O estresse oxidativo (EO) é considerado fator importante no desenvolvimento do câncer de próstata e outras lesões pré-malignas nesta glândula decorrentes do envelhecimento, apresentando relação direta com estabelecimento de processo inflamatório (VALKO et al., 2007; RICH Jr et al., 2012; KIDO et al., 2017). Além disso, estudos prévios de nosso grupo de pesquisa demonstraram que a ingestão de dieta hiperlipídica (DH) intensificou alterações no tecido prostático, demonstrando papel crucial na injuria desta glândula (Artigo Científico II). Dessa forma, tendo como foco a prevenção de modificações oxidativas e inflamatórias na próstata decorrente do envelhecimento associado ou não ao sobrepeso, os presentes resultados demostraram a capacidade dose dependente do ECJ de reduzir estes processos no lobo ventral da próstata.
No presente estudo, o envelhecimento induziu EO e consequentemente o processo de peroxidação lipídica na próstata, sendo intensificado pelo consumo de DH. A literatura especializada tem apontado que com o avanço da idade ocorre redução da atividade fisiológica do organismo, fato que contribuiu para formação elevada de radicais livres, produzidos pelo metabolismo aeróbico (VALKO et al., 2007). O acúmulo destes radicais durante o envelhecimento leva ao aumento progressivo do EO, causando cada vez mais danos ao organismo. Dentre estas alterações, destaca-se o aumento da peroxidação lipídica, danos ao DNA, redução de mecanismos de reparo de DNA, oxidação proteica, bem como interferência em vias de apoptose e proliferação celular (HARMAN, 1956; VALKO et al., 2007; RICH Jr et al., 2012). Além disso, o desenvolvimento do EO promove alterações na maquinaria enzimática de defesa intracelular, levando a alterações nos níveis de GSR, GSH, GPx, SOD e Catalase, considerados importantes biomarcadores do estresse (VALKO et al., 2007; RIBEIRO et al., 2010; RICH Jr et al., 2012).
Controvérsias podem ser identificadas na literatura científica com relação ao aumento ou redução destes marcadores durante situações de EO (RIBEIRO
et al., 2010; COLADO-VELASQUEZ et al., 2015; BATISTA et al., 2017). Nossos
presentes resultados mostraram aumento da catalase e SOD2 durante o envelhecimento associado ou não ao sobrepeso. Tais resultados estão em concordância com autores prévios, os quais sugeriram que a atividade de enzimas antioxidantes aumenta com o EO (RIBEIRO et al., 2010). Entretanto, outros autores já indicaram previamente redução na atividade da SOD total e Catalase, bem como aumento nos níveis de peroxidação lipídica na próstata de ratos com obesidade induzida pela ingestão de sacarose (COLADO- VELASQUEZ et al., 2015). Neste contexto, Pires et al. (2011) sugeriram que o aumento ou manutenção da atividade de enzimas antioxidantes é um processo que ocorre antes de sua inibição e que varia de acordo com a metodologia utilizada para a indução do EO.
O envelhecimento associado ou não ao sobrepeso também interferiu em moléculas do ciclo antioxidante da glutationa, reduzindo o nível de GPx3 e GSH, além de aumentar o nível de GSR. Níveis reduzidos de GPx3 e GSH são especialmente relacionados ao desenvolvimento do câncer de próstata e ao aumento local de espécies reativas de oxigênio (EROs), amplificando danos oxidativos a célula (THOMAS e MALLIS, 2001; SEKINE et al., 2011). Outros estudos indicaram que a redução de GPx3 acelera o crescimento prostático, por apresentar atividade de supressão tumoral, tendo sua expressão inversamente proporcional ao escore de Gleason (YU et al., 2007; SEKINE et al., 2011). Já, níveis reduzidos de GSH são relacionados ao aumento de sua oxidação, sugerindo aumento de EO (TOWNSEND et al., 2003). Além disso, o aumento de GSR em situação de EO representa uma alteração do organismo para a manutenção de elevados níveis de glutationa, com capacidade antioxidante, indicando tentativa do organismo de neutralizar esse estresse (SKRYZYDLEWSKA et al., 2002).
Dessa forma, no presente estudo, o aumento de SOD2, catalase e GSR sugere uma tentativa do organismo de estabilizar alterações no padrão oxidativo, ocasionadas pelos tratamentos experimentais. Apesar disto, os reduzidos níveis de GSH e GPx3, bem como a elevada peroxidação lipídica verificada neste estudo, sugere que a maquinaria enzimática de defesa intracelular não foi
suficiente para prevenir as consequências do EO provocado pelo envelhecimento e/ou sobrepeso no modelo experimental utilizado. Assim, concluímos que o envelhecimento e/ou sobrepeso foram capazes de estimular o EO, o que possivelmente contribuiu para o desequilíbrio no microambiente prostático, desencadeando alterações severas como processos inflamatório e proliferativo, bem como o aparecimento de lesões pré-malignas nesta glândula.
A administração do ECJ foi capaz de reestabelecer os níveis de enzimas antioxidantes intracelulares e de peroxidação lipídica na próstata de camundongos durante o envelhecimento e/ou com sobrepeso. Estudo prévio de nosso grupo de pesquisa verificou que o ECJ, também utilizado no presente estudo, apresentou relevante conteúdo de compostos fenólicos, bem como alta atividade antioxidante in vitro (LAMAS et al., 2018). Apesar disto, evidências da ação da jaboticaba no microambiente da próstata para se comparar seu efeito antioxidante benéfico ou não, não foram apresentados na literatura. Entretanto, foi previamente verificado que o consumo de casca de jaboticaba liofilizada associado a DH foi capaz de modular os níveis de SOD, catalase, GSR, GPx e peroxidação lipídica no fígado ou plasma de ratos (BATISTA et al., 2014). Apesar disto, Lenquiste et al. (2015) observaram somente alteração no nível de catalase e GSH após ingestão de chá da casca da jaboticaba, associado a DH, no fígado de ratos. Assim, os presentes resultados indicaram a eficácia do ECJ desenvolvido por nós, uma vez que foi capaz de interferir nos níveis de SOD2, catalase, GSR, GSH, GPx3 e peroxidação lipídica no tecido prostático alterado pelo envelhecimento e/ou consumo de DH.
A redução do EO na próstata já foi verificada após tratamento com diferentes polifenóis provenientes de produtos naturais como o chá verde e a palmeira (PANDEY et al., 2010; CALADO-VELASQUEZ et al., 2012; HENNING
et al., 2012). Estes efeitos foram atribuídos a capacidade de modular a
maquinaria antioxidante enzimática intracelular, reduzindo os níveis de peroxidação lipídica e de EROs no tecido prostático (CALADO-VELASQUEZ et
al., 2012; HENNING et al., 2012). Além disso, foi verificado que os polifenóis do
chá verde apresentaram a capacidade de interferir na remodelação da cromatina e alterar a metilação do DNA, estimulando a expressão de glutationa-S- transferase pi (PANDEY et al., 2010). Esta molécula é responsável por catalisar
a reação da glutationa com substratos de peroxidação lipídica, reduzindo a toxicidade e facilitando a excreção (PANDEY et al., 2010).
Além disso, dentre as propriedades atribuídas aos compostos fenólicos, está a sua capacidade de estabilizar radicais livres, a qual é considerada sua principal atividade antioxidante, permitindo a inibição ou redução do EO e peroxidação lipídica (BORS et al., 1990; FRAGA et al., 2010). Estas moléculas também apresentaram capacidade de interagir com as membranas celulares, devido a presença de domínios hidrofóbicos e hidrofílicos em sua molécula, ficando mais próximos da bicamada lipídica, o que permite maior proteção ao processo de peroxidação lipídica da membrana celular (VERSTRAETEN et al., 2005; SIRK et al., 2009; FRAGA et al., 2010). Dessa forma, sugerimos que a capacidade antioxidante dos polifenóis contribuiu para reduzir o estresse oxidativo de forma ampla, implicando diretamente no equilíbrio da maquinaria antioxidante endógena, bem como na redução da peroxidação lipídica da membrana celular. De forma geral, acreditamos que a redução de estresse oxidativo ocasionada pelo ECJ possa ter contribuído para a manutenção de microambiente que favoreceu a interação entre compartimentos prostáticos, prevenindo o desenvolvimento de alterações associadas, como processo inflamatório intenso.
Diversas pesquisas já relacionaram o envelhecimento a presença de processo inflamatório (RICH Jr et al., 2012; KIDO et al., 2017). Nosso estudo mostrou pela primeira vez na literatura científica o efeito do consumo de DH durante o envelhecimento, intensificando o processo inflamatório na próstata, em período da vida em que o organismo já apresenta alterações típicas no tecido prostático. Em concordância com os presentes resultados, estudo anterior do nosso grupo de pesquisa demonstrou aumento de importantes marcadores pró- inflamatórios na próstata durantes este período, tais como NFkB, COX-2, TNFα e IL-1β (KIDO et al., 2017). Acredita-se que o desequilíbrio hormonal e EO, tenham papel fundamental no estímulo ao processo inflamatório, bem como com o surgimento de lesões malignas na próstata durante o envelhecimento (ELLEM
et al., 2009). Além disso, sabe-se que o consumo de DH está diretamente
associado ao aumento da expressão de NFkB, STAT-3 e COX-2, bem como níveis de IL-1β, IL-6 e TNFα, sendo acompanhado de evidencias morfológicas de inflamação na próstata de camundongos (SHANKAR et al., 2012; LIU et al.,
2014). O tecido adiposo está relacionado a maior secreção de citocinas pró- inflamatórias, bem como indução de EO, influenciando a patogênese inflamatória na próstata (SHANKAR et al., 2012).
A literatura especializada tem considerado o fator de transcrição NFkB um mediador essencial para ativar a resposta inflamatória em modelo de envelhecimento e consumo de DH (SHANKAR et al., 2012; KIDO et al., 2017). Outros autores demonstraram previamente que a formação de EROs e consequentemente o EO estimulam vias inflamatórias, sendo a ativação primária da sinalização de NFkB, essencial para organizar a expressão de outros fatores pró-inflamatórios (SHANKAR et al., 2015). Além disso, há evidências de que a ativação de NFkB pode tanto estimular quanto ser estimulado pela produção de EROs em organismos caracterizados como obesos, gerando a condição de inflamação oxidativa, ainda mais prejudicial ao tecido prostático (VALKO et al., 2007; VYKHOVANETS et al., 2011; SHANKAR et al., 2012; COLADO- VELASQUEZ et al., 2015). A regulação positiva do NFkB promove o recrutamento de outras citocinas inflamatórias, como IL-1, IL-6 e TNFα, estimulando o sítio de inflamação (PASPARAKIS, 2009; SHANKAR et al., 2015). Dessa forma, a constante secreção destas citocinas, geram uma retroalimentação positiva, ativando o NFkB de forma constitutiva e crônica. Este processo contribui para a manutenção do processo inflamatório, estimulando outras moléculas inflamatórias tais como COX-2 e STAT-3, interferindo na regulação de genes relacionados a proliferação, sobrevivência e invasão celular (BOLLRATH e GRETEN, 2009; SHANKAR et al., 2012).
Liu e colaboradores (2014) observaram após tratamento de células epiteliais prostáticas (normais, benignas e malignas), com ácidos graxos saturados, que a superexpressão de NFkB é acompanhada da superexpressão de COX-2. Estes autores verificaram que o NFkB se liga a sítios regulatórios do gene da COX-2, promovendo inflamação crônica, por via de sinalização comum derivada do TLR4. A utilização de bloqueador específico de TLR4 confirmou este efeito, uma vez que promoveu a translocação de NFkB e inibição da COX-2. Níveis elevados de COX-2 também foram observados em modelo de hiperplasia prostática benigna, sendo sua expressão associada a regiões de intensa proliferação celular ou atrofia inflamatória proliferativa, promovendo secreção de
prostaglandinas e controlando processos de proliferação e apoptose (ZHANG et
al., 2005; SUGAR, 2006; LIU et al., 2014; SHANKAR et al., 2015).
O “crosstalk” entre o NFkB e o fator de transcrição STAT-3 representa outro caminho para o desenvolvimento de inflamação na próstata, após ingestão de DH (SHANKAR et al., 2012). O STAT-3 é estimulado principalmente pelas IL- 1 e IL-6 ativadas pelo NFkB. Estas interleucinas apresentam papel fundamental estimulando a associação física entre STAT-3 e NFkB no núcleo celular (LEE et
al., 2009; SHANKAR et al., 2012). Esta interação impede a liberação de NFkB,
mantendo-o ativado de forma permanente, tendo implicações patológicas (LEE
et al., 2009; SHANKAR et al., 2012). A ativação de STAT-3 também promove a
retroalimentação positiva, estimulando ainda mais a secreção de interleucinas e o processo inflamatório crônico. Este “crosstalk” é considerado fator fundamental para a inflamação associada a carcinogênese, sustentando a inflamação crônica e estimulando a progressão neoplásica (SHANKAR et al., 2015). Assim, a STAT- 3 cria uma condição pró-inflamatória, suprimindo a resposta imune anti-tumoral (DARNELL et al., 1994; SHANKAR et al., 2015).
Dessa forma, como discutido acima, o consumo de DH intensificou o EO no lobo ventral da próstata de camundongos durante o envelhecimento, o que possivelmente implicou diretamente no aumento da inflamação intraprostática. Este fato, associado ao aumento de interleucinas inflamatórias, possivelmente colaborou de forma importante para o estímulo crônico ao NFkB, o qual pode ser relacionado ao aumento de moléculas inflamatórias de diferentes vias de sinalização. Além disso, a capacidade da DH de intensificar a ativação de moléculas de diferentes vias pode ter potencializado a ativação do NFkB, contribuindo ainda mais para a injuria prostática. Assim, de forma geral, nós concluímos que o consumo de DH colaborou para a ocorrência de inflamação crônica e oxidativa na próstata de animais durante o envelhecimento, facilitando processos de proliferação celular e aparecimento de lesões nesta glândula.
Estudos que relacionem o consumo de jaboticaba à inflamação da próstata não foram encontrados na literatura científica. Dessa forma, nossos resultados indicaram, de forma inédita, que o ECJ utilizado é capaz de interferir no processo inflamatório crônico observado na próstata de camundongos durante o envelhecimento associado ou não ao sobrepeso. Entretanto, outras pesquisas já demonstraram que o ECJ ou casca de jaboticaba liofilizada
reduziram os níveis de IL-6, IL-1β, COX-2 e TNFα no fígado de camundongos de ingeriram DH, apresentando ação importante na redução da patogênese neste órgão (DRAGANO et al., 2013; LAMAS et al., 2018). Além disso, estudos envolvendo modelos de isquemia renal e melanoma elucidaram o fato de a reduzida expressão de TLR4 por polifenóis, ser uma importante forma de modular a via TLR4/NFkB, reduzindo consequentemente níveis séricos de IL-1β, IL-6 e TNFα (LI et al., 2014; CHEN et al., 2018). Li e colaboradores (2014) destacaram a importância da atividade antioxidante apresentada pelos polifenóis, provendo modulação dos mecanismos antioxidantes endógenos, estimulando negativamente vias de sinalização inflamatórias.
Outros polifenóis já demonstraram habilidade de modulação de marcadores inflamatórios em cultura de células prostáticas (HAFEEZ et al., 2008; LEE et al., 2011; DAVALLI et al., 2012; FERRUELO et al., 2014). De acordo com Ferruelo et al. (2014), a capacidade da quercetina e do resveratrol de reduzir o NFkB, participa da redução da expressão de COX-2, estando diretamente relacionado a redução do processo proliferativo. Davalli et al. (2012) reforçaram este resultado, descrevendo que a epigalocatequina, polifenol derivado do chá verde, foi capaz de reduzir a ligação de NFkB ao DNA, diminuindo a expressão de sua subunidade ativa, bem como de moléculas por ele ativadas como a COX- 2. Além disso, estudos avaliando efeito de antocianinas e α-tomatina, em cultura de células de câncer de próstata, revelaram que a inibição do NFkB ativa processos apoptóticos, principalmente por aumentar a relação Bax/Bcl-2 (HAFEEZ et al., 2008; LEE et al., 2011).
Estudos prévios de nosso grupo de pesquisa, focando em lesões prostáticas neoplásicas ou relacionadas ao envelhecimento, revelaram importantes considerações com relação a quimioprevenção do processo inflamatório nesta glândula (KIDO et al., 2016; KIDO et al., 2017). De acordo com estes autores, a capacidade de reduzir os níveis de NFkB na próstata representa importante caminho de regular o processo inflamatório nesta glândula. Dessa forma, os autores verificaram que reduzir o NFkB implica na redução de uma série de mediadores pró-inflamatórios, tais como: IL-1β, TNFα, COX-2, pSTAT- 3, os quais contribuem para o suporte a este processo. Além disso, estes mesmos autores relacionaram a redução do processo inflamatório ao menor nível de fator mitogênico e proliferação celular, sugerindo que a regulação da
inflamação possa interferir em outros processos cruciais ao desenvolvimento neoplásico.
Dessa forma, os resultados obtidos no presente estudo apontaram o ECJ como um composto promissor na prevenção de processo inflamatório na próstata. A capacidade do ECJ de reduzir o NFkB e TLR4 no presente estudo representam aspecto chave na minimização do processo inflamatório crônico, generalizado no tecido prostático. Ainda podemos sugerir que a atuação do ECJ nestas moléculas possa ter influenciado a redução de mediadores “downstream”, que promovem suporte a este processo. Estes fatos possivelmente permitiram que a atuação no ECJ na próstata de camundongos durante o envelhecimento com ou sem sobrepeso ocorresse de forma abrangente, reduzindo os níveis de diferentes moléculas de vias inflamatórias interligadas no tecido prostático.