Produção, Caracterização e Atuação Anticariogênica da Quitosana extraída de Cunninghamella elegans UCP 542

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. PRODUÇÃO, CARACTERIZAÇÃO E ATUAÇÃO ANTICARIOGÊNICA DA QUITOSANA EXTRAÍDA DE Cunninghamella elegans UCP 542. THAYZA CHRISTINA MONTENEGRO STAMFORD. Recife Janeiro/2006.

(2) THAYZA CHRISTINA MONTENEGRO STAMFORD. PRODUÇÃO CARACTERIZAÇÃO E ATUAÇÃO ANTICARIOGÊNICA DA QUITOSANA EXTRAÍDA DE Cunninghamella elegans UCP 542 Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, na área de Microbiologia.. Orientadora: Profª Drª Galba Maria de Campos Takaki. Recife Janeiro/2006.

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(5) Aos meus amados pais com sincero reconhecimento e gratidão por terem me ajudado e incentivado a minha formação educacional, pois sem seus sacrifícios, dedicação e amor fiel, hoje não estaria alcançando mais um objetivo em minha vida..

(6) “Não temerei. O medo é o assassino da mente. O medo é a morte pequena que trás a obliteração. Enfrentarei o meu medo. Deixarei que passe sobre mim e através de mim, e quando ele se for voltarei minha visão interior para fitar a sua trilha. Por onde o medo passou. nada. restou,. apenas. eu. permaneço.” Frank Harbet, 1962.

(7) AGRADECIMENTOS . A Deus que sempre me guiou. A Maria, tantas vezes admirável, minha amiga e companheira, que derramaste sobre mim, desde o início desta longa jornada, a tua benção e o teu amor fiel, e por seres minha força e alegria de todas as horas. À Profª. Drª. Galba Maria de Campos Takaki, a quem devoto todo meu respeito, pela maravilhosa pessoa que é, e pela simplicidade com que compartilha seus conhecimentos. A toda equipe de pesquisa da Profª. Drª. Galba Takaki pelo companheirismo na busca de idéias comuns, pelas sugestões, atenção e principalmente pela amizade dispensada. Ao Departamento de Química. Fundamental da Universidade Federal de. Pernambuco por todo auxílio e atenção prestados, durante a. fase experimental desta. pesquisa, em especial aos professores doutores Petrus Santa Cruz, Benício Barros Neto e André Galembeck e suas equipes pelo companheirismo no intercambio de conhecimentos, nas relações interdiciplinares e as valiosas sugestões. Aos professores do Doutorado em Ciências Biológicas pela amizade e conhecimentos transmitidos durante o curso, em especial à Coordenadora do curso Profª Drª Suely Lins Galdino pela atenção e excelente trabalho desenvolvido. Ao Magnífico Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Pe Theodoro Paulo Peters S. J. , pelo acesso aos laboratórios do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais para realização deste trabalho. A CAPES, CNPq, FACEP e FINEP pelo apoio financeiro e confiança no desenvolvimento científico do Brasil. À Sônia Mª da Silva, secretária do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais, pela atenção e amizade dispensadas ao longo de nosso convívio. Aos técnicos Salatiel José de Santana e Severino Humberto de Almeida pela colaboração e amizade durante a fase experimental desta pesquisa..

(8) A minha amada irmã Thatiana Montenegro Stamford Arnaud, obrigada por estar sempre comigo e pela ajuda e apoio na fase de discussão dos dados desta pesquisa. Aos meus amigos, irmãos que a vida me presenteou, Adrian, Daniela, Gisele, Lisângela, Luciana, Marcelo e Severino, por me manterem lúcida e firme nos momentos de dúvida e cansaço, meus sinceros agradecimentos..

(9) SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS. I. LISTA DE TABELAS. IV. RESUMO. VI. ABSTRACT. VIII. 1. INTRODUÇÃO. 10. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 12. 2.1 CARIE DENTÁRIA. 12. 2.1.1. Considerações gerais. 12. 2.1.2. Placa bacteriana. 14. 2.1.3. Processo de desmineralização e remineralização do esmalte dentário. 17. 2.2. FLÚOR: AÇÃO ANTICARIOGÊNICA. 18. 2.3. QUITINA E QUITOSANA. 20. 2.3.1. Considerações gerais. 20. 2.3.2. Produção de quitina e quitosana. 24. 2.3.3. Aplicação da quitosana na área de saúde. 26. 2.3.3.1. Atuação antimicrobiana. 27. 2.3.3.2. Atuação na área odontológica. 28. 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 31. PRIMEIRO ARTIGO.

(10) TÍTULO: Growth of Cunninghamella elegans UCP 542 and production of chitin and chitosan using alternatives culture media. ABSTRACT INTRODUCTION MATERIALS & METHODS Microorganisms Culture medium Microbiological Methods Growth profile Analytical Methods Glucose, nitrogen and pH determination Chitin and Chitosan Extraction Chitin and chitosan characterization Infrared spectroscopy Deacetylation degree (DD%) PRIMEIRO ARTIGO Molecular weight Statistic analysis RESULTS AND DISCUSSIONS. 41 44 44 46 46 47 47 47 48 48 48 49 49 49 49 50 50. REFERENCES. 54. FIGURES. 58. TABLES. 62.

(11) SEGUNDO ARTIGO. TÍTULO: Estudo comparativo das propriedades físico-químicas da quitosana de fungo e de crustáceo.. 63. RESUMO. 65. INTRODUÇÃO. 66. MATERIAIS E MÉTODOS. 67. Reagentes. 67. Caracterização da quitosana:. 68. Espectroscopia na região do Infravermelho (IR). 68. Difração de Raio-X. 68. Determinação do grau de deacetilação. 69. Determinação do peso molecular. 69. Análise Térmica. 70. RESULTADOS E DISCUSSÃO. 70. AGRADECIMENTOS. 75. REFERÊNCIAS. 75. FIGURAS. 78. TABELAS. 81. TERCEIRO ARTIGO TÍTULO: Redução da formação da quitosana. RESUMO INTRODUÇÃO MATERIAIS E MÉTODOS. placa bacteriana. dentária por 83 85 86.

(12) Microrganismos. 88. Condições de cultivo. 88. Substância teste. 89. Atividade antimicrobiana. 89. Adsorção da bactéria ao esmalte dentário. 90. Hidrofobicidade. 90. Produção de glucana extracelular. 91. Processo desmineralização e remineralização do esmalte dentário. 92. Microscopia eletrônica de varredura. 93. Considerações éticas. 93. Analise estatística. 94. RESULTADOS E DISCUSSÃO AGRADECIMENTOS REFERÊNCIAS TABELAS FIGURAS LEGENDAS DAS TABELAS E FIGURAS. 94 94 100 100 105 107 109. CONCLUSÕES. 110. ANEXOS. 112.

(13) LISTA DE FIGURAS. REVISÃO DE LITERATURA. Figura 1. Representação da etiologia da cárie dentária, segundo diagrama proposto por Newbrun, 1992. Figura 2.. 12. Formação da placa bactéria pela produção de polissacarídeo. extracelular. A- Esquema dos constituintes do processo de adesão. 1- Película adquirida, 2- Esmalte dentário, 3-Cocos, 4- Proteínas da parede celular bacteriana, 5- Glucosiltransferase , 6- Mutana, 7- Dextrana. B- Microscopia eletrônica de varredura x 7.000. Adesão in vitro de S. mutans (cultivo em meio base para dextrana). co- Cocos, MO- matriz orgânica. Fonte: Marcantoni, M. Ecología de la cavidad bucal. In.: Negroni. Microbiologia estomatológica. Fundamentos y guia práctica. Figura 3. Esquema da reação de N-desacetilação da quitina. Fonte: Anjos, F.S.C. Filmes e beads à base de quitosana: incorporação de compostos luminescentes e. 16.

(14) estudos de interações hospedeiro-hóspede. 2005. Dissertação (Mestrado)Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco.. 21. Figura 4. Arranjo das cadeias de α e β quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b). Fonte: Tharanathan; Kittur, Critical Rev. Food Sci. Nutrit., 43(1),2003.. 22. Figura 5. Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos 23. da Ordem Mucorales.. PRIMEIRO ARTIGO. Figure 1. Biomass (g/L) from Cunninghamella elegans (UCP 542) and chitin (mg) and chitosan (mg) extracted per 1g of dry weight of Cunninghamella elegans (UCP 542) biomass grown in different culture media, after 96 hours of time cultivation, at 28ªC, 150rpm.. 58. Figure 2. Profile of Cuninghamella elegans (UCP 542) grown in yam bean 59 medium at 28°C, 150 rpm. Figure 3 Chitin and chitosan produced by C. elegans grown in yam bean medium, during 96 hours of cultivation. Figure 4. Infrared spectra of chitin (A) and chitosan (B) extracted from. 60.

(15) Cuninghamella elegans (UCP 542) grown in yam bean medium.. 61. SEGUNDO ARTIGO. Figura 1. Espectroscopia pelo raio de infra-vermelho da quitosana de origem microbiológica (A) e comercial, extraída da carapaça de crustáceos (B).. 78. Figura 2. Difração de raio-X da quitosana microbiológica (A) e comercial (B).. 79. Figura 3. Curvas de DSC e TGA das amostras de quitosana microbiológica (A) e comercial (B) sob fluxo de nitrogênio de 50mL.min-1. Massa das amostras de aproximadamente 10mg, razão de aquecimento de 10°C min-1 , suporte de amostra de alumínio.. 80. TERCEIRO ARTIGO. Figura 1. Diagrama de dispersão estratificado de acordo com a atuação da quitosana, microbiológica e comercial: na inibição da adesão das bactérias cariogênicas ao dente (A); na diminuição da hidrofobicidade da célula bacteriana (B) e na produção de glucana extracelular pelas bactérias cariogênicas (C). Figura 2. Microscopia Eletrônica de Varredura da superfície dentária (SD): na ausência de bactéria e quitosana (A); na presença de S. mutans formando. 107.

(16) biofilme dentário (BD), constituído por bactéria e polissacarídeos extracelulares (B); na ausência de bactéria e presença de quitosana (Q), a qual interage com o dente formando um filme, em superfície lisa (C e D) e em superfície de cicatrícula e fissura (E e F).. 108. LISTA DE TABELAS. PRIMEIRO ARTIGO. Table 1. Values of deacetylation degree (%DD), intrinsic viscosity ([η]), and viscosimetric molecular weight (MV) values for chitin and chitosan produced by C. elegans (UCP 542) grown in yam bean medium. 62. SEGUNDO ARTIGO. Tabela 1. Valores de índice de cristalinidade (ICR), dimensão média dos cristalitos (DAP), grau médio de desacetilação (%GD), de viscosidade intrínseca, ([η]), e os valores da massa molar média viscosimétrica (MV) para as amostras de quitosana microbiológica e comercial. Tabela 2. Resultados de TG e DSC para a decomposição térmica da amostra de. 81.

(17) quitosana comercial (QC) e microbiológica (QM) em atmosfera de nitrogênio. 82. TERCEIRO ARTIGO. Tabela 1. Atividade bacteriostática e bactericida da quitosana comercial e microbiológica diluída em ácido acético 1% para bactérias cariogênicas do gênero Streptococcus.. 105. Tabela 2. Dosagem da perda e do ganho de cálcio e fósforo do esmalte dentário durante o processo de desmineralização e remineralização do dente tratado com quitosana comercial e microbiológica... 106. V.

(18) RESUMO A cárie dentária é uma doença infecto-contagiosa que acomete cerca de 95% da população mundial. A placa bacteriana dentária é constituída principalmente por microrganismos do gênero Streptococcus, considerado o principal agente etiológico da cárie. A eficiência de produtos sintéticos e naturais que interferem nas propriedades adesivas e na colonização da cavidade bucal por bactérias cariogênicas, visando prevenir a cárie vem sendo objeto de pesquisas recentes. A quitosana é um polissacarídeo natural, biocompatível e biodegradável, derivado da N-deacetilação da quitina. A quitina é encontrada na parede celular de fungos, exoesqueleto de crustáceos e cutículas de inseto. A quitosana foi estudada devido às suas propriedades de inibição do crescimento bacteriano e do processo de colonização da superfície dentária por bactérias cariogênicas. Com este objetivo, foi realizado um screening de meios de cultura para a produção de quitina e quitosana por Cunninghamella elegans (UCP 542). O meio selecionado a base de jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban), apresentou maior produção de biomassa (20,4g/L), de quitina (409mg/g de biomassa) e de quitosana (39,1mg/g de biomassa). A quitosana microbiológica isolada apresentou grau de deacetilação em torno de 85% e massa molar média viscosimétrica (Mv) de 4,016 x 104 (g/mol).. Dando prosseguimento aos estudos, foi realizada a. caracterização físico-química da quitosana de origem microbiológica e de crustáceo. As investigações sobre a atividade antibacteriana da quitosana para Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis e Streptococcus oralis, foram realizadas no sentido de estabelecer a concentração mínima bacteriostática e a concentração mínima bactericida. A resposta antimicrobiana da quitosana microbiológica e de crustáceo foram.

(19) semelhantes, sendo o efeito bacteriostático na concentração de 2mg/mL e o bactericida na concentração de 2,5mg/mL para S. mutans, S. mitis e S. oralis e de 5mg/mL para S. sanguis. Os estudos dirigidos para avaliar os mecanismos de adesividade da quitosana ao dente e à bactéria foram realizados através da Microscopia Eletrônica de Varredura, determinação da hidrofobicidade da parede celular bacteriana e produção de glucana pelas amostras de Streptococcus. Os resultados seqüenciais obtidos indicaram maior habilidade da quitosana na redução e adsorção das bactérias cariogênicas ao dente nas concentrações acima de 2,0mg/mL. Ambas as amostras de quitosana diminuiram a produção de glucanos, bem como a hidrofobicidade da parede celular de S. mutans, S. sanguis, S. mitis e S. oralis. Ao final, foi observada a ação da quitosana microbiológica e de crustáceo no processo de desmineralização e remineralização do esmalte dentário, quando submetido à presença de ácido cítrico 50mM (pH 3,0), através da quantificação de cálcio e fósforo. Os dentes previamente tratados com ambas as amostras de quitosana apresentaram redução nas perdas de cálcio e fósforo. Os resultados obtidos confirmaram o grande potencial biotecnológico da quitosana microbiológica para prevenção e terapêutica da doença cárie, sugerindo seu emprego como biomaterial odontológico.. VII.

(20) ABSTRACT. Dental plaque is believed to be a major etiologic factor in the development of dental caries. Specific types of microorganisms are associated with plaque as it develops and matures. Studies involving the reduction in the accumulation of dental plaque have therefore been carried out by many investigations. Chitosan is a natural and biocompatibly, polysaccharide derived from chitin by N-deacetylation. Chitin is found in a wide range of natural sources, such as crustaceans, insects annelids, mollusks, coelenterates and is a common constituent of fungal cell walls. Chitosan was studied due its inhibitory properties on the bacterial growth and the dental colonization processes by cariogenic bacteria. The aim of the present paper was investigate the chitin and chitosan production from Cunninghamella elegans (UCP 542) grown in a submersion fermentation using five culture media as substrate. The results showed higher yield of biomass (24.3g/L) and production of chitin (440mg/g of biomass), and chitosan (66mg/g of biomass) in yam bean medium. Chitin and chitosan showed degree of deacetilation and viscosimetric molecular weight up to 6.2% and 4.255 x 104 g/mol, and 85% and 4.016 x 104 g/mol, respectively. Giving continuation to the studies, chitosan from fungal and crustacean were characterized by chemical and physical analysis. The investigation of chitosan antimicrobial action against Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguis and Streptococcus oralis, was carried through in the direction to establish the minimal bacteristatic concentration and the minimal bactericide concentration.. The chitosan, from fungal and crustacean, showed similar. antimicrobial activity , having a bacteriostatic action in concentration of 2mg/mL, and.

(21) bactericide action in 2,5mg/mL for S. mutans, S. mitis and S. oralis and in 5mg/mL for S. sanguis. The directed studies to evaluate the chitosan adhesives mechanisms to dental enamel and to bacteria, had been carried through the following methods: Scanning Electron Microscopy, determination of bacteria cell wall hydrophobicity and glucan production by Streptococcus samples. The sequential results obtained indicated a reduction in the adsorption of bacteria to dental enamel, with better result in 2mg/mL. Chitosan decreased bacteria glucan production and the bacteria cell wall hydrophobicity. To the end was observed the chitosan, from fungi and crustacean, action on the dental enamel desmineralization and mineralization process was observed with 50mM citric acid (pH 3.0), for the measurement of calcium and phosphorus. Chitosan decreased the calcium and phosphorus loss from dental enamel and promoted the remineralization process of tooth. The results confirm a high biotechnological potential of chitosan from fungi as an anticarie biomaterial, suggesting for use in dental products.. IX.

(22) 1. INTRODUÇÃO A cárie dentária é uma doença infecto-contagiosa de maior prevalência e incidência na espécie humana, constituindo-se em relevante problema de saúde pública na maioria dos países (LORENZO e LORENZO, 2002; STAMFORD et al., 2000). Caracteriza-se por uma desmineralização progressiva dos tecidos calcificados dos dentes, devido à ação de ácidos produzidos durante a metabolização de açúcares por bactérias que se encontram aderidas ao esmalte dentário, formando a placa bacteriana (MARCANTONI, 1999; STROPARO e STROPARO, 2002). Com o advento da ciência e tecnologia as pesquisas de produtos que visam à prevenção da instalação da cárie passaram a ser de primordial importância para a indústria farmacêutica e odontológica. Entre os produtos anticariogênicos, o flúor tem mostrado resultados positivos no controle e prevenção da cárie dental, sendo, atualmente, o produto mais utilizado em consultório e domicílio (MARCANTONI, 1999; STAMFORD et al. 2000). Contudo, o uso indiscriminado do flúor culminou com a crescente ocorrência de pessoas acometidas pelos seus efeitos colaterais, sendo o mais comum a fluorose dentária (PERES et al., 2003; RODRIGUES, et al., 2003). Assim, vários estudos vêm sendo realizados com a finalidade de verificar a eficácia de novos produtos que interfiram na colonização da cavidade bucal por bactérias cariogênicas, que sejam biocompatíveis e auxiliem na regeneração dos tecidos dentários injuriados pelo processo carioso. A quitosana devido à sua natureza biocompatível e suas propriedades funcionais, apresenta amplo potencial para aplicação como biomaterial na área médico-odontológica.

(23) (TARSI et al, 1998; SANO et al, 2003). Neste sentido, foram realizadas pesquisas, visando verificar a atuação anticariogênica da quitosana microbiológica, através das seguintes etapas:. I. Seleção de meio de cultura de baixo custo para produção, extração e caracterização de quitina e quitosana por Cunninghamella elegans UCP 542; II. Estudo comparativo das propriedades físico-químicas da quitosana de fungo e de crustáceo; III. Determinação da atuação anticariogênica da quitosana microbiológica e de crustáceo: determinação da atividade antimicrobiana frente bactérias cariogênicas; avaliação dos mecanismos de adesão da quitosana ao dente e às bactérias e avaliação da ação da quitosana no processo de desmineralização e remineralização do esmalte dentário..

(24) 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1. CARIE DENTÁRIA 2.1.1. Considerações gerais A cárie dentária é uma enfermidade bacteriana multifatorial e transmissível que envolve cerca de 95% da população mundial de forma e qualidade diferente para cada indivíduo (WALTER e NAKAMA ,1992; LORENZO e LORENZO, 2002). Para sua instalação, é necessária a interação dos seguintes fatores: a) o hospedeiro, correspondendo ao dente e a saliva; b) microflora bacteriana que irá formar a placa dental e c) o substrato cariogênico, constituído a base de carboidratos fermentáveis. Contudo, como demonstrado na figura 1, é a duração e a freqüência da interação entre estes fatores que irá produzir a lesão cariosa (NARVAL et al., 2000; CAMPOS e CAMPOS, 2002).. Microrganismo. Microflora Substrato. CARIE. Tempo. Hospedeiro. Figura 1. Representação da etiologia da cárie dentária, segundo diagrama proposto por Newbrun, 1992..

(25) De acordo com Tenuta et al. (2003) e Stamford et al.(2005), a cárie é muito mais do que simples cavidades que aparecem na superfície dentária. É a conseqüência do desvio do comportamento da dieta, associada com uma hiperinfecção por microrganismos cariogênicos e um distúrbio da produção salivar. Há fatores do hospedeiro que modulam a atividade de cárie, tais como: fluxo salivar, capacidade tampão da saliva, higiene bucal e desordens locais ou sistêmicas, que podem alterar a resistência do hospedeiro, a cariogenicidade da dieta e a virulência da microbiota oral. Segundo Sperança et al. (1997) a cárie dentária é uma patologia reconhecida como de natureza microbiana, que está ligada a fatores de natureza ecológica e a determinantes bioquímicos. Embora se faça necessária à presença de três fatores chamados primários (microbiota- dieta- hospedeiro), a tríade fatorial identifica a microbiota da placa como sendo o componente mais óbvio da virulência traduzida pela cariogenicidade. Contudo, para Almstahl e Wikstrom (1999) e Sánchez e Sáenz (2001), não é a presença de bactérias cariogênicas, por si só, que promove a instalação da cárie dental. Embora os fatores biológicos sejam essenciais para o aparecimento de várias doenças, outros elementos podem condicionar o surgimento e influir na expansão. Dentre estes, estão o desenvolvimento econômico, social e educacional do país, assim como os padrões de cultura e tradição popular que regulam os hábitos e as condutas pessoais e coletivas (PERES, et al., 2000; PINTO, 2000; MALTZ e SILVA, 2001). Desta forma, outros modelos, para explicar a complexidade multifatorial da doença cárie, foram propostos, tentando classificar dentro de cada componente do processo, inúmeros fatores.

(26) envolvidos e levando em consideração aspectos sociais e culturais (THILSTRUP e FEJERSKOV, 2001; GONÇALVES, 2003). Com base nos novos modelos etiológicos propostos, a cárie passou a ser denominada como uma doença infecto-contagiosa, trifatorial, endógena, comportamental e reversível na fase inicial (LORENZO e LORENZO, 2002). A cárie caracteriza-se por uma desmineralização progressiva dos tecidos calcificados dos dentes, devido à ação de ácidos produzidos. pelas. bactérias. que. se. encontram. aderidas. ao. esmalte. dentário. (MARCANTONI, 1999; STROPARO e STROPARO, 2002).. 2.1.2. Placa bacteriana A placa dentária é definida, pela Organização Mundial de Saúde (OMS), como uma entidade bacteriana proliferante com atividade enzimática que se adere firmemente a superfície dentária e que por sua atividade bioquímica e metabólica, tem sido proposta como o principal agente etiológico da cárie dental (WHO, 1997). Todas as superfícies da cavidade bucal são colonizadas por bactérias. Cada superfície possui uma população distinta de microrganismos, a qual é determinada, em parte, por fatores como sensibilidade ao oxigênio, disponibilidade de nutrientes e a capacidade de aderir à uma superfície específica (LOESCHE, 1993). A flora bacteriana das superfícies bucais é constituída principalmente pelo gênero Streptococcus na faixa de 30% a 60%. O grupo viridans está constituído por Streptococcus salivarius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans e Streptococcus sanguis. A localização do Streptococcus mitis tem sido observada na mucosa bucal, enquanto que S. salivarius na língua, no caso de S. mutans e S. sanguis nos dentes e na placa bacteriana..

(27) A placa bacteriana na superfície dental pode conter até 1011 Unidades Formadoras de Colônia (UFC) de Streptococcus/grama de placa, além de Actinomicetos, Lactobacillus e Veillonella (WOLINSKY, 1997; UZEDA, 2003). Contudo, S. mutans constitui a maior parte da flora total de Streptococcus da placa, sendo, no entanto, a principal bactéria cariogênica, devido às suas características acidogênicas e acidúricas e sua capacidade de se aderir à superfície lisa do dente (DASANAYAKE et al., 1995; STAMFORD et al., 2005). A superfície limpa do esmalte dentário tem predomínio de mais grupo fosfato disponível do que íons cálcio. A adesão de moléculas nesta superfície engloba a interação dos grupos fosfatos com os íons cálcio da saliva para formar pontes de carga negativa (carboxil-fosfato-sulfato e ácido siálico). Os grupos com carga positiva dos componentes salivares, principalmente glicoproteínas ácidas, interagem de maneira direta com o fosfato na superfície do dente, formando a película adquirida (MARCANTONI, 1999; THILSTRUP e FEJERSKOV, 2001; UZEDA, 2003). A presença elevada de grupamentos sulfato e carboxila na película adquirida, aumentam a carga negativa da superfície do dente (LOESCHE, 1993). Como as bactérias possuem cargas negativas ao se aproximam do dente, ocorre uma repulsão elétrica, ente a bactéria e a superfície dentária (MALTZ, 1996). A formação da placa bacteriana dental envolve uma combinação de forças físicoiônicas, hidrofóbicas, de Van der Waals e a fixação de hidrogênio entre a superfície dentária e os componentes orgânicos e inorgânicos da saliva. As forças de repulsão entre a bactéria e a película adquirida são anuladas pela ação do cálcio da saliva, que forma uma ponte de ligação entre o dente e a película. Desta forma se formam agregados de glucoproteínas-cálcio-bactéria. A adesão de bactérias ao dente, ocorre também pela ação de vários componentes salivares que servem como receptores para proteínas de união da.

(28) bactéria, principalmente S. mutans, como podemos visualizar na figura 2. A produção de glucanas pelas bactérias reforçam esta união (MARCANTONI, 1999; RODRIGUES et al, 2003). Segundo Vacca-Smith e Bowen (1998) e Uzeda (2003), S. mutans, S. sanguis e S.mitis são capazes de sintetizar polímeros de α- glucana intracelular e extracelular, solúvel e insolúvel, pela degradação da sacarose pela ação da enzimas transferases. A glucana estabelece a ligação do microrganismo de forma irreversível ao dente, favorecendo a formação da placa bacteriana (WUNDER e BOWEN, 1999; CURY et al., 2000).. A. permanência da placa bacteriana na superfície do esmalte dentário acarreta perda de minerais do dente, pela ação dos ácidos produzidos pelo metabolismo bacteriano, ocasionando a instalação da doença cárie (MOUTON et al., 1999; STEINBERG et al., 1999). A. B. MO. MO. co. Figura 2. Formação da placa bactéria pela produção de polissacarídeo extracelular. AEsquema dos constituintes do processo de adesão. 1- Película adquirida, 2- Esmalte dentário, 3-Cocos, 4- Proteínas da parede celular bacteriana, 5- Glucosiltransferase , 6Mutana, 7- Dextrana. B- Microscopia eletrônica de varredura x 7.000. Adesão in vitro de S. mutans (cultivo em meio base para dextrana). co- Cocos, MO- matriz orgânica. Fonte: Marcantoni, M. Ecología de la cavidad bucal. In.: Negroni. Microbiologia estomatológica. Fundamentos y guia práctica..

(29) 2.1.3. Processo de desmineralização e remineralização do esmalte dentário O esmalte dentário, segundo Dawes (2003), é composto principalmente de sais de fosfato de cálcio dispostos em uma estrutura cristalina denominada hidroxidoapatita. Em pH abaixo de 5,5 os cristais de hidroxidoapatita se dissolvem liberando íons cálcio e fosfato para saliva, de acordo com a seguinte equação: desmineralização. 8H + Ca10(PO4)6OH2. Ácidos. Hidroxidoapatita. remineralização. 6(PO4) + 10Ca++ + 2OH-. O processo de desmineralização e remineralização do dente é dinâmico e envolve fenômenos físico-químicos que são parcialmente compreendidos. A reação de desmineralização ocorre em pH abaixo de 5,5 (pH crítico do esmalte dentário), quando íons hidrogênio deslocam os íons de cálcio e fosfato da porção mineral, liberando-os no meio bucal (FRAUNHOFER e ROGERS, 2004). Em condições fisiológicas, tem se demonstrado que a saliva e a placa bacteriana encontram-se saturadas de íons cálcio e fosfato, o que favorece o estado cristalino da hidroxidoapatita do esmalte dentário (MALTZ, 1996; MARCANTONI, 1999). Entretanto, a produção de ácidos decorrentes do metabolismo bacteriano atua reduzindo o pH da placa bacteriana, em uma velocidade maior do que a capacidade local de neutralização pela saliva (SISSONS et al, 1998; ALVES e MEDEIROS, 1997 e BURNE, 1998). Os ácidos ligam-se ás hidroxilas da hidroxidoapatita, favorecendo a formação de fosfato de cálcio e subseqüente dissolução do esmalte dentário (TENUTA et al, 2003; ZAURA e CATEM, 2004)..

(30) Os principais ácidos produzidos pelas bactérias cariogênicas, durante a fermentação dos carboidratos da dieta, são os ácidos acético, láctico e fosfórico (MARGOLIS et al., 1999). Contudo, a desmineralização do esmalte dentário pode ocorrer também pela ingestão de alimentos ácidos. A maioria dos refrigerantes contém algum tipo de acidulante, como ácido cítrico, ácido fosfórico ou outros ácidos orgânicos.. Esses ácidos polibásicos. promovem a remoção de cálcio do dente por quelação, como também, mantém o pH ácido, pois apresentam capacidade tampão (FRAUNHOFER e ROGERS, 2004; HUGHES et al, 2004). O processo de desmineralização pode ser revertido com o aumento da concentração de íons cálcio ou pela normalização do pH (SOET et al., 2000).. 2.2. FLÚOR: AÇÃO ANTICARIOGÊNICA O controle dos microrganismos orais está relacionado com a formação da placa bacteriana e com o processo de regeneração do esmalte dentário, é utilizada grande variedade de agentes inibidores de cárie, sendo o flúor o mais utilizado na clínica odontológica (MARCANTONI, 1999; FRANCHINI et al., 2002). O uso do flúor no controle e prevenção da cárie dental tem mostrado resultados positivos, sempre que usado em conjunto com o controle mecânico da placa (RODRIGUES et al., 2003; CANGUSSU e CASTELLANO, 2004). O flúor apresenta dois mecanismos de ação anticariogênica. O primeiro é a ação antimicrobiana e o segundo é a formação de fluorapatita, reduzindo a solubilidade do esmalte pela ação de ácidos. A atuação do flúor é influenciada pelo pH (RODRIGUES et al, 2003). Os fluoretos atuam sobre a célula bacteriana e alteram seu crescimento ao inibir o metabolismo energético celular, atuando de forma irreversível (MARQUIS, 1995). O flúor.

(31) é mais eficaz em pH ácido, pois apresenta maior reatividade devido à quantidade o íon flúor que se ligar ao ácido formando ácido fluoridríco (HF), o qual é mais facilmente absorvido pela célula bacteriana (STOOKEY et al, 2003). Como o pH intracelular das bactérias é em torno de 7,0 ocorre à dissociação do HF em suas formas iônicas. O íon flúor interfere no ciclo de Krebs ao combinar-se com a enzima enolase, alterando o metabolismo intracelular dos carboidratos. (LOESCHE, 1993; GALVEZ et al, 2000). Ao inibir a enzima enolase, o flúor, também, diminui a produção de ácido láctico pela bactéria (MARCANTONI, 1999). Outro mecanismo de ação do flúor é a inibição da aderência bacteriana e a formação da fluorapatita. Em concentração em torno de 1 a 30ppm o flúor inibi a formação da película adquirida, ao alterar as cargas eletrostáticas da superfície do esmalte dentário. Na concentração de 200 a 500ppm, o flúor se une ao cálcio da saliva por quelação e impede que este atue como ponte de ligação entre a bactéria e o dente (MALTZ, 1996; MODESTO, 1997). Durante a aplicação tópica do flúor, na forma de fluoreto de cálcio, ocorre adsorção superficial dos íons fosfato dentro da superfície do fluoreto de cálcio. A produção de ácidos pelas bactérias diminuem o pH, fazendo com que haja uma redução na concentração de fosfato. Desta forma o fluoreto de cálcio libera flúor, o qual será estruturado dentro da hidroxidoapatita do esmalte dentário, através das reações de dissolução e reprecipitação (KRASSE, 1988; RAELLA e SAXEGAARD, 1990; TORRADO et al, 2004). Apesar de suas características anticariogênicas o flúor é uma substância reativa e tóxica, sendo considerada como padrão ótimo para. administração, no Brasil, a. concentração de 0,7ppm (ASSIS et al, 1999). A maior parte do flúor ingerido deposita-se nos tecidos ósseos, enquanto que só uma pequena porção se dirige para os dentes O flúor.

(32) pode produzir efeitos adversos de forma crônica ou aguda. Na crônica, os fluoretos circulantes no organismo afetam a mineralização dos dentes formando um esmalte hipoplásico de diferentes manifestações clínicas, denominada fluorose dentária. O consumo de 6mg/dia de flúor pode causar danos ósseos e neurológicos, além da fluorose em crianças com deficiência de cálcio. A partir de 10mg/dia o flúor é considerado tóxico, podendo acarretar problemas gástricos, pela formação de ácido fluorídrico no estômago, podendo ocasionar também alterações ósseas como fluorose esquelética, artrite e fraturas de stress, associadas a distúrbios de aprendizagem em infantes (FORTE et al, 2001). Devido à toxicidade do flúor, vários estudos vêm sendo realizados com a finalidade de verificar a eficácia de novos produtos que interfiram na colonização da cavidade bucal por bactérias cariogênicas, que sejam biocompatíveis e auxiliem na regeneração dos tecidos dentários injuriados pelo processo carioso (COVAZZOLA, 2003).. 2.3. QUITINA E QUITOSANA 2.3.1. Considerações gerais A quitina é um polímero natural, insolúvel em água, linear que apresenta o mesmo tipo de unidade monomérica β-1,4 N-acetilglucosamina e com exceção da celulose é o polissacarídeo mais abundante e largamente distribuído na natureza (CANELA e GARCIA, 2001). Quitosana é um polímero derivado da N-deacetilação da quitina (Figura 3), podendo os grupos N-acetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados da quitosana (KHAN et al., 2002; OKAWA et al., 2003). A quitina é encontrada naturalmente.

(33) no exoesqueleto dos crustáceos, insetos e na parede celular de fungos (CANELA e GARCIA, 2001; ANDRADE et al., 2003).. OH OH CH2 H OH H. H. O. H NH O. H OH H. CH 2. OH. O H. H O. H. OH. CH 2. CH2. NaOH H. Desacetilação. O. H. O. H. NH O. O H. H. OH. H. H. NH2. H. H OH. H. H. NH2 n. n. Quitina. Quitosana. Figura 3. Esquema da reação de N-desacetilação da quitina. Fonte: Anjos, F.S.C. Filmes e beads à base de quitosana: incorporação de compostos luminescentes e estudos de interações hospedeiro-hóspede. 2005. Dissertação (Mestrado)-Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco. A quitina foi isolada pela primeira vez em 1811 por Braconnot, quando trabalhava com fungos, o qual concluiu que os mesmos continham uma nova substância que era completamente distinta da encontrada na madeira. Em 1823, Odier isolou uma substância contida nas carapaças de insetos, a qual chamou de quitina. Odier e Childre relataram que isolaram a quitina com vários tratamentos com soluções de hidróxido de potássio concentrado. Isso os levou a um equívoco, pois na realidade eles isolaram a quitosana. Esta foi descrita pela primeira vez em 1859 por Rouget, e o seu nome foi proposto em 1894 por Hoppe-Seyler, pelo fato de que a quitosana possui a mesma quantidade de nitrogênio da quitina. A quitosana foi produzida industrialmente pela primeira vez em 1971, no Japão (CAMPOS-TAKAKI, 2005)..

(34) Quitina e quitosana são polissacarídeos conhecidos por apresentarem polimorfismo, podendo assumir três conformações. As cadeias destes polímeros ligam-se através do “hidrogênio” em três diferentes estruturas cristalinas (α,β,γ), cujo arranjo depende da polaridade adquirida pelas cadeias de açúcar. A estrutura α é a mais abundante na natureza e encontra-se geralmente nos crustáceos, enquanto que a β é encontrada comumente nos fungos (WINTEROWD e SANDFORD, 1995; JAWORSKA et al, 2003). Esta ultima, caracteriza-se por ser mais flexível e menos dura do que a forma α, apresentando melhor reatividade na preparação de derivados químicos (CAMPOS-TAKAKI, 2005). As estruturas cristalinas são diferenciadas pela orientação das cadeias e o tipo de células unitárias que formam o retículo. Na estrutura α apresenta cadeias orientadas com arranjo antiparalelo e células unitárias ortorrômbicas (Figura 4a), apresentando campo magnético forte. A estrutura β, apresenta as cadeias orientadas de forma paralela e é constituída de células monoclínicas (Figura 4b). A estrutura γ tem orientação mista, não havendo, na literatura, estudos relacionados ao tipo de célula unitária (RAMAKRISHNAN e PRASAD, 1972; THARANATHAN e KITTUR, 2003; LIMA, 2005). a. b. Figura 4. Arranjo das cadeias de α e β quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b). Fonte:Tharanathan; Kittur, Critical Rev. Food Sci. Nutrit., 43(1),2003.

(35) A biossíntese de quitina difere significativamente em fungos e crustáceos, contudo, etapas de biossíntese e maquinaria enzimática para regulação catalítica são similares, como observado na figura 5.. Crustáceo. Fungo. stáceo. Fungo. Glicose-6P. Superfície celular. N-acetilglicosamina-1P. (Zimogêno). Glicose-6P UDP-N-acetilglicosamina. UDP-N-acetilglicosamina Mg. Quitina sintetase. Citoplasma citoplasma. UTP. +2. Protease Protease. Mg+2. Quitina sintetase. Quitina. Quitina. Quitina desacetilase. Conversão química. Quitosana. Quitosana. Figura 5. Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales.. Nos. crustáceos. inicia-se. pela. conversão. de. glicose-6-fosfato. em. N-. acetilglicosamina-1-fosfato, envolvendo uma série de etapas que requerem várias reações enzimáticas. A N-acetilglicosamina-1-fosfato reage com a UTP formando a UDP-NAcetilglicosamina, que finalmente, transfere a N-acetilglicosamina para a polimerização de cadeias de quitina em um processo mediado pela enzima quitina-sintetase e íons Mg+2 ,.

(36) como catalisador, resultando na formação de uma longa cadeia de sub-unidades monossacarídicas unidas por ligações β-1→4 (CABIBI, 1987). A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina mediante tratamento químico com NaOH em alta temperatura (DAVIS e BARTINICK- GARCIA, 1984). Nos fungos a síntese de quitina e de quitosana ocorrem simultaneamente. A síntese de quitina é altamente compartimentalizada. A enzima quitina sintetase ocorre na forma de zimógeno, sendo distribuída em regiões específicas da superfície celular, em vesículas especializadas chamadas quitossomas (GARCIA, 1989). A montagem macromolecular inicia-se fora do citoplasma, onde a enzima protease atua na superfície celular ativando o zimogêno. Desta forma a UDP-N-acetilglicosamina é produzida a partir da glicose, e a quitina sintetase catalisa a transferência do N-acetilglicosamina para polimerização da cadeia formando quitina. A quitosana presente na parede celular de alguns fungos da Ordem Mucorales, é formada a partir da deacetilação da cadeia de quitina nascente, pela ação da quitina deacetilase, durante a biossíntese de quitina. As sínteses de quitina e de quitosana são realizadas pela organização espacial da síntese de quitina na superfície celular (DAVIS e BARTINICK- GARCIA, 1984).. 2.3.2. Produção de quitina e quitosana Exoesqueletos de crustáceos constituem a fonte tradicional para obtenção de quitina e quitosana. O conteúdo de quitina nos crustáceos varia com a espécie estando o rendimento entre 2 a 12% da massa corpórea total, e de 13 a 42% na casca. A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina utilizando NaOH 50% e temperatura em torno de 110ºC.

(37) (SYNOWIECHI e AL-KHATEEB, 2003).. Existem várias limitações em relação à. viabilidade do processo de obtenção da quitina e quitosana proveniente de crustáceos, tais como: adaptação ao clima, sazonalidade, locais de confinamento e o processamento em larga escala associado com a conversão química de quitina em quitosana (FRANCO et al., 2005; AMORIM et al., 2005). Utilização de massa micelial de fungos como fonte alternativa de quitina e quitosana tem demonstrado grandes vantagens, tais como: extração simultânea de quitina e quitosana, independência dos fatores de sazonalidade, produção em larga escala (AMORIM et al., 2001; FRANCO et al., 2005). A quantidade destes polissacarídeos extraídos da biomassa varia com a espécie de fungo e condições de cultivo utilizadas. Geralmente fungos da Classe Zygomycetes apresentam maior quantidade de quitina e quitosana em sua parede celular (CHUNG et al., 1994; FRANCO et al., 2005). Várias pesquisas utilizando fungos como fonte alternativa de quitina e quitosana relatam rendimentos iguais ou superiores, destes polímeros, aos obtidos quando utilizadas fontes tradicionais (ANDRADE et al., 2003; AMORIM et al., 2005). Estudos utilizando biomassa de Mucor rouxii e M. javanicus como fonte de polissacarídeos obtiveram rendimento de quitosana em torno de 8% e de quitina entre 8,9% e 23,9% (SYNOWIECK e AL-KHATEEB, 1997; ANDRADE et al., 2003). Em recentes estudos, tem se estabelecido métodos de otimização para processos de obtenção de quitina e quitosana a partir de massa micelial de Cunninghamella elegans, sendo relatados rendimentos de quitosana entre 5% e 8%, e de quitina em torno de 13% a 24% (ANDRADE et al., 2000, AMORIM et al., 2001; FRANCO et al., 2005)..

(38) 2.3.3. Aplicação da quitosana na área de saúde A quitosana é um polímero caracterizado por propriedades específicas que revelam seu potencial para inúmeras aplicações, destacando-se sua alta biocompatibilidade. A quitosana tem definido o seu status regulatório e toxicológico, sendo sua toxicidade oral em humanos (LD50) reportada em 16g/Kg de peso corpóreo (YADAV e BHISE, 2004). As principais propriedades deste polissacarídeo são: bioatividade, biodegradabilidade (metabolizada por várias enzimas, especialmente lisozima), biocompatibilidade, reatividade do grupo amino deacetilado, permeabilidade seletiva, ação polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e capacidade adsortiva (SYNOWIECKI e ALKHATEEB , 2003; THARANATHAN e KITTUR, 2003). Em pH biológico a quitosana apresenta-se como um policátion. Em meio ácido os grupos amino da quitosana captam íons hidrogênio do meio, resultando em uma carga global positiva ao polímero, o que permite a sua interação com moléculas carregadas negativamente tais como: gorduras, esmalte dentário, tecidos moles, membrana celular, entre outras. Essa capacidade bioadesiva da quitosana é o principal fator para o seu uso em cosméticos, incluindo pasta de dente e cremes (HORNER et al., 1997; PAUTLOWSKA, 1997). A quitosana vem sendo extensivamente estudada na atualidade devido às suas propriedades peculiares que lhe conferem uma variedade de aplicações, tais como: carreador de drogas de liberação controlada (ASPDEN et al., 1997; TAKEUCHI et al., 2001), antibacteriano (IKINCI et al., 2002; CHUNG et al., 2004; YADAV e BHISE, 2004).

(39) e antiácido (MUZZARELLI et al.,1989; SHIBASAKI et al.,1994a; SHIBASAKI et al., 1994b); inibe a formação de placa bacteriana e descalcificação do esmalte dentário (TARSI et al., 1997; SANO et al., 2002; SANO et al., 2003); promove a osteogênese (Murugan; Ramakrishna, 2004); tem ação absorvente de gordura (CRAVEIRO et al., 1998) e promove a cicatrização de úlceras e lesões (YUSOF et al., 2003; TANODEKAEW et al., 2004). Dentre as várias aplicações da quitosana, destaca-se o emprego na área de biomateriais: manufatura de lentes de contato, membranas artificiais, pele artificial, liberação de fármacos e DNA, engenharia de tecidos, aplicações ortopédicas e periodontais, entre outras (ITO et al., 1999; ANJOS, 2005). Este polímero é usualmente obtido na forma de floco ou em pó, não possui porosidade elevada e é solúvel em meio ácido. Outras formas de apresentação da quitosana, como em gel, esponja, pasta e solução, vêm sendo estudadas. (BEPPU et al., 1999; VALENTINI et al., 2000).. 2.3.3.1. Atividade antimicrobiana Vários pesquisadores relatam que a quitosana tem ação antimicrobiana em uma grande variedade de microrganismos, incluindo algas, fungos e bactérias. Contudo esta ação sofre influência de fatores intrínsecos (grau de desacetilação) e extrínsecos (nutrientes, condições do meio ambiente, substratos químicos). A quitosana apresenta atividade antimicrobiana para vários microrganismos patógenos, destacando-se sua atuação contra bactérias gram-positivas e diversas espécies de Candida (CUERO, 1999; YADAV e BHISE, 2004). Este polissacarídeo também age potencializando outras drogas de inibição, como o gel de clorexidrina, uma vez que aumenta o tempo de permanência da droga no local de ação (MUZZARELLI et al., 1990; SENEL et al., 2000)..

(40) Segundo Avadi et al. (2004) e Tsai e Hwang (2004) o efeito antibacteriano da quitosana é devido à formação de complexos polieletrolíticos formados entre o agente policatiônico, grupo amino da quitosana, com a superfície carregada negativamente da célula bacteriana. Ao interagir com a célula bacteriana, a quitosana, promove deslocamento de Ca++ dos sítios aniônicos da membrana, avariando-os (YADAV e BHISE; 2004). Por apresentar maior carga positiva, quitosana com alto grau de deacetilação e alto peso molecular tem sua ação antimicrobiana potencializada, (IKINCI et al ,2002). Por outro lado, Zheng; Zhu (2003), relatam que quitosana de baixo peso molecular pode penetrar na célula microbiana causando distúrbios fisiológicos e conseqüentemente levando a morte do microrganismo. Ao investigar a relação entre atividade antimicrobiana da quitosana e as características da parede celular de bactérias, Chung et al (2004), observaram que o polissacarídeo apresenta melhor ação bactericida e bacteriostática para bactérias Gramnegativas do que Gram-positivas devido à composição de fosfolipídios e ácidos carboxílicos da parede celular bacteriana. Tsai e Su (1999) e Zheng e Zhu (2003) verificaram que a atividade antimicrobiana da quitosana está diretamente relacionada com a adsorção do polissacarídeo a bactéria, o que acarretará em alterações na estrutura da parede celular, conseqüentemente, na permeabilidade da membrana celular.. 2.3.3.2. Atuação na área odontológica A quitosana apresenta amplo emprego na área odontológica. Em cirurgias periodontais acelera a cicatrização, por exercer uma ação hemostática, promover a formação regular de fibrina e favorecer a epitelização e tem ação antimicrobiana. Ao ser.

(41) associada a um antibiótico permite a liberação gradual deste. Também apresenta ação anticariogênica (FUENTES et al, 2003; SANO et al, 2003). Como apresenta um pKa de 6,3, a quitosana age como tampão na cavidade oral, prevenindo a deterioração do esmalte dentário pela ação dos ácidos orgânicos, derivados do metabolismo bacteriano (MUZZARELLI et al.,1989; SHIBASAKI et al.,1994a; SHIBASAKI et al., 1994b). Também atua na regeneração de tecidos moles periodontais e em cirurgias específicas promovendo a regeneração de tecido ósseo. Em experimentos com humanos o sal formado pela mistura da quitosana com ascorbato favoreceu a proliferação e organização das células, aumentando, assim, a capacidade de reconstrução histológica dos tecidos, reduzindo a mobilidade dentária e bolsas periodontais (MUZZARELLI et al.,1993). O gel de quitosana obtido pela diluição desse polímero em ácido acético tem sido sugerido como material preventivo e terapêutico para cárie dentária (TARSI et al., 1997; SANO et al., 2002). Na prevenção de cárie, estudo em humanos com solução bochecho contendo quitosana confirmou a eficácia deste produto para higiene oral, reduzindo a formação de placa bacteriana (SANO et al, 2001; SANO et al., 2003). Como material restaurador e endodôntico, a associação do gel de quitosana com fosfato de cálcio ou óxido de zinco na formulação de cemento dentário tem demonstrado, “in vitro”, interação do cemento com tecido dentinário, indução de formação de tecido mineralizado (hidroxidoapatita) e absorção de fluoreto presente no meio (MUZZARELLI et al., 1997; BELMONTE et al., 1999). Estudos de associação da quitosana com materiais dentários, tais como tetrafluotileno e hidroxidoapatita sugerem que a quitosana aumenta a biocompatibilidade.

(42) dos materiais, favorece a migração celular e inibe a adsorção de bactérias orais (S. sanguis, S. mutans, S, mitus, S. salivarius) ao dente (MARUYAMA; ITO, 1996; TARSI et al., 1998). A quitosana ao ser utilizada para promover a regeneração de tecido mole gengival, em ratos, apresentou ausência de inflamação ou de reações alérgicas, melhor hemóstase e modulou a migração de neutrófilos e macrófagos, promovendo a reepitelização e induzindo a síntese de colágeno (HOWLING et al, 2001). Várias pesquisas vêm sendo desenvolvidas com partículas de quitosana ligadas a hidroxidoapatita na forma de pasta ou esponja para utilização como enxerto ósseo em cirurgias periodontais e ortopédicas (MUZZARELLI et al., 1993; YAMAGUCHI et al, 2001; MURUGAN e RAMAKRISHNA, 2004).. Em experimentos em animais e em. humanos a quitosana diminui a solubilidade da hidroxidoapatita em solução biológica, aumentando a bioadesividade, osteoindução e osteocondução do enxerto; desta forma, reduz o tempo necessário para a regeneração óssea (MUZZARELLI, et al, 1989; XU et al, 2004). Experimentos realizados com cemento de fosfato de cálcio associado com quitosana, em animais, para utilização em implantes e enxertos verificaram ausência de resposta inflamatória, formação precoce de tecido ósseo em contato com o implante, melhor adesividade, menor taxa de degradação e maior resistência a fratura pelo cemento com quitosana, em comparação com os cementos de fosfato de cálcio tradicionais (KHOR e LIM, 2003; WANG, et al, 2004)..

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