CÉLULAS SANGUÍNEAS EM ADULTOS JOVENS
CONSUMIDORES DE TABACO
Betina Röhsler Bersch1, Eduardo Périco2, Adriane Pozzobon3
Resumo: Foram avaliados os efeitos/danos genotóxicos sobre o DNA de adultos jovens consumidores de tabaco. Participaram do estudo 40 indivíduos, divididos em dois grupos: grupo teste, com 20 fumantes, e grupo controle, com 20 não fumantes, que responderam um questionário estruturado e foram submetidos à punção venosa para coleta de amostra de sangue. O ensaio cometa foi utilizado para avaliar o potencial genotóxico do tabaco, detectando a ocorrência de lesões primárias no DNA. Na avaliação do índice de dano no DNA observou-se diferença significativa entre o grupo de fumantes (41,11 ± 21,45) e o grupo de não fumantes (24,65 ± 6,96) (p=0,000). Com relação ao número de cometas encontrados, não se observou diferença entre os grupos para as classes 0 (sem dano), I (dano pequeno) e IV (dano máximo), entretanto, no grupo de fumantes, houve maior percentual das classes II (dano intermediário) e III (dano elevado) quando comparado ao grupo de não fumantes (p< 0,0001; p= 0,0023). Com a presente pesquisa verificou-se que o consumo de tabaco pode provocar efeito genotóxico sobre o DNA de células sanguíneas. Palavras-chave: Tabaco. Genotoxicidade. Ensaio cometa. Sangue periférico.
DNA DAMAGE OF BLOOD CELLS IN YOUNG ADULT
TOBACCO USERS
Abstract: This study evaluated the effects and genotoxic damage on the DNA of young adult tobacco users. It included 40 people, who were divided into two groups: the test group with 20 smokers and the control group with 20 non-smokers, who answered a structured questionnaire and underwent venipuncture to have some blood sample collected. Comet assay was used to evaluate the genotoxic potential of tobacco, detecting primary DNA damage. DNA damage index revealed a significant difference between the smokers (41.11 ± 21.45) and the non-smokers (24.65 ± 6.96) (p = 0.000). In regard to the total of comets found, no difference was detected between groups for classes 0 (no damage), I (little damage) and IV (maximum damage), however, among the smokers, there was a higher percentage of Class II (intermediate) and III (high damage) damage when compared to the group of non-smokers (p <0.0001, p = 0.0023). This research showed that the consumption of tobacco may cause genotoxic effect on the DNA of blood cells.
Keywords: Tobacco. Genotoxicity. Comet assay. Peripheral blood.
1 Graduação em Ciências Biológicas, Centro Universitário UNIVATES. 2 Doutorado em Ecologia, USP. Professor da Univates.
1 INTRODUÇÃO
O consumo de tabaco antigamente era visto como um estilo de vida, mas atualmente já é reconhecido como uma dependência química que expõe seus usuários a várias substâncias tóxicas (MS; INCA; COORDENAÇÃO DE PREVENÇÃO E VIGILÂNCIA, 2004).
Atualmente o tabagismo é considerado a principal causa de morte evitável em todo o mundo(WHO, 2008) e é um problema de saúde pública, por conta da alta prevalência e mortalidade, decorrentes das doenças relacionadas ao tabaco (AMB; ANSS, 2009). Anualmente as mortes devido ao uso do tabaco atingem 4,9 milhões de pessoas no mundo (WHO, 2009) e, no Brasil, estima-se que cerca de 200 mil mortes/ano sejam decorrentes do tabagismo (INCA; SVS; MS, 2003), sendo o Brasil é um dos principais produtores e exportadores de tabaco no mundo (MS; INCA; COORDENAÇÃO DE PREVENÇÃO E VIGILÂNCIA, 2004). Além disso, no Brasil, um terço da população adulta é fumante, a maioria na faixa etária dos 20 aos 40 anos (TAMASHIRO; COHEN; PALMER, 2009; CUNHA; JORGE; FONTELES, 2007).
Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE (2009), a região Sul do Brasil tem o maior percentual de fumantes de tabaco (19,0%) e, em relação às unidades federativas, o Rio Grande do Sul tem um dos maiores percentuais de fumantes de tabaco na população, cerca de 20,7%. Os prejuízos causados à saúde pelo hábito de fumar e o controle do tabagismo são considerados grandes desafios para a saúde pública, pois o tabaco é a droga mais utilizada e distribuída no mundo (OLIVEIRA; VALENTE; LEITE, 2008).Além disso, as consequências do uso do tabaco estão entre as principais causas de mortes ocorridas em nível mundial, como doenças inflamatórias, doenças infecciosas do trato respiratório (TAMASHIRO; COHEN; PALMER, 2009) e doenças crônicas, incluindo doenças cardíacas, doenças cerebrovasculares, câncer e doenças pulmonares (DOMÍNGUEZ et al., 2004). Há evidências de que o tabaco faça parte da causa de quase 50 diferentes doenças (OLIVEIRA; VALENTE; LEITE, 2008).
As doenças cardiovasculares representam uma das maiores causas de morte no Rio Grande do Sul (MOREIRA et al., 1995; ISHITANI et al., 2007). Um dos motivos da ocorrência dessas doenças está relacionado com o tabagismo, pois as substâncias presentes na fumaça do cigarro, como o monóxido de carbono, a nicotina, o benzopireno e os radicais livres, foram identificadas e relacionadas como causadoras de danos cardiovasculares (STUCHI; CARVALHO, 2003), resultando no aumento da frequência cardíaca, da contração do coração, da vasoconstrição coronária, da pressão arterial e em taquicardia (CUNHA; JORGE; FONTELES, 2007; NUNES, 2006).
Além das doenças cardiovasculares, o consumo de tabaco é, de longe, o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC) e de diversas outras doenças pulmonares, como bronquite crônica
(inflamação), enfisema e asma em adultos e crianças (CUNHA; JORGE; FONTELES, 2007; CARVALHO, 2007).
Segundo Cunha, Jorge e Fonteles (2007), a composição química do tabaco pode variar conforme o seu processamento, desde o tipo de folhas de tabaco utilizado, o modo e a região onde foi cultivado, as características de preparação em relação à compactação, filtro e papel, até mesmo às variações de temperatura resultantes da combustão incompleta do tabaco. Na queima de um cigarro há produção de 4.720 substâncias químicas, em 15 funções químicas, das quais 60 apresentam atividade cancerígena (AMB; ANSS, 2009).
Estudos permitem evidenciar, por exemplo, que a exposição aos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (como o benzopireno, as nitrosaminas e as aminas), que são substâncias carcinogênicas existentes no fumo, atuam sobre o DNA, levando à formação de adultos, mutações e, finalmente, câncer (NUNES, 2006; DUARTE; PASCHOAL, 2005).
Os agentes genotóxicos interagem quimicamente com o material genético, provocando alterações oxidativas, quebras na molécula de DNA, entre outras. Essas alterações podem provocar lesão, que, na maioria dos casos, é reparada pelo próprio organismo, ou a célula é eliminada. Contudo, caso essa lesão seja fixa, pode ser transmitida para as células filhas, provocando alteração na progênie (SOUZA; FONTANETTI, 2007; KLUG et al., 2010; NUSSBAUM; MCLNNES; WILLARD, 2008). As mutações resultantes de fatores externos são consideradas mutações induzidas. Podem resultar de agentes naturais do nosso ambiente ou artificiais, feitas pelo homem, como, por exemplo, substâncias químicas encontradas na fumaça do tabaco (KLUG et al., 2010; SNUSTAD; SIMMONS, 2001).
Com o passar dos tempos, novas metodologias para avaliação de danos no DNA têm sido desenvolvidas. Desde 1988, quando Singh et al. (1988) publicaram a descrição para o ensaio cometa, essa técnica vem sendo uma das mais utilizadas para detecção desses danos, devido à sua capacidade de detectar lesões pré-mutagênicas (SOUZA; FONTANETTI, 2007; SILVA et al., 2000). Inicialmente, a técnica foi desenvolvida para visualizar danos de DNA induzidos por radiação em células de mamíferos, mas atualmente o ensaio cometa é amplamente utilizado como uma ferramenta em muitas áreas de pesquisa, como por exemplo, no biomonitoramento ambiental e na genética toxicológica, entre outras (SOUZA; FONTANETTI, 2007; BRIANEZI; CAMARGO; MIOT, 2009; ROCHA et al., 2009).
O ensaio cometa, ou técnica da eletroforese celular em microgel, é de baixo custo, seguro, novo, rápido e é uma técnica simples e muito útil (RIBEIRO-VIEIRA et al., 2007; BRIANEZI; CAMARGO; MIOT, 2009). Essa técnica parte do princípio básico da lise de membranas celulares para posterior migração do DNA na matriz de agarose induzida pela eletroforese. Quando visualizado no microscópio, o DNA nuclear migrado adquire forma aparente de um cometa, com cabeça (região nuclear) e
cauda, que contém fragmentos ou fitas de DNA (BRIANEZI; CAMARGO; MIOT, 2009; RIBEIRO; MARQUES; SALVADORI, 2006). Caso a célula apresente núcleo redondo, é identificada como sem dano (SILVA, 2007).Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo investigar a presença de dano no DNA no sangue periférico de jovens fumantes comparando com não fumantes, utilizando o ensaio, cometa e avaliar o índice de dano a partir das classes do cometa nas amostras.
2 MÉTODOS
O presente estudo foi de caráter experimental, quali-quantitativo. Foram avaliados 40 voluntários, sendo divididos em dois grupos: 20 no grupo dos fumantes e 20 no grupo dos não fumantes. A presente pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Centro Universitário UNIVATES sob número de protocolo 037/2011.
Foram incluídos na pesquisa indivíduos fumantes e não fumantes com idade entre 18 e 28 anos, devendo os fumantes estar fazendo uso diário de cigarro industrializado há, no mínimo, um ano. Foram excluídos do estudo indivíduos que realizaram bronzeamento artificial há pelo menos seis meses e que estavam sob uso de medicamentos oxidantes, antibióticos e corticoides até três meses antes da pesquisa.
Os participantes foram submetidos a um questionário semiestruturado quanto ao uso de tabaco, convivência com fumantes, consumo de álcool, ingestão de medicamentos e histórico de doença cardiovascular ou de doenças pulmonares obstrutivas crônicas (DPOC). Acoleta de 2 mL de sangue venoso dos voluntários foi realizada nos meses de setembro e outubro de 2011.
Para verificação do dano no DNA foram utilizados os leucócitos do sangue periférico, por serem de fácil obtenção, de grande número, além de as células já se encontrarem em suspensão no sangue, não necessitando da ação de enzimas ou de processo mecânico para seu isolamento (BRIANEZI; CAMARGO; MIOT, 2009).
O ensaio cometa foi realizado de acordo com o método proposto por Silva (2007), sendo as lâminas preparadas com agarose 1,5% para pré cobertura. Após, misturou-se 5µl de sangue com 75µl de agarose low melting 0,75% e se condicionou em cima da pré-cobertura de agarose na lâmina. Os procedimentos seguintes foram dispor as lâminas em solução de lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM e TRIS 10 mM), para quebra das membranas celulares e, após, corrida em eletroforese com tampão específico (300 mM NaOH e 1 mM EDTA, pH>13), neutralização com tampão TRIS (pH=7,5), secagem overnigth, solução fixadora e secagem em estufa a 37oC. Finalmente, realizou-se a hidratação das lâminas com posterior coloração com solução de prata a 37oC e secagem em temperatura ambiente para posterior observação dos cometas.
Para cada indivíduo foram confeccionadas lâminas em triplicata. As lâminas foram analisadas em microscópio óptico binocular da marca Olimpus® modelo
CX31 no aumento de 40x. Foram analisadas, para cada indivíduo, 100 células em triplicata. Quando há dano no DNA, ocorre fragmentação do mesmo apresentam um espalhamento do material genético em forma de cauda, sendo classificadas de I a IV, representando respectivamente menor e maior índice de dano. As cinco categorias usadas para classificação dos cometas são as propostas por García et al. (2004), sendo que a classe 0 indica que não há dano, a classe I indica dano pequeno, a classe II representa dano intermediário, a classe III dano elevado, e finalmente a classe IV indica dano máximo (FIGURA 1). O índice de dano no DNA foi calculado com o somatório dos produtos da multiplicação entre o número de cometas de cada classe e o dígito denominador da classe (0, 1, 2, 3 e 4). IDtotal= (0 x n° classe 0) + (1 x n° classe I) + (2 x n° classe II)+ (3 x n° classe III) + (4 x n° classe IV). O índice de dano foi correlacionado pela correlação de Spearman com o tempo de uso de tabaco.
Figura 1: Classes dos cometas
Classe 0 Classe I Classe II Classe III Classe IV
Obs.: Microscopia óptica com aumento de 100x
Os dados analisados foram apresentados como média ± erro padrão da média (EP). Realizou-se o teste t de student para a comparação das classes de cometa entre os grupos. Considerou-se o nível de significância como P < 0,05. A análise estatística dos dados foi feita no software Bioestat 5.0®.
3 RESULTADOS
Os dados mostram que a média de idade do grupo controle foi de 23,1 ± 0,48 anos, enquanto no grupo teste foi de 24,7 ± 0,48 anos. Com relação à participação por sexo, as mulheres prevaleceram tanto no grupo controle (65%) quanto no grupo teste (70%), sendo a média de idade das mulheres no grupo controle de 22,5 ± 0,55 e de 25 ± 0,6 no grupo teste. A média de idade dos homens foi de 24,3 ± 0,77 no grupo controle e de 23,8 ± 0,79 no grupo teste.
Com relação ao histórico de DPOC ou doença cardiovascular, em ambos os grupos a maioria dos participantes relatou não possuir doença, sendo 75% no grupo controle e 90% no grupo teste. O uso de medicação também foi restrito, visto que apenas 10% (dois) do grupo controle e 15% (três) do grupo teste relataram o uso contínuo de medicação, como antidepressivos.
O consumo de álcool também foi dominante no grupo teste, ou seja, 100% dos participantes relataram ingerir álcool, enquanto, no grupo controle, 15% (três) relataram não ingerir álcool. A Tabela 1 mostra os dados quanto ao consumo de álcool em ambos os grupos.
Tabela 1 – Frequência do consumo de álcool dos grupos controle (não fumantes) e teste (fumantes) Controle Teste 1x por semana 64,7% 50% 2x por semana 35,3% 15% 3x por semana - 30% Mais de 3x - 5%
A Figura 2 ilustra o tempo de consumo de tabaco do grupo teste. Com relação ao consumo de cigarros por dia, 50% consomem entre um e cinco cigarros por dia, 10% consomem entre seis e 10 e 40% consomem mais de 10 cigarros por dia. Não houve correlação entre o tempo de utilização do tabaco e o dano geral (rs = 0,0019, p = 0,9936). Figura 2: Distribuição do tempo de consumo de tabaco entre os indivíduos do grupo fumantes
Com relação ao número de cometas encontrados nos dois grupos, observa-se que não houve diferença entre os grupos para as classes 0, I e IV, entretanto, na classe II e III, houve maior percentual dessas células no grupo de fumantes quando comparado ao grupo de não fumantes (p< 0,0001 e p= 0,0023, respectivamente) (FIGURA 3). O índice de dano no DNA das células do sangue periférico foi significativamente maior no grupo de fumantes se comparado ao grupo de não fumantes (p=0,000) (FIGURA 4).
Figura 3: Análise da média de dano de DNA obtida pela técnica de cometa Clas se 0 Clas se I Clas se II Clas se III Clas se IV 0 20 40 60 80 Fumantes Não Fumantes cometa
Núme
ro
de
cé
lu
la
s
Obs.: Valores correspondentes ao número de células por classe.
Legenda: a* p= 0,0001 em relação a fumantes e não fumantes (teste t em relação às demais classes); b*p= 0,0023 em relação a fumantes e não fumantes (teste t em relação às demais classes).
Figura 4: Índice de dano no DNA das células sanguíneas em fumantes e não fumantes
Fuma ntes Não Fumantes 0 20 40 60 80
ín
di
ce
de
dano
Legenda: *p=0,000 (teste t em relação ao grupo de fumantes).
4 DISCUSSÃO
A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que mais de cinco milhões de mortes ao ano no mundo são decorrentes do tabagismo e espera-se que esse número seja de aproximadamente oito milhões no ano 2030, tornando o tabagismo a principal causa de morte prematura, sendo que 80% delas ocorrerão em países em desenvolvimento (WHO, 2008).
No Brasil há milhões de fumantes, que consomem cerca de 110 bilhões de cigarros por ano. A maioria dos fumantes está na faixa etária dos 20 aos 40 anos, compreendendo aproximadamente 11 milhões de mulheres e 16 milhões de homens (INCA; SVS; MS, 2003). Segundo os inquéritos nacionais da Pesquisa Nacional de Saúde e Nutrição e da Pesquisa de Saúde Mundial, realizados no Brasil, a prevalência global de tabagismo em adultos acima de 18 anos passou de 34,8% em 1989 para 22,4% em 2003 (MONTEIRO, 2007). Barros et al. (2011) demonstraram que a prevalência geral do fumo diário no Brasil foi de 15,1%, variando de 17,4% na região Sul a 12,8% na região Norte.
Segundo dados do IBGE (2009), o Rio Grande do Sul tem um dos maiores percentuais de fumantes de tabaco na população com mais de 15 anos, cerca de 20% em relação a todo o Brasil. O maior percentual de fumantes está entre os homens da região Sul, na área rural, entre os menos escolarizados e os de menor rendimento domiciliar per capita.
A prevalência de 100% de consumidores de álcool no grupo teste e de 85% no grupo controle poderia ser esperada, visto que o consumo de álcool vem aumentando em todo o mundo (WHO, 2004). NoBrasil, um estudo feito pelo Instituto Nacional do Câncer (2003) mostra que a região Sul tem um dos maiores percentuais de consumo de álcool, sendo Porto Alegre a 2ª capital do Brasil em que mais pessoas consomem álcool.
O ensaio cometa é uma das técnicas mais utilizadas e empregadas para detecção de danos no DNA, devido à sua capacidade de detectar lesões pré-mutagênicas em células individuais, sua aplicabilidade a qualquer organismo eucarionte e tipo de célula e por ser uma técnica de leitura rápida e com resultados seguros (SOUZA; FONTANETTI, 2007; SILVA et al., 2000; BRIANEZI; CAMARGO; MIOT, 2009). Sua empregabilidade em diversos organismos abre um leque muito grande de possibilidades de estudo, sendo uma base para pesquisas na área de produtos industriais, genética toxicológica, radiação biológica, processos de reparo de DNA e biomonitoramento ambiental (SOUZA; FONTANETTI, 2007; BRIANEZI; CAMARGO; MIOT, 2009; ROCHA et al., 2009) , bem como para detectar poluições e contaminações (SILVA et al., 2000; ROCHA et al., 2009; RAMSDORF, 2007; BÜCKER; CARVALHO; ALVES-GOMES, 2006).
Um estudo realizado no Rio Grande do Sul utilizando o teste cometa em fumicultores demonstrou que a exposição desses aos pesticidas e às folhas de fumo provavelmente está correlacionada com o aumento no nível de danos no DNA de células sanguíneas (JUFFO et al., 2009).Porém não se encontrou registro de estudos anteriores a este aqui elucidado com fumantes no Rio Grande do Sul e que utilizaram o teste cometa como análise de danos de DNA nesses indivíduos.
No presente estudo, a análise das classes dos cometas indicou que o consumo de tabaco pode ter efeito genotóxico em fumantes, visto que houve diferença significativa na ocorrência de dano no DNA das classes II e III. Esse efeito genotóxico também foi demonstrado em outras pesquisas como na Colômbia, onde um estudo similar avaliou a genotoxicidade em jovens por exposição ao tabaco. Nesse estudo, os autores avaliaram a frequência de aberrações cromossômicas em linfócitos do sangue periférico de jovens tabagistas e não tabagistas, com idade entre 19 e 29 anos e verificaram que a frequência de aberrações cromossômicas foi significativamente maior nos jovens tabagistas (6,02 ± 0,52), do que em não tabagistas (3,04 ± 0,50) indicandoassociação entre tabagismo e genotoxicidade (ARBOLEDA-MORENO, 2004). Na Grécia, um estudo avaliou homens com idade entre 20-25 anos e 55-60 anos e também mostrou que o tabagismo está associado com o aumento de aproximadamente 40% no nível de dano no DNA, tanto para a faixa etária jovem como de terceira idade (PIPERAKIS, 1998). Dhawan, Mathur e Seth (2001) também relataram que o tabagismo teve um claro efeito de dano no DNA de leucócitos em fumantes indianos.
Na presente pesquisa não encontramos diferença significativa na classe I entre fumantes e não fumantes. Esse fato pode ter ocorrido devido ao pequeno número de participantes analisados. Além disso, a presença de dano classe I em ambos os grupos pode ser atribuída a fatores relacionados à exposição solar, que podem induzir ao dano no DNA. Moller et al. (2000), em seus estudos com indivíduos saudáveis, demonstraram que a exposição à luz solar é um fator indicativo de dano no DNA.Outros estudos também verificaram que danos no DNA podem surgir mais em indivíduos durante os meses de verão do que em outras épocas do ano (BETTI, 1995; FRENZILLI, 1997).
Outras técnicas genéticas e moleculares podem contribuir para identificação e caracterização do tipo de lesão provocada no DNA perante a exposição ao tabaco. A presente pesquisa procurou avaliar o efeito nocivo do tabaco e suas inúmeras toxinas no DNA de células sanguíneas de fumantes. Estudos realizados não só com tabaco, mas também com outros fatores potencialmente tóxicos, como pesticidas, podem contribuir para a verificação do índice de dano no DNA de indivíduos expostos a essas toxinas. Estudos posteriores que avaliem um número maior de indivíduos abrangendo diferentes faixas etárias também podem ser úteis para uma avaliação mais precisa de qual classe poderá prevalecer.
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