobiana por E. coli. Sendo verificado que criações onde não são usados medicamentos, baixa positividade para E. coli e baixos percentuais de resistência a antimicrobianos. Isso sugere que a seleção de resistência ocorra inicialmente no criatório.
A resistência por E. coli a pelo menos, duas classes de agentes antimicrobianos é um achado comum, tanto na medicina humana quanto na veterinária, o que tem causado um crescente impacto no que seriam opções terapêuticas viáveis (BAUM, 2005). Este fato foi observado por ARTÊNCIO (2007), quando desenvolveu um experimento com finalidade de determinar a resistência frente a antimicrobianos por E. coli. O autor analisou 115 amostras isoladas de aves de produção, provenientes de três diferentes origens: cama de aviários, lesões de celulite e lesões de aves com sintomatologia respiratória.
Sendo verificada múltipla resistência para dois ou mais agentes antimicrobianos, em porcentagem de 35,2%, 31,2% e 66,6%, para cama avícola, celulite e para amostras de sintomatologia respiratória, respectivamente.
Também em estudo desenvolvido por ABREU (2010), confirmou-se a situação da crescendo resistência de cepas de E. coli a antimicrobianos. Foram coletadas 180 traquéias de aves para detecção de E. coli e determinação do perfil
de resistência a antimicrobianos. Dentre as amostras analisadas, a maioria dos isolados foi resistente à Tetraciclina (16/20), seguida pela Ceftazidima (13/20) e Ácido Nalidíxico (12/20), sendo apenas um resistente à Amoxicilina. Afirmando que resistência a múltiplos antimicrobianos pode indicar um possível potencial patogênico das cepas de E. coli para todos os tipos de ave, animais e mesmo para o homem.
3.CONSIDERAÇÕES FINAIS
Cepas de E. coli normalmente compõem a microbiota normal do intestino de aves e mamíferos. No entanto, existem cepas patogênicas para aves (APEC) que determinam processos patológicos extra-intestinais em aves. O diferencial destas cepas reside na presença de fatores de virulência, conferida principalmente pelos sorogrupos envolvidos, resistência a antimicrobianos e genes de virulência adquiridos.
Neste sentido, muito se sabe acerca da virulência das APEC, porém dados a respeito deste patógeno são necessários e a determinação da expressão de gene de virulência de cepas extra-intestinais durante a infecção são dados primordiais, dado a estreita relação entre as amostras de origem humana e avícola, em particular, amostras de Escherichia coli isoladas de meningite neonatal, pneumonia e septicemias
.
Desta maneira, entende-se que estudos epidemiológicos sobre a resistência a antimicrobianos e sorogrupos envolvidos nos casos de colibacilose em aves, bem como conhecimento dos fatores de virulência de amostras, são essenciais para adoção de medidas de controle eficazes, evitando-se a exposição humana a cepas patogênicas.
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