UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
CELINA DE ALMEIDA LAMAS
"EFEITO DO EXTRATO DA CASCA DA JABOTICABA EM
PARÂMETROS METABÓLICOS E LESÕES
PROSTÁTICAS FRENTE AO ENVELHECIMENTO E
SOBREPESO INDUZIDO POR DIETA HIPERLIPÍDICA."
“JABOTICABA PEEL EXTRACT EFFECT ON METABOLIC
PARAMETERS AND PROSTATIC LESIONS IN AGING
AND HIGH-FAT DIET-INDUCED OVERWEIGHT”
CAMPINAS 2018
"EFEITO DO EXTRATO DA CASCA DA JABOTICABA EM
PARÂMETROS METABÓLICOS E LESÕES PROSTÁTICAS
FRENTE AO ENVELHECIMENTO E SOBREPESO INDUZIDO
POR DIETA HIPERLIPÍDICA."
“JABOTICABA PEEL EXTRACT EFFECT ON METABOLIC
PARAMETERS AND PROSTATIC LESIONS IN AGING AND
HIGH-FAT DIET-INDUCED OVERWEIGHT”
CAMPINAS 2018
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Celular e Estrutural na área de Biologia Celular.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctorate in Cellular and Structural Biology, in the area of Cellular Biology.
ORIENTADORA: Profa Dra Valéria Helena Alves Cagnon Quitete
CO-ORIENTADOR: Profo Dro Mário Roberto Maróstica Junior
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA [TESE / DISSERTAÇÃO] DEFENDIDA [PELA ALUNA] [CELINA DE ALMEIDA LAMAS] E ORIENTADA [PELA] [Profa Dra VALÉRIA HELENA ALVES CAGNON QUITETE].
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa Dra Valéria Helena Alves Cagnon Quitete
Profa Dra Carolina Prado de França Carvalho
Profa Dra Cleida Aparecida de Oliveira
Profa Dra Eliana Pereira de Araújo
Profo Dro Francisco Eduardo Martinez
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esta tese aos meus pais, que me ensinaram à
importância da família, o caminho da honestidade e persistência. Ao
meu marido pelo apoio incondicional em todos os momentos,
principalmente nos de incerteza, muito comum para quem tenta
trilhar novos caminhos.
Sem vocês nenhuma conquista valeria a pena.
“O sucesso nasce do querer, da determinação e
persistência em se chegar a um objetivo.
Mesmo não atingindo o alvo, quem busca e
vence obstáculos, no mínimo fará coisas
admiráveis.” (José de Alencar)
À Deus por ser a fortaleza onde encontro apoio, coragem e vontade de sempre realizar meu trabalho da melhor forma possível.
À minha mãe, minha amiga, meu porto seguro. Muito obrigada por sempre acreditar mais em mim do que eu mesma. Por sempre comprar meus sonhos e me lembrar que eu sou capaz. Muito obrigada pelo seu amor.
Ao meu pai, meu amigo, meu maior exemplo de amor ao próximo e dedicação. Muito obrigada por todo estímulo, por escutar meus lamentos e por renovar as minhas energias nesta caminhada. Muito obrigada pelo seu amor.
À minha irmã, minha amiga, onde encontro alegria e carinho sempre. Você me inspira, e enche minha vida de amor. Obrigada por ser minha parceira e por sempre estar disponível para corrigir meus erros de inglês! Muito obrigada pelo seu amor.
Ao meu marido, que está ao meu lado há tantos anos, sempre me apoiando e me incentivando. Obrigada por cuidar de mim e se preocupar tanto comigo. Obrigada por acreditar na minha capacidade e por sonhar os meus sonhos. Muito obrigada pelo seu amor.
À minha orientadora, Valéria Helena Alves Cagnon Quitete, por me ensinar até hoje os caminhos para me tornar uma profissional cada vez melhor. Muito obrigada pela confiança e por ter me permitido realizar este trabalho ao lado de alguém que transfira sabedoria. Você é com certeza um exemplo de dedicação que pretendo sempre seguir.
À toda a minha família que sempre me apoiou e torceu por mim. Obrigado Às minhas queridas amigas Marina, Mariana, Mônica, Camila, Bauli, Natália, Juliana, Luany, Geovannia, Aline, Karina, Ana Laura e Patrícia. Obrigado pelo
À minha amiga Larissa Kido, muito obrigada por ser minha parceira, por ter acompanhado de perto todas as etapas deste trabalho e por, desde o início, nunca ter negado esforços para me ajudar. Eu agradeço a você por ter compartilhado toda a sua sabedoria comigo nestes anos. Obrigada por me permitir encontrar alegria e calma na correria do dia a dia.
Ao Dro Fábio Montico, pela amizade e por ter me ensinado grande parte das
técnicas que desenvolvi neste trabalho.
À Lívia Cuquetto Leite, pela amizade, viagem, pela parceria e lealdade de sempre. Obrigada por ter confiado em mim e por me ensinar a ensinar.
À Mariana de Pádua, pela amizade e por revisar a versão inglês do artigo proveniente desta tese.
À todos os colegas do Laboratório de Biologia da Reprodução, por todo o companheirismo e ajuda para que esta tese fosse finalizada.
Ao meu co-orientador Profo Dro Mário Roberto Maróstica Junior, pelas
contribuições acadêmicas, permitindo que desenvolvêssemos o extrato da jaboticaba e por incentivar o depósito de patente, bem como a divulgação do produto.
As colegas do Laboratório de Nutrição e Metabolismo da Faculdade de Engenharia de Alimentos, Sabrina Lenquiste e Andressa Baseggio, pela parceira e trabalho em equipe. Vocês foram essenciais para a realização desta tese. À Professora Dra Carla Beatriz Collares Buzato, por aceitar participar deste
trabalho de prontidão, disponibilizando a dieta hiperlipídica para a realização do experimento. Obrigada pelas discussões de resultados, atenção, agilidade e cuidado que tem com nossos trabalhos.
realização das análises de caracterização do extrato da jaboticaba. Obrigada pela disponibilidade e por me atenderem com paciência e gentileza.
Aos colegas do Laboratório de Plasticidade Muscular e à Profa Dra. Elaine Minatel
pelas colaborações diárias, discussões, companhia, risadas e cafés.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Estrutural e Funcional pela contribuição direta e indireta para a execução deste trabalho.
À Universidade Estadual de Campinas por me proporcionar com excelência o acesso ao saber durante os anos de pós-graduação.
Ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Estrutural à sua coordenação pelo incentivo à pesquisa científica e ao aprimoramento acadêmico de seus alunos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – 141766/2015-8) e a Fundação de Amparo da Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP – 2015/25714-1) pelo apoio financeiro durante a realização deste trabalho.
Aos membros da banca pela atenção, disponibilidade e por aceitarem o convite. À todos que de uma maneira ou de outra contribuíram para a realização deste trabalho.
Considerando a íntima relação entre o envelhecimento, sobrepeso e o aparecimento de disfunções metabólicas e prostáticas, o presente trabalho teve como objetivo desenvolver extrato da casca da jaboticaba (ECJ) e avaliar seu efeito em parâmetros metabólicos e prostáticos frente à senescência e consumo de dieta hiperlipídica (DH). Um total de 70 camundongos FVB foram divididos nos seguintes grupos experimentais: JV (jovem–3 meses), SE (senescente–11 meses), SHP (senescente + DH), SJI (senescente + 2,9g/Kg ECJ), SJII (senescente + 5,8g/Kg ECJ), SHJI (senescente + DH + 2,9g/Kg ECJ) e SHJII (senescente + DH + 5,8g/Kg ECJ). Após 60 dias, os animais foram eutanaziados com posterior coleta de plasma, fígado e do lobo ventral da próstata. O ECJ demonstrou grande quantidade e variedade de compostos bioativos, além de alta atividade antioxidante in vitro. Considerando-se parâmetros metabólicos, o ECJ reduziu o ganho de peso, consumo energético, melhorou perfil lipídico e glicêmico, além de reduzir esteatose e marcadores de inflamação no fígado de camundongos senescentes que consumiram ou não DH. O efeito dose-dependente do ECJ no metabolismo, foi evidenciado considerando que promoveu a redução da glicose de jejum, intolerância à glicose e redução de marcadores inflamatórios no fígado de camundongos senescentes que consumiram ou não DH. As análises realizadas no lobo ventral prostático mostraram que o ECJ interferiu, de maneira geral, reduzindo o desequilíbrio hormonal, angiogênese, inflamação e estresse oxidativo em camundongos senescentes que consumiram ou não DH. Entretanto, o tratamento com a dose mais elevada de ECJ mostrou-se mais efetivo na regulação dos níveis dos marcadores destes processos avaliados na próstata, permitindo maior preservação da morfologia desta glândula associado a redução de lesões pré-malignas. Além disso, foi observado que o consumo de DH durante o envelhecimento intensificou as alterações metabólicas, hepáticas e prostáticas avaliadas neste período, contribuindo para aumento na incidência de lesões. Dessa forma, a ação anti-inflamatória, hipoglicemiante e a capacidade de interferir no metabolismo de lipídeos, atribuída ao ECJ, contribuíram para a prevenção do pré-diabetes e da doença hepática gordurosa não alcoólica nos modelos experimentais avaliados. Considerando-se parâmetros prostáticos, o ECJ exerceu efeito dose-dependente positivo reestabelecendo o equilíbrio hormonal, inflamatório, angiogênico e oxidativo. Estes efeitos possivelmente possibilitaram melhor interação entre epitélio e estroma prostático, contribuindo para a recuperação do microambiente desta glândula alterado pelo envelhecimento associado ou não ao consumo de DH. Dessa forma, o ECJ pode ser indicado como uma terapia potencial na prevenção de alterações metabólicas, hepáticas e prostáticas durante o envelhecimento associado ou não ao sobrepeso.
Considering the close relationship between aging, overweight and the appearance of metabolic and prostatic dysfunctions, the objective of this study was to develop the patented jaboticaba peel extract (PJE) and to evaluate its effect on metabolic and prostatic parameters of aged or high-fat-fed aged mice. A total of 70 FVB mice were divided into the following experimental groups: YG (young-3 months), SE (senescent-11 months), HfSE (senescent + high-fat diet (HFD), JSEI (senescent + 2.9g/kg PJE), JSEII (senescent + 5.8 g/kg PJE), HfJSEI (senescent + HFD + 2.9g/kg PJE) and HfJSEII (senescent + HFD + 5.8g/kg PJE). After 60 days, the animals were euthanized with subsequent plasma, liver and ventral prostate lobe removal. The PJE demonstrated a large amount and variety of bioactive compounds, in addition to high antioxidant activity
in vitro. Considering metabolic parameters, the PJE interfered reducing weight
gain, energy consumption, improving lipid and glycemic profile, as well as reducing steatosis and inflammatory markers in the liver of aged mice or HFD-fed aged mice. The dose-dependent effect of PJE on the metabolism was evidenced by considering the reduction of fasting glucose, glucose intolerance and the decreased liver inflammatory markers levels in aged mice or HFD-fed aged mice. The analyzes performed on the prostatic ventral lobe showed that the PJE interfered, in general, reducing hormone imbalance, angiogenesis, inflammation and oxidative stress in aged mice or HFD-fed aged mice. However, the treatment with the highest PJE dose was more effective in regulating the levels of the markers of these processes in the prostate, allowing a greater preservation of the morphology of this gland associated with a reduction of premalignant lesions. In addition, it was observed that the HFD intake during aging intensified the metabolic and prostatic changes verified in this period, contributing to an increased lesions incidence. Thus, the PJE anti-inflammatory and hypoglycemic action, as well as its ability to interfere in lipid metabolism, contributed to the pre-diabetes and nonalcoholic fatty liver disease prevention in these experimental animal models. Considering the prostatic parameters, the PJE exerted a positive dose-dependent effect reestablishing the hormonal, inflammatory, angiogenic and oxidative balance. These effects, improved the epithelium and stroma interactions, contributing to the recovery of the prostate microenvironment altered by aging or HFD intake. Thus, the PJE can be indicated as a potential therapy in the prevention of metabolic, hepatic and prostatic changes due to aging associated or not with overweight.
Akt: Proteína Quinase B / Protein Kinase B AR: Receptor de Andrógeno / Androgen Receptor BSA: Albumina do Soro Bovino / Bovine Serum Albumin CAT: Catequina / Cathechin
CEMIB: Centro Multidisciplinar para Investigação Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório – UNICAMP / Multidisciplinary Center for Biological Investigation on Laboratory Animal Science - UNICAMP
COX-2: Cicloxigenase-2 / Ciclooxygenase-2
CYN-3-GLU: Cianidina-3-glicosídeo / Cyanidin-3-glycoside DAB: Diaminobenzidina / Diaminobenzidine
DH: Dieta Hiperlipídica
DHGNA: Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica DHT: Dihidrotestosterona
DMT2: Diabetes Melittos do Tipo II
EAG: Equivalente de Ácido Gálico / Gallic Acid Equivalent ECJ: Extrato da Casca da Jaboticaba
ERK: Quinase Regulada Extracelularmente / Extracellularly Regulated Kinase EO: Estresse Oxidativo
ERα: Receptor α de Estrógeno / Estrogen Receptor α ERβ: Receptor β de Estrógeno
EROs: Espécies Reativas de Oxigênio
ESI: Eletrospray de Ionização / Electrospray Ionization
FRAP: Ensaio para Análise da Capacidade de Redução do Ferro / Ferric Reducing Antioxidant Power
GPx: Glutationa Peroxidase GSH: Glutationa Reduzida GR: Glutationa Redutase
GTT: Teste de Tolerância a Glicose / Glucose Tolerance Test HDL: Lipoproteína de Alta Densidade / High Density Lipoprotein HE: Hematoxilina e Eosina
1
IL-1β: Interleucina 1β IL-6: Interleucina 6 IL-8: Interleucina 8 IL-15: Interleucina 15
ITT: Teste de Tolerância a Insulina / Insulin Tolerance Test LDL: Lipoproteína de Baixa Densidade / Low Density Lipoprotein MVD: Densidade de Microvasos / Microvessels Density
NAFLD: Doença Hepática Gordurosa Não Alcoólica / Nonalcoholic fatty liver disease
NAS: Escore Final da Atividade da Doença Hepáticas Gordurosa Não Alcóolica / Nonalcoholic Fatty Liver Disease Activity Score
NIP: Neoplasia Intraepitelial Prostática
NFκB: Fator de Transcrição Nuclear kappa B
ORAC: Capacidade de Absorção dos Radicais Oxigenados / Oxygen Radical Absorbance Capacity
PCNA: Antígeno Nuclear de Proliferação Celular / Proliferating Cell Nuclear Antigen
PI3K: Fosfoinositideo 3 Quinase / Phosphatidylinositol 3 Kinase
PIN: Neoplasia Intraepitelial Prostática / Prostatic Intraepithelial Neoplasia pIRS-1:Substrato de Receptor de Insulina Fosforilada 1 / Phosphorylated Insulin Receptor Substrate 1
PJE: Extrato da Jaboticaba Patenteado / Patented Jaboticaba Extract PKA: Proteína Quinase A / Protein Kinase A
PKC: Proteína Quinase C / Protein Kinase C
PPARγ: Receptor gamma Ativado por Proliferador de Peroxissomo / Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
pSTAT-3: Sinal Transdutor e Ativador de Transcrição 3 Fosforilado ROS: Espécies Reativas de Oxigênio / Reactive Oxigen Species SOD2: Superóxido Dismutase 2
STAT-3: Sinal Transdutor e Ativador de Transcrição 3 T2DM: Diabete Mellitos do Tipo 2 / Type 2 Diabetes Mellitos
TLR4: Receptor do Tipo Toll 4 / Toll-like Receptor 4
TNFα: Fator de Necrose Tumoral alpha / Tumor Necrosis Factor alpha
VEGF: Fator de Crescimento do Endotélio Vascular / Vascular Endothelium Growth Factor
1. INTRODUÇÃO... 18
1.1. Implicações Metabólicas do Envelhecimento ... 18
1.2. Implicações Metabólicas do Ganho de Peso ... 20
1.3. Morfologia e Fisiologia da Próstata ... 22
1.4. Senescência e próstata ... 26
1.5. Ganho de Peso e Próstata ... 29
1.6. Jaboticaba e seus compostos bioativos ... 32
2. JUSTIFICATIVA ... 35
3. OBJETIVO ... 36
3.1. Objetivos específicos... 36
4. MATERIAL E MÉTODOS GERAIS ... 37
4.1. Extrato da Casca da Jaboticaba (ECJ) ... 37
4.2. Avaliação de Fenóis Totais... 37
4.3. Avaliação de Antocianinas Monoméricas ... 37
4.4. Concentração Total de Flavonóides ... 38
4.5. Análise de cromatografia líquida acoplada à espectrometo de massas (UPLC-ESI-QTOF-MS/MS) ... 38
4.6. Quantificação de compostos bioativos por UPLC-MS/MS ... 39
4.7. Ensaio para Análise da Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio (ORAC) hidrofílico ... 40
4.8. Ensaio para Análise da Capacidade de Redução do Ferro (FRAP) ... 40
4.9. Ensaio Antioxidante ABTS... 40
4.10. Animais e desenho experimental ... 40
4.11. Ganho de Peso Relativo (%), Consumo Alimentar e Energético ... 42
4.12. Glicemia de Jejum, Teste de Tolerância a Insulina e Teste de Tolerância a Glicose ... 43
4.13. Perfil Lipídico ... 43
4.14. Microscopia de Luz... 43
4.15. Análises Histopatológicas ... 44
4.15.1. Fígado ... 44
4.15.2. Lobo Ventral da Próstata ... 44
4.16. Imunohistoquímica ... 45
4.17. Determinação da Densidade de Microvasos ... 46
4.18. Detecção da apoptose e determinação do índice apoptótico ... 47
4.19. Extração de proteínas no fígado/lobo ventral prostático e análise de Western Blotting ... 47
4.20. Ensaio de Glutationa Reduzida Total (GSH) ... 48
5.1. Title ... 50
5.2. Abstract ... 51
5.3. Introduction ... 51
5.4. Methods ... 53
5.4.1. Patented jaboticaba peel extract (PJE) ... 53
5.4.2. Patented jaboticaba peel extract (PJE) bioactive compounds and in vitro antioxidant activity ... 53
5.4.3. Animals and Experimental Design ... 57
5.4.4. Relative Body Weight Gain (%), Food and Energy Intake ... 58
5.4.5. Fasting Glucose, Glucose Tolerance Test and Insulin Tolerance Test ... 58
5.4.6. Lipid profile ... 58
5.4.7. Light Microscopy ... 59
5.4.8. Liver Histopathological Analysis ... 59
5.4.8. Liver Protein Extraction and Western-Blotting Analyses ... 59
5.4.9. Statistical Analysis ... 60
5.5. Results ... 60
5.5.1. PJE Bioactive Compounds and in vitro Antioxidant Activity ... 60
5.5.2. Relative Body Weight Gain (%), Food and Energy Intake ... 61
5.5.3. Lipid Profile ... 61
5.5.4. Fasting Glucose, Glucose Tolerance Test and Insulin Tolerance Test ... 62
5.5.5. Liver Histopathology ... 62
5.5.6. Western-Blotting Evaluation in Liver ... 64
5.6. Discussion ... 65 5.7. Conclusion ... 72 5.8. References ... 73 5.9. Tables ... 82 5.10. Figures ... 84 6. ARTIGO CIENTÍFICO II ... 90 6.1. Title ... 90 6.2. Abstract ... 91 6.3. Introduction ... 92 6.4. Methods ... 94
6.4.1. Animals and Experimental Design ... 94
6.4.2. Morphological Analysis ... 95
6.4.3. Immunohistochemistry ... 95
6.4.4. Apoptosis ... 96
6.4.5. Determination of Microvessel Density (MVD) ... 96
6.6. Discussion ... 101 6.7. Conclusion ... 106 6.8. References ... 107 6.9. Table ... 114 6.10. Figures ... 115 7. RESULTADOS ADICIONAIS ... 122
7.1. Avaliação do Processo Inflamatório ... 122
7.1.1. Cicloxigenase 2 (COX-2) ... 122
7.1.2. Fator Transcrição Nuclear Kappa B (NFkB) ... 123
7.1.3. Receptor do Tipo “Toll” 4 (TLR4) ... 124
7.1.4. Fator de Necrose Tumoral α (TNFα) ... 124
7.1.5. Sinal Transdutor e Ativador de Transcrição 3 fosforilado (pSTAT-3) ... 124
7.1.6. Interleucina 6 (IL-6) ... 125
7.1.7. Interleucina 1β (IL-1β) ... 125
7.2. Avaliação do Processo de Estresse Oxidativo ... 125
7.2.1. 4-Hydroxynonenal (4HNE) ... 125
7.2.2. Glutationa Reduzida (GSH) ... 125
7.2.3. Glutationa Peroxidase 3 (GPx3) ... 126
7.2.4. Glutationa Redutase (GSR) ... 126
7.2.5. Catalase ... 126
7.2.6. Superóxido Dismutase 2 (SOD2) ... 126
8. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ADICIONAIS ... 127
9. CONCLUSÃO RESULTADOS ADICIONAIS ... 134
10. TABELA RESULTADOS ADICIONAIS ... 135
11. FIGURAS RESULTADOS ADICIONAIS ... 136
12. CONSIDERAÇÕES GERAIS DA TESE ... 140
13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS GERAIS DA TESE ... 142
ANEXO I ... 161
ANEXO II ... 168
1. INTRODUÇÃO
1.1. Implicações Metabólicas do Envelhecimento
O envelhecimento é biologicamente definido como um processo natural que ocorre no decorrer na vida caracterizado pela perda progressiva da capacidade funcional do organismo, no qual o indivíduo passa a não ser capaz de manter a homeostase corporal. Tais alterações promovem desregulação funcional de órgãos e de tecidos, levando ao enfraquecimento de diversas funções e perda de energia. Estima-se que em 2025, 26% da população mundial seja representada por pessoas idosas (acima dos 65 anos), sendo muito importante o entendimento das alterações decorrentes deste processo, a fim de promover aumento da qualidade de vida desta população (KOWAL et al., 2012; MICHALAKIS et al., 2013).
A teoria dos radicais livres no envelhecimento tem sido muito aceita para explicar o surgimento de alterações típicas deste período de vida. Esta teoria defende o fato de que radicais livres derivados de oxigênio (espécies reativas de oxigênio – EROs), são responsáveis por causar danos em nível celular e tecidual, o que contribui para a perda da capacidade funcional de idosos (WICKENS et al., 2001). Considerando que radicais livres são produtos naturais do metabolismo aeróbico, foi proposto por Harman (1992) que a exposição prolongada a estas EROS, contribui para dano oxidativo durante a vida promovendo doenças relacionadas a senescência.
Dentre as alterações observadas no envelhecimento, foram verificadas modificações substanciais na composição corporal, como a redução do percentual de massa magra e aumento de gordura corporal. Além disso, sabe-se que neste período ocorrem mudanças no padrão de distribuição de gordura, como redução da gordura periférica e aumento de depósitos viscerais. Este quadro contribui para aumento de depósitos de gordura em tecidos não adiposos, como o fígado, aumentando o risco de desenvolvimento de alterações metabólicas como esteatose (HUGHES et al., 2001; MICHALAKIS et al., 2013). São também características do envelhecimento a diminuição do apetite, aumento da saciedade, alterações na dentição e na capacidade de sentir sabor, além da redução no nível dos hormônios leptina e grelina, os quais regulam o
processo de fome e saciedade, contribuindo para a redução do peso corporal (MICHALAKIS et al., 2013).
Além disso, uma alta prevalência de intolerância à glicose, resistência à insulina e diabetes mellitus do tipo 2 (DMT2) tem sido observada em pessoas idosas (COWIE et al., 2009; OH et al., 2016). Visando manter os níveis de glicose normais frente ao estresse metabólico decorrente do envelhecimento, acredita-se que ocorra um aumento no número de células β-pancreáticas e da acredita-secreção de insulina neste período da vida (PRENTKI e NOLAN, 2006; OH et al., 2016). Em contrapartida, este aumento na secreção de insulina reduz a sensibilidade periférica a este hormônio (KAHN et al., 1993; OH et al., 2016). Dessa forma, estes mecanismos compensatórios eventualmente desencadeiam uma resposta contrária, reduzindo a secreção de insulina e contribuindo para o desenvolvimento de DMT2 durante o envelhecimento (GU et al., 2012; OH et al., 2016).
Além disso, alterações no processamento de glicose no organismo são consideradas fatores de risco para o desenvolvimento de outras desordens metabólicas como hipercolesterolemia e acúmulo de gordura hepática, frequentes em pessoas idosas (MAZZA et al., 2012; CHIANG et al., 2016). Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que alteram o metabolismo de lipídeos durante o envelhecimento. Existem evidências de que neste período ocorra redução da degradação do colesterol em ácidos biliares, contribuindo para aumento do seu nível no fígado e plasma (BERTOLOTTI et al., 2014). Além disso, o aumento da idade relaciona-se à uma intensificação da lipogênese no fígado e redução da lipólise no tecido adiposo, processos estes associados a diminuição da β-oxidação (CARVALHEIRA et al., 2002). Dessa forma, estas alterações podem promover mudanças em mecanismos de captação e processamento de ácidos graxos do fígado, levando ao acúmulo de gordura hepática durante o envelhecimento (BERTOLOTTI et al., 2014; CHIANG
et al., 2016). Este acúmulo crônico, por sua vez, pode desencadear alterações
mais severas como a esteatose hepática (KAWANO e COHEN, 2012; CHIANG
1.2. Implicações Metabólicas do Ganho de Peso
De acordo com a última pesquisa de vigilância de fatores de risco e proteção para doenças crônicas (VIGITEL), o sobrepeso e a obesidade atingem grande proporção da população brasileira com mais de 18 anos, uma vez que em 2016, os dados remetem que 53,8% dos indivíduos apresentaram sobrepeso e 18,9% apresentaram obesidade (VIGITEL, 2017). O ganho de peso mostrou-se ainda mais pronunciado considerando a população com mais de 65 anos, a qual apresentou um aumentou de cerca de 10% desde 2008 (VIGITEL, 2008; VIGITEL, 2017). Em 2016, 57,7% da população com mais de 65 anos apresentou sobrepeso e 20,3% obesidade (VIGITEL, 2017). Estes resultados são acompanhados de aumento na prevalência de diabetes e hipertensão no mesmo período (PORTAL BRASIL, 2017).
Esse cenário é consequência direta da mudança nos hábitos de vida da população brasileira nos últimos anos, refletindo o processo de transição alimentar no Brasil, que antes apresentava altas taxas de desnutrição e hoje apresenta maior prevalência de obesidade (ABESO, 2017; PORTAL BRASIL, 2017). Considerando a população idosa, estas alterações podem ser representadas pela redução no consumo de frutas, hortaliças e outros alimentos tradicionais como o feijão, associado ao aumento do consumo de alimentos industrializados, como refrigerante (VIGITEL, 2017). O aumento do sedentarismo também pode ser considerado importante fator que contribui para o sobrepeso desta população, uma vez que 71% dos idosos realizam práticas de atividade física insuficiente (VIGITEL, 2017).
O sobrepeso e a obesidade são caracterizados pelo acúmulo excessivo de tecido adiposo branco no organismo. O índice de massa corporal (IMC), calculado pela divisão da massa corporal pela estatura ao quadrado, é a forma recomendada pela organização mundial da saúde (OMS) para classificar e avaliar o sobrepeso e a obesidade. Assim, são consideradas pessoas com sobrepeso aquelas que apresentam IMC ≥ 25 kg/m2 e com obesidade aquelas
que apresentam IMC ≥ 30 kg/m2 (VIGITEL, 2017). Sabe-se que consumo de
dieta rica em lipídios e açúcares é um fator de risco ao aumento do peso corporal, sendo a quantidade e tipo de gordura relevantes para o desenvolvimento da obesidade (YANG et al., 2012; SILVA et al., 2015). Estudos têm mostrado que a
alta ingestão de gordura saturada possui relação com o aumento da adiposidade corporal e doenças relacionadas como a hiperinsulinemia e dislipidemia (PELSER et al., 2013; CASTELLI et al., 2016).
O tecido adiposo branco é um órgão endócrino, capaz de sintetizar e liberar uma série de fatores, participando de processos de mobilização de triglicerídeos e colesterol. Além disso, é responsável pela secreção do hormônio leptina e adiponectina, responsáveis por regular a ingestão alimentar e o gasto energético, mantendo constante a quantidade de gordura corporal (WAJCHENBERG, 2000). Nesse contexto, estudos demonstraram que o aumento deste tecido adiposo está relacionado a elevação nos níveis de leptina e ao desenvolvimento subsequente de resistência a esse hormônio, estimulando a ingestão alimentar e redução do gasto energético. Além disso, observa-se uma redução dos níveis do hormônio adiponectina, regulador do processamento de glicose e metabolismo lipídico no fígado (WAJCHENBERG, 2000; MICHALAKIS
et al., 2013). Em conjunto, essas disfunções acabam alterando a regulação do
processo de fome e saciedade contribuindo para aumento da ingestão alimentar e obesidade.
O aumento da gordura corporal, é consequência da hipertrofia e hiperplasia dos adipócitos, que relaciona-se com a criação de um microambiente pró-inflamatório, com aumento da expressão de citocinas inflamatórias, como IL-6, IL-1β e TNFα, e extravasamento de ácidos graxos para a circulação (EMANUELA, 2012; BARROS, 2015). Este cenário, estimula a fosforilação dos receptores de insulina em serina, prejudicando a ativação de proteínas chaves da via deste hormônio e promovendo a resistência à insulina (CARVALHEIRA et
al., 2002; EMANUELA, 2012; FESTUCCIA et al., 2014; FREITAS et al., 2014;
BARROS, 2015). Estudo recente demonstrou que consumo de dieta hiperlipídica reduziu o nível do substrato do receptor de insulina 1 (IRS-1) no fígado de ratos, sugerindo efeito negativo na via de sinalização deste hormônio (SAHIN et al., 2017). Este quadro não só estimula o aumento da glicemia plasmática como também promove o aumento de espécies reativas de oxigênio, fato que leva a disfunção das células β pancreáticas, estimulando ainda mais a resistência à insulina e o DMT2 (BRAND e NICHOLLS, 2011; PEPIN et al., 2016).
Song e colaboradores (2016) verificaram que a ingestão de dieta hiperlipídica promoveu o quadro de resistência à insulina, associado ao aumento
de LDL colesterol e esteatose hepática. Estes autores sugerem que altos níveis de insulina induzem a expressão do gene insig1/2 no fígado, estando associado ao estímulo a síntese de colesterol (YANG et al., 2002; SONG et al., 2016). Além disso, o consumo de dieta hiperlipídica pode acelerar a síntese de triglicerídeos, levando ao aumento da concentração de gordura hepática (FRUHBECK et al., 2006; SONG et al., 2016). O microambiente pró-inflamatório e oxidativo decorrente da hipertrofia dos adipócitos também interferem na expressão de genes responsáveis pela oxidação de ácidos graxos, biossíntese do colesterol e capitação de glicose no fígado (SONG et al., 2016), estimulando ainda mais o acúmulo de ácidos graxos neste órgão. Assim, o aumento de gordura no fígado pode promover quadros mais severos como a esteatose hepática e a doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) (COHEN et al., 2011). A DHGNA é considerada a doença hepática de maior incidência mundial, sendo caracterizada pela presença de esteatose, inflamação e inchaço dos hepatócitos, sem que haja histórico de consumo de álcool ou outra doença hepática associada (KLEINER et al., 2005).
1.3. Morfologia e Fisiologia da Próstata
A próstata é considerada a maior glândula acessória do sistema genital masculino. Em humanos, apresenta um conjunto de 30 a 50 glândulas túbulo alveolares ramificadas, envolvidos por uma cápsula. Os ductos destas glândulas desembocam em uma porção da uretra que atravessa o órgão, conhecida como uretra prostática (KIERSZENBAUM, 2008; JUNQUEIRA e CARNEIRO, 2012). Estas estruturas glandulares encontram-se envolvidas por um estroma denso, entremeado por fibras musculares lisas e vasos sanguíneos (HAM e CORMACK, 1991). A principal função prostática é a produção e o armazenamento de um líquido fino, leitoso, que contém cálcio, íons citrato e fosfato, enzima de coagulação e pro-fibrolisina, entre outras proteínas, açucares, íons, enzimas, lipídeos estruturais de membrana, substâncias imunossupressoras e anti-inflamatórias. Este líquido fará parte do sêmen, o qual é fundamental para o processo reprodutivo (GUYTON e HALL, 2006; LACORTE, 2008).
Em roedores, a próstata apresenta-se de forma lobulada, localizando-se inferiormente à bexiga urinária, com distribuição incompleta ao redor da uretra,
sendo dividida anatomicamente em: próstata ventral, lateral, dorsal e anterior, sendo essa última também chamada de glândula de coagulação (Figura 1) (HAYASHI et al., 1991; ROYBURMAN et al., 2004). Estes lobos são compostos por um complexo sistema de estruturas ductais e túbulo-alveolares (ROYBURMAN et al., 2004). Além disso, apresentam diferenças com relação a morfologia, produtos secretados e a resposta hormonal, sendo o lobo ventral considerado o mais andrógeno-responsivo (BANERJEE et al., 1994; OLIVEIRA
et al., 2016)
O lobo ventral apresenta um conjunto de estruturas túbulo-alveolares, na qual o epitélio está envolvido por um delgado estroma (AUMULLER et al., 1990). O epitélio neste lobo apresenta-se cúbico a cilíndrico, sendo envolto pelo estroma prostático, o qual sustenta o epitélio, composto por células e matriz extracelular. Entre estas células encontram-se principalmente células musculares lisas e fibroblastos, mas também estão presentes mastócitos,
Figura 1. Visão geral dos lobos prostáticos de camundongos. (A-B) Vista anterior
dos órgãos urogenitais masculinos de camundongos, sendo observados lobo ventral (VP), anterior (AP) e lateral da próstata, vesícula seminal (SV), bexiga urinária (Bladder) e uretra (U). (C-D) Vista posterior dos órgãos urogenitais masculinos de camundongos, sendo observados lobo dorsal da próstata (DP), vesícula seminal (SV) e bexiga urinária (Bladder). (E) Esquema demonstrando visão anterolateral dos lobos prostáticos, vesícula seminal, bexiga urinária e uretra de camundongos. Barra de escala = 1cm. (OLIVEIRA et al.,2016; modificado de SUGIMURA et al., 1986)
macrófagos, ao lado de nervos e vasos sanguíneos. A principal função destas células é sintetizar os componentes estruturais e reguladores na matriz. Já a matriz extracelular é composta por fibras colágenas, fibras reticulares, fibras elásticas, proteoglicanos, entre outras glicoproteínas (NEMETH e LEE, 1996; MARKER et al., 2003). Associada a esta matriz encontram-se fatores de crescimento, moléculas reguladoras e enzimas de remodelação, que agem como sinais biológicos, atuando sobre as células epiteliais. Dentre os componentes da matriz, o colágeno e fibras elásticas são responsáveis por conferir ao tecido prostático rigidez mecânica e flexibilidade (CUNHA e MATRISIAN, 2002). A associação entre componentes celulares do estroma e matriz extracelular permite a formação de um microambiente que possibilita o crescimento e diferenciação das células adjacentes, o que contribui para a manutenção da forma e função do tecido prostático (CORNELL et al., 2003).
A literatura aponta que a interação entre epitélio-estroma é fundamental para a regulação e manutenção da atividade funcional da próstata, sendo tal processo regulado primordialmente pela ação de hormônios, os quais participam da diferenciação e manutenção do estado ativo da glândula (CUNHA et al., 2002). A membrana basal do epitélio funciona como ponto de união desta interação, garantindo suporte mecânico e fisiológico, sendo composta por colágeno IV, heparan sulfato e laminina (HAYWARD e CUNHA, 2000). Andrógenos, como a testosterona e diidrotestosterona (DHT), são hormônios fundamentais neste processo de regulação prostática. Entretanto, a próstata também é sensível a ação de hormônios somatotróficos (insulina, prolactina e hormônio do crescimento), ácido retinóico e estrógenos.
A testosterona que atua no organismo masculino é produzida principalmente nos testículos (95%), sendo parte produzida pelas glândulas adrenais (5%) (AUMULLER e SEITZ, 1990). O andrógeno pode ser convertido em DHT por meio da enzima 5α-redutase, presente principalmente nas células do estroma prostático (KIERSZENBAUM, 2008). Apesar de ambos interagirem com o mesmo receptor, a DHT apresenta de 5-10 vezes mais afinidade a estes que a testosterona (PRINS et al., 1991). Essa ação hormonal se dá através da ligação destes andrógenos a receptores intracelulares específicos, denominado receptor de andrógeno (AR), o qual é responsável por regular mecanismos de expressão gênica (PRINS et al., 1991).
Apesar desta glândula ser principalmente regulada por andrógenos, a ação sinérgica de estrógenos também é fundamental para manutenção do tecido prostático e, em determinadas situações, pode estar atrelada ao surgimento de lesões (CUNHA et al., 2012; KIDO et al., 2014). A enzima aromatase é essencial no processo de produção de estrógenos, uma vez que promove a biossíntese deste hormônio a partir de um substrato androgênico (O’DONNELL et al., 2001). Além disso, os estrógenos atuam na próstata através de dois receptores distintos, sendo: receptor α de estrógeno (ERα) e o receptor β de estrógeno (ERβ). Tais receptores são expressos de forma diferencial na próstata: o ERα principalmente na região estromal, sendo relacionado a ocorrência de proliferação celular, inflamação e lesões pré-malignas; enquanto o ERβ é principalmente expresso no epitélio, estimulando processos anti-proliferativos, anti-inflamatórios e anti-carcinogênicos (ELLEM e RISBRIDGER, 2010; CANDIDO et al., 2012).
Alterações benignas ou malignas na próstata vêm sendo alvo de várias pesquisas nos últimos anos, considerando sua alta incidência (TIMMS e HOFKAMP, 2011; TINGA et al., 2014). O tumor maligno de próstata é considerado a neoplasia mais frequente no mundo, com exceção dos carcinomas baso e espinocelular da pele (WHO, 2014). Acredita-se que os casos de câncer de próstata irão aumentar em 50% até o ano de 2020 (WHO, 2014). Além disso, de acordo com o Instituto Nacional de Câncer, serão esperados para cada ano no biênio 2018-2019 aproximadamente 68.220 novos casos de câncer de próstata no Brasil (INCA, 2018). Além desta lesão, a hiperplasia benigna (HBP) de próstata e as prostatites são frequentes. Na HBP ocorre crescimento tumoral não neoplásico, que leva a hiperplasia do estroma (principalmente células musculares lisas) e do tecido epitelial (BILLIS, 1997). Já as prostatites são caracterizadas pela infiltração de células inflamatórias, especialmente, no estroma prostático (SHAPPELL et al., 2004).
Como visto, afecções prostáticas estão relacionadas ao desequilíbrio da interação entre epitélio e estroma, observando-se intenso processo inflamatório. Este processo pode ser ilustrado por meio da análise do padrão de expressão de moléculas inflamatórias relacionadas ao tecido estudado. O câncer de próstata tem sido associado a elevados níveis de cicloxigenase-2 (COX-2). A expressão desta molécula é induzida rapidamente em resposta a citocinas,
fatores de crescimento e promotores de tumor (VANE et al., 1998). Acredita-se que esta enzima seja capaz de aumentar a resistência das células ao processo de apoptose, alterando a homeostase prostática (BADAWI et al., 2000). Da mesma forma, a via do fator nuclear kappa B (NFkB) apresenta importante ação do controle do crescimento celular, diferenciação, apoptose, inflamação e resposta ao estresse (SUN et al., 2010). Assim, sua intensa expressão ocasiona um desequilíbrio nestes processos, podendo levar ao crescimento e progressão do câncer (SWEENEY et al., 2004). Visto que para o desenvolvimento tumoral é necessário aumento de vascularização, o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) é um considerado um importante fator angiogênico, estimulando a migração celular e permeabilidade vascular (ROSE et al., 2004). Foi visto que esta molécula pode estar relacionada à vascularização de tumores sólidos malignos, facilitando a invasão celular e formação de metástases (MISTRY et al., 2007). Ao contrário, a endostatina, produto da clivagem do colágeno na região C-terminal, age como inibidor de proliferação e migração de células endoteliais, apresentando uma ação anti-angiogênica, podendo também apresentar redução na expressão em casos de patologias (MUCCI et al., 2009).
1.4. Senescência e próstata
O aumento da idade está intimamente relacionado a problemas na próstata(KONETY et al., 2008). A idade é considerada o único fator de risco bem estabelecido para o desenvolvimento do câncer de próstata, uma vez que somente 1% dos casos deste tipo de câncer são identificados em homens abaixo dos 50 anos. Dessa forma, o constante aumento da expectativa de vida mundial, contribui para que o câncer de próstata seja o segundo tipo de câncer mais frequente entre homens no Brasil (INCA, 2018).
O desenvolvimento de alterações prostáticas durante o envelhecimento está relacionado a diversas alterações endócrinas. Dentre estas modificações encontra-se a redução nos níveis de testosterona e DHT circulantes, acompanhado de aumento nos níveis de estrógeno (UNTERGASSER et al., 1999; HARMAN et al., 2001). Acredita-se que no envelhecimento haja um progressivo declínio nos níveis de testosterona circulantes, bem como aumento da conversão de andrógeno em estrógeno, levando ao desequilíbrio entre eles,
alterando o microambiente prostático (MORALES, 2002). Wu e Gore (2010) sugeriram que com o avanço da idade pode haver uma alteração da interação da testosterona com o seu receptor nas regiões do cérebro envolvidas no controle das características sexuais masculinas e eixo hipotálamo-hipófise-gônada. Verifica-se também modificação no número e função de AR, bem como alteração da sensibilidade tecidual a testosterona (KAUFMAN et al., 2005).
Já foi relatado que o envelhecimento pode alterar a atividade das enzimas 5α-redutase e aromatase, responsáveis, respectivamente, pela conversão de testosterona em DHT e pela conversão de andrógenos em estrógenos, contribuindo para o desequilíbrio hormonal (HARMAN et al., 2001). Além disso, células inflamatórias do estroma prostático, em animais senescentes, secretam citocinas inflamatórias que contribuem para uma regulação positiva na expressão da enzima aromatase, promovendo um aumento consequente dos níveis de estrógeno (ELLEM e RISBRIDGER, 2009). A alteração no padrão de expressão de receptores hormonais prostáticos foi relatada por Candido et al. (2012), que verificaram baixos níveis de testosterona e estrógeno, bem como predominante expressão moderada à fraca de receptores androgênicos e estrogênicos (α/β) nos lobos ventral e dorsolateral da próstata de animais durante o envelhecimento.
Além disso, o desequilíbrio hormonal neste período tem sido relacionado ao estímulo ao processo inflamatório e surgimento de lesões pré-malignas e malignas na próstata (ELLEM et al., 2009). Esta glândula apresenta atividade imune intensa, apresentando células do sistema imune no epitélio e estroma (DE MARZO et al., 2007). Um estímulo crônico, faz com que estas células secretem grandes quantidades de citocinas pró-inflamatórias que induzem o espessamento da camada fibromuscular ao redor do ácino, bem como a proliferação epitelial e estromal, principalmente via expressão de COX-2 (WANG
et al., 2004; NICKEL et al., 2008). De acordo com isto, recente trabalho do nosso
grupo de pesquisa demonstrou que o envelhecimento promove aumento dos níveis de COX-2, NFkB e fator α de necrose tumoral (TNFα) (KIDO et al., 2017).
Cordeiro et al. (2008) verificaram redução na expressão de genes relacionados a síntese e checagem de proteínas, bem como inibição de crescimento celular, além de transcrição aumentada de genes de sobrevivência celular e evasão apoptótica na senescência. Dessa forma, durante o
envelhecimento, ocorre o acúmulo de células senescentes no estroma prostático, as quais secretam fatores que comprometem a estrutura e a função tecidual, como fatores pró-inflamatórios e componentes de matriz extracelular, contribuindo para alteração do microambiente, favorecendo o aparecimento de lesões (SPRENGER et al., 2008; MONTICO et al., 2015). Kido et al. (2014) descreveram a presença de atrofia epitelial, com redução das células epiteliais secretoras e hipertrofia estromal, além de regiões de neoplasia intraepitelial prostática, de atrofia epitelial proliferativa e microácinos (lesões pré-malignas, caracterizadas como pequenos ácinos com lúmen pouco definido), em camundongos senescentes.
É conhecido que, após a puberdade a homeostase prostática é mantida através do equilíbrio entre fatores de crescimento inibitórios e estimulatórios. Devido à alteração do programa transcricional no envelhecimento, enzimas envolvidas nos processos de remodelação tecidual e angiogênese encontram-se reguladas positivamente (SPRENGER et al., 2008). O estímulo a angiogênencontram-se ocorre durante o câncer a fim de suprir a necessidade de oxigênio e nutrientes para o crescimento do tumor, contribuindo para processos de proliferação e migração celular (NIU e XIA, 2009; MONTICO et al., 2015). Montico et al. (2013) observaram aumento dos níveis de VEGF e redução de endostatina em animais idosos. Outros estudos revelaram que a regulação positiva dos VEGF está relacionada à elevados níveis de estrógeno, também presente em idosos (GARVIN et al., 2005).
Além disso, Montico et al. (2015) verificaram que a próstata de animais durante o envelhecimento também apresenta o quadro de estroma reativo, característico do início da tumorigênese. Estes autores sugerem que a tentativa de modular o microambiente pró-angiogênico e pró-inflamatório existente na próstata de organismos senescentes seria o principal mecanismo que desencadeia este quadro.
O envelhecimento também tem sido relacionado a maior incidência de estresse oxidativo (DESAI et al., 2010). Este estresse, nada mais é do que o desequilíbrio na geração de EROs e radicais livres. Em baixos níveis, essas EROs participam de diversos processos no metabolismo (proliferação celular, diferenciação, apoptose e senescência), porém podem ser tóxicas quando em níveis elevados (GUPTA et al., 2004). O organismo apresenta dois grupos
antioxidantes importantes na defesa contra estas EROs, sendo estes os não enzimáticos (glutationa, vitamina E e C) e os enzimáticos (catalase, superóxido dismutase, glutationa peroxidase) (KEFER et al., 2009). Além do aumento de estresse oxidativo com a idade, estudos relataram que no envelhecimento também há uma diminuição na atividade de defesa antioxidante intracelular, levando a danos (DESAI et al., 2010). Em experimento realizado por Alvarez et
al. (2004), o estresse oxidativo nesta glândula levou ao aumento do lúmen dos
ácinos e perda de pregueamento típico. Já Riánsares et al. (2005) verificaram aumento de proliferação celular devido a este estresse.
1.5. Ganho de Peso e Próstata
Países ocidentais apresentam grande consumo de gorduras saturadas, carne vermelha, e ao mesmo tempo apresentam maior incidência de câncer de próstata (RODRIGUES NETTO, 2008). Além disto, o Rio Grande do Sul foi considerado o estado brasileiro com maior incidência de câncer de próstata, ao mesmo tempo em que sua capital, Porto Alegre, foi considerada a cidade brasileira com maior percentual de pessoas com sobrepeso (ABESO, 2017; INCA, 2018). Assim, estes fatos ilustram a relação entre aumento da adiposidade corporal e afecções prostáticas.
A obesidade é considerada atualmente um problema de saúde pública, estando associada a sérias desordens em todo o organismo, como o diabetes do tipo II (MICHALAKIS et al., 2013). O desenvolvimento do diabetes do tipo II é relacionado ao quadro de resistência à insulina, sendo este hormônio um potente agente mitogênico e anti-apoptótico (HSING et al., 2007). Dessa forma, o diabete do tipo II induzido pela obesidade pode estimular o crescimento prostático e consequentemente aumentar o risco de alterações nesta glândula (HSING et al., 2007). Além disso, acredita-se que insulina estimula liberação do fator de crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF-1), o qual promove o crescimento celular prostático (SU et al., 2011). O ganho de peso também tem sido associado ao desenvolvimento de câncer de próstata, aumentando a agressividade desta doença (SU et al., 2011). Foi verificado que o aumento da adiposidade é relacionado a menores valores de antígeno específico da próstata e aumento da
glândula, levando a maiores desafios cirúrgicos também relacionados à diferente fisiologia destes tumores (GROSSMANN e WITTERT, 2012).
As alterações prostáticas relacionadas a obesidade ocorrem, entre outros fatores, devido à complexa correlação entre desordens metabólicas ocasionadas por maus hábitos alimentares e alteração nos níveis de andrógenos circulante, afetando de diversas formas a fisiologia desta glândula (ARAUJO e WITTERT, 2011). O aumento da adiposidade visceral promove uma redução nos níveis de testosterona, o que predispõe ao maior ganho de gordura, estimulando ainda mais o desequilíbrio hormonal nesta glândula (GROSSMANN et al., 2010; ARAUJO e WITTERT, 2011). Estudo recente verificou que consumo de dieta hiperlipídica aumenta níveis de AR, apresentando importante papel no estimulo a tumorigênese na próstata ventral e dorsolateral de gerbilos (FACINA et al., 2018). De acordo com estes autores, o aumento de lesões malignas e premalignas na próstata foi consequência da interferência do consumo de dieta hiperlipídica em vias hormonais, as quais são relacionadas a mecanismos de proliferação e sobrevivência celular (PYTLOWANCIV et al., 2016; FACINA et al., 2018).
Estudo prévio já demonstrou que a ingestão de dieta hiperlipídica por ratos adultos aumenta o nível de estradiol sérico e a imunoexpressão de ERα na próstata (PYTLOWANCIV et al., 2016). Assim, foi sugerido que o aumento de estradiol ocorreu como uma consequência do estímulo a enzima aromatase promovido pelo aumento da adiposidade (PYTLOWANCIV et al., 2016). Além disso, Silva e colaboradores (2015) sugeriram que alterações hormonais decorrentes da ingestão de dieta hiperlipídica são associadas ao aumento de VEGF, sugerindo estímulo pró-angiogênico que contribuiu para o suporte ao desenvolvimento de lesões nesta glândula.
O aumento da gordura visceral estimula a secreção de adipocinas e citocinas pró-inflamatórias, as quais também contribuem para o desenvolvimento de afecções prostáticas. Lenquiste et al. (2012) verificaram que o aumento da adiposidade foi capaz de aumentar os níveis das adipocinas: leptina, grelina e adiponectina. O aumento nos níveis de leptina pode promover proliferação de células prostáticas cancerígenas, bem como inibir a apoptose in vitro, e alterar o padrão de distribuição de gordura corporal (ONUMA et al., 2003; HAVEL, 2011). Em estudo recente, Habib et al. (2015), utilizando células de câncer de próstata
e células de hiperplasia prostática benigna, observaram que a leptina foi capaz de reduzir a expressão de ERβ e ao mesmo tempo estimular a expressão de ERα. Já a adiponectina (adipocina sensível a insulina) é inversamente correlacionada à quantidade de gordura visceral, apresentando papel protetor no câncer, inibindo a angiogênese induzida pelo tumor e crescimento celular in vitro (BRAKENHIELM et al., 2004; BUB et al., 2006). Atualmente, o polimorfismo do gene da adiponectina tem sido associado ao maior risco de câncer de próstata e expressão do receptor de insulina e do IGF-1 em tumores nesta glândula (MICHALAKIS et al., 2007; DHILLON et al., 2011). Além disso, sabe-se que concentrações de adiponectina são reduzidas em caso de resistência à insulina (SAVOPOULOS et al., 2011).
O estado pró-inflamatório associado à obesidade, também contribui para o desenvolvimento e progressão do câncer de próstata. As citocinas conhecidas por estarem em níveis elevados devido ao ganho de peso como o TNFα e, as interleucinas 6 e 8 (IL-6, IL-8) são associadas ao risco de desenvolvimento deste tumor (HSING et al., 2007; SHANKAR et al., 2012). Dragano et al. (2013) verificaram alteração nos níveis de IL-6 e IL-1β no fígado de animais adultos que consumiram dieta hiperlipídica. Além disso, estes fatores pró-inflamatórios estimulam a via do NFkB, relacionada à carcinogênese. A ativação desta via é constitutiva no câncer de próstata e está relacionada à progressão do tumor independente de andrógeno (GORBACHINSKY et al., 2010; GROSSMANN e WITTERT, 2012).
A produção excessiva de espécies reativas de oxigênio é considerada um
mecanismo chave no desenvolvimento da obesidade, resistência à insulina e diabetes (FEILLET-COUDRAY et al., 2009). Estudos demonstraram que consumo de dieta hiperlipídica estimula o estresse oxidativo por meio do aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e redução da proteção antioxidante intracelular (ASCHBACHERA et al., 2014). Lenquite et al. (2015) observaram redução de glutationa reduzida (GSH), catalase e superóxido dismutase no plasma de ratos adultos que consumiram dieta hiperlipídica. Além disso, o quadro de estresse oxidativo, ocasionado pela obesidade, também está
relacionado à expressão de NFkB (FURUKAWA et al., 2004; SHANKAR et al.,
por dieta hiperlipídica na próstata, é responsável por ativar o NFkB, o que contribui para o aumento de todo o processo inflamatório.
1.6. Jaboticaba e seus compostos bioativos
Algumas frutas têm sido consumidas não somente devido a seus atributos sensoriais e preferências pessoais, mas devido aos nutrientes que apresentam (ROOSEN et al., 2007). Dentre os compostos com ação benéfica ao organismo presente nas frutas destaca-se a significativa quantidade de minerais, fibras, vitaminas e compostos bioativos (LEITE-LEGATTI et al., 2012).
Foi definido por Kris-Etherton et al. (2002) que compostos bioativos são substâncias extranutricionais, presentes em pequenas quantidades nos alimentos, as quais apresentam efeito significativo para a saúde. Dentre eles destacam-se os compostos fenólicos, os quais são metabólitos secundários de plantas, e podem ser quimicamente definidos como substâncias que possuem um anel benzeno ligado a uma ou mais hidroxilas, podendo apresentar outros grupos substituintes em sua estrutura, como ésteres, metil-ésteres e glicosídeos (HO et al., 2010). Além disso, estes são subdivididos em duas categorias, sendo os flavonóides e não-flavonóides (ABE et al., 2007; HO et al., 2010).
Inicialmente, os compostos fenólicos são produzidos pelas plantas a fim de protege-las dos ataques físicos como o estresse hídrico, a radiação ultravioleta do sol e dos ataques biológicos por fungos, vírus e bactérias. Dessa forma, estão distribuídos nas folhas, nas sementes e principalmente na casca dos vegetais (ANDRADE, 2006; DOMENEGHINI e LEMES, 2011).
Dentre as propriedades benéficas à saúde atribuídas aos compostos bioativos, destaca-se: atividade antioxidante, atividade anti-inflamatória, atividade anti-carcinogênica, habilidade de prevenir doenças cardiovasculares e neurodegenerativas, redução do ganho de peso, regulação de hormônios relacionados a obesidade, bem como melhora dos quadros de intolerância à glicose e resistência à insulina (TSUDA et al., 2003; BRITO et al., 2007; DEFURIA et al., 2009; LEITE et al., 2011; WU et al., 2012).
A jaboticaba é uma fruta brasileira amplamente conhecida no país. Pode ser encontrada nas variedades Myrciaria caulifolia Vell Berg e Myrciaria caulifolia (DC) Berg (MATTOS, 1983; DONADIO, 2000) sendo consumida principalmente
na forma “in natura”. É considerada uma fruta brasileira com significativo teor de flavonóides da classe antocianinas, especialmente na casca, as quais são responsáveis pela maioria das cores azul, violeta e tonalidades de vermelhos presentes em flores e frutos (KONG et al., 2003; LEITE-LEGATTI et al., 2012). Estudo prévio observou a presença de 315mg antocianinas em 100g de casca de jaboticaba (TERCI, 2004). Apesar de as antocianinas terem sido descritas como composto majoritário, já foi relatado à presença de outros compostos fenólicos na casca deste fruto, como ácidos fenólicos, quercetina, isoquercitina, taninos (ácido gálico e ácido elágico) e terpenos (REYNERTSON et al., 2006; PLAGEMANN et al., 2012). Além disso, esta fruta é uma boa fonte de carboidratos, minerais (cálcio, ferro, potássio e fósforo), aminoácidos (triptofano, lisina), vitaminas (principalmente vitamina C), fibras solúveis e insolúveis (LORENZI et al., 2000; LENQUISTE et al., 2012). Outro importante composto presente na casca da jaboticaba pertence à classe dos depisídeos, denominados jaboticabinas, os quais apresentam intensa atividade anti-proliferativa (REYNERTSON et al., 2006). Apesar disto, estes compostos são pouco encontrados em produtos feitos a partir deste fruto, como geleias e licores (WU
et al., 2012).
Estudos prévios já demonstraram o efeito da ingestão da casca de jaboticaba em parâmetros metabólicos, hepáticos e oxidativos de roedores (LEITE et al., 2011; LENQUISTE et al., 2012; DRAGANO et al., 2013; BATISTA
et al. 2014). Foi visto que a adição de casca da jaboticaba liofilizada a dieta
hiperlipídica consumida por ratos aumenta os níveis séricos de grelina e HDL-colesterol, sugerindo seu efeito positivo no controle do processo fome-saciedade, bem como no metabolismo lipídico (LENQUISTE et al., 2012). Além disso, Dragano et al. (2013) demonstraram que o consumo da casca de jaboticaba liofilizada foi capaz de prevenir resistência à insulina, reduzir níveis séricos de insulina, além de aumentar o nível de moléculas que participam da via de sinalização deste hormônio, como pIR, IRS-1 e pAkt, em camundongos tratados com dieta hiperlipídica. Estes autores também verificaram a capacidade da casca da jaboticaba liofilizada de reduzir o processo inflamatório no fígado, demonstrando decréscimo de IL-6 e IL-1β após o tratamento.
Com relação à parâmetros oxidativos, Lenquiste et al. (2015) observaram que o consumo do extrato aquoso da casca da jaboticaba foi capaz de aumentar
os níveis de glutationa reduzida, de glutationa peroxidase plasmática e hepática, bem como de catalase hepática em ratos que consumiram dieta hiperlipídica. Corroborando estes resultados, Batista et al. (2014) observaram redução da peroxidação lipídica no fígado e cérebro, além de aumento dos níveis das enzimas glutationa peroxidase e superóxido dismutase em animais que consumiram a casca da jaboticaba liofilizada juntamente com a dieta hiperlipídica. Em revisão, Fraga et al. (2010) descrevem a capacidade dos compostos fenólicos de estabilizar radicais livres como sendo seu principal mecanismo de ação antioxidante, permitindo reequilíbrio da fisiologia celular.
A atividade anti-proliferativa da casca da jaboticaba em células de leucemia e câncer de próstata foi verificada por Leite-Legatti et al. (2012). Entretanto, existem poucas evidências na literatura científica que relacione a casca da jaboticaba e o tecido prostático. Apesar disto, estudos avaliando o efeito de outros compostos naturais ou compostos fenólicos isolados na próstata sugerem efeito benéfico sob diversos tipos de alterações. Foi observado por Khan e Mukhtar (2013) que compostos fenólicos provenientes do chá verde foram capazes de reduzir a expressão de NFkB e IGF-1, bem como a proliferação celular na próstata de roedores com câncer. A administração de quercetina, também apresentou efeitos positivos, reduzindo a expressão de AR e proliferação celular, além de reduzir expressão de marcadores anti-apoptóticos e aumento de apoptose na próstata ventral e dorso-lateral de ratos com câncer (SHARMILA et al., 2014). Além disso, Vanella et al. (2013) confirmaram a capacidade do ácido elágico em reduzir os níveis de VEGF, FGF e IL-15 em cultura de células de câncer prostático. Corroborando estes autores, Wang et al. (2016) verificaram redução nos níveis de VEGF em células de câncer de próstata em cultura, após tratamento com chá verde e/ou quercetina. Já, a atividade benéfica das antocianinas em relação ao estresse oxidativo causado pela hiperplasia benigna de próstata foi relatada por Li et al. (2013) que verificaram redução da peroxidação lipídica, bem como aumento na capacidade de absorção do radical oxigênio (ORAC), glutationa total, enzimas superóxido dismutase e glutationa peroxidase na próstata de camundongos.
2. JUSTIFICATIVA
O envelhecimento é o periodo da vida no qual ocorrem alterações metabólicas e hormonais em individuos do sexo masculino, as quais favorecem o estado de prediabetes e o desequilíbrio morfológico e funcional do tecido prostático, culminando no desenvolvimento de lesões. Recentes estudos provenientes de nosso grupo de pesquisa descreveram aumento de lesões malignas, proliferação celular, angiogênese além de desequilíbrio hormonal e presença do quadro de estroma reativo na próstata de animais senescentes (KIDO et al., 2014; MONTICO et al., 2015; MONTICO et al., 2015; KIDO et al., 2017). Isto posto, tais achados reiteram que o aumento da população idosa tem sido fator de preocupação em todo o mundo.
Além disso, é conhecido o fato do aumento da incidencia de sobrepeso na população com idade avançada nos ultimos anos. O forte indicativo de que dietas ricas em gordura são fatores que potencializam e ou deflagram danos metabólicos no organismo, bem como lesões prostáticas malígnas ou não, também tem sido fatores de grande preocupação para o bem estar deste grupo populacional. Apesar disto, os efeitos da dieta hiperlipídica sobre o metabolismo e a próstata durante o envelhecimento ainda não estão totalmente elucidados. Dessa forma, há pertinência para a realização de estudos que esclareçam aspectos relacionados, particularmente, a interação epitélio-estroma desta glândula tanto durante o envelhecimento como associado ao sobrepeso, considerando parâmetros inflamatórios, hormonais, angiogênese e estresse oxidativo na dinâmica do microambiente prostático.
No contexto o envelhecimento e da obesidade, a necessidade de terapias naturais que estimulem hábitos saudáveis e ao mesmo tempo previnam e/ou revertam lesões são importantes na atualidade visto que, maus hábitos alimentares contribuem para o aparecimento de doenças. A jaboticaba, por ser uma fruta conhecida no Brasil e conter compostos bioativos, que apresentam benefícios sobre diferentes alterações teciduais e/ou metabólicas, tem sido considerada uma potencial terapia na prevenção e/ou minimização de afecções. Dessa forma, entendemos que novos estudos certamente indicarão novas opções terapêuticas para a prevenção e ou tratamento de alterações
metabólicas e de lesões da próstata decorrentes do envelhecimento associado ou não ao sobrepeso.
3. OBJETIVO
O objetivo geral do presente estudo foi desenvolver um extrato da casca da jaboticaba e avaliar seu possível efeito terapeutico sobre parâmetros metabólicos e sobre a biologia estrutural e molecular do lobo ventral prostático, especialmente relacionado à angiogênese, inflamação, desequilíbrio hormonal e estresse oxidativo, durante período de senescencia associado ou não ao consumo de dieta hiperlipídica.
3.1. Objetivos específicos
I. Desenvolver extrato da casca da jaboticaba e avaliar sua composição bioativa bem como seu potencial antioxidante in vitro;
II. Caracterizar o efeito da senescência associado ou não ao consumo de dieta hiperlipídica através de parâmetros metabólicos, morfológicos, e moleculares avaliando o metabolismo de glicose e lipídeo, morfologia hepática e do lobo ventral da próstata, além da imunoreatividade de moléculas relacionadas a alterações hormonais, angiogênicas, inflamatórias, oxidativas, morte e proliferação celular no microambiente da próstata ventral de camundongos FVB;
III. Caracterizar o efeito terapêutico do extrato de casca da jaboticaba em animais senescentes submetidos ou não à dieta hiperlipídica através de parâmetros metabólicos, morfológicos, e moleculares avaliando o metabolismo de glicose e lipídeo, morfologia hepática e do lobo ventral da próstata, além da imunoreatividade de moléculas relacionadas a alterações hormonais, angiogênicas, inflamatórias, oxidativas, morte e proliferação celular no microambiente da próstata ventral de camundongos FVB;
IV. Verificar e comparar o efeito terapêutico de duas doses (crescentes) do extrato da casca da jaboticaba com maior efetividade na reversão e/ou minimização dos efeitos do processo de senescência associado ou não ao
consumo de dieta hiperlipídica através de parâmetros metabólicos, morfológicos e da biologia celular no lobo ventral da próstata.
4. MATERIAL E MÉTODOS GERAIS
4.1. Extrato da Casca da Jaboticaba (ECJ)
A extração é um processo muito usado para isolar compostos bioativos de produtos naturais. O método utilizado para preparar o ECJ foi patenteado (MARÓSTICA et al., 2017 - ANEXO I) e consistiu na adição da casca de jaboticaba liofilizada em etanol com posterior remoção de solvente. Os compostos presentes no ECJ e sua atividade antioxidante in vitro foram avaliados conforme descrito abaixo.
4.2. Avaliação de Fenóis Totais
A avaliação de fenóis totais presentes no extrato foi realizada de acordo com o método proposto por Swain e Hillis (1959) e adaptado por Roesler et al. (2007), baseado na redução do reagente Folin-Ciocalteu na presença de compostos fenólicos. Os resultados foram expressos em mg de equivalente de ácido gálico (EAG) por gde amostra seca.
4.3. Avaliação de Antocianinas Monoméricas
A concentração de antocianinas monoméricas foi determinada de acordo com o método proposto por Wrolstad (1976) e adaptado por Abe et al. (2007). A absorbância da amostra diluída foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: A = (A510 – A700)pH 1,0 – (A510 – A700)pH 4,5. Em seguida foi calculada a
concentração do pigmento antocianina monomérica na amostra original, como segue: Antocianina Monomérica (mg/100g) = (A x PM x FD x 100) / (e x 0,71*). Onde: A = absorbância (cálculo anterior); PM = peso molecular da antocianina predominante na amostra; FD = fator de diluição; e = absortividade molar da antocianina predominante na amostra; DF = fator de diluição; 0,71= valor
