Faculdade de Engenharia de Alimentos
KARINA HUBER
AVALIAÇÃO DE PRODUTO DIET A BASE DE AÇAÍ JUÇARA (Euterpe edulis Martius) E SEUS EFEITOS ANTIOBESOGÊNICO, ANTI-INFLAMATÓRIO E
ANTIOXIDANTE EM ADOLESCENTES OBESOS.
Campinas 2016
AVALIAÇÃO DE PRODUTO DIET A BASE DE AÇAÍ JUÇARA (Euterpe edulis Martius) E SEUS EFEITOS ANTIOBESOGÊNICO, ANTI-INFLAMATÓRIO E
ANTIOXIDANTE EM ADOLESCENTES OBESOS.
Orientadora: GLAUCIA MARIA PASTORE
CAMPINAS 2016 ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA KARINA HUBER, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. GLAUCIA MARIA PASTORE.
Tese apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ciência de Alimentos.
Orientadora
Prof. Dr. Juliano Lemos Bicas Universidade Estadual de Campinas
Membro titular
Profª Drª Miriam Dupas Hubinger Universidade Estadual de Campinas
Membro titular
Profª Drª Luciane Daniele Cardoso Universidade Federal do Espírito Santo
Membro titular
Profª Drª Solange Guidolin Canniatti-Brazaca Universidade de São Paulo
Membro titular
Prof. Dr. Mário Roberto Maróstica Junior Universidade Estadual de Campinas
Membro suplente
Profª Drª Rosângela dos Santos Universidade Estadual de Campinas
Membro suplente
Profª Drª Neuza Maria Brunoro Costa Universidade Federal do Espírito Santo
Membro suplente
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
RESUMO
A obesidade é caracterizada pelo excessivo acúmulo de gordura corporal. Alimentos funcionais vem sendo avaliados na terapêutica da obesidade e inflamação dela resultante, destacando-se o açaí com seu elevado teor de antocianinas. O objetivo deste trabalho foi verificar a aplicabilidade de uma preparação doce diet à base de juçara (Euterpe edulis Martius) como alimento funcional ao avaliar a sua composição, aspectos sensoriais, capacidade antioxidante, anti-inflamatória e antiobesogênica em adolescentes obesos. Uma preparação diet e outra tradicional a base de juçara foram elaboradas e a aceitação, preferência e intenção de compra foram avaliadas por 64 provadores. As características físico-químicas (cinzas, proteínas, lipídeos, carboidratos, umidade, pH, acidez, cor e sólidos totais) e as antocianinas da polpa do fruto e preparações foram realizadas para caracterização do produto e pesquisa do seu potencial de funcionalidade. No ensaio clínico, foi determinado o peso, circunferência da cintura, IMC/I, colesterol total e frações, glicose de jejum e triglicerídeos, níveis plasmáticos de IL-6 e IL-10, TNF alfa, adiponectina, PCR, e antioxidantes do soro antes, durante e depois das 8 semanas de intervenção com os 26 adolescentes que participaram, recebendo ou não a preparação diet. Aplicou-se ANOVA ao teste de aceitação; cálculo de porcentagem à intenção de compra e teste de preferência; ANOVA e teste de Tukey à análise físico-química e de antocianinas; e teste de Shapiro-Wilk seguido dos testes t de Student e Mann-Whitney nas comparações entre grupos, e pelos testes de Friedman, ANOVA, Wilcoxon e teste t na avaliação do tempo de intervenção. Para as análises estatísticas adotou-se 5% de significância. Houve aceitação da aparência, cor, aroma e textura, e rejeição do sabor da preparação diet. 92% dos julgadores preferiram a preparação tradicional, e 40,6% afirmaram que “provavelmente não comprariam” a diet. O teor de cinzas variou de 2,04 a 3,8%; umidade de 85,44 a 92,75%; proteínas de 6,56 a 14,58%; lipídeos entre 18,05 e 39,5%; carboidratos de 45,81 a 73,35%; acidez entre 0,19 e 0,39 g de ácido cítrico/100g; sólidos totais de 7,25 a 14,56%; e pH entre 4,09 e 4,75. Os parâmetros de cor confirmaram a coloração roxa conferida pelas antocianinas. As concentrações de antocianinas totais obtidas por CLAE para a polpa, preparação diet e tradicional foram, respectivamente: 173, 122, e 120 mg/100g, e de 388,53; 425,87; e 390,22 mg/100g pela metodologia de pH diferencial. Não houve redução nos parâmetros antropométricos ao longo da intervenção e nem diferença entre os grupos. Após 4 semanas de intervenção, o grupo que consumiu a preparação apresentou
longo do estudo a IL-10 aumentou e a IL-6 reduziu no grupo controle. A capacidade antioxidante do soro não aumentou. Conclui-se que a elevada concentração de antocianinas confere potencialidade à preparação diet como alimento funcional, embora melhorias sejam necessárias visando aumentar a aceitação.A ingestão diária de juçara não foi efetiva na redução das medidas corporais e da maioria dos parâmetros bioquímicos, inflamatórios, e antioxidativo.
foods has been evaluated in the treatment of obesity and inflammation resulting from it, especially the acai with its high content of anthocyanins. The aim of this study was to verify the applicability of a sweet diet preparation based on juçara (Euterpe edulis Martius) as a functional food, evaluating its composition, sensory aspects, antioxidant activity, anti-inflammatory and antiobesogenic in obese adolescents. A diet preparation and a traditional preparation based on the fruit were formulated and acceptance, preference and intention to purchase were evaluated by 64 panelists. The physicochemical parameters (ash, protein, lipids, carbohydrates, moisture, pH, acidity, color and total solids) and anthocyanins of pulp and preparations were made for the product characterization and for the research of its functionality potential. In the clinical trial, it was determined weight, waist circumference, BMI/I, total cholesterol and fractions, fasting glucose and triglycerides, plasma IL-6 and IL-10, TNF alpha, adiponectin, CRP, and serum antioxidants before, during and after 8-week of intervention with 26 adolescents who participated receiving or not the diet preparation. ANOVA was applied to acceptance testing; Calculation of percentage for purchase intent and preference test; ANOVA and Tukey test for physicochemical and anthocyanins analysis; and Shapiro-Wilk followed by Student t test and Mann-Whitney for comparisons between groups, and by Friedman, ANOVA, Wilcoxon and T test in the evaluation of the intervention time. For statistical analysis we adopted a 5% of significance. There was acceptance of appearance, color, flavor and texture, and rejection of the taste of diet preparation. 92% of the panelists preferred the traditional preparation, and 40.6% said they "probably would not buy" the diet. The ash content ranged from 2.04 to 3.8%; Moisture from 85.44 to 92.75%; Proteins from 6.56 to 14.52%; lipids between 18.58 and 39.5%; carbohydrates from 45.84 to 73.27%; acidity between 0.19 and 0.39 g of citric acid/100 g; total solids from 7.25 to 14.56%; and pH between 4.09 and 4.75. Color parameters confirmed the purple coloring conferred by anthocyanins. The total anthocyanin concentrations for pulp, diet preparation and traditional were, respectively, 173, 122, and 120 mg/100g in HPLC methodology, and 388.53; 425.87; and 390.22 mg/100g by differential pH. 26 subjects agreed to participate in the intervention. There was no reduction in anthropometric parameters during the intervention and no difference between the groups. After 4 weeks of intervention, the group that consumed the preparation showed lower blood sugar levels
IL-6 decreased in the control group. The serum antioxidant capacity did not increased. It can be concluded that the hight concentration of anthocyanins provides potentiality to the diet preparation as a functional food, although improvements are necessary to increase acceptance. The daily intake of juçara was not effective in reducing body measurements and most of the biochemical, inflammatory, and antioxidative parameters.
2 OBJETIVOS ... 13
2.1 OBJETIVO GERAL ... 13
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 13
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 14
3.1 EPIDEMIOLOGIA E FISIOPATOLOGIA DA OBESIDADE ... 14
3.2 OBESIDADE E INFLAMAÇÃO ... 16 3.3 ANTIOXIDANTES ... 17 3.4 ANTOCIANINAS ... 19 3.5 AÇAÍ JUÇARA ... 22 3.5.1 CARACTERIZAÇÃO BOTÂNICA ... 23 3.5.2 COMERCIALIZAÇÃO ... 25 3.5.3 COMPOSIÇÃO ... 26
3.5.4 ASPECTOS FUNCIONAIS E TOXICOLÓGICOS ... 26
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 27
4.1 MATÉRIA-PRIMA E PREPARAÇÕES COM AÇAÍ JUÇARA ... 27
4.2 ANÁLISE SENSORIAL ... 28
4.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS ... 29
4.4 QUANTIFICAÇÃO DE ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) ... 30
4.5 QUANTIFICAÇÃO DE ANTOCIANINAS POR pH DIFERENCIAL ... 31
4.6 DESCRIÇÃO DO ENSAIO CLÍNICO E POPULAÇÃO ... 31
4.6.1 ROTINA DIETÉTICA ... 33
4.6.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA E COMPOSIÇÃO CORPORAL ... 34
4.6.3 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS ... 34
4.6.4 AVALIAÇÃO DE MARCADORES INFLAMATÓRIOS ... 35
4.7 CUIDADOS ÉTICOS ... 36
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 36
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 37
5.1 PRODUTOS A BASE DE AÇAÍ JUÇARA ... 37
EFICIÊNCIA DA POLPA E PREPARAÇÕES DE AÇAÍ JUÇARA ... 44
5.5 QUANTIFICAÇÃO DE ANTOCIANINAS POR pH DIFERENCIAL ... 49
5.6 ENSAIO CLÍNICO ... 51
5.6.1 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO ... 51
5.6.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA E COMPOSIÇÃO CORPORAL ... 53
5.6.3 ANÁLISES BIOQUÍMICAS ... 57
5.6.4 MARCADORES INFLAMATÓRIOS ... 60
5.6.5 CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO SORO ... 64
6 CONCLUSÃO ... 66
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 67
8 APÊNDICES ... 80
8.1 APÊNDICE A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido da análise sensorial. ... 80
8.2 APÊNDICE B - Termo de Assentimento do Ensaio Clínico ... 82
8.3 APÊNDICE C - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Ensaio Clínico ... 85
8.4 APÊNDICE D - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido do Ensaio Clínico para maiores de 18 anos ... 88
8.5 APÊNDICE E – Parecer do CEP/UFES referente a etapa de análise sensorial 91 8.6 APÊNDICE F – Parecer do CEP/UFES referente ao ensaio clínico ... 95
9 ANEXOS ... 103
9.1 ANEXO A - Ficha de avaliação utilizada para o teste de aceitação e intenção de compra. ... 103
9.2 ANEXO B – Ficha de avaliação utilizada para o teste de preferência pareado. 103 9.3 ANEXO C – Tabela de Caracterização dos sujeitos quanto a peso, CC, e IMC, antes, durante e após a intervenção ... 104
9.4 ANEXO D – Tabela de resultados das análises bioquímicas do sangue dos indivíduos antes, durante e após a intervenção. ... 105
9.6 ANEXO F - Tabela com os resultados de Capacidade antioxidante do soro dos grupos teste e controle durante e após a intervenção. ... 107
1 INTRODUÇÃO GERAL
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (WHO, 2005), a adolescência compreende, cronologicamente, o período entre 10 e 19 anos. Trata-se de um período caracterizado por mudanças sociais, alimentares, e pelo rápido crescimento, desenvolvimento físico, e modificações na composição corporal, as quais demandam aumento dos requerimentos nutricionais (JACOBSON, EISENSTEIN e COELHO, 1998; RÉ, 2011; TORAL, CONTI e SLATER, 2009). A Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF) realizada nos anos de 2008 e 2009 constatou aumento da prevalência de obesidade em adolescentes brasileiros (IBGE, 2010). Segundo o relatório “Estatísticas Mundiais de saúde 2012” da OMS, a obesidade está entre os treze fatores associados ao aumento da morbi-mortalidade mundial, atingindo 12% da população mundial. É, ainda, responsável pela morte de 2,8 milhões de pessoas por ano (WHO, 2012).
A obesidade é uma doença crônica complexa, de etiologia múltipla, caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal a ponto de prejudicar o adequado funcionamento do organismo. O excesso de gordura corporal está intimamente relacionado a alterações metabólicas como a resistência insulínica, dislipidemias e hipertensão arterial, as quais representam importantes fatores de risco para o desenvolvimento das doenças cardiovasculares (CHIARPENELLO et al., 2013; DESPRÉS e LEMIEUX, 2006; KERSHAW e FLIER, 2004).
Estudos sugerem que a obesidade é uma condição clínica associada a um estado inflamatório de baixa intensidade resultante do desbalanço na produção de moléculas pró e anti-inflamatórias, a favor das primeiras. A etiopatogenia da obesidade ainda não está totalmente elucidada, mas sugere-se que entre os mecanismos envolvidos estejam o aumento do estresse oxidativo (KEANEY et al., 2003), do processo inflamatório (PEREZ-MATUTE et al., 2007; WANG et al., 2008) e da produção de adipocinas (PÉREZ-ECHARRI et al., 2005; ROH et al., 2007) bem como a redução de enzimas antioxidantes naturais (TILG e MOSCHEN, 2006). Nesse sentido, pesquisas tem objetivado compreender os mecanismos moleculares envolvidos na obesidade e verificar o efeito de alimentos e fitoquímicos que possam ser utilizados em sua terapêutica (MONTERA, 2007).
Os compostos bioativos incluem uma diversidade de substâncias resultantes do metabolismo secundário de plantas, como os polifenóis (ISLAM et al., 2003). Na classe dos flavonoides, as antocianinas são largamente estudadas em decorrência de suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias, antitumorais, entre outras (BI et al., 2014; POJER et al., 2013; WANG e STONER, 2008).
Na dieta humana, uma das principais fontes de antocianina são as frutas, destacando-se o fruto da palmeira juçara (Euterpe edulis Martius), encontrada ao longo de toda a parte leste do Brasil (RIBEIRO, MENDES e PEREIRA, 2011). O despolpamento desse fruto gera um produto semelhante à polpa do açaí, o qual apresenta alto conteúdo de antocianina (290 mg/100 g de fruta) (BOBBIO et al., 2000; BRITO et al., 2007).
A polpa do açaí juçara, além de excelente fonte de antocianinas (até 409,85 mg de antocianinas), é rica em fibras, vitamina E, proteínas, minerais, e lipídeos (44% de conteúdo graxo), sobretudo os ácidos graxos ômega-6 e ômega-9 (BORGES et al., 2011; FREGONESI et al., 2010; TONON, BRABET e HUBINGER, 2009). Em decorrência dessa riqueza nutricional e em especial ao elevado teor dos pigmentos antociânicos, esse fruto insere-se no grupo de alimentos com alegação de funcionalidade.
Sendo assim, este estudo objetivou avaliar a composição e os aspectos sensoriais de uma preparação doce diet a base de açaí juçara (Euterpe edulis Martius) e a capacidade do seu teor de antocianinas melhorar e reverter o perfil inflamatório, obesogênico e oxidativo de adolescentes em quadro de obesidade.
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Este trabalho teve por finalidade verificar a aplicabilidade de uma preparação doce diet à base de juçara (Euterpe edulis Martius) como alimento funcional ao avaliar a sua composição físico-química, seus aspectos sensoriais e a capacidade antioxidante, anti-inflamatória e antiobesogênica promovidas por suas antocianinas em adolescentes obesos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Formular uma preparação diet e uma tradicional a base do fruto da palmeira juçara (Euterpe edulis Martius);
Avaliar a aceitação, preferência e intenção de compra das preparações propostas por meio de análise sensorial;
Caracterizar os produtos formulados ao analisar a composição química e as características físicas da polpa do fruto e preparações;
Verificar o potencial de funcionalidade das preparações e polpa ao analisar qualitativamente e quantitativamente as antocianinas por cromatografia líquida de alta eficiência e pela metodologia de pH diferencial, comparando os resultados e respectivas particularidades de cada método;
Promover suplementação nutricional com a preparação diet a base de açaí Juçara em adolescentes obesos;
Verificar as possíveis modificações nos parâmetros metabólicos (glicose plasmática de jejum e lipídios séricos), inflamatórios (IL-6, IL-10, TNFα, PCR, e adiponectina), antropométricos e corporais (peso, IMC, e CC), e na capacidade antioxidante total do soro dos voluntários ao longo da intervenção.
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 EPIDEMIOLOGIA E FISIOPATOLOGIA DA OBESIDADE
A obesidade, definida como acúmulo anormal ou excessivo de gordura, e cuja prevalência mundial mais que dobrou entre 1980 e 2014, acomete 13% da população mundial de adultos (11% de homens e 15% de mulheres) (WHO, 2015a). Segundo Freedman et al. (2012), entre 1974 e 1993, foi evidenciado aumento acentuado (de 6% para 17%) da prevalência de obesidade entre crianças e adolescentes de 5 a 17 anos de idade, especialmente após os anos 1980. Sabe-se que a ocorrência dessa enfermidade durante a infância e adolescência deve ser observada com atenção, visto que resulta em maior possibilidade de desencadear padrões de obesidade na idade adulta (MACHADO, 2013; WHO, 2015b). Assim, um diagnóstico de sobrepeso dos 10 aos 14 anos de idade aumenta em 20 vezes a chance de se manter esse perfil na terceira década de vida em relação à manutenção de um peso normal desde a adolescência (GREYDANUS e BHAVE, 2004).
No Brasil, a Pesquisa de Orçamentos Familiares 2008-2009, realizada em parceria entre o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) e o Ministério da Saúde mostraram que, em 34 anos, o número de crianças e adolescentes com excesso de peso subiu de 3,7% para 21,7% no sexo masculino. Para o sexo feminino os números avançaram de 7,6% para 19%. A obesidade também apresentou níveis ascendentes nesse mesmo período, aumentando de 0,4% para 5,9% entre meninos, e de 0,7% para 4,0% entre meninas (IBGE, 2010).
A obesidade é uma doença crônica de etiologia multifatorial, envolvendo fatores genéticos, o estado neuroendócrino, e fatores ambientais desfavoráveis; havendo sobreposição principalmente dos fatores genéticos e ambientais (CAMPIÓN, MILAGRO e MARTÍNEZ, 2010; SØRENSEN, 1995). Para a sua triagem, normalmente utiliza-se o Índice de Massa Corporal (IMC), calculado pela divisão do peso corporal em kg pela altura, em metros, ao quadrado (DE ONIS, BLOSSNER e BORGHI, 2010; WHO, 2015a). Mais
recentemente, a circunferência da cintura passou a ser utilizada como indicador de gordura visceral e, em adição ao IMC, no diagnóstico da obesidade em todas as fases da vida (BURGOS et al., 2013).
A distribuição da gordura corporal difere entre os indivíduos, podendo ser classificada como andróide e ginecóide. No padrão de distribuição andróide a gordura se acumula principalmente no tórax e no abdome, chamada de gordura visceral, abdominal ou central e está mais relacionada às complicações metabólicas em adultos e crianças. Já a distribuição ginecóide, mais comum nas mulheres, apresenta a gordura distribuída de forma periférica pelo corpo, no tecido subcutâneo, com a maior parte da gordura depositada nas nádegas e coxas (TAYLOR et al., 2000).
Estudos demonstram que o padrão andróide está mais relacionado a alterações como doença cardiovascular (DCV), dislipidemia, hiperinsulinemia, resistência à insulina, dentre outras. Carneiro et al. (2003) constataram que a prevalência de hipertensão arterial aumentou de 35,7% (naqueles com relação cintura/quadril (RCQ) entre 0,73 e 0,88) para 66,6% (naqueles com RCQ maior que 0,97), independente do IMC. Adicionalmente, e corroborando o estudo de Burgos et al. (2013), relataram que os valores da pressão arterial sistêmica, a proteína C reativa e a adiponectina se correlacionaram com as medidas da circunferência da cintura, evidenciando que a distribuição central de gordura corporal é fator determinante no desenvolvimento de DCV e suas complicações.
A gordura visceral apresenta características metabólicas e funcionais (BURGOS
et al., 2013). Dessa forma, o balanço energético positivo prolongado, além de levar ao
aumento do número e tamanho dos adipócitos, promove a infiltração de células mononucleadas nos depósitos adiposos. Como consequência, desenvolve-se um processo inflamatório crônico, com produção de citocinas ou adipocitocinas pró-inflamatórias (DUNCAN, DUNCAN e SCHMIDT, 2005; LOPES, 2007) como o fator de necrose tumoral (TNF-α), interleucinas, visfatina, resistina, leptina e adiponectina, juntamente ao estresse oxidativo, com redução das enzimas antioxidantes de produção endógena (catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase) (SANT’ANA, 2014). A apoptose ou necrose dos adipócitos faz com que a gordura armazenada nessas células extravase para o meio extracelular e circulação sistêmica, aumentando os ácidos graxos livres na corrente sanguínea, células e tecidos, promovendo assim um estado tóxico denominado lipotoxicidade, que interfere negativamente nas vias metabólicas como um todo (CATTANI, 2012).
Dietas ricas em ácidos graxos saturados, assim como lipopolissacarídeos de bactérias gram-negativas, também geram resposta inflamatória ao ativar receptores TLR4 (Toll-like receptors) no hipotálamo. Sua ativação promove produção de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 e IL-12, que por sua vez desencadeia a morte de neurônios e consequente desequilíbrio no mecanismo de fome/saciedade, influenciando na obesogênese (CHUANG e MCINTOSH, 2011; SANT’ANA, 2014).
Em todas as faixas etárias, tais alterações no perfil inflamatório e oxidativo decorrentes da obesidade vêm sendo indicadas como principais fatores desencadeadores de complicações como doença cardiovascular, resistência insulínica, esteatose hepática não-alcoólica, hipertensão arterial e alguns tipos de câncer (CAMERON et al., 2003; CHIARPENELLO et al., 2013; MELLO, LUFT e MEYER, 2004; OLIVEIRA et al, 2004; PORTINHO, ZIMMERMANN e BRUCK, 2012). Além de promover inativação enzimática, mutação, ruptura de membrana, aumento na aterogenicidade de lipoproteínas plasmáticas de baixa densidade e morte celular, efeitos esses associados ao envelhecimento e ao desenvolvimento de doenças crônicas, inflamatórias e degenerativas como as acima mencionadas (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999).
3.2 OBESIDADE E INFLAMAÇÃO
A obesidade representa um estado de inflamação crônica de baixo grau (CALHAU e AZEVEDO, 2011) que ocasiona alterações nos mediadores celulares e moleculares da imunidade e inflamação. A obesidade, resistência à insulina e diabetes tipo 2 estão intimamente associados com inflamação crônica caracterizada pela produção anormal de citocinas pró inflamatórias, aumento de reagentes de fase aguda e de outros mediadores, e ativação de uma rede de vias de sinalização inflamatórias (HOTAMISLIGIL, 2006).
O estado de inflamação crônica subclínica é caracterizado por elevações em marcadores inflamatórios, que vão de leucócitos até reagentes de fase aguda, como proteína C reativa (PCR). Esse estado é produzido basicamente por mecanismos moleculares da imunidade inata. A regulação do processo inflamatório envolve equilíbrio entre as citocinas pró e anti-inflamatórias, com as últimas exercendo papel de inibidoras das primeiras (MOURA, POMERANTZEFF e GOMES, 2001).
Observam-se associações entre os altos níveis de adiposidade e a elevação sérica das citocinas inflamatórias IL-1, IL-6, IL-10, TNF-α, e da proteína C-reativa (ROSSETTI, BRITTO e NORTON, 2009). Os adipócitos secretam várias citocinas e
proteínas de fase aguda que, direta ou indiretamente, elevam a produção e circulação de fatores relacionados com a inflamação (PRADO et al., 2009). A redução da massa gorda em contrapartida está correlacionado ao declínio dos níveis séricos de grande parte dessas adipocinas, contribuindo, portanto, para o decréscimo da inflamação e da resistência insulínica, e aumento na circulação de adiponectina (LYON, LAW e HSUEH, 2003).
O balanço energético positivo crônico relaciona-se ainda ao aumento nos níveis de leptina e decréscimo nos níveis de adiponectina, ambos liberados pelo tecido adiposo. A leptina é uma potente citocina pró-inflamatória reguladora do metabolismo endócrino e da resposta à fome, além de estimular a expressão de IL-1, IL-6 e TNF-α (SACHECK, 2008). A adiponectina apresenta-se em níveis reduzidos em pessoas obesas e desempenha função importante no metabolismo glicídico e lipídico, apresentando forte relação com a ocorrência de diabetes tipo 2 e doença arterial coronariana; além de estimular a produção de ácido nítrico e inibir a adesão de monócitos às células endoteliais (ARNAIZ
et al., 2010; OGAWA et al., 2005).
O tecido adiposo como órgão secretor de produtos e mediadores inflamatórios libera alguns destes na corrente sanguínea (IL-6, leptina e adiponectina) enquanto que outros como o TNF-α parecem exercer seus efeitos de forma autócrina ou parácrina. Produtos do tecido adiposo como a leptina e adiponectina exercem efeitos benéficos sobre o balanço energético, a ação insulínica e a proteção vascular, enquanto que TNF-α, IL-6 e resistina influenciam no desenvolvimento da resistência insulínica; e o inibidor do ativador de plasminogênio I e angiotensinogênio envolvem-se em complicações vasculares associadas à obesidade (GUIMARÃES et al., 2007). É interessante ressaltar que grande parte desse padrão expandido de expressão do tecido adiposo assemelha-se ao padrão humoral da resposta de fase aguda. A obesidade, então, poderia ser caracterizada como uma obesite; ou seja, uma reação inflamatória crônica e branda no tecido adiposo, semelhante à reação clássica de fase aguda (DUNCAN, DUNCAN e SCHMIDT, 2005).
3.3 ANTIOXIDANTES
Células e tecidos estão constantemente sob a ação de radicais livres e espécies reativas do oxigênio, produzidos durante o metabolismo normal de oxigênio ou induzidos por danos exógenos como dietas ricas em ácidos graxos saturados e outros fatores ambientais. Quando a produção de radicais livres excede a capacidade antioxidante endógena, instala-se um desequilíbrio oxidativo e inflamatório além das espécies radicalares atacarem lipídios, proteínas e DNA (CHUANG e MCINTOSH, 2011). Assim, a
integridade estrutural e função das membranas celulares, enzimas e material genético fica desestabilizado (PRIOR, 2003; GALVANO, 2007).
Os antioxidantes previnem ou reparam os danos oxidativos causados pelas espécies reativas de oxigênio, espécies reativas de nitrogênio, radicais derivados de tióis (RS•), espécies reativas de cloro, espécies reativas de carbono e complexos de metais de transição, principalmente Fe, Cu, Mn e Cr (ANDRADE et al., 2007; BECHARA, 2009; DEGÁSPARI e WASZCZYNSKYJ, 2004; RUDNICKI et al., 2007). Entretanto, sabe-se que os componentes celulares não são protegidos totalmente por antioxidantes endógenos, e é bem estabelecido que antioxidantes obtidos da dieta são indispensáveis para a defesa apropriada contra oxidação (CERQUEIRA, MEDEIROS e AUGUSTO, 2007).
Um adequado suporte nutricional, com fornecimento dos micronutrientes com atividade antioxidante ou que funcionem como cofatores para elementos antioxidantes é capaz de reduzir o estresse oxidativo e o processo inflamatório (MONTERA, 2007), bem como as enfermidades deles decorrentes (doenças neurodegenerativas, cardiovasculares, obesidade e resistência a insulina) (JENSEN et al., 2008). Estudos demonstram que o consumo frequente de alimentos ricos em antioxidantes naturais, aumenta a capacidade antioxidante do plasma, a proteção vascular e ajuda a reestabelecer o equilíbrio oxidativo e inflamatório do organismo, reduzindo o risco de doenças relacionadas à obesidade e inflamação (LIMA et al., 2012; SACHECK, 2008).
Dentre as diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural, os compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos, sobretudo por inibirem a peroxidação lipídica, a lipoxigenase in vitro (SOUSA et al., 2007), processos aterogênicos e câncer (SHAHIDI e WANASUNDARA, 1992). Essa atividade antioxidante deve-se, principalmente, às suas propriedades redutoras, as quais desempenham papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres ou quelação de metais de transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo (SOARES, 2002). Os intermediários formados pela ação de antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis, devido à ressonância do anel aromático presente na estrutura dessas substâncias (ALMEIDA-DORIA e REGITANO-D`ARCE, 2000).
Sabe-se que os compostos fenólicos e outros bioativos presentes sobretudo em frutas e vegetais, por terem inúmeros grupos hidroxila associados aos anéis aromáticos de sua estrutura, agem na proteção celular de forma direta e indireta. Direta ao agir como antioxidante, reduzindo as espécies reativas de oxigênio; e indireta ao inibir a ativação de NF-κβ levando à redução dos níveis de citocinas inflamatórias e moléculas de adesão, e ao
aumento da expressão de enzimas antioxidantes (NORATTO et al., 2014). Tais polifenóis, em associação às fibras presentes em frutas e vegetais, previnem a oxidação da lipoproteína de baixa densidade (colesterol LDL) e, consequentemente, o surgimento de aterosclerose (DEMBISTKY et al., 2011).
3.4 ANTOCIANINAS
As antocianinas são pigmentos vegetais importantes pertencentes à classe de compostos fenólicos chamados coletivamente de flavonoides (Figura 1), devido às suas características de esqueleto carbônico C6C3C6. Dentro de cada grupo de flavonoides há variados compostos diferentes, sendo que a cor é determinada pela presença e número de substituintes ligados à molécula (DAMODARAN, PARKIN e FENNEMA, 2010). Esses compostos são metabólitos secundários de plantas e estão geralmente envolvidos nos sistemas de defesa destas à radiação ultravioleta e à agressão por patógenos (ISLAM et
al., 2003).
Segundo Brito et al. (2007), as antocianinas encontradas em alimentos são glicosídeos e acilglicosídeos de seis agliconas de antocianidinas: pelargonidina, cianidina, delfinidina, malvidina, peonidina e petunidina. Segundo Costa et al. (2012), o que diferencia esses fitoquímicos é o número de grupos hidroxila esterificados na molécula; o grau de metoxilação desses grupos; a natureza, número e posição de glicosilação; e a natureza e número de ácidos alifáticos e aromáticos ligados aos resíduos glicosídeos. Diferem dos outros flavonoides principalmente por não possuírem a função oxo (-C=O) no anel pirano (PALACIO, 2008).
As antocianinas são pigmentos solúveis em água, embora sejam instáveis e apresentem maior estabilidade em condições ácidas. São responsáveis pelas cores que variam do vermelho intenso ao violeta e azul de flores, frutas e vegetais. Tanto a cor do pigmento quanto a sua estabilidade são fortemente influenciadas pelos substituintes da aglicona. A degradação da antocianina pode ocorrer durante a extração do vegetal, processamento e estocagem e pode ser influenciada por vários fatores como: pH, temperatura, enzimas, ácido ascórbico, oxigênio, dióxido de enxofre e íons metálicos (RIBEIRO, MENDES e PEREIRA, 2011).
Figura 1. Estruturas de flavonoides
Esse grupo de flavonoides é largamente elucidado por suas propriedades farmacológicas e propriedades medicinais, incluindo as atividades antioxidante, anticarcinogênica, anti-inflamatória, vasodilatadora e antimicrobiana (FREGONESI et al., 2010; MARTINEZ-FLÓRES et al., 2002; QIN et al., 2009). A estrutura fenólica confere atividade antioxidante por meio da doação ou transferência de elétrons dos átomos de hidrogênio (NOVELLO, 2011). Como consequência tem-se, entre outros, a prevenção da oxidação de proteínas de baixa densidade (LDL), obesidade e hipoglicemia, de enfermidades cardiovasculares e doenças neurológicas (BRITO et al., 2007; MENEZES, TORRES e SRUR, 2008).
No tocante ao aproveitamento das antocianinas pelo corpo humano, Sancho e Pastore (2012) citam que uma menor porcentagem desses compostos é rapidamente absorvida no estômago e jejuno como glicosídeos; outra parte é inicialmente metabolizada por meio da conjugação com ácido glicurônico e sulfatos e também metilada; e a maior proporção é hidrolisada no cólon para liberar o açúcar e a aglicona que será degradada para formar ácidos fenólicos disponíveis para reabsorção. A formação de produtos como o ácido protocatecoico (principal metabólito de antocianinas em humanos) a partir do metabolismo de antocininas é responsável pelos efeitos benéficos observados após consumo de alimentos fonte deste pigmento.
Os frutos do açaí possuem uma coloração roxa intensa devido à alta concentração de antocianinas, proantocianidinas e outros flavonóides (FREGONESI et al., 2010). A excelente concentração desses bioativos (até 409,85 mg de antocianinas em 100g de matéria úmida) somada ao elevado teor de conteúdo graxo (44% de lipídeos) insere o açaí no grupo de alimentos com alegação funcional (BORGES et al., 2011).
Brito et al. (2007) detectaram 2.956 mg de antocianinas totais em 100g de base seca de açaí juçara e 290 mg de antocianinas totais em 100g de base úmida de açaí juçara. Costa et al. (2013) citam teores de 282 a 303 mg de antocianinas em 100 g de matéria úmida de açaí; revelando, portanto, seu significativo conteúdo de compostos fenólicos. Esses autores indicam, ainda, que as principais antocianinas presentes no açaí (Figura 2) são: glicosídeo, rutinosídeo, acetilhexose, cianidina-3-arabinosídeo, cianidina-3-sambubiosídeo, peonidina-3-rutinosídeo, peonidina-3-glicosídeo, e pelargonidina-3-glicosídeo.
Figura 2. Estrutura química das principais antocianinas encontradas no açaí.
FONTE: Adaptado de Yamaguchi et al. (2015)
3.5 AÇAÍ JUÇARA
O açaí é uma emulsão obtida a partir da extração da parte comestível dos frutos das palmeiras do gênero Euterpe. Na região amazônica o açaí é obtido a partir da polpa dos frutos do açaizeiro (Euterpe oleracea Martius) e do açaizeiro da terra firme (Euterpe
precatória Martius). Na região da Mata Atlântica e cerrado, pode-se obter o açaí a partir dos
frutos do palmiteiro ou juçara (Euterpe edulis Martius) (BORGES, 2010).
De acordo com Regulamento técnico de Padrão de Identidade e Qualidade (PIQ) do açaí, o produto pode ser classificado dependendo da adição ou não de água em: 1-
polpa de açaí, extraída sem adição de água por meio mecânico e sem filtração; 2- açaí grosso, polpa extraída com adição de água e filtração, apresentando acima de 14% de sólidos totais e aparência muito densa; 3- açaí médio, polpa extraída com adição de água e filtração, apresentando acima de 11 a 14% de sólidos totais e aparência densa; e 4- açaí fino, polpa extraída com adição de água e filtração, apresentando de 8 a 11% de sólidos totais e aparência pouco densa. Deve possuir no mínimo 5 g de proteína/100 g de matéria seca, 20 g de lipídeos totais/100 g de matéria seca, e 51 g de carboidratos totais/100 g de matéria seca (BRASIL, 2000). Entretanto, até o momento não há PIQ estabelecido especificamente para o açaí Juçara, podendo, portanto, haver modificações desses valores de referência para tal espécie.
Oliveira, Farias Neto e Pena (2007) comparam as propriedades nutricionais do açaí e da juçara e ressaltam os níveis significativamente superiores de ferro, zinco, potássio, açúcares e lipídeos, além das antocianinas, que podem alcançar concentrações quatro vezes maior no juçara (COSTA et al., 2012). Dessa forma, é excelente alternativa para consumo nas regiões Sul e Sudeste do Brasil, onde não há floresta nativa de açaí e sim de juçara.
3.5.1 CARACTERIZAÇÃO BOTÂNICA
Diferentemente do açaizeiro (Euterpe oleracea Mart.), que pode atingir acima de 25 metros de altura e apresentar em torno de 20 estirpes (caules) (PALACIO, 2008), o juçara atinge no máximo 20 m e possui apenas 1 estirpe (OLIVEIRA, FARIAS NETO e PENA, 2007). Tal aspecto pode justificar, em parte, seus teores de antocianinas superiores em relação à primeira espécie.
A espécie Euterpe edulis Martius pertence à família Arecaceae (Palmae) e tem sinonímia botânica: Euterpe equsquizae Bertoni ex Hauman, e Euterpe globosa Gaertn. As folhas são alternas, pinadas, com até 3 m de comprimento; os frutos são carnosos, fibrosos, com endosperma muito abundante; e a semente é quase esférica, parda-amarelada, envolta por uma cobertura fibrosa, com até 10 mm de diâmetro, e possuem endosperma muito abundante, com alto teor de reservas, as quais constituem-se de carboidratos (cerca de 88%), proteínas (10%) e lipídeos (2%) (MARTO, 2007). Os frutos amadurecem de abril a novembro, com frutificação geralmente abundante, podendo uma planta em condições favoráveis produzir de 2.728 a 3.320 frutos/cacho (SILVA, 2011).
A floração ocorre de setembro a janeiro. A temperatura média anual das regiões produtoras varia entre 17 e 27ºC e a precipitação média anual entre 1000 mm a 2200 mm,
apresentando melhor crescimento com índices pluviométricos superiores a 1500 mm. A espécie também ocorre em regiões com estacionalidade (Florestas Estacionais), tolerando uma estação seca de até três meses com déficit hídrico leve como no sul da Bahia, por exemplo (MARTO, 2007).
A Figura 3 mostra que há ocorrência da espécie no Cerrado e Mata Atlântica brasileiros, nos estados do Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Bahia, Alagoas, Sergipe, Goiás, Distrito Federal, Minas Gerais, Espírito Santo, São Paulo, Rio de Janeiro, Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul (RIBEIRO, MENDES e PEREIRA, 2011).
Figura 3. Mapa das regiões produtoras de Juçara (Euterpe edulis Martius)
3.5.2 COMERCIALIZAÇÃO
A espécie Euterpe edulis Martius é a principal palmeira produtora de palmito da mata atlântica, o que a tornou alvo de intensa exploração a partir da década de 60 para a produção de palmito, levando-a à inclusão na lista de espécies brasileiras em extinção (PRIETO, 2012). Atualmente é crescente o extrativismo de seus frutos, utilizados como substituto ao açaí (Euterpe oleracea e Euterpe precatoria). A extração dos frutos de E.
edulis surge neste contexto como uma possibilidade menos agressiva, comparativamente
à extração de palmito, uma vez que não exige o corte e consequente morte da planta (BRANCALION et al., 2012). Ademais, o valor econômico, a aceitação pelo mercado consumidor e a procura por este produto são uma realidade no Brasil e no mundo (SILVA, 2011).
O açaí sempre foi largamente consumido na região norte do Brasil onde é nativo. Com a divulgação das suas propriedades nutritivas e energéticas, o uso da polpa de açaí generalizou-se em todo o país. Assim, o cultivo do açaizeiro e o processamento do seu fruto já ocorrem em vários estados brasileiros, principalmente no sul da Bahia. Nas regiões Sul e Sudeste o juçara entra no mercado em substituição ao açaí devido à sua maior ocorrência natural e por apresentar propriedades sensoriais e nutricionais similares (SILVA, BARRETO e SERÔDIO, 2004). O açaí hoje é produto de exportação para vários países, principalmente os EUA, que detém 77% das exportações, seguido pela Holanda (9% das exportações), e Japão (8% das exportações) (PARÁ, [2013?]). Logo, o mercado para o juçara apresenta grande potencial de crescimento como alternativa à comercialização do açaí.
Na região Norte, o açaí é consumido, na maioria das vezes, na refeição principal, puro ou misturado com farinha de mandioca; nas regiões Sul e Sudeste o juçara é consumido como bebida energética, principalmente entre os jovens, geralmente misturado com xarope de guaraná e outras frutas tropicais. Esses consumidores buscam um complemento alimentar rico em vitaminas e minerais, de alto valor calórico (GOUVÊA, 2010; PALACIO, 2008).
É cada vez mais comum a comercialização de produtos a base de açaí na forma de sucos, “smoothies”, tabletes e bebidas instantâneas, com apelos de promoção e manutenção da saúde, propiciados pelos compostos fenólicos, pelas indústrias alimentícia, cosmética e farmacêutica (MARCASON, 2009; YAMAGUCHI et al., 2015). De fato há diversos estudos científicos mostrando alguns efeitos benéficos à saúde, tais como efeitos anti-inflamatórios, anti-alérgicos, decréscimo do estresse oxidativo, prevenção de
enfermidades neurológicas e cardiovasculares, entre outros (COSTA et al., 2013; MENEZES, TORRES e SRUR, 2008). Porém, ainda há resultados conflituosos e contraditórios, indicando, portanto, a necessidade de mais estudos na área para a confirmação dos apelos de promoção de saúde (MARCASON, 2009).
O fruto das palmeiras Edulis é altamente perecível, sua vida de prateleira é limitada a um prazo de 12 a 72 horas, mesmo sob refrigeração, a depender das práticas de pós-colheita. O acondicionamento, manuseio e transporte adequados são fundamentais para evitar contaminações por coliformes fecais, Salmonellas e outros microorganismos patogênicos. Além disso, existe ainda a degradação natural no fruto, promovida pela ação enzimática (GUIMARÃES e MASCIGRANDE, 2011). Sousa (2000) avaliou a estabilidade das antocianinas de açaí e observou perda de 29% entre 5 e 30 dias de armazenamento a 25oC, do açaí pasteurizado. De acordo com o autor a temperatura de armazenagem é o fator mais importante para a conservação das antocianinas do açaí.
3.5.3 COMPOSIÇÃO
Embora haja poucos estudos que diferenciem a composição nutricional entre as espécies de açaí, sabe-se que esses frutos apresentam muitas propriedades importantes à saúde humana. O juçara apresenta alto valor energético, devido, principalmente, ao elevador conteúdo lipídico; além de ser rico em fibras, vitamina E, proteínas e minerais (FREGONESI et al., 2010; TONON, BRABET e HUBINGER, 2009). Sua composição mineral apresenta aproximadamente 19,3 (± 6,0) mg de sódio/100g, 94,8 (± 11,2) mg de potássio/100g, 4,3 (±1,0) mg de cálcio/100g, 46,6 (± 1,5) mg de ferro/100g, e 5,2 (± 1,0) mg de fósforo/100g (RIBEIRO, MENDES e PEREIRA, 2011).
A composição química aproximada do açaí juçara constitui-se em 18 a 44% de lipídeos, dos quais 44 a 55% é representado pelo ácido oleico e 18 a 25% pelo ácido linoleico; 5 a 8% de proteínas; 1,5 a 3,3% de cinzas; e 88 a 90% de umidade (BORGES et
al., 2011). Quanto ao conteúdo de carboidratos, há divergências na literatura, com valores
variando desde 3% (YAMAGUCHI et al., 2015) a 52%, todos apresentados em base seca (MENEZES, TORRES e SRUR, 2008; SCHAUSS et al., 2006).
3.5.4 ASPECTOS FUNCIONAIS E TOXICOLÓGICOS
Inserido no contexto dos alimentos funcionais, vem chamando a atenção pelo alto teor de antocianinas, flavonoide responsável pela coloração característica desta fruta e que apresenta elevado poder antioxidante (BORGES et al., 2011; SCHAUSS et al., 2006;
SILVA, BARRETO e SERÔDIO, 2004). Este pigmento está presente em quantidades que vão desde 110,09 mg/100g de matéria úmida (COSTA et al., 2012) até 409,85 mg de antocianinas/100g de matéria úmida de açaí juçara (BORGES et al., 2011). Mink et al. (2007) concluíram que a ingestão diária de 0,2 mg de antocianinas/dia associa-se à redução do risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares em mulheres na pós menopausa.
Permanecem escassos os dados na literatura para permitir a definição da Ingestão Dietética de Referência (DRI’s) de fitoquímicos, sobretudo com relação àqueles presentes no açaí. Segundo a autoridade européia em segurança alimentar (EFSA – European Food Safety Authority), o JECFA (FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) estabeleceu como ingestão diária aceitável até 2,5 mg de antocianinas da casca de uva/Kg de peso corpóreo para antocianinas atuando como aditivo alimentar (EFSA JOURNAL, 2013).
Pojer et al. (2013) cita em sua revisão de literatura que os riscos toxicológicos do consumo de antocianinas provenientes apenas da dieta é baixo devido a sua baixa absorção no organismo, e que mesmo pessoas que consomem 160 mg desses bioativos 2 vezes ao dia apresentam boa tolerância, sem relatos significativos de efeitos colaterais.
Assim, a carência de estudos na literatura que avaliem preparações a base de açaí (sobretudo de açaí juçara) e os efeitos dessas formulações na saúde humana, aliados à relevância do assunto “obesidade na adolescência” no contexto da saúde pública, considerando ainda a importância socioeconômica e ecológica do uso dos frutos de juçara, justificam a realização de estudos com o intuito de se firmar melhor entendimento e comprovação (ou não) sobre os efeitos terapêuticos dos fitoquímicos presentes nesse alimento.
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 MATÉRIA-PRIMA E PREPARAÇÕES COM AÇAÍ JUÇARA
A polpa de açaí juçara usada para as preparações foi adquirida de uma processadora de polpa de frutas, localizada na zona rural do município de Rio Novo do Sul (ES), que possui cultivo próprio das palmeiras. A processadora atua com aprovação da Vigilância Sanitária, sob o alvará de licença para localização e funcionamento da prefeitura do município, e dispõe do Selo de Inspeção Municipal (SIM) para comercialização dos produtos. Para o despolpamento do açaí e obtenção da polpa para consumo, foram utilizados frutos de açaí Juçara e água na proporção de 1:3 (fruto:água) Kg/L, sendo esta
proporção a menor possível para viabilizar o processo em questão. Devido ao volume de preparações que seriam consumidas pelos voluntários e a restrição de espaço físico para estocagem, as polpas de juçara para o preparo das formulações foram obtidas em 3 momentos distintos, representando, portanto, 3 lotes de matéria-prima.
Testes preliminares foram realizados com o objetivo de elaborar uma preparação padrão à base do juçara semelhante ao mix de açaí (E. oleracea) tradicionalmente comercializado, e uma formulação diet com menor teor calórico e sem adição de açúcar. Para isso, foram utilizadas orientações de preparo e ingredientes baseados em estudo prévio (BATISTA, 2014) que realizou análise sensorial de 3 preparações diet e 3 preparações adoçadas com xarope de guaraná. As preparações diet tinham como ingredientes comuns a polpa de açaí juçara, sucralose, ácido cítrico, lecitina de soja e goma guar; sendo que a primeira distinguiu-se pela adição de banana prata, a segunda pela incorporação de farinha de semente de uva, enquanto a terceira possuía apenas os ingredientes base para as três formulações. As preparações adoçadas com xarope de guaraná tiveram como única diferença a substituição da sucralose pelo xarope.
A partir dos achados de Batista (2014) e por meio de testes em laboratório, foi estabelecida uma preparação padrão contendo xarope com o único objetivo de comparação à preparação diet em termos sensoriais e de caracterização química e física, e uma formulação diet à base de juçara. Ambas as formulações foram preparadas em liquidificador industrial de aço inoxidável sob temperatura ambiente de 20ºC sem incidência de luz direta, embaladas em recipientes descartáveis tampados, e congeladas até o momento das análises in vitro. A preparações diet a serem entregues aos adolescentes eram preparadas diariamente, 2 horas antes de serem servidas, e armazenadas em temperatura de refrigeração.
4.2 ANÁLISE SENSORIAL
Com o intuito de comparar a aceitação das preparações, viabilizar a oferta da preparação diet no estudo clínico, e estudar o potencial de inserção dessa formulação diet no mercado de alimentos funcionais, foram conduzidos os testes de aceitação, preferência e intenção de compra das duas preparações formuladas.
O recrutamento dos participantes do estudo se deu por meio da divulgação por cartazes e redes sociais, e convite para participação voluntária no estudo. O painel constituiu-se por julgadores com idade entre 18 e 30 anos, não treinados, que assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE (Apêndice A) antes dos testes, e que
relataram gostar de açaí. Por outro lado, os critérios de exclusão foram: não gostar de açaí, apresentar intolerância a qualquer ingrediente constituinte das formulações, e não assinar o Termo de Consentimento.
Os voluntários compareceram ao laboratório de Análise Sensorial do CCA-UFES e direcionaram-se às cabines individuais, onde, sob luz branca, as amostras de preparação tradicional e diet foram oferecidas aos julgadores de forma monádica e casualizada. Foram servidos aproximadamente 30 mL de cada uma das duas preparações em copos identificados com numeração aleatória de três dígitos, juntamente com um copo de água à temperatura ambiente para alternar entre as amostras (MININ, 2006).
Foi realizado teste de aceitação por escala hedônica e de intenção de compra (Anexo A), bem como teste de preferência entre as amostras (Anexo B). No teste de aceitação sensorial por escala hedônica, avaliaram-se os atributos aparência, cor, aroma, textura e sabor, numa escala de nove pontos, variando de “desgostei extremamente” a “gostei extremamente”; e para a avaliação da intenção de compra dos produtos, uma escala de cinco pontos com opções variando entre “certamente não compraria” e “certamente compraria”. No teste de preferência foi solicitada a indicação da amostra preferida entre as duas testadas.
4.3 ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS
Com a finalidade de caracterizar as preparações formuladas e a polpa do fruto utilizada como matéria-prima, foi analisada a composição química e as características físicas das mesmas em triplicata em cada um dos 3 lotes adquiridos de polpa de juçara. As análises do teor de umidade, proteína bruta e cinzas seguiram as normas da Association of Official Analytical Chemists (AOAC, 2005) e de extrato etéreo, pH, e acidez, de acordo com as metodologias indicadas pelo Instituto Adolfo Lutz (IAL, 2008).
Para determinação do teor de umidade utilizou-se o método gravimétrico (método AOAC nº 925.09), em que as amostras são secas em estufa a 105ºC até peso constante. O teor protéico foi determinado pelo método Microkjeldahl (método AOAC nº 920.87), sendo quantificado pela multiplicação do conteúdo de nitrogênio total pelo fator 5,75 (fator de correção para proteínas de origem vegetal) (SOSULSKI; IMAFIDON, 1990). As cinzas (método AOAC nº 923.03) foram obtidas por processo gravimétrico, por meio da incineração das amostras em mufla a 550ºC por 4 horas. Determinou-se o extrato etéreo utilizando-se éter de petróleo para extração contínua em equipamento de Soxhlet. Para a determinação eletrométrica do pH utilizou-se medidor digital a 20ºC ± 5ºC. A acidez titulável
se deu por volumetria potenciométrica com solução de NaOH 0,1 M, sendo expressa em equivalentes de ácido cítrico (g de ácido cítrico/100 g). Sólidos totais foram quantificados subtraindo-se de 100 o teor de umidade (100 - U) e expressos em % de sólidos totais. O teor de carboidratos totais foi calculado a partir da diferença: 100 – (umidade + proteínas + lipídios + cinzas). A cor foi observada objetivamente utilizando-se colorímetro através do sistema de leitura CIELAB, analisando L* (luminosidade), a coordenada a* (intensidade de vermelho e verde) e b* (intensidade de amarelo e azul). A partir das coordenadas a* e b*, foram calculados o ângulo de tonalidade cromática (h*) e o Chroma ou saturação de cor (C*), conforme as equações: C* = (a*2 + b*2)1/2 e h* = arctan (b*/a*).
4.4 QUANTIFICAÇÃO DE ANTOCIANINAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
A identificação e quantificação das antocianinas majoritárias cianidida-3-glicosídeo e cianidina-3-rutinosídeo seguiu as metodologias propostas por Schauss et
al.(2006) e Gallori et al. (2004), com modificações.
Procedeu-se a extração de 1,5 gramas da amostra homogeneizada com 20 mL de solvente extrator (1% de HCl em metanol) sob agitação por 2 horas, em banho metabólico à temperatura ambiente. A suspensão foi armazenada por 12 horas em freezer à -18°C, seguida de centrifugação a 4000 rpm (1789 g), por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para frascos âmbar e armazenado em freezer (-18°C) até o momento das análises, quando o extrato foi filtrado em unidades filtrantes HV Millex (polietileno, 0,45 μm de porosidade) diretamente nos vials.
Utilizou-se detector espectrofotométrico DAD “Photodiode Array” (arranjo de fotodiodos), modelo SPD- M10 AVP, Shimadzu, com comprimento de onda de 520 nm, coluna Cromatográfica de fase reversa Phenomenex Gemini C18, 5 μm, 250 mm x 4,6 mm, munida de coluna de guarda Phenomenex ODS (C18), 4 mm x 3mm, à temperatura ambiente. As fases móveis foram A- Água ultrapura acidificada com acido fórmico (pH=2): acetonitrila (89:11 v/v); e B- Acetonitrila 100%, com eluição por gradiente: 0 a 20 minutos - 0% de B; 20 a 22 minutos- aumento linear para 25 % de B; 22 a 27 minutos - 50% de B; 27 a 29 minutos - aumento linear para 0% de B; 29 a 45 minutos - recondicionamento da coluna cromatográfica. O tempo de corrida foi de 45 minutos (29 minutos de corrida e 16 minutos de recondicionamento), com fluxo da fase móvel igual a 1,0 mL/minuto, e volume de injeção de 50 µL. A pressão usual variou em função do gradiente na faixa de 66 a 88 Kgf, e o degasamento, antes e durante a corrida, foi feito com gás hélio a 100 kpa.
Foram utilizados os padrões das antocianinas majoritárias cianidina 3-O-glicosídeo e cianidina 3-O-rutinosídeo, ambos da Sigma-Aldrich, para observar o tempo de retenção de cada antocianina e seus respectivos picos com a finalidade de comparar, quantificar e identificar esses flavonoides nas amostras posteriormente injetadas. As soluções diluídas dos padrões foram injetadas (50 µL) em conjunto como uma mistura nas condições acima descritas, e o conteúdo de antocianinas foi expresso em miligramas por 100 gramas de amostra (µg/100g).
4.5 QUANTIFICAÇÃO DE ANTOCIANINAS POR pH DIFERENCIAL
Para a extração das antocianinas, homogeneizou-se 10 g de amostra e 50 mL de etanol/água (70:30 v/v). O pH da solução foi ajustado para 2 com o auxílio de HCl 3 mol/L. A solução ficou em repouso por 24 horas a 8°C, ao abrigo da luz (FRANCIS, 1982), e depois foi filtrada à vácuo, sendo o filtrado diluído em balão volumétrico de 100 mL com o solvente extrator. A quantificação do pigmento pelo método do pH diferencial seguiu a metodologia proposta por Giusti e Wrolstad (2003), com auxílio de um espectrofotômetro (BEL photonics; SP 2000 UV). As absorbâncias das amostras foram mensuradas a 510 nm e 700 nm em tampões com pH 1,0 (ácido clorídrico-cloreto de potássio, 0,025M) e 4,5 (acetato de sódio, 1M). As antocianinas totais foram quantificadas em pH 1,0 e as antocianinas monoméricas pela diferença com o pH 4,5 (INACIO et al., 2013). Para apresentação dos resultados em mg de equivalentes de cianidina-3-glicosídeo/100g da amostra, foi utilizada a massa molar e coeficiente de absortividade molar da cianidina-3-glicosídeo: 490,0 g/mol e 26900 L/cm.mol, respectivamente.
4.6 DESCRIÇÃO DO ENSAIO CLÍNICO E POPULAÇÃO
O diagrama de fluxo do ensaio clínico é apresentado na Figura 4. Tratou-se de um ensaio clínico prospectivo, com delineamento paralelo, do tipo caso-controle, proporção 1:1. Foram realizadas comparações entre o perfil inflamatório, bioquímico, antropométrico, e a capacidade antioxidante do soro dos indivíduos antes, durante e após a intervenção.
Figura 4. Diagrama de fluxo do ensaio clínico.
FONTE: Adaptado de Schulz, Altman e Moher (2010).
Todos os 858 estudantes matriculados em duas escolas da sede do município de Alegre (ES), com faixa etária entre 10 e 19 anos, foram avaliados quanto ao peso, altura e índice de massa corporal relacionado à idade (IMC/I) segundo critérios de classificação da WHO (2007). Os 72 indivíduos diagnosticados como obesos (IMC/I > escore z +2) foram convidados a participar do estudo mediante a assinatura de um termo de assentimento livre e esclarecido juntamente com os responsáveis (Apêndices B, C e D).
Procedeu-se à alocação dos 34 adolescentes que aceitaram participar do estudo em grupo controle (17 indivíduos) e grupo intervenção (17 indivíduos). Cada grupo correspondeu à uma das duas escolas participantes do estudo, com vistas a permitir que a preparação diet fosse elaborada todos os dias até o momento da merenda escolar da escola pertencente ao grupo intervenção, além de viabilizar a entrega da preparação a todos os alunos durante os 20 minutos de intervalo para merenda. Segundo Palacio (2008), o açaí é altamente perecível, suas antocianinas são facilmente degradadas, e sua textura modifica-se com facilidade após o processo de congelamento.
Ambos os grupos receberam orientações nutricionais e restrição calórica de 250 kcal/dia por meio de um plano alimentar individualizado. O grupo intervenção, acrescido a isso, recebeu 200g da preparação diet de açaí diariamente durante 8 semanas, sendo o
valor calórico dessa preparação (88,6 Kcal) contabilizado nos cálculos dietéticos. Os critérios adotados para inclusão no estudo foram: adolescentes com idade entre 10 e 19 anos portadores de obesidade diagnosticada pelo IMC/I. A exclusão obedeceu os seguintes critérios: utilização de medicamentos que pudessem interferir nos resultados da pesquisa, uso de nutracêuticos e ou suplementos com função antioxidante, grávidas, nutrizes e participantes com desordem alimentar e alergia, ou intolerância ao açaí juçara.
O ensaio clínico ocorreu ao longo dos momentos:
T0: recrutamento, assentimento informado e avaliação inicial (antropometria, história clínica pregressa e atual, investigação do uso de medicação, presença de doença crônica não transmissível (DCNT) já diagnosticada, peso ao nascer, e história familiar (peso, estatura e pressão arterial dos pais));
T1: randomização e determinações da linha de base (composição corporal e coleta de sangue para determinação dos perfis metabólico, oxidativo e inflamatório);
T2: 1ª etapa da intervenção nutricional com e sem suplementação dietética (primeiras 4 semanas);
T3: determinações clínico-laboratoriais e antropométricas referentes a T2; T4: 2ª etapa de intervenção nutricional com e sem suplementação dietética (5ª a 8ª semana);
T5: determinações clínico-laboratoriais e antropométricas finais referentes a T4.
4.6.1 ROTINA DIETÉTICA
Diariamente, de segunda à sexta-feira no horário da merenda escolar, 200g de preparação diet de juçara era entregue aos adolescentes participantes do grupo intervenção na escola, além de orientações de consumo da preparação (ingestão preferencialmente em substituição à merenda escolar ou à alguma outra pequena refeição do dia, e nunca devendo substituir o almoço ou jantar ou ser fracionado ao longo do dia como complementação das refeições) e de orientações sobre a realização do plano alimentar com restrição de 250 Kcal/dia. A preparação diet apresentava aproximadamente 88,6 Kcal e 240 mg de antocianina. O grupo controle, por sua vez, recebeu durante as mesmas 8 semanas, dieta com restrição calórica de 250 kcal/dia e orientações nutricionais. A quantidade da preparação e de antocianinas foi estipulada tomando-se por base outros estudos clínicos (MERTENS-TALCOTT et al., 2008; UDANI et al., 2011; FOLLY, 2014), de forma a obter resultados sem contudo desencadear efeitos adversos indesejáveis nos voluntários.
4.6.2 AVALIAÇÃO ANTROPOMÉTRICA E COMPOSIÇÃO CORPORAL
As avaliações de circunferência da cintura, peso e altura foram realizadas nas duas escolas. Pesaram-se os adolescentes utilizando balança da marca Tanita, a altura determinada com a ajuda de estadiômetro da marca alturexata, e a circunferência da cintura obtida por meio de fita métrica flexível e inelástica. Em todas as situações os adolescentes encontravam-se em posição ortostática, descalços, com os calcanhares juntos, costas retas, com os braços relaxados e estendidos ao longo do corpo e a cabeça no plano horizontal. Com estes dados foi calculado o índice de massa corporal (IMC), que relaciona o peso e a altura ao quadrado. Para a avaliação do IMC/I e estatura/I foram utilizadas as curvas da WHO (2007) e a classificação feita com base no critério escore -z (WHO, 2007). Para a avaliação de circunferência da cintura foi empregado o índice de circunferência da cintura para idade, o qual considera o sexo; utilizando para a classificação o ponto de corte percentil 90, de forma que valores >P90 indicam riscos associados à obesidade (FREEDMAN, 1999).
4.6.3 AVALIAÇÕES BIOQUÍMICAS
Os voluntários foram orientados a realizarem jejum de 12 horas para as coletas de sangue, as quais foram realizadas na semana que antecedeu o início da intervenção, na 5ª semana de intervenção e ao final da última semana (8ª semana) de estudo nas escolas participantes. Um profissional bioquímico realizou as coletas utilizando-se seringas, agulhas e tubos descartáveis para o recolhimento de 10 mL de sangue. As análises foram realizadas no laboratório de bioquímica do CCA-UFES, imediatamente após a coleta. Para as determinações no plasma utilizou-se o método enzimático colorimétrico de Trinder para a dosagem de colesterol total; a metodologia de Friedewald, Levy e Fredrickson (1972) para LDL e VLDL; método colorimétrico acelerador-detergente seletivo para HDL; método enzimático colorimétrico de Trinder para glicose; e determinação direta de triglicerídeos plasmáticos. Os valores de referência adotados para a avaliação das dosagens se encontram na Tabela 1.
Tabela 1. Valores de referência para parâmetros bioquímicos do sangue de
adolescentes
Parâmetro Valor de referência (mg/dL)
Glicemia de jejum normal1,2 < 100
Triglicérides2 < 90 (Limítrofe: 90 – 129) Colesterol total2 < 170 (Limítrofe: 170 – 199)
Colesterol HDL2 > 45
Colesterol LDL2 < 110 (Limítrofe: 110 – 129)
Colesterol VLDL3 < 20
1Sociedade Brasileira de Diabetes (2014); 2Sociedade Brasileira de Cardiologia (2014); 3HONORATO et al. (2010).
4.6.4 AVALIAÇÃO DE MARCADORES INFLAMATÓRIOS
Foram analisadas simultaneamente, no soro dos voluntários, as citocinas pró-inflamatórias interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral (TNF α), bem como a citocina anti-inflamatória interleucina-10 (IL-10), utilizando-se kit multiplex (Millipore®). A sensibilidade de detecção do kit para os analitos é de 0,9 pg/ml para IL-6, 1,1 pg/ml para IL-10 e 0,7 pg/ml para TNF-α.
A adiponectina foi quantificada no soro por meio de kit de ELISA específico da Millipore®. Proteína C reativa (PCR) foi analisada através da técnica ultrassensível turbidimétrica, juntamente com as análises bioquímicas do sangue. Os valores de referência adotados para a predição do risco de desenvolvimento de doenças coronarianas relacionado às concentrações séricas de PCR podem ser observados na Tabela 2. Segundo Pearson et al. (2003), valores de PCR acima de 10,0 mg/dL são indicativos de processo infeccioso, trauma ou inflamação aguda.
Tabela 2. Categoria de risco cardiovascular relativo e concentração de PCR
Risco cardiovascular PCR (mg/dL)
Baixo <0,1mg/dL
Médio 0,1-0,3 mg/dL
Alto >0,3 mg/dL
4.6.5. DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE ANTIOXIDANTE DO SORO
Foi utilizado o kit “QuantichromTM antioxidant assay” da BioAssay Systems para a determinação quantitativa colorimétrica da capacidade antioxidante do soro. A intensidade da cor do complexo colorido formado após a redução de Cu2+ em Cu+ pelo antioxidante foi aferida a 570 nm, sendo proporcional à capacidade antioxidante total do soro. Os resultados foram expressos como micromolar (µM) de Trolox equivalente (TE).
4.7 CUIDADOS ÉTICOS
O projeto de pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos (CEP) do Centro de Ciências da Saúde (CCS-UFES), acrescentando-se a Universidade Estadual de Campinas como Instituição participante, de acordo com a Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, para aprovação dos protocolos descritos. Os voluntários receberam informações sobre a pesquisa, os procedimentos e análises que foram realizados. As etapas de intervenção tiveram início apenas após a aprovação pelo CEP, e esclarecimentos sobre o Projeto e assinatura do termo de assentimento livre e esclarecido juntamente com os responsáveis. O parecer número 494.062 do CEP/UFES referente a etapa de análise sensorial encontra-se no apêndice E, e o de número 1.306.902 relacionado ao ensaio clínico, no apêndice F.
4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para o teste de aceitação, foram calculadas as médias das notas atribuídas às preparações de acordo com os diferentes atributos, e realizada a ANOVA. A frequência em percentuais foi calculada para a intenção de compra, bem como para o teste de preferência. Para a análise dos dados referentes à caracterização físico-química e conteúdo de antocianinas da polpa e das formulações desenvolvidas foi realizada estatística descritiva seguida de ANOVA e teste de Tukey.
No ensaio clínico, para verificar se os dados apresentavam distribuição normal, foi realizado o teste de Shapiro-Wilk. Nessas análises utilizou-se o teste t de Student nos casos de normalidade dos dados e teste Mann-Whitney nos casos de não normalidade dos dados.
Para verificar a influência do tempo de intervenção sobre as variáveis utilizou-se os testes de Friedman com comparações múltiplas de Bonferroni, ANOVA com medições repetidas e comparações múltiplas de Tukey, além do teste t para amostras pareadas e teste de Wilcoxon.
A relação entre o consumo e as variáveis clínicas foi realizado por meio da análise de regressão linear simples.
As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa estatístico IBM SPSS Statistics versão 21, adotando-se o valor de significância de 5% e intervalo de confiança de 95%.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 PRODUTOS A BASE DE AÇAÍ JUÇARA
Para elaborar as preparações padrão e diet, foram testados alguns ingredientes, sendo estabelecido finalmente nas fichas técnicas de preparo (Figura 5) a polpa de açaí juçara, xarope de guaraná, lecitina de soja, goma guar, e ácido cítrico para a preparação padrão. Na formulação diet foi feita a substituição do xarope de guaraná pelo edulcorante sucralose na proporção de 6 gotas/100g de açaí juçara, equivalente a 0,3mL/100g de polpa de açaí juçara, com vistas a obter preparação de menor teor calórico para ser ofertada aos participantes obesos do ensaio clínico. O valor calórico de uma porção de 200g da preparação tradicional resultou em 135,7 Kcal, enquanto a porção de preparação diet apresentou 88,6 Kcal.
