TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
LÊ THỊ NGỌC THẢO
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HOÁ CỦA CÁC
HỢP CHẤT CÓ TRONG THÂN VÀ LÁ
MÀN MÀN HOA TÍM (Cleome chelidonii)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
LÊ THỊ NGỌC THẢO
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HOÁ CỦA CÁC
HỢP CHẤT CÓ TRONG THÂN VÀ LÁ
MÀN MÀN HOA TÍM (Cleome chelidonii)
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA DƯỢC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. NGUYỄN TRỌNG TUÂN Cần Thơ, 2014
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, con xin cảm ơn ba mẹ đã tạo mọi điều kiện và động viên tinh thần giúp con có động lực để hoàn thành tốt luận văn này.
Em cũng xin cảm ơn quý thầy cô Bộ môn Hoá Khoa Khoa Học Tự Nhiên đã hết lòng dạy dỗ và truyền đạt những bài học, kinh nghiệm quý báu giúp em có đủ kiến thức để hoàn thành tốt luận văn.
Hơn nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Trọng Tuân đã tận tình định hướng hướng đi cho em trong những ngày đầu tiên bắt đầu thực hiện luận văn, tạo mọi điều kiện và giúp đỡ để em có thể thực hiện luận văn tốt nhất. Thầy luôn theo sát nhắc nhở và giải đáp những thắc mắc giúp em có thể nhanh chóng hoàn thành xong nghiên cứu.
Đặc biệt em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Thế Duy đã truyền đạt những bài học quý báu trong những ngày đầu bước vào phòng thí nghiệm.
Bên cạnh đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn đến chị Huệ Nhi đã tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ để em hoàn thành tốt luận văn.
Em cũng xin được cảm ơn quý thầy cô trong Hội đồng chấm luận văn đã dành thời gian quý báu để đọc và nhận xét bài báo cáo giúp em hoàn thiện luận văn.
Cuối cùng em xin cảm ơn các anh chị cao học và các bạn cùng làm trong phòng thí nghiệm Hoá Sinh 1 đã luôn quan tâm, chia sẻ và truyền đạt những kinh nghiệm trong suốt thời gian qua.
Xin chân thành cảm ơn! Cần Thơ, ngày… tháng … năm 2014
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập Tự Do Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Nguyễn Trọng Tuân
2. Đề tài: “Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các hợp chất có trong thân và lámàn màn hoa tím (Cleome chelidonii)”
3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Ngọc Thảo MSSV: 2112090 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
... ... b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
... ...
Những vấn đề còn hạn chế:
... ... c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
... ... d) Kết luận, đề nghị và điểm: ... ... Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cán bộ hướng dẫn TS. Nguyễn Trọng Tuân
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Trường Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập Tự Do Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện: ……… 2. Đề tài: : “Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các hợp chất có trong thân và lá màn màn hoa tím (Cleome chelidonii)”.
3. Sinh viên thực hiện: Lê Thị Ngọc Thảo MSSV: 2112090 Lớp: Hóa Dược – Khóa: 37
4. Nội dung nhận xét:
a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
... ... b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
... ...
Những vấn đề còn hạn chế:
... ... c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
... ... d) Kết luận, đề nghị và điểm: ... ... Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2014 Cán bộ phản biện
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
TÓM TẮT
Nghiên cứu đã áp dụng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH để xác định khả năng ức chế gốc tự do của các hợp chất kháng oxi hoá của thân và lá màn màn hoa tím (Cleome chelidonii). Độ hấp thụ của DPPH trong MeOH khoảng 0,2175 ở bước sóng 517 nm. Đường chuẩn Vitamin C được xây dựng trong khoảng nồng độ từ 5 – 25 µM. Kết quả giá trị IC50 của Vitamin C đo được là khoảng 22 µM.
Tiến hành đo quang phổ hấp thụ 6 cao phân đoạn gồm: Cao Lá – MeOH (TiL – MeOH), Lá – Ethyl Acetate (TiL – EtOAc), Lá– Hexane (TiL – Hex),Thân – MeOH MeOH), Thân – Ethyl Acetate (TiTh-EtOAc), Thân – Hexane (TiTh-Hex) bằng phương pháp UV-Vis. Kết quả giá trị IC50 của 6 cao lần lượt là: TiL – MeOH (74,82 µg/mL), TiL – EtOAc (82,644 µg/mL), TiL – Hex (372,42 µg/mL), TiTh – MeOH (76,173 µg/mL), TiTh – EtOAc (106,618 µg/mL), TiTh – Hex (451,691 µg/mL).
Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng tiến hành định tính cao chiết, bước đầu xác định một số hợp chất có khả năng kháng oxi hoá trong cao chiết bao gồm: Flavonoid, Alkaloid, Polyphenol, Glycoside.
Từ khoá: Cleome chelidonii, IC50, DPPH, màn màn hoa tím,kháng
oxi hoá
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
ABTRACT
The research focused onDPPH using free radicals DPPH to determine ability to inhibit free radical of oxidative compounds in stems and leave of C. chelidonii. The ascorbance of DPPH in MeOH was about 0,2175 at 517 nm. The linearity was observed of Vitamin Cin the concerntration range of 5 – 25 µM. IC50 value of Vitamin Cwas about 22 µM.
Leaves extracts in Methanol (TiL-MeOH), Ethyl Acetate (TiL-EtOAc), Hexane (TiL-Hex) and stems extracts in Methanol (TiTh-MeOH), Ethyl Acetate (TiTh-EtOAc), Hexane (TiTh-Hex) which were measured by UV-Vis method. The results indicated that there were 4 extracts show moderated the antioxidant activity with IC50 values:TiL-MeOH (74,82 µg/mL), TiL-EtOAc (82,644 µg/mL), TiL-Hex (372,42 µg/mL), TiTh-MeOH (76,173 µg/mL), TiTh-EtOAc (106,618 µg/mL), TiTh-Hex (451,691 µg/mL).
Besides, the research also carried out the qualitative extracts and identified a number of compounds that be able to antioxidant as: Flavonoids, Alkaloids, Polyphenol, Glycoside.
Keywords:Cleome chelidonii, IC50, DPPH.
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Đề tài: “KH H
MÀN MÀN HOA TÍM (
Tôi xin cam đoan các k
nghiên cứu được thực hiện trong thời gian qua v luận văn cùng cấp n Hiệu trưởng: ……….. Trường khoa: Trưởng chuyên ngành ……… TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN TH KHOA KHOA HỌC TỰ NHI
BỘ MÔN HOÁ HỌC
Năm học 2014 – 2015
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HOÁ CỦA CÁC HỢP CHẤT CÓ TRONG THÂN VÀ LÁ
MÀN MÀN HOA TÍM (Cleome chelidonii LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các kết quả trình bày trong luận văn đều dựa ợc thực hiện trong thời gian qua và chưa được d
ấp nào khác.
Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2014 Sinh viên thực hiện
Lê Thị Ngọc Thảo
Luận văn tốt nghiệp đại học Chuyên ngành: Cử nhân hoá dược Đã bảo vệ và được duyệt ……….. : ……… ên ngành Cán bộ hướng dẫn ……… Nguyễn Trọng Tuân ỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ ỌC TỰ NHIÊN Ộ MÔN HOÁ HỌC
ẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXI HOÁ CỦA CÁC À LÁ
helidonii)".
ận văn đều dựa vào ợc dùng cho bất kỳ ơ, ngày … tháng … năm 2014 ực hiện ……….. ………. ớng dẫn ễn Trọng Tuân
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN………i
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN………...ii
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN……….iii
TÓM TẮT………iv
ODTRACT………..v
LỜI CAM ĐOAN……….vi
DANH MỤC BẢNG………ix
DANH MỤC HÌNH………..x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT………..xii
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU ... 1
1.1 Đặt vấn đề ... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ... 2
1.3 Nội dung nghiên cứu ... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 3
2.1 Tổng quan về màn màn hoa tím ... 3
2.1.1 Giới thiệu chung về họ màn màn (Cleomaceae) [5] ... 3
2.1.2 Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii) ... 3
2.1.3 Công dụng ... 5
2.1.4 Thành phần hoá học ... 6
2.1.5 Tình hình nghiên cứu về màn màn tím (C. chelidonii) ... 6
2.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH ... 7
2.2.1 Gốc tự do ... 7 2.2.1.1 Giới thiệu về gốc tự do ... 7 2.2.1.2 Các loại gốc tự do thường gặp [10] ... 8 2.2.1.3 Vai trò của gốc tự do [2] ... 9
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
2.2.2.1 Vai trò chất chống oxi hoá ... 11
2.2.2.2 Nguyên tắc hoạt động [10] ... 11
2.2.2.3 Các chất chống oxi hoá thường gặp ... 12
2.2.3 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa [8] ... 16
2.2.3.1 Phương pháp sử dụng gốc tự do Superoxide ... 16
2.2.3.2 Phương pháp sử dụng gốc tự do Hydroxyl ... 16
2.2.3.3 Phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH ... 17
CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 18
3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện ... 18
3.2 Thiết bị, dụng cụ ... 18
3.3 Hoá chất ... 18
3.4 Định tính các thành phần có trong cao chiết [16] ... 18
3.5 Phân tích các thành phần kháng oxi hoá bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) [17] ... 19
3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp DPPH ... 20
3.6.1 Phần trăm ức chế và giá trị IC50 ... 20
3.6.2 Xây dựng đường chuẩn vitamin C (acid ascorbic) ... 20
3.6.3 Khảo sát khả năng loại gốc tự do DPPH của cao chiết... 21
3.6.3.1 Đo độ hấp thụ của cao ... 22
3.6.3.2 Đo độ hấp thụ của hỗn hợp (cao và DPPH) ... 25
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 28
4.1 Kết quả định tính ... 28
4.2 Phân tích các thành phần kháng oxi hoá bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) ... 30
4.3 Xây dựng đường chuẩn Vitamin C ... 31
4.4 Khảo sát khả năng loại gốc tự do DPPH của cao chiết từ thân và lá của màn màn tím ... 33
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 40
5.1 KẾT LUẬN ... 40
5.2 KIẾN NGHỊ ... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO………...41
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1: Xây dựng đường chuẩn Vitamin C... 21
Bảng 3.2: Đo độ hấp thụ cao TiL-MeOH ... 22
Bảng 3.3: Đo độ hấp thụ cao TiL-EtOAc ... 22
Bảng 3.4: Đo độ hấp thụ cao TiL-Hex ... 23
Bảng 3.5: Đo độ hấp thụ cao TiTh-MeOH ... 23
Bảng 3.6: Đo độ hấp thụ cao TiTh-EtOAc ... 24
Bảng 3.7: Đo độ hấp thụ của TiTh-Hex ... 24
Bảng 3.8: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL-MeOH + DPPH) ... 25 Bảng 3.9: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL-EtOAc + DPPH) ... 25 Bảng 3.10: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL-Hex + DPPH) ... 26 Bảng 3.11: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiTh-MeOH + DPPH) ... 26 Bảng 3.12: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL-EtOAc + DPPH) ... 27 Bảng 3.13: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiTh-Hex + DPPH) ... 27
Bảng 4.1: Kết quả phân tích các thành phần kháng oxi hoá bằng SKLM ... 31
Bảng 4.2: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của Vitamin C ... 32
Bảng 4.3: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của cao TiL – MeOH ... 33
Bảng 4.4: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của cao TiL – EtOAc ... 34
Bảng 4.5: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của cao TiL – Hex . 35 Bảng 4.6: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của cao TiTh – MeOH ... 36
Bảng 4.7: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của cao TiTh – EtOAc ... 37 Bảng 4.8: Kết quả độ hấp thụ và phần trăm ức chế của cao TiTh – Hex 38
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1: Màn màn hoa tím ... 4
Hình 2.2: Hình dáng hoa màn màn tím ... 5
Hình 2.3: Công thức cấu tạo của Vitamin C ... 12
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của Vitamin E ... 13
Hình 2.5: Cấu trúc chung của Acid Phenolic ... 15
Hình 2.6: Cấu trúc chung của Flavonoid ... 15
Hình 2.7: Cấu trúc chung của Stilbenes ... 16
Hình 2.8: Cấu trúc chung của Lignans ... 16
Hình 3.1: Phương trình phản ứng Cyanidin ... 19
Hình 4.1: Kết quả định tính Flavonoid cao Tím, Lá ... 28
Hình 4.2: Kết quả định tính Flavonoid cao Tím, Thân ... 28
Hình 4.3: Kết quả định tính Alkaloid cao Tím, Lá ... 29
Hình 4.4: Kết quả định tính Alkaloid cao Tím, Thân ... 29
Hình 4.5: Kết quả định tính Polyphenolcao Tím, Lá ... 29
Hình 4.6: Kết quả định tính Polyphenolcao Tím, Thân ... 29
Hình 4.7: Kết quả định tính Glycoside cao Tím, Lá ... 30
Hình 4.8: Kết quả định tính Glycoside cao Tím, Thân ... 30
Hình 4.9: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ Vitam C ... 32
Hình 4.10: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ cao TiL – MeOH ... 33
Hình 4.11: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ cao TiL – EtOAc ... 36
Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ cao TiL – Hex ... 35
Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ cao TiTh-MeOH ... 34
Hình 4.14: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ cao TiTh-EtOAc ... 37
Hình 4.15: Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của % ức chế DPPH vào nồng độ cao TiTh-Hex ... 38
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT AcOH Acetic acid
CCl4 Carbon Tetrachloride EtOAc, EA Ethyl acetate
Hex Hexane
IC50 Half maximal Inhibitory Concentration MeOH, Me Methanol
TiL-MeOH cao Methanol của lá TiL-EtOAc cao Ethyl Acetate của lá TiL-Hex cao hexane của lá
TiTh-MeOH cao Methanol của thân TiTh-EtOAc cao Ethyl Acetate của thân TiTh-Hex cao Hexane của thân Rf Retention factor SKLM Sắc ký lớp mỏng
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề
Hiện nay, sự phát triển của các nghiên cứu về gốc tự do và chất chống oxi hoá đã mở ra hướng đi mới giúp con người có thể quản lý sức khoẻ và bệnh tật [1]. Các gốc tự do tác động đến các đại phân tử (protein, DNA, lipid..) làm tổn thương hoặc gây chết tế bào [2]. Có nhiều nguyên nhân sinh ra gốc tự do, một phần phát sinh từ các hoạt động trong các bào quan trong cơ thể (ti thể, peroxisome, sự viêm nhiễm…), một phần từ các yếu tố bên ngoài (khói thuốc lá, bức xạ, ozone… và nhất là ô nhiễm môi trường) [1]. Trong khi đó, sự ô nhiễm môi trường đang là vấn đề cấp thiết, do đó nguy cơ gốc tự do gia tăng làm ảnh hưởng tới sức khoẻ con người ngày càng được quan tâm. Vì vậy, việc tìm hiểu và khám phá gốc tự do của sinh vật là cần thiết để có thể thiết kế một chế độ dinh dưỡng tối ưu góp phần chống lại các yếu tố gây độc tế bào [2].
Bên cạnh đó, việc cơ thể không thể kiểm soát việc sản xuất các gốc tự do có liên quan đến sự khởi đầu của bệnh ung thư, viêm khớp dạng thấp, xơ vữa động mạch cũng như sự suy thoái các quá trình liên quan đến não. Vì vậy để giảm thiểu các thiệt hại do gốc tự do mang lại, chất chống oxi hoá tổng hợp được tạo ra, tuy nhiên các chất oxi hoá tổng hợp đang bị nghi ngờ là gây tổn hại đến gan và gây ung thư. Do đó, việc tìm kiếm và sử dụng các chất chống oxi hoá từ thiên nhiên là điều cần thiết để làm chậm lại tiến trình của các căn bệnh mãn tính [3].
Các chất chống oxi hoá (Vitamin C, Vitamin E, Vitamin A, Polyphenol, glutathione, arginie, creatine,….) có chức năng sàng lọc các gốc tự do có hại trong cơ thể [2]. Vì lẽ đó, các nghiên cứu tách chiết cũng như thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của các hợp chất ngày càng đa dạng hơn. Góp phần không nhỏ vào việc phát hiện các hợp chất chống oxi hoá từ nhiều dược liệu khác nhau.
Màn màn tím (Cleome chelidonii) là dược liệu thân cỏ có rất nhiều công dụng như lá màn màn hoa tím có thể trị viêm gan, thận mãn tính [4], hạt của nó được sử dụng trong việc điều trị giun sán [5], dịch chiết từ rễ, thân, lá, hoa của màn màn tím có khả năng bảo vệ gan và chống lại sự viêm nhiễm [6]. Trong khi đó, việc nghiên cứu trên loài này ở nước ta rất hạn hẹp. Do đó đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các hợp chất trong thân và lá của màn màn hoa tím (Cleome chelidonii)” là thực sự cần thiết để có thể khẳng định giá trị dược liệu của màn màn hoá tím, góp phần cung cấp thêm nguồn
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 1 dược liệu chứa hợp chất chống oxi hoá từ thiên nhiên, cải thiện và bảo vệ sức khoẻ con người. Đồng thời định hướng đưa vào sử dụng trong lĩnh vực y học cổ truyền Việt Nam.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Đề tài “Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các hợp chất trong thân và lá của màn màn hoa tím (Cleome chelidonii)” mong muốn đạt được các mục tiêu sau:
- Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa và khả năng ức chế DPPH từ các cao phân đoạn của thân và lá màn màn hoa tím.
- Bước đầu định tính xác định được các thành phần kháng oxi hoá có trong cao chiết.
1.3 Nội dung nghiên cứu
- Định tính các hợp chất có hoạt tính sinh học như Flavonoid, Alkaloid, Polyphenol, Glycoside có trong cao chiết từ thân và lá của màn màn tím.
- Phân tích các thành phần kháng oxi hoá bằng sắc kí lớp mỏng. - Xây dựng đường chuẩn Vitamin C.
- Khảo sát khả năng loại gốc tự do DPPH của 6 cao phân đoạn của thân và lá màn màn tím bao gồm: TiL – MeOH, TiL – EtOAc, TiL – Hex, TiTh – MeOH, TiTh – EtOAc, TiTh – Hex.
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về màn màn hoa tím
2.1.1 Giới thiệu chung về họ màn màn (Cleomaceae) [5]
Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii) là một loài thuộc chi màn màn (Cleome). Cleome là chi lớn nhất trong họ màn màn (Cleomaceae). Bao gồm 180-200 loài thân thảo hằng năm hoặc cây trồng lâu năm và cây bụi, phân bố rộng rãi ở ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Sự phân bố chính của màn màn là ở vùng ôn đới, có khoảng 150 loài đã được ghi nhận ở đó. Ở Ấn Độ, chi này hiện diện khoảng 15 loài, 12 loài được báo cáo có ở Maharashtra, trong khi đó 7 loài được tìm thấy ở Kolhapur.
Hooker and Thomson đã đưa chi màn màn (Cleome) và các chi cùng họ khác vào họ Capparidaceae. Tuy nhiên, gần đây tất cả những họ này đều được phân chia lại và được đưa vào họ Cleomaceae.
Các loài thuộc chi màn màn như: C.viscosa, C.simplicifolia, C. gynandra, C. chelidonii, C. speciosa phát triển ở những vùng giống nhau nhưng khác nhau về đặc điểm của đất. Màn màn tím (C. chelidonii) phát triển ở những nơi ẩm ướt hoặc vùng núi đá. Trong khi C. simplicifolia vàC. viscose thì phát triển um tùm ở những nơi đất đen vào mùa mưa. C. simplisifolia có vòng đời ngắn chỉ 3-4 tháng, C. viscosa vàC. gynandra phát triển cả năm nhưng mạnh mẽ nhất là vào mùa mưa, C. gynandra phát triển chủ yếu ở vùng có chất thải cũng như nước thải sinh hoạt, C. speciosa là loại phát triển rộng trong bóng râm ở vùng đất đỏ, đặc biệt là mùa mưa.
Cleome được biết bởi rất nhiều tên như hoa nhện và loài cây ong núi. Những kiến thức bản địa của cộng đồng về loài này được xây dựng, đưa thành tài liệu và cuối cùng trở thành hệ thống kiến thức của tổ chức y học như Ayurveda, Siddha, Unani và những vùng khác ngoài Ấn Độ.
2.1.2 Màn màn hoa tím (Cleome chelidonii) Tên gọi khác: mần ri tím, mần ri tía.
Tên khoa học: Cleome chelidonii hoặc Polanisia chelidonii.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2 Phân loại (http://vi.wikipedia.org/Màn-màn-tím) Giới: Plantae Bộ: Brassicales Họ: Cleomaceae Chi: Cleome Loài: C. cleome Hình 2.1:Màn màn hoa tím https://www.flickr.com/photos/phuonglovejesus2782010/5113820594/in/set-72157625236768316 Mô tả
Màn màn tím là cây thân thảo, cao 20-40 cm. Thân có ít lông, 5 cạnh màn xanh nhợt hay đỏ. Cuống lá bằng hoặc gấp rưỡi phiến lá, mang 3 lá chét, lá giữa lớn, có lông thưa sát [7].
Hoa đơn độc ở nách lá, cuống dài hơn lá, 4 lá dài xanh, 4 cánh hoa tím thường vểnh ra, có 6 nhị , có bao phấn màu lam. Bầu có lông, vòi nhuỵ ngắn. Quả cái dài [7]. Màu sắc hoa: tím hoặc hồng [5].
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
Hình 2.2: Hình dáng hoa màn màn tím
https://www.flickr.com/photos/phuonglovejesus2782010/5113820668/in/set-72157625236768316
Phát triển mạnh ở những đất đen ẩm hoặc đất ở vùng núi đá. Chiều dài nang từ 5-8 cm. Hạt có màu xám nâu (Grey brown). Ra hoa và kết quả từ tháng 8 đến tháng 10 [5].
Nơi sống và thu hái
Cây thuộc vùng Ấn Độ - Malaysia, mọc hoang ở chỗ đất thấp, bãi trống, dọc đường đi. Thu hái cây quanh năm [7].
2.1.3 Công dụng
Cleome có truyền thống nổi tiếng về tính dược liệu của chúng, bột lá trị nhức đầu, nước ép từ lá của C. gynandra trị đau tai và các bệnh về da. Nó cũng được sử dụng như thực phẩm ở các nước Châu Phi và đa số cho phụ nữ mang thai. Lá khi được đun sôi lên được sử dụng cho việc làm sơn đen [5].
Các loài như C. viscosa, C. gynandra vàC. chelidonii có nhiều ứng dụng trong làm thuốc, thường dùng trong điều trị xung huyết da và gây kích ứng. Ngoài ra, chúng cũng được sử dụng trong việc điều trị thấp khớp và thậm chí là nhức đầu [5]..
Đồi với C. viscosa là loại thảo dược thơm được dùng cho các tuyến nội tiết của lông, móng, tóc (trichomes). Hơn nữa, hạt của chúng được cho là có khả năng làm thuốc trừ giun sán và đặc biệt hữu ích trong sốt, tiêu chảy và co giật ở trẻ em [5].
Ở nhiều nước Châu Phi một số loài được cho là có giá trị về thuốc. Một số loài như C. gynandra ăn được như rau trong điều kiện khắc nghiệt. Trong khi đó, một số chi màn màn lớn được xem xét và bị bỏ qua như một loài cỏ dại ở một số quốc gia. Các loài như C. speciosa, C. hassleriana, C. serrulata
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2 thường được trồng trong vườn hoặc trên hàng rào như một loài hoa để trang trí. Hạt của hầu hết chi màn màn có hình giày ngựa, chứa tới 17 đến 19 % tinh dầu. Tinh dầu của hạt chi màn màn có đặc tính chống côn trùng [5].
Hạt giống của màn màn tím (C. chelidonii) có thể được dùng làm gia vị (Flora, Ấn Độ vol 2). Hạt của chúng chứa rất nhiều acid béo không bão hoà như acid linoleic và phytosterol [5].
Màn màn tím thường được dùng trong điều trị đau bụng, kiết lỵ, đau đầu, viêm tai giữa và thấp khớp. Bên cạnh đó, màn màn tím cũng có nhiều đặc tính điều trị như thuốc trị giun, bệnh về da và có tính chất kháng viêm. C.chelidonii có chứa các glycoside như glucocapparin và glucocleomin [8].
Màn màn tím được dùng chữa các chứng cảm cúm nóng lạnh, nhức đầu, ho hen, và chữa rắn cắn. Lá dùng chữa viêm đau thận. Ở Ấn Độ, rễ dùng làm thuốc trị giun, nước sắc lấy dùng chữa viêm gan mạn tính và bệnh ngoài da [7]..
2.1.4 Thành phần hoá học
Các khảo sát định tính màn màn tím cho thấy sự hiện diện của các hợp chất có hoạt tính sinh học như Flavonoid, Phenolic, Tannin, Alkaloid, Glycoside trong các dịch chiết khác nhau của C. chelidonii[6].
2.1.5 Tình hình nghiên cứu về màn màn tím (C. chelidonii)
Sambasivarao Ethadi và các cộng sự đã nghiên cứu về hoạt tính chống viêm và bảo vệ gan từ các dịch chiết khác nhau của màn màn hoa tím bằng thử nghiệm in vitro trên chuột bạch. Nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá hoạt tính chống viêm nhiễm và bảo vệ gan từ dịch chiếtkhác nhau (nước-alcohol, MeOH, EA, Hexane) của màn màn tím chống lại sự viêm nhiễm do carrageenan - một loại polysaccharide gây ra và CCl4 gây ngộ độc ở gan chuột. Các dịch chiết từ gốc của C.chelidonii cho thấy khả năng kháng viêm và bảo vệ gan trên chuột thì phụ thuộc vào liều lượng. Trong tất cả các dịch chiết thì dịch chiết với MeOH cho hoạt tính chống viêm tối đa (phần trăm ức chế tối đa ở chứng phù thủng chân là 53,39% ± 1,2) và bảo vệ gan (81.02%) với liều lượng là 400 mg/kg. Các kết quả đã chỉ ra rằng các dịch chiết từ C.chelidonii có khả năng kháng viêm, bảo vệ gan phụ thuộc vào liều lượng,
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
(C.chelidonii). Nghiên cứu đã so sánh Polyphenol và Alkaloid tổng số, hoạt tính kháng oxi hoá trên in vitro của dịch chiết EtOH của gốc và phần trên (thân, lá, hoa)của C.chelidonii từ hai khu vực khác nhau ở Materu (song Godavari) và Lam (sông Krishna) của Ấn Độ. Sự phụ thuộc vào nồng độ của hoạt tính kháng oxi hoá đã được khảo sát cho tất cả các dịch chiết và có sự so sánh ở hai khu vực với việc sử dụng các phương pháp sàng lọc như: Superoxide, Hydroxyl, DPPH. Trong cả hai khu vực, thì dịch chiết của phần gốc cho kết quả kháng oxi hoá tốt hơn và hàm lượng Alkaloid nhiều hơn [8].
Bên cạnh đó, nghiên cứu về quang phổ hồng ngoại (IR) của C.chelidonii cũng được thực hiện bên cạnh bốn loài khác (C. viscosa L., C. chelidonii L.f., C. gynandra L., C. speciosa Raf và C. simplicifolia (Camb.) Hook f. & Thoms).Tất cả các nghiên cứu cho thấy các đỉnh hấp thụ theo đường truyền tín hiệu thì có bản chất tương tự nhau. Hầu hết các nhóm chức quan sát được ở cả năm nhóm hầu như tương tự nhau, nhưng có chút khác biệt về số bước sóng. Các thành phần như Protein, Lipid, Amino acid và Nucleic acidscủa cả năm loài hầu như tương tự nhau mà các nghiên cứu về IR hiện nay đã minh chứng [5].
T. Songsak và G.B. Lockwood đã nghiên cứu thành phần Glucosinoate của 6 loại dược liệu ở Thái Lan, trong đó có màn màn tím. Nghiên cứu cho biết màn màn tím có chứa glucocapparin và glucocleomin [4].
2.2 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH 2.2.1 Gốc tự do
2.2.1.1 Giới thiệu về gốc tự do
Các gốc tự do được định nghĩa là các phân tử có điện tử lẻ trong obitan. Chúng thường không ổn định và rất dễ xảy ra phản ứng [2].
Ví dụ: gốc tự do của Oxy là superoxide, hydroxyl, peroxyl (RO2•), alkoxyl (RO•), hydroperoxyl (HO2•). Hai gốc tự do của Nitơ là Nitric oxide và Nitrogen dioxide (NO2•) [2].
Gốc tự do của Oxi (ROS) và gốc tự do của Nitơ (RNS) có thể được chuyển đổi thành các gốc ổn định (non-radical). Ví dụ: Hydrogen peroxide, hydochlorua acid (HOCl), hydrobromua acid (HOBr), peroxynitrite (ONOO-) [2].
Các gốc tự do có phạm vi phản ứng rộng, sự chuyển và bổ sung electron đã hình thành nên liên kết cộng hoá trị giữa hai lớp electron. Gốc tự do có thể
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2 cho một electron để thực hiện sự khử (reducing), hoặc sẽ nhận thêm một electron để thực hiện sự oxi hoá (oxidizing) từ các nguyên tử khác [9].
2.2.1.2 Các loại gốc tự do thường gặp [10] Hydroperoxyl
Các gốc Hydroperoxyl hay còn gọi là perhydroxyl là một loại proton của superoxide với công thức hoá học HO2. Hydroperoxyl được hình thành thông qua sự chuyển giao của một proton đến một nguyên tử Oxy. Hydroperoxyl có thể hoạt động như một oxididant trong một số phản ứng sinh học quan trọng. Chẳng hạn như việc lấy nguyên tử hydro từ tocopherol và acid béo polyunstaturated (có khả năng sinh ra cholesterol) ở màng lipid. Như vậy nó có thể mở đầu cho sự peroxy hoá lipid.
Superoxide
Superoxide có thể hoạt động như một chất oxi hoá hoặc một chất khử. Nó có thể oxi hoá lưu huỳnh, acid ascorbic hoặc NADPH và có thể làm giảm Cytochrome C và các ion kim loại. Một phản ứng tách đã dẫn đến sự hình thành hydrogen peroxide và oxy, nó có thể xảy ra tự phát hoặc có sự xúc tác của enzyme superoxide dismutase. Dạng proton của nó (pKa 4,8) thì gốc superoxide và hydroperoxyl là các chất chống oxi hoá mạnh, nhưng sự tương thích sinh học của nó có lẽ nhỏ vì nồng độ của chúng quá thấp ở pH sinh lý.
Hydrogen peroxide
Khi giảm một hoá trị của superoxide thì sẽ tạo ra hydrogen peroxide mà không phải là gốc tự do vì tất cả các electron của nó đều được ghép đôi. Nó dễ dàng thấm qua màng tế bào, do đó nó không bị chia thành từng ngăn trong tế bào. Chính điều này đã gây ra sự phá vỡ DNA, dẫn đến sự phá vỡ sợi đơn và hình thành liên kết ngang protein – DNA. Nhiều enzyme (peroxidaza) sử dụng hydro peroxide như một chất trong phản ứng oxy hóa có liên quan đến sự tổng hợp các phân tử hữu cơ phức tạp. Đây là một tác nhân oxy hóa nhưng không có phản ứng đặc biệt và ý nghĩa chính của nó nằm ở chỗ nó là nguồn gốc của hydroxyl có trong các phản ứng chuyển tiếp kim loại.
Singlet oxygen
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Triplet oxygen
Các triplet oxygen có thể phản ứng với các nguyên tố và ion để tạo thành oxide, nhưng không phải là hợp chất, mà đang ở trạng thái đơn chất. Tuy nhiên, nó phản ứng dễ dàng với các gốc tự do được sản xuất từ hoạt động của các gốc hoạt động khác, từ bức xạ, tia cực tím, sức nóng hoặc tạo phức với oxy và sự chuyển tiếp kim loại để sản xuất các gốc peroxide hoạt động và tự động kích hoạt sự oxi hoá của các acid béo không no.
2.2.1.3 Vai trò của gốc tự do [2]
Các gốc tự do có vai trò quan trọng đối với nguồn gốc của sự sống và tiến hoá sinh học, liên quan đến các tác dụng có lợi trên sinh vật. Các gốc ROS góp phần vào các hoạt động quan trọng như truyền tín hiệu, phiên mã gen và sự điều tiết hoạt tính sGC (soluble Guanylate Cyclase – một enzyme quan trọng của con đường phát tín hiệu của NO) trong tế bào. Trong khi đó, NO lại là một trong những phân tử tín hiệu phổ biến, quan trọng và tham gia vào hầu hết các chức năng của tế bào và cơ quan chức năng trong cơ thể. Ở mức độ cơ thể việc sản xuất NO là rất cần thiết cho sự thư giãn và phát triển các cơ trơn mạch máu của tế bào, độ bám dính của bạch cầu, sự kết tập tiểu cầu, sự hình thành mạch, chứng huyết khối, trương lực mạch máu và sự lưu thông của máu.
Bên cạnh đó, NO được sản xuất từ các nerone có vai trò như chất dẫn truyền thần kinh và NO được tạo ra từ sự kích hoạt các thực bào và là một trung gian giúp giết chết mầm bệnh ở các đại thực bào và kích hoạt các thực bào khác đáp ứng hệ thống miễn dịch.
2.2.1.4 Tác hại của gốc tự do
Bên cạnh những lợi ích kể trên, gốc tự do cũng có một số tác hại đáng kể. Các gốc tự do sẽ oxi hoá các đại phân tử (protein, amino acid, lipid và DNA), dẫn đến việc làm tổn thương và chết tế bào.Tính gây độc tế bào của các gốc tự do là có hại đối với động vật có vú và là trung gian của những căn bệnh mãn tính [2].
Các gốc tự do của oxy (ROS) tiềm ẩn bệnh như gốc hydroxyl, anion superoxide, hydrogen peroxide, hypochloride, gốc nitrite oxide, peroxynitride. Đây là những gốc có hoạt tính cao, có thể có ở nhân, màng tế bào, gây hại đến các phân tử sinh học có liên quan như DNA, protein, cacbohydrate, và chất béo. Các gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử quan trọng (đặc biệt là acid nucleic, lipid và protein) dẫn đến tổn thương tế bào và phá vỡ cân bằng nội môi [1].
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2 Ung thư và xơ vữa động mạch, hai nguyên nhân chính gây tử vong nguyên nhân chủ yếu là do bệnh “gốc tự do” gây ra. Ung thư bắt đầu khởi phát và phát triển có liên quan đến các nhiễm sắc thể khuyết tật và kích hoạt các gen gây ung thư. Nó có thể là phản ứng của các gốc tự do nội sinh, như sự khởi đầu bởi bức xạ ion hoá, dẫn đến hình thành khối u [1].
Sự tương quan quan trọng giữa việc tiêu thụ các chất béo và dầu và tỷ lệ tử vong từ bệnh bạch cầu và sự tân sinh tế bào ác tính của vú, buồng trứng và trực tràng ở những người trên 55 tuổi có thể đã phản ánh sự peroxy hoá lipid nhiều hơn là những căn bệnh do phản ứng của gốc tự do liên quan đến chế độ ăn uống chất béo có nguồn gốc từ bên trong thành động mạch và huyết thanh để có peroxide và các chất khác – các hợp chất gây tổn thương tế bào nội mô và gây ra những biến đổi ở thành động mạch [1].
2.2.1.5 Sản xuất các gốc tự do trong cơ thể Có 3 nguồn gốc chính sinh ra gốc tự do [10]: Nguồn gốc bên trong Nguồn gốc bên ngoài Các yếu tố sinh lý Nguồn gốc bên trong
Sự hình thành gốc tự do xảy ra liên tục trong các tế bào như một hệ quả của cả hai loại phản ứng có bản chất enzyme và không có bản chất enzyme. Đối với phản ứng có bản chất enzyme, gốc tự do có thể được sinh ra từ các chuỗi dẫn truyền hô hấp, trong thực bào, trong tổng hợp prostaglandin, và trong hệ thống cytochrome P-450. Bên cạnh đó, gốc tự do cũng được hình thành từ phản ứng không có bản chất enzyme giữa oxy với các hợp chất hữu cơ cũng như các phản ứng bắt đầu bằng ion hoá phản ứng [1]. Bên cạnh đó, một số nguồn gốc bên trong tạo ra gốc tự do còn có ti thể, xanthine oxidase, đại thực bào, perosixome, sự viêm nhiễm, tập thể dục, thiếu máu cục bộ, các phản ứng liên quan đến sắt và sự vận chuyển các kim loại khác [10].
Nguồn gốc bên ngoài [10]
Bao gồm các phản ứng không có bản chất enzyme của oxy với các hợp
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
Các yếu tố sinh lý [10]
Các trạng thái tinh thần như căng thẳng, xúc động, …và các bệnh có điều kiện cũng góp phần sinh ra gốc tự do.
2.2.2 Chất chống oxi hoá
2.2.2.1 Vai trò chất chống oxi hoá
Chất chống oxy hóa là một chất ức chế quá trình oxy hóa, thậm chí ở nồng độ tương đối nhỏ và do đó có vai trò sinh lý khác nhau trong cơ thể. Thành phần chống oxy hoá trong các loài thực vật có vai trò sàng lọc gốc tự do và giúp chuyển đổi các gốc tự do đối với các loài ít phản ứng. Một loạt các chất chống oxy hóa sàng lọc gốc tự do được tìm thấy trong các nguồn thực phẩm như trái cây, rau và trà,….[10].
Các chất chống oxi hoá ngày càng được quan tâm nhiều hơn vì sự tham gia của chúng trong các quá trình sinh học và công nghiệp. Nhìn chung,chúng góp phần đẩy lùi ung thư, tim mạch, chống viêm và các hoạt tính khác [11].
Theo US Food and Drug Administration (FDA), chất chống oxy hóa được xác định là chất được sử dụng để bảo quản thực phẩm bằng cách làm chậm sự suy giảm, ôi thiu hoặc đổi màu do quá trình oxy hóa [10].
2.2.2.2 Nguyên tắc hoạt động [10]
Nhìn chung, các chất chống oxy hóa hoạt động theo các phương thức sau:
Phá vỡ chuỗi phản ứng (ví dụ: α-tocopherol sẽ hoạt động trong pha lipid để giữ lại gốc tự do).
Bằng cách làm giảm nồng độ của loại phản ứng có oxy (ví dụ: Glutathione).
Bằng cách làm sạch gốc tự do khởi tạo (ví dụ: Superoxide dimustase hoạt động trong pha lipid để giữ lại các gốc tự do superoxide).
Bằng cách tạo phức càng với kim loại chuyển tiếp: một nhóm các hợp chất hoạt động bằng cách cô lập các kim loại chuyển tiếp.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2
2.2.2.3 Các chất chống oxi hoá thường gặp Vitamin C (Acid ascorbic)[12]
Công thức Vitamin C
(R)-3,4-dihyroxy-5-((S)-1,2-dihydroxyethyl)furan-2(5H)-one
Hình 2.3: Công thức cấu tạo của Vitamin C
Vitamin C là một hợp chất tiềm năng, là một hợp chất chống oxi hoá hoà tan trong nước. Vitamin C hay acid ascorbic là một dẫn xuất với 6 carbon của đường hexose, nhưng nó không thể tổng hợp ở bộ linh trưởng. Nguồn thực phẩm chứa nhiều Vitamin C bao gồm các loại trái cây, đặc biệt là nho, họ cam chanh, các loại rau…. Do cấu trúc vòng đối xứng , nên Vitamin C có thể tồn tại ở bốn cấu trúc lập thể, nhưng chỉ có L-ascorbic acid là có hoạt tính sinh học. Nó đại diện cho hàng rào chống oxi hoá trong máu, có khả năng phản ứng với hầu hết các loại oxy và có thể làm ngưng các chuỗi phản ứng của gốc tự do. Vitamin C cũng có tác dụng quan trọng với các chất chống oxi hoá khác. Gluthatione đóng vai trò quan trọng trong việc tái sinh Vitamin C bị oxi hoá, và bản thân Vitamin C cũng có vai trò quan trọng trong việc tái tạo mối liên kết giữa lipid và Vitamin E.
Mối liên hệ giữa nguy cơ tử vong do bệnh tim mạch và hấp thụ Vitamin C đã được báo cáo vào năm 1950. Những người có nồng độ Vitamin C thấp ở huyết thanh và huyết tương là những người hút thuốc lá, người già, hoặc những người được nuôi dưỡng trong điều kiện kém hoặc bệnh mãn tính. Tổ chức Y Tế Thế giới (WHO) cũng đã đưa ra nhận định nồng độ Vitamin C thấp liên quan đến tỉ lệ tử vong do bệnh tim mạch hoặc đột quỵ đã được Basel nghiên cứu. Ngược lại, việc nồng độ Vitamin C cao sẽ giúp bảo vệ và làm giảm tỷ lệ tử vong do động mạch vành. Trout đã báo cáo rằng việc bổ sung Vitamin C góp phần làm giảm Cholesterol tổng số và làm tăng highdensity
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
Vitamin E (tocopherol) [12] Công thức Vitamin E α-tocopherol, R1=R2=R3=CH3 α-tocotrienol, R1=R2=R3=CH3 β-tocopherol, R1=R3=CH3, R2=H β-tocotrienol, R1=R3=CH3, R2=H γ-tocopherol, R1=R2=CH3, R3=H γ-tocotrienol, R1=R2=CH3, R3=H δ-tocopherol, R1=R2=R3=H δ-tocotrienol, R1=R2=R3=H Hình 2.4:Công thức cấu tạo của Vitamin E
Vitamin E là hợp chất hoà tan chủ yếu trong lipid, lần đầu được phát hiện vào năm 1936. Vitamin E có 8 hình thức trong tự nhiên, có thể chia thành hai dòng hợp chất là tocopherol và tocotrienol (gọi chung là tocol). Bốn tocopherol bao gồm một vòng 6-chromanol hoặc khởi đầu với một chuỗi bên phytyl. Ba trung tâm chiral tồn tại ở vị trí cuối 2,4,8. Vì vậy, một số dạng lập thể có thể tồn tại. Có 4 hình thức của tocopherol bao gồm alpha, beta, gamma, delta tuỳ thuộc vào sự thay thế của methyl trong vòng chromanol. Các tocotrienol khác với tocopherol bởi sự hiện diện của liên kết đôi trong chuỗi phytyl. Vì vậy nhờ ưu điểm của trung tâm chiral và sự hiện diện của các liên kết đôi tocotrienol có thể tồn tại đến 8 đồng phân khác nhau. Các tocotrienol cũng có các loại như alpha, beta, gamma, delta. Trong 8 hình thức của vitamin E, chỉ có alphatocopherol được chuyên chở trong máu và được xem là một hình thức hoạt động. Việc rối loạn nghiêm trọng chức năng tuyến tuỵ và mật hoặc sự kém hấp thu lipd có thể là do ảnh hưởng đến sự hấp thụ Vitamin E. Khi ở trong máu, Vitamin E gắn kết huyết tương mang protein, vận chuyển đến gan, đưa vào lipoprotein, đặc biệt là nơi nồng độ lipoprotein thấp (VLDL) và được bài tiết vào máu.
Các hợp chất có nhóm Polyphenol[13]
Polyphenol là nhóm hợp chất được tìm thấy trong tự nhiên từ trái cây, rau, ngũ cốc và các loại nước uống. Các loại trái cây như nho, táo, lê, anh đào và dâu, với 100 gram trọng lượng tươi chứa khoảng 200-300 mg Polyphenol. Các sản phẩm được chiết xuất từ các loại trái cây có chứa một lượng đáng kể
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2 Polyphenol. Thông thường một ly rượu vang đỏ hoặc một ly trà hoặc cà phê có chứa khoảng 100 mg Polyphenol. Bên cạnh đó, ngũ cốc, các loại đậu khô và sô cô la cũng chứa một lượng Polyphenol đáng kể.
Polyphenol là những hợp chất chuyển hoá thứ cấp và thường liên quan đến bảo vệ chống lại bức xạ tia cực tím hoặc sự tấn công của các mầm bệnh. Trong thực vật, Polyphenol góp phần tạo nên sự cay đắng, chát, màu sắc, hương vị, mùi và chất chống oxi hoá ổn định. Đến cuối thế kỉ 20, các nghiên cứu về dịch tễ học và phân tích tổng hợp đã cho rằng việc sử dụng lâu dài chế độ ăn có chứa Polyphenol sẽ cung cấp một số chất chống lại ung thư, bệnh tim mạch, tiểu đường, loãng xương và bệnh thoái hoá thần kinh.
Có hơn 8000 hợp chất Polyphenolic khác nhau đã được tìm thấy trong các loài thực vật khác nhau. Tất cả các hợp chất phenolic đều được sinh ra từ chất trung gian phổ biến phenylalanine, hoặc từ một tiền thân như acid shikimic. Chủ yếu xảy ra ở hình thức liên hợp với một hoặc nhiều bã đường liên kết với các nhóm hydroxyl, mặc dù mối liên hệ trực tiếp của đường (polysaccharide hoặc monosaccharide) đến một carbon thơm cũng tồn tại. Sự liên kết với các hợp chất khác, như cacboxylic và axit hữu cơ, các amin, lipid và liên kết với phenol khác cũng phổ biến. Polyphenol có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau theo chức năng của vòng phenol. Các nhóm chính của Polyphenol bao gồm acid Phenolic , Flavonoid, Stilbene và Lignan.
Acid Phenolic
Acid phenolic được tìm thấy nhiều trong các loại thực phẩm và được chia thành hai nhóm: dẫn xuất của acid benzoic và các dẫn xuất của acid cinnamic. Hàm lượng acid phenolic trong các loại quả ăn được tương đối thấp, ngoại trừ các loại trái cây màu đỏ, củ cải đen và hành tây, có nồng độ acid phenolic từ vài chục miligram mỗi kilogram trọng lượng tươi. Các acid hydroxycinnamic phổ biến hơn acid hydroxybenzoic và chủ yếu là p-coumaric, caffeic, ferulic và axit sinapic.
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
Hình 2.5: Cấu trúc chung của Acid Phenolic Flavonoid
Flavonoid bao gồm các nhóm được nghiên cứu nhiều nhất của các Polyphenol. Nhóm này có cấu trúc cơ bản phổ biến bao gồm hai vòng thơm liên kết với nhau bởi ba nguyên tử carbon hình thành một heterocycle oxy hóa. Hơn 4.000 loại Flavonoid đã được xác định, trong đó nó góp phần tạo màu sắc hấp dẫn của hoa, trái cây và lá. Dựa vào những thay đổi liên quan đến heterocycle, Flavonoid được chia thành các nhóm như: flavonol, flavon, flavanone, flavanol, anthocyanins và isoflavones. Sự khác biệt trong mỗi nhóm xuất phát từ sự thay đổi về số lượng và sự sắp xếp của các nhóm hydroxyl và mức độ alkyl hoá/glycosyl hoá của chúng. Quercetin, myricetin, catechins… là những Flavonoid phổ biến nhất.
Hình 2.6: Cấu trúc chung của Flavonoid Stilbene
Stilbene chứa hai gốc phenyl nối với nhau bằng một cầu nối Methylen với hai carbon. Sự hiện diện của Stilbene trong chế độ ăn của con người là khá thấp. Hầu hết các Stilbene hoạt động trong thực vật như phytoalexin kháng nấm, các hợp chất được tổng hợp chỉ để chống lại sự nhiễm trùng hoặc chấn thương. Một trong những nghiên cứu tốt nhất để tổng hợp Polyphenol Stilbene là từ resveratrol (3,4 ', 5-trihydroxystilbene), được tìm thấy chủ yếu trong nho, sản phẩm từ nho như rượu vang đỏ cũng chứa một lượng đáng kể resveratrol.
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 2
Hình 2.7: Cấu trúc chung của các Stilbene Lignan
Lignanlà những hợp chất diphenolic có chứa một cấu trúc 2,3-dibenzylbutane được hình thành bởi các dimerization của hai acid cinnamic. Một số lignan, như secoisolariciresinol, được coi là phytoestrogen. Các nguồn dinh dưỡng giàu Lignan nhất là hạt lanh, trong đó có chứa nhiều secoisolariciresinol (lên đến 3,7 g/kg trọng lượng khô) và một lượng thấp matairesinol.
Hình 2.8: Cấu trúc chung của các Lignan
2.2.3 Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa [8] 2.2.3.1 Phương pháp sử dụng gốc tự do Superoxide
Anion superoxide đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành nên hydrogen peroxide, gốc hydroxyl, và oxy singlet, những chất gây thiệt hại đến lipid, protein và DNA. Do đó, việc nghiên cứu các hoạt tính loại bỏ gốc tự do Superoxide của các dịch chiết hoặc hợp chất từ thực vật là một trong những cách quan trọng để làm rõ cơ chế hoạt động của chất chống oxi hoá.
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
sinh học ngắn. Việc tạo ra các hydroxyl đã khởi đầu cho sự peroxy hoá lipid và/hoặc lan truyền thành chuỗi phản ứng thông qua việc phân huỷ của lipd hydroperoxy. Một gốc hydroxyl singlet có thể dẫn đến sự hình thành của nhiều phân tử lipid.
Một gốc hydroxyl singlet có thể dẫn đến sự hình thành của nhiều phân tử lipid hydroperoxide trong màng tế bào, chính điều này có thể làm phá vỡ nghiêm trọng chức năng của màng tế bào dẫn đến sự chết của tế bào.
2.2.3.3 Phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH
DPPH (1-1-diphenyl -2 -picryl hydrazine) là một gốc tự do ổn định và có thể nhận một electron hoặc gốc hydro để trở thành một phân tử có tính chất nghịch từ ổn định. Chất chống oxi hoá tương tác với DPPH để chuyển cả electron và nguyên tử hydro đến DPPH, vì vậy nó vô hiệu hoá tính chất của gốc tự do, dựa vào mức độ thay đổi màu sắc ta xác định được khả năng loại bỏ gốc tự do của thuốc.Vì sự dễ dàng và tiện lợi của sự tương tác này nên hiện nay nó được sử dụng rộng rãi trong việc sàng lọc hoạt tính của gốc tự do.
Để đánh giá khả năng kháng oxi hoá của một hợp chất cụ thể hoặc cao chiết, ta cho hợp chất/cao chiết đó phản ứng với gốc tự do ổn định DPPH trong MeOH. Khảo sát sự làm giảm độ hấp thụ của DPPH bởi các hợp chất/cao chiết sẽ đánh giá được khả năng loại bỏ gốc tự do của chúng. Gốc tự do DPPH hấp thụ cực đại ở bước sóng 517 nm. Nhưng khi tương tác với các chất có tính oxi hoá, độ hấp thụ sẽ giảm hoặc biến mất [14].
Độ hấp thụ của DPPH trong dung dịch đệm của MeOH cao nhất, tiếp đó là trong MeOH, dung dịch đệm của EtOH. Vì vậy khi pha DPPH trong dung dịch đệm của MeOH sẽ nhạy hơn EtOH khi đo quang phổ hấp thụ. Giá trị độ hấp thụ của DPPH đo được khoảng từ 0.221 – 0.698 (Ayres, 1949). Điều này tương ứng với nồng độ từ 25 – 70 µM. Nếu lấy nồng độ nằm trong khoảng này sẽ hợp với các yêu cầu về độ chính xác khi đo quang phổ hấp thụ [15].
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 4 CHƯƠNG 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện
Đề tài luận văn: “ Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá của các hợp chất có trong thân và lá của màn màn hoa tím (Cleome chelidonii)’’được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ. Đề tài được thực hiện từ tháng 08/2014 đến tháng 11/2014.
3.2 Thiết bị, dụng cụ - Bếp điện
- Cân phân tích
- Máy đo quang phổ UV-VIS Helios α, Thermo (Mỹ) - Tủ sấy
- Pipet các loại - Bình định mức
- Cốc thủy tinh các loại - Bình tam giác có nút mài - Ống nghiệm các loại 3.3 Hoá chất
DPPH, Methanol, CCl4, AcOH, anhydric acetic, acid H2SO4 đặc, H2SO4 loãng, HCl đặc,Pyridin, thuốc thử Dragendorff, thuốc thử Tollens, bột Mg, , Ethanol, Chlorofom, FeCl3, Ethyl Acetate.
3.4 Định tính các thành phần có trong cao chiết [16] Định tính Flavonoid
Sử dụng phản ứng Cyanidin của Wilstatter (hay phản ứng Shinoda) Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng khử bằng bột Mg trong HCl/ethanol trên các dẫn xuất flavonoid.
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Phản ứng
Quecertin Clorur cyanidin
(màu đỏ) Hình 3.1: Phương trình phản ứng Cyanidin Định tính alkaloid
Sử dụng thuốc thử Dragendorff
Cách thực hiện: Cho dung dịch acid H2SO4 loãng vào ống nghiệm chứa
cao chiết hoà tan trong MeOH, nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendorff vào ống nghiệm. Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện kết tủa cam-nâu.
Định tính các hợp chất có Polyphenol (Phenolic)
Sử dụng thuốc thử 5% FeCl3/ Ethanol
Cách thực hiện: Cho vào hai ống nghiệm mỗi ống dung dịch cao chiết trong MeOH, ống 1 dùng để so sánh. Ống 2 nhỏ từ dung dịch 5% FeCl3/Ethanol (có màu vàng cam) vào. Nếu có Polyphenol dung dịch sẽ chuyển sang xanh đậm, tím hoặc đen.
Định tính Glycoside
Sử dụng thuốc thử Tollens : Phản ứng đường khử
Cách thực hiện: Cho vào ống nghiệm có chứa khoảng 1-2 mg cắn, thêm 5 giọt pyridine, 4 giọt thuốc thử Tollens mới pha. Nếu có Glycoside dưới đáy ống nghiệm sẽ có hiện tượng tráng bạc hoặc có tủa đen Ag kim loại.
3.5 Phân tích các thành phần kháng oxi hoá bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) [17]
Các thành phần có khả năng chống oxi hoá trong cao chiết sẽ được phân tích bằng kỹ thuật SKLM với dung dịch DPPH là thuốc thử hiện hình.
Cách thực hiện: Khoảng 100 µg mỗi cao chiết được chấm lên SKLM (Merch), sau đó được giải ly với hệ dung môi thích hợp. Tiến hành đo UV (240-300nm). Vị trí các vết tách nhau trên bản mỏng cho các giá trị Rf khác nhau. Phun dung dịch 0,05% DPPH/MeOH (màu tím) lên bản mỏng, ủ bản mỏng 10 phút trong bóng tối, nhiệt độ phòng. Các chất có khả năng oxi hoá sẽ
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 4 xuất hiện trên bản mỏng với vết màu vàng trắng, chứng tỏ rằng các hợp chất này đã tương tác với gốc tự do DPPH.
3.6 Khảo sát hoạt tính kháng oxi hoá bằng phương pháp DPPH 3.6.1 Phần trăm ức chế và giá trị IC50
Cách tính toán phần trăm ức chế (IC) của mẫu khảo sát đối với DPPH
IC = ( )100 T C S T OD OD OD OD Trong đó:
IC: Phần trăm ức chế của mẫu đối với DPPH. ODC: Mật độ quang của cao chiết.
ODT: Mật độ quang của DPPH.
ODS: Mật độ quang của hỗn hợp DPPH và cao chiết.
Giá trị IC50 là nồng độ ức chế làm giảm nồng độ DPPH một nửa. Xác định dựa vào phương trình tuyến tính của phần trăm ức chế (IC) theo nồng độ mẫu được pha.
3.6.2 Xây dựng đường chuẩn vitamin C (acid ascorbic) Chuẩn bị mẫu
Pha DPPH: Cân 2 mg DPPH định mức với 5 mL MeOH ta sẽ được DPPH nồng độ 1000 µM, cố định nồng độ DPPH là 50 µM (nồng độ phù hợp với các yêu cầu về độ chính xác khi đo quang phổ hấp thụ).
Pha Vitamin C: Cân khoảng 1,8 mg Vitamin C định mức với 10 mL MeOH. Ta được dung dịch Vitamin C nồng độ 1000 µM.
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
Tiến hành
Bảng 3.1: Xây dựng đường chuẩn Vitamin C
STT DPPH (mL) Vitamin C MeOH (mL) Nồng độ (µM) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0,1 0 0 0 1,9 2 0,1 5 0,9 0,01 1,89 3 0,1 10 1,8 0,02 1,88 4 0,1 15 2,7 0,03 1,87 5 0,1 20 3,6 0,04 1,86 6 0,1 25 4,5 0,05 1,85
Tiến hành pha dãy chuẩn Vitamin C từ nồng độ 0-25 µM từ dung dịch Vitamin C nồng độ 1000 µM. Nồng độ DPPH cố định là 50 µM, vì vậy thể tích DPPH cần lấy ở mỗi eppendorf cố định là 0,1 mL.Tiến hành đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy đo quang phổ UV-Vis Heliox α.
3.6.3 Khảo sát khả năng loại gốc tự do DPPH của cao chiết Chuẩn bị mẫu khảo sát và tính toán nồng độ
Dung dịch DPPH (tính toán tương tự như với vitamin C): Cân chính xác 2 mg DPPH và định mức thành 5 mL với MeOH, cố định nồng độ dung dịch DPPH là 50 µM.
Pha cao
Cân chính xác 0,01 g từng cao phân đoạn của thân và lá màn màn tím, sau đó định mức với 10 mL MeOH được nồng độ cao ban đầu là 1000 µg/mL.
Tiến hành thí nghiệm
Do cao chiết hấp thụ khá mạnh ở bước sóng 517 nm, điều này có thể làm ảnh hưởng đến kết quả đo độ hấp thụ sau khi hỗn hợp cao và DPPH đã phản ứng với nhau. Có khả năng xảy ra hiện tượng chồng chéo độ hấp thụ. Vì vậy, cần phải tiến hành đo độ hấp thụ của cao.
Hỗn hợp cao, DPPH, MeOH được ủ trong bóng tối 30 phút, ở nhiệt độ phòng. Tất cả các quá trình đều phải thực hiện trong bóng tối.
Sau khi tiến hành đo nhiều lần để dò tìm khoảng nồng độ mà ở đó cao chiết sẽ ức chế 50% DPPH (giá trị IC50), sau đó dựng đường chuẩn của phần
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 4 trăm ức chế theo nồng độ cao chiết. Dựa vào phương trình tuyến tính xác định được giá trị IC50.
3.6.3.1 Đo độ hấp thụ của cao
Bảng 3.2: Đo độ hấp thụ của cao TiL – MeOH
STT TiL – MeOH MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0 0 2 2 20 0,04 1,96 3 40 0,08 1,92 4 60 0,12 1,88 5 80 0,16 1,84 6 100 0,2 1,8
Bảng 3.3: Đo độ hấp thụ của cao TiL – EtOAc
STT TiL – EtOAc MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0 0 2 2 60 0,12 1,88 3 70 0,14 1,86 4 80 0,16 1,84 5 90 0,18 1,82 6 100 0,2 1,8
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Bảng 3.4: Đo độ hấp thụ của cao TiL – Hex
STT TiL – Hex MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0 0 2 2 100 0,2 1,9 3 200 0,4 1,6 4 300 0,6 1,4 5 400 0,8 1,2 6 500 1 1
Bảng 3.5: Đo độ hấp thụcủa cao TiTh – MeOH
STT TiTh – MeOH MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0 0 2 2 20 0,04 1,96 3 40 0,08 1,92 4 60 0,12 1,88 5 80 0,16 1,84 6 100 0,2 1,8
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 4 Bảng 3.6: Đo độ hấp thụ của cao TiTh – EtOAc
STT TiTh – EtOAc MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0 0 2 2 25 0,05 1,95 3 50 0,1 1,9 4 75 0,15 1,85 5 100 0,2 1,8 6 125 0,25 1,75
Bảng 3.7: Đo độ hấp thụ của TiTh – Hex
STT TiTh – Hex MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0 0 2 2 100 0,2 1,8 3 200 0,4 1,6 4 300 0,6 1,4 5 400 0,8 1,2 6 500 1 1
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
3.6.3.2 Đo độ hấp thụ của hỗn hợp (cao và DPPH)
Thí nghiệm kiểm tra độ hấp thụ của hỗn hợp (cao và DPPH) được trình bày trong các bảng sau:
Bảng 3.8: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL – MeOH và DPPH)
STT DPPH
(mL)
TiL – MeOH MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0,1 0 0 1,9 2 0,1 20 0,04 1,86 3 0,1 40 0,08 1,82 4 0,1 60 0,12 1,78 5 0,1 80 0,16 1,74 6 0,1 100 0,2 1,7
Bảng 3.9: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL – EtOAc và DPPH)
STT DPPH
(mL)
TiL – EtOAc MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích mL) 1 0,1 0 0 1,9 2 0,1 60 0,12 1,78 3 0,1 70 0,14 1,76 4 0,1 80 0,16 1,74 5 0,1 90 0,18 1,72 6 0,1 100 0,2 1,7
DI
ỄN
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Luận văn tốt nghiệp Chương 4 Bảng 3.10: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiL – Hex và DPPH)
STT DPPH
(mL)
TiL – Hex MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0,1 0 0 1,9 2 0,1 100 0,2 1,7 3 0,1 200 0,4 1,5 4 0,1 300 0,6 1,3 5 0,1 400 0,8 1,1 6 0,1 500 1 0,9
Bảng 3.11: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiTh – MeOH và DPPH)
STT DPPH
(mL)
TiTh – MeOH MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0,1 0 0 1,9 2 0,1 20 0,04 1,86 3 0,1 40 0,08 1,82 4 0,1 60 0,12 1,78 5 0,1 80 0,16 1,74 6 0,1 100 0,2 1,7
ĐÀN TOÁN - LÍ - HÓA 1000B TR
ẦN H
ƯNG
ĐẠ
O TP.QUY
NH
ƠN
Bảng 3.12: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiTh – EtOAc và DPPH)
STT DPPH
(mL)
TiTh – EtOAc MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0,1 0 0 1,9 2 0,1 25 0,05 1,85 3 0,1 50 0,1 1,8 4 0,1 75 0,15 1,75 5 0,1 100 0,2 1,7 6 0,1 125 0,25 1,65
Bảng 3.13: Đo độ hấp thụ hỗn hợp (TiTh – Hex và DPPH)
STT DPPH
(mL)
TiTh – Hex MeOH
(mL) Nồng độ (µg/mL) Thể tích (mL) 1 0,1 0 0 1,9 2 0,1 100 0,2 1,7 3 0,1 200 0,4 1,5 4 0,1 300 0,6 1,4 5 0,1 400 0,8 1,1 6 0,1 500 1 0,9
