LARA GONÇALVES PESSANHA

OTIMIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO NA FERMENTAÇÃO DE CALDO DE CANA-DE-AÇÚCAR POR Bacillus thuringiensis var. israelensis

LARA GONÇALVES PESSANHA

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE

DARCY RIBEIRO – UENF

CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ Março – 2008

ii

OTIMIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO NA FERMENTAÇÃO DE CALDO DE CANA-DE-AÇÚCAR POR Bacillus thuringiensis var. israelensis

LARA GONÇALVES PESSANHA

Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

CAMPOS DOS GOYTACAZES, RJ Março – 2008

iii

OTIMIZAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO NA FERMENTAÇÃO DE CALDO DE CANA-DE-AÇÚCAR POR Bacillus thuringiensis var. israelensis

LARA GONÇALVES PESSANHA

Tese apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense – Darcy Ribeiro, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Biociências e Biotecnologia.

Aprovada em 28 de Março de 2008. Comissão examinadora:

_________________________________________________________________ Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata – EEL/ USP

_________________________________________________________________ Drª. Marílvia Dansa A. Petretski – LQFPP/ UENF

_________________________________________________________________ Dr. Enrique Medina-Acosta – LBT/ UENF

_________________________________________________________________ Dr. Vanildo Silveira – LBT/ UENF (Revisor)

_________________________________________________________________ Drª. Marília Amorim Berbert de Molina – UENF

iv

"Para chegar ao fim das coisas, é preciso primeiro julgá-las possíveis”.

Luís XIV

Aos meus queridos pais Antônio Carlos e Leide

v

Agradecimentos

A Deus pelas oportunidades de crescimento e aprendizado vivenciadas a cada dia, por todo o amparo e sustentação em todos os momentos de minha vida.

Aos meus pais Antônio Carlos e Leide e ao meu irmão Lincoln por todo amor e carinho, e principalmente por estarem sempre ao meu lado. Vocês são muito importantes em minha vida. Amo muito vocês!

À Professora Marília Amorim Berbert de Molina pela orientação, pela competência e profissionalismo e, acima de tudo, por todo carinho, confiança e amizade construídos ao longo destes anos. Agradeço a Deus por ter colocado em meu caminho um ser humano tão raro e especial como você. Muito obrigada por tudo professora!

Às tias do coração Nini, Dinda e Amada, por serem uma torcida poderosa e um grande alicerce em minha vida.

Ao meu namorado Pablo, por todo amor, incentivo, paciência e interesse para ouvir todos os meus comentários e explicações sobre os resultados de cada ensaio. Você tem me tornado uma pessoa melhor a cada dia. Te amo!

À minha querida Priscila (in memorian). Já não há mais a saudade de antes e sim a certeza cada vez mais forte de que estamos ainda mais unidas. Obrigada por ser o meu anjo da guarda!

Aos amigos do Grupo Bti, Fabrízio, Raphael, Juliani e Irene, por todo apoio durante a realização deste trabalho. Por cada inóculo preparado, cada amostra retirada, por cada análise feita, pelas palavras de carinho e incentivo. Jamais teria conseguido sem vocês.

Aos amigos do Culto Pedro, pelas preces e por toda vibração positiva que certamente me sustentaram e me deram forças para continuar prosseguindo.

À Flavinha, pelo carinho e amizade ao longo destes anos de UENF.

Aos professores Arnaldo Márcio Ramalho Prata, Enrique Medina-Acosta e Marílvia Dansa A. Petretski, por aceitarem fazer parte da banca avaliadora deste trabalho. Em especial, ao professor Arnaldo Márcio Ramalho Prata e à sua aluna Cláudia, por toda a ajuda com o planejamento experimental e as análises estatísticas.

À FAPERJ e à CAPES pelo financiamento deste trabalho e pela bolsa de estudos.

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Cinética de formação de células nos meios com S0= 30 g/L até o momento da formação de grumos.

29

Figura 2 – Cinética de formação de células nos meios com S0= 10 g/L até o momento da formação de grumos.

29

Figura 3 – Cinética de formação de células nos meios com S0= 20 g/L até o momento da formação de grumos.

30

Figura 4 – Variação do pH do cultivo durante a fermentação dos diferentes meios de cultivo.

31

Figura 5 – Número total de células (CT) obtido na fermentação dos diferentes meios de cultivo.

31

Figura 6 – Número total de esporos (ET) obtido na fermentação dos diferentes meios de cultivo.

32

Figura 7 – Taxa de esporulação (TSP) obtida na fermentação dos diferentes meios de cultivo.

32

Figura 8 – Gráfico de Pareto representando a estimativa dos efeitos ao nível de 90% de confiança sobre a variável resposta células totais.

36

Figura 9 – Representação geométrica do planejamento 23 sem a adição dos pontos centrais para a resposta células totais.

37

Figura 10 – Gráfico de Pareto representando a estimativa dos efeitos ao nível de 90% de confiança sobre a variável resposta esporos.

40

Figura 11 – Representação geométrica do planejamento 23 sem a adição dos pontos centrais para a variável resposta esporos totais.

41

Figura 12 – Gráfico de Pareto representando a estimativa dos efeitos ao nível de 90% de confiança sobre a variável resposta taxa de esporulação.

44

Figura 13 – Superfície de resposta linear que relaciona a taxa de esporulação com a concentração de extrato de levedura e de sulfato de amônio em níveis codificados.

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 14 – Superfície de resposta linear que relaciona a taxa de esporulação com a concentração de extrato de levedura e a concentração inicial de substrato em níveis codificados.

48

Figura 15 – Número total de células (CT) obtido na fermentação dos diferentes meios de cultivo.

51

Figura 16 – Número total de esporos (ET) obtido na fermentação dos diferentes meios de cultivo.

52

Figura 17 – Taxa de esporulação (TSP) obtida na fermentação dos diferentes meios de cultivo.

52

Figura 18 – Cinética de formação de células nos meios com diferentes fontes de carbono até o momento da formação de grumos (tgr).

53

Figura 19 – Variação do pH do cultivo durante a fermentação de meios de cultivo formulados com diferentes fontes de carbono.

53

Figura 20 – Cinética de formação de células nos diferentes meios avaliados em biorreator.

58

Figura 21 – Consumo de açúcar durante a fermentação dos diferentes meios de cultivo avaliados em biorreator.

61

Figura 22 – Variação do pH do cultivo durante a fermentação dos diferentes meios avaliados em biorreator.

62

Figura 23 – Número total de células (CT) obtido na fermentação dos diferentes meios de cultivo em frascos agitados e em biorreator de bancada.

63

Figura 24 – Número total de esporos (ET) obtido na fermentação dos diferentes meios de cultivo em frascos agitados e em biorreator de bancada.

63

Figura 25 – Taxa de esporulação (TSP) obtida na fermentação dos diferentes meios de cultivo em frascos agitados e em biorreator de bancada.

64

Figura 26 – Concentração de proteínas totais do complexo esporo-cristal nos diferentes meios de cultivo avaliados em frascos agitados e em biorreator de bancada.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 27 – Perfil protéico obtido na análise do complexo esporo-cristal nos diferentes meios de cultivo avaliados em frascos agitados e em biorreator de bancada.

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Composição do meio de cultivo Agar nutriente. 13

Tabela 2 – Composição do meio de cultivo GYS. 14

Tabela 3 – Composição dos meios de cultivo nos ensaios em frascos agitados.

14

Tabela 4 – Composição dos meios de cultivo do segundo grupo de ensaios em frascos agitados e dos ensaios em biorreator de bancada.

15

Tabela 5 – Valores das variáveis independentes empregadas no planejamento fatorial completo 23.

17

Tabela 6 – Matriz do planejamento fatorial completo 23 com quatro repetições do ponto central.

18

Tabela 7 – Matriz do planejamento fatorial com as formulações dos meios de cultivo a serem estudados.

18

Tabela 8 – Resultados gerais obtidos nas diferentes formulações de meio avaliadas no primeiro grupo de ensaios em frascos agitados.

26

Tabela 9 – Critérios para validação de diferentes modelos (Moldavsky e Cohen, 1996).

34

Tabela 10 – Análise da variância dos efeitos principais e das interações dos fatores sobre a variável resposta células totais.

35

Tabela 11 – Análise da variância da regressão para o modelo representativo do número de células totais.

38

Tabela 12 – Análise da variância dos efeitos principais e de interações dos fatores sobre a variável resposta esporos totais.

39

Tabela 13 – Análise da variância da regressão para o modelo representativo do número de esporos totais.

42

Tabela 14 – Análise de variância dos efeitos principais e de interações dos fatores sobre a variável taxa de esporulação.

43

Tabela 15 – Análise da variância dos efeitos principais e de interações dos fatores sobre a variável taxa de esporulação, desprezando a curvatura.

x

LISTA DE TABELAS

Tabela 16 – Análise de variância da regressão para o modelo representativo da taxa de esporulação.

44

Tabela 17 – Análise variância para os coeficientes de regressão do modelo representativo da taxa de esporulação.

45

Tabela 18 – Análise de variância da regressão para o modelo representativo da taxa de esporulação, excluindo os fatores não-significativos.

46

Tabela 19 – Resultados gerais obtidos nas diferentes formulações de meio avaliadas nos ensaios em frascos agitados.

51

Tabela 20 – Resultados gerais obtidos nas diferentes formulações de meio avaliadas nos ensaios em biorreator.

xi

LISTA DE ABREVIAÇÔES

Bti Bacillus thuringiensis var. israelensis P.A Puro para análise

CC Meio formulado com sacarose oriunda do caldo de cana SYS Meio formulado sacarose P.A

GYS Meio formulado com glicose FYS Meio formulado com frutose

YS Meio formulado com extrato de levedura e sais

EL Extrato de levedura

SA Sulfato de amônio

S0 Concentração inicial de substrato ART Açúcares redutores totais

µX,m Máxima velocidade específica de crescimento Xtgr Concentração celular obtida em tgr

Xm Concentração celular máxima

tgr Tempo de início da formação de grumos

tf Tempo final de fermentação

tX,m Tempo para atingir a concentração celular máxima ufc/mL Unidades formadoras de colônias por mililitro

CV Células vegetativas

CE Células esporuladas

EPL Esporos livres

CT Células totais

ET Esporos totais

Tsp Taxa de esporulação

∆S Diferença entre a concentração inicial e final de substrato MSR Metodologia de superfície de resposta

xii

Sumário

1.1 - Toxinas produzidas por Bt e seu modo de ação 2

1.2 - Importância biotecnológica 4

1.3 - Processo fermentativo para produção de bioinseticidas com Bt 5

2- OBJETIVOS 11 3 - MATERIAIS E MÉTODOS 12 3.1 - Microrganismo 12 3.2 - Matéria-prima 12 3.2.1 - Obtenção 12 3.2.2 - Tratamento 12 3.3 - Meios de cultivo 13 3.4 - Condições de cultivo 15

3.4.1 - Preparo das culturas estoque 15

3.4.2 - Preparo do inóculo 16 3.4.3 - Ensaios de Fermentação 16 3.5 - Métodos Analíticos 19 3.5.1 - Coleta de amostras 19 3.5.2 - pH 19 3.5.3 - Morfologia celular 19

3.5.4 - Obtenção do número de células e de esporos 20

3.5.5 - Concentração celular 20

3.5.6 - Concentração de açúcares redutores totais 21 3.5.7 - Análise de proteínas do complexo esporo-cristal 23 3.5.8 - Cálculo das máximas velocidades específicas de crescimento 23

4 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 25

4.1 - Avaliação do cultivo em meios formulados com caldo de cana de

açúcar 25

4.1.1 - Avaliação da influência dos fatores sobre a variável resposta

xiii

4.1.2 - Avaliação da influência dos fatores sobre a variável resposta

esporos totais 39

4.1.3 - Avaliação da influência dos fatores sobre a variável resposta

taxa de esporulação 42

4.2 - Avaliação do processo fermentativo em meios com diferentes

fontes de carbono 50

4.2.1 - Ensaios em frascos agitados 50

4.2.2 - Ensaios em biorreator de bancada 57

5- CONCLUSÕES 68

6- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69

xiv

Resumo

A bactéria Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) sintetiza, durante a esporulação, um cristal paraesporal composto por proteínas chamadas δ -endotoxinas, que são extrema e especificamente tóxicas contra larvas de mosquitos de importância para a saúde pública por serem vetores de doenças como dengue, malária e oncocercose, sendo esta particularidade explorada para a produção de bioinseticidas no controle destes insetos. A otimização do processo fermentativo para o crescimento, esporulação e produção das toxinas é de extrema importância para a produção de bioinseticidas com esta bactéria. Neste sentido, este trabalho teve como objetivo otimizar a composição do meio de cultivo a base de caldo de cana-de-açúcar na fermentação da bactéria. Os ensaios foram realizados em duas etapas. Na primeira etapa, os ensaios foram feitos em frascos agitados e na segunda etapa, foram realizados em biorreator de bancada. O primeiro grupo de ensaios em frascos agitados teve como objetivo avaliar o efeito da composição de meios formulados com caldo de cana-de-açúcar, extrato de levedura (EL) e sulfato de amônio (SA), em diferentes concentrações, sobre a produção de células e de esporos da bactéria. Verificou-se que extrato de levedura foi o nutriente que exerceu maior efeito significativo sobre produção de células e de esporos de Bti. O efeito da concentração inicial de sacarose somente foi significativo quando se considerou a interação desta variável com as demais, e apenas sobre a produção de células. Foi possível ainda ajustar um modelo linear aos dados experimentais que permitiu determinar as condições que levam a uma maximização da taxa de esporulação. O segundo grupo de ensaios em frascos agitados e os ensaios em biorreator tiveram como objetivo avaliar a influência de diferentes fontes de carbono sobre a produção de biomassa e a esporulação da bactéria. Foram testados em ambos os ensaios meios com formulação idêntica, variando-se apenas a fonte de carbono (glicose, frutose e sacarose P.A e sacarose oriunda do caldo de cana), além de uma quinta formulação isenta de carboidrato. As maiores concentrações celulares e de esporos foram obtidas nos meios com glicose e frutose, independentemente da escala operacional. Nos ensaios em frascos, valores de células totais (CT) e de esporos totais (ET) semelhantes foram obtidos em meios com sacarose P.A e sacarose oriunda do caldo de cana, mas em biorreator, as melhores condições de transferência de oxigênio, favoreceram o crescimento e a esporulação no meio com caldo de cana. A escala de fermentação influenciou os resultados obtidos no meio com frutose, tendo sido obtidos, em frascos, valores de CT e ET expressivamente maiores que em biorreator. Em meio não suplementado com carboidrato, os nutrientes fornecidos pelo extrato de levedura foram suficientes para garantir uma produção de células e de esporos comparável à verificada em meio com sacarose P.A. Mesmo com diferenças nos valores de CT e ET, as taxas de esporulação (TSP) foram similares em todos os meios (> 90%). Independentemente da condição de processo, elevadas concentrações residuais de sacarose foram observadas nos meios com caldo de cana ou com sacarose P.A, indicando baixa capacidade da bactéria para metabolizar este dissacarídeo. Porém, todos os carboidratos testados levaram à produção de δ-endotoxinas, o que também foi constatado no meio não suplementado com açúcar. A utilização de glicose ou frutose levou às maiores concentrações de proteínas totais.

Palavras-chave: Fermentação, meios de cultivo, caldo de cana-de-açúcar, biomassa, esporulação.

xv

Abstract

Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) produces, during sporulation process, a parasporal crystal which is composed of several proteins called δ-endotoxins that are extreme and specifically toxic against mosquito larvae, vectors of human diseases, such as dengue fever, malaria and onchocerciasis. Due to its insecticidal activity, Bti has been explored for the control of these insects by bioinsecticides production. The optimization of growth, sporulation and toxins production is very important to the development of fermentation process with this bacterium. The aim of this work was to optimize the culture media composition, having sugar cane juice as a base ingredient, for the fermentation with Bti. The assays were performed in two different stages. In the first stage, assays were carried out in shaked flasks. In the second stage, assays were carried out in a mini-scale bioreactor. The first group of shaked flasks assays had the aim to evaluate the effect of media composition based on sugar cane juice, yeast extract (YE) and ammonium sulfate (AS), with different concentrations of each nutrient, on the cells and spores production of Bti. The results showed that YE was the nutrient that presented the highest significant effect on cells and spores production. In addition to these results, it was verified that the interaction among the initial sucrose concentration (S0) and YE and AS concentrations had a significant effect only on cells production. The results obtained with this group of assays also led the fitting of a first order linear model to experimental data, which alowed to determine the appropriate assay conditions , in order to improve the sporulation rates. The second group of shaked flasks assays and the mini-scale bioreactor assays were performed in order to evaluate the influence of different carbon sources on cells and spores production. In all assays were tested culture media with the same composition. The only difference on these media composition was the carbon source used (glucose, fructose). A media formulation without a carbohydrate was also tested and all the results were compared to the ones obtained with media in which sucrose was used as carbon source. The comparison of fermentation process in media supplemented with different carbohydrates showed that the highest cells and spores concentrations were obtained in media with glucose and fructose, for both operational conditions tested (shaked flasks and mini-scale bioreactor assays). On flasks assays, similar total cells (TC) and total spores (TS) values were verified in sucrose media. However, on bioreactor assays, the better oxygen transfer conditions favored the growth and the sporulation in media with sugar cane juice. The fermentation scale affected the results achieved with fructose media. Is this case, high values of TC and TS were verified on flaks assays, while it was observed a markable reduction on cell and spore production on bioreactor assays. In media with no carbohydrate in its composition, the nutrients supplied by yeast extract showed to be suitable to allow a cell and spore production which was similar to those ones obtained with sucrose media. Although it was observed differences on values of TC and TS, similar values of sporulation rates (Tsp) were verified for all media tested (> 90%). High residual sucrose concentrations were observed in media with sugar cane juice or comercial sucrose, revealing the low bacteria capacity to uptake this carbohydrate. On the other hand, a δ-endotoxine production was verified for all carbohydrates tested, and also for media with no carbohydrate in its composition. High total protein concentrations were achieved in media with glucose and fructose.

1

–

I

Bacillus thuringiensis (Bt) constitui o agente microbiano mais importante e mais amplamente utilizado no controle de vetores de doenças e pestes agrícolas em todo o mundo (Lacey et al., 2001; Federici, 2005). Trata-se de uma bactéria Gram-positiva, anaeróbica facultativa, em forma de bastonete, que, como a maioria dos representantes de seu gênero, é capaz de formar endósporos altamente resistentes ao calor, à dessecação intensa e a solventes orgânicos (Stahly et al., 1991; Pelczar et al., 1996). A formação de inclusões citoplasmáticas adjacentes ao esporo, durante o ciclo de esporulação, confere a este microrganismo uma característica entomopatogênica e o diferencia da maioria das espécies de Bacillus (Andrews et al., 1982; Ruud et al., 2003). Todas as linhagens de Bt atuam sobre as formas larvárias, sendo inócuas para os insetos adultos (Alves, 1998). Ao contrário dos inseticidas químicos, os larvicidas produzidos com Bt são extremamente específicos quanto à espécie-alvo, apresentando baixa ou nenhuma toxicidade para insetos benéficos e animais vertebrados, incluindo pássaros e mamíferos (Mahmood, 1998; Polanczyk et al., 2003; Petry et al., 2004). Além disso, constituem uma alternativa viável ao problema do desenvolvimento de resistência, por parte dos insetos, aos inseticidas sintéticos (Federici et al., 2003).

A descoberta da variedade Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti), em 1977, teve grande repercussão na comunidade científica, uma vez que representou a perspectiva, até então desconhecida, de utilização de Bt em programas de controle biológico de insetos vetores de doenças (Schnepf et al., 1998; Poopathi e Tyagi, 2004; Lord, 2005). Bti distingue-se, entre as demais variedades isoladas, como a que apresenta os melhores resultados no combate às larvas de dípteros como Aedes aegypti, vetor da dengue, Anopheles sp, transmissor da malária e espécies de simulídeos responsáveis pela transmissão do agente causador da oncocercose (Su e Mulla, 1999; Poopathi et al., 2002; Balaraman, 2005).

A dengue representa um dos principais problemas de saúde pública no mundo, principalmente em países tropicais, devido às condições climáticas favoráveis à proliferação do mosquito vetor Aedes aegypti. Cerca de 2,5 bilhões de pessoas encontram-se sob risco de infecção nestas áreas (Tauil, 2002; Federici et al., 2003). A Organização Mundial da Saúde (OMS) estima que entre 50 e 100 milhões de pessoas se infectem anualmente em todos os continentes, à exceção da Europa (Schatzmayr, 2000). No Brasil, segundo dados da Secretaria de Vigilância em Saúde (SVS) do Ministério da Saúde, foram registrados 510.112 casos da

doença em 2007, com inúmeros casos de Febre Hemorrágica da Dengue (FHD) e óbitos. Os Estados de Mato Grosso do Sul, Paraná e Rio de Janeiro notificaram um aumento expressivo no número de casos no mesmo ano. Verifica-se que esse aumento na incidência da doença vem ocorrendo no País nos últimos anos. Em 2006, foram registrados 345.922 casos, sendo confirmados 628 casos de febre hemorrágica e a ocorrência de 67 óbitos (SVS/MS, 2007).

1.1 Toxinas produzidas por Bt e seu modo de ação

A atividade inseticida de Bacillus thuringiensis está associada a toxinas protéicas localizadas em corpos de inclusão paraesporais (cristais) produzidos concomitantemente ao processo de esporulação, podendo representar até 30% da massa seca da célula (Höfte e Whiteley, 1989; Aronson, 1993; Milner, 1994). As proteínas que constituem o cristal são coletivamente denominadas de δ-endotoxinas, ou proteínas Cry e apresentam massas moleculares que variam entre 60 e 160 kDa. Possuem duas regiões distintas: uma porção amino-terminal, normalmente variável e associada à toxicidade, e uma porção carboxi-terminal, mais conservada entre as proteínas, associada geralmente à formação do cristal (Cooper, 1994; Schnepf et al., 1998). Cada variedade de Bt produz um tipo de toxina que é ativo contra um limitado grupo de insetos e esta especificidade deve-se, principalmente, à sua estrutura química formada por diferentes polipeptídeos (Höfte e Whiteley,1989). A especificidade das proteínas é o resultado da eficiência de várias etapas envolvidas na produção das toxinas ativas e suas subseqüentes interações com as células do epitélio do trato digestivo dos insetos alvos (Koziel et al., 1993).

Na forma como são sintetizadas, as proteínas Cry se apresentam como pró-toxinas, sem ação entomopatogênica, as quais necessitam ser ativadas para o desencadeamento de seus efeitos tóxicos (Glazer e Nikaido, 1995). Para esta ativação, é necessário que o cristal protéico seja ingerido pela larva do inseto, uma vez que as condições alcalinas do intestino e a presença de proteases permitirão sua solubilização e a conseqüente liberação da toxina na sua forma ativa (Li et al., 1991; Cooper, 1994). O modo de ação das proteínas Cry se dá pela sua interação com as células do epitélio intestinal, por meio do reconhecimento por receptores específicos presentes nas microvilosidades do intestino médio do inseto, levando à formação de poros. Há uma desestabilização dos gradientes osmótico e iônico que culmina com a morte do inseto por inanição ou septicemia, em poucas horas após a ingestão do cristal (Gill et al., 1992; Glare e O’Callagham, 2000).

As seqüências gênicas que codificam as toxinas Cry são chamadas de genes cry, os quais estão localizados em plasmídeos (Crickmore et al., 1998). A primeira classificação dos genes cry feita por Höfte e Whiteley em 1989 baseava-se na seqüência de aminoácidos de seus produtos e na especificidade de ação das toxinas. Por esse método, foram descritos cinco grupos de genes cry diferentes, organizados em algarismos romanos de I a V.

Assim, de acordo com o espectro de atividade inseticida e homologia das seqüências de aminoácidos, as proteínas Cry foram agrupadas em cinco grandes classes. A primeira classe, denominada CryI, representa as proteínas ativas contra os insetos da ordem Lepidoptera. Proteínas CryII são ativas contra Lepidoptera e Diptera, CryIII são tóxicas para Coleoptera e CryIV para Diptera. Proteínas CryV, descobertas mais tarde, apresentam atividade contra Lepidoptera e Coleoptera (Ruud et al., 2003).

Com o avanço dos estudos sobre a biologia molecular de Bt, novos genes cry foram seqüenciados e catalogados, originando diversas exceções dentro da classificação proposta por Höfte e Whiteley (1989). Por essa razão, Crickmore et al. (1998) propuseram uma nova classificação, baseada somente na seqüência de aminoácidos codificada pelos genes, não levando em consideração o perfil de toxicidade. Atualmente são descritos mais de 190 genes cry diferentes, enumerados por algarismos arábicos (Crickmore, 2007).

As proteínas Cry de Bti são codificadas por genes localizados em um grande plasmídeo, denominado pBtoxis, cuja seqüência completa de nucleotídeos foi determinada por Berry et al. (2002), apresentando um número total de pares de bases de 172.923. Bti sintetiza três proteínas Cry, de massas moleculares de 125 (Cry 4Aa), 134 (Cry 4Ba) e 67 kDa (Cry 11Aa) (Crickmore et al., 1998; Federici, 2005).

Além das δ-endotoxinas, diversas linhagens de Bt sintetizam uma série de outras toxinas, algumas com capacidade para participar da ação entomopatogênica. Dentre elas, destaca-se a proteína Cyt, uma citolisina de ação inespecífica com relação ao inseto-alvo, produzida principalmente por B.t. var. israelensis. A toxina Cyt1Aa de Bti tem massa molecular de 27 kDa e é acumulada no cristal juntamente com as δ-endotoxinas (Ruud et al., 2003). Por não apresentar homologia com as demais proteínas Cry, não é classificada como uma δ-endotoxina (Schnepf et al., 1998).

Existem fortes evidências com relação à ação sinérgica das δ-endotoxinas e da toxina Cyt, visto que nenhuma das toxinas isoladas é tão ativa quanto o cristal nativo (Wu e Chang, 1985; Chilcott e Ellar., 1988; Chang et al., 1993; Crickmore et al., 1995). As toxinas atuam em conjunto, reduzindo a probabilidade do desenvolvimento de resistência por parte dos insetos-alvo (Becker, 2000; Regis et al. 2001), fornecendo as bases para a construção de larvicidas recombinantes mais efetivos contra mosquitos e simulídeos (Federici et al., 2003).

1.2 Importância biotecnológica

O potencial larvicida das toxinas produzidas por Bt vem sendo explorado desde a década de 30, principalmente para o controle de lepidópteros (Polanczyk et al., 2003; Lord, 2005). A variedade Bacillus thuringiensis var. israelensis vem sendo comercializada em larga escala para o controle de mosquitos e borrachudos, havendo um grande número produtos eficientes disponíveis no mercado mundial (Polanczyk et al., 2003; Poopathi e Tyagi, 2004). Produtos formulados com Bti foram usados em campanhas intensivas de controle de pernilongos realizadas nos EUA e Alemanha e no combate de simulídeos vetores da oncocercose na África (Glare e O’Callagham, 2000). De acordo com Polanczyk et al. (2003), existem alguns produtos à base de Bti disponíveis no mercado brasileiro, a maioria deles importados. A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), em conjunto com uma empresa privada, a Bthek Biotecnologia, introduziu um novo produto à base de Bti no mercado em 2002.

Um dos produtos biológicos mais utilizados atualmente é o VECTOBAC® DT (ABBOTT LABORATORIES, EUA) que é uma formulação de Bti (ABG-6499) em forma de tablete contendo 3,4% dos ingredientes ativos. Este produto apresentou alta eficiência contra larvas de Aedes albopictus, A. aegypti e Culex pipiens, levando a 100% de mortalidade em cerca de 24 horas de tratamento (Toma et al., 2003). Outro produto à base de Bti, TEKNAR® (VALENT BIOSCIENCES, EUA), foi utilizado em larga escala, pela OMS, para o controle de oncocercose na África (Federici et al., 2003).

Segundo Vilarinhos et al. (1998), a eficiência das formulações baseadas em Bti varia de 96% a 100%, até 72 horas após a aplicação e, embora estes produtos apresentem um custo um pouco superior em relação aos produtos químicos tradicionalmente utilizados, eles são mais competitivos quando considerados os custos sociais e ambientais do uso de inseticidas não seletivos. Apesar de Bti atuar

somente sobre as larvas, sua alta eficiência permite restringir o nível populacional de A. aegypti, impedindo a ocorrência de epidemias. Em 2002, foram usadas, aproximadamente, 360 toneladas de Bti no combate de vetores no Brasil, consumindo US$ 2,2 milhões (Polanczyk et al., 2003).

Além de sua atividade entomopatogênica, Bt constitui a maior fonte de genes que conferem resistência a insetos em plantas transgênicas. A clonagem dos genes responsáveis pela toxicicidade de Bt possibilita expressá-los em linhagens acristalíferas de Bt ou Escherichia coli. Com a reintrodução de genes clonados em Bt, é possível estudar os fatores de regulação e expressão dos genes das endotoxinas (Kumar e Udayasiriyam, 2004).

1.3 Processo fermentativo para produção de bioinseticidas com Bt

Embora a participação, no mercado mundial de bioinseticidas, de produtos formulados especificamente com a variedade Bacillus thuringiensis var. israelensis tenha sido crescente nos últimos anos, existe uma carência de informações sobre os seus processos de produção. Devido à competitividade de mercado, os fabricantes optam por manter em sigilo detalhes dos métodos operacionais que levam à obtenção das diferentes formulações (Yang e Wang, 1998). Além disso, os dados publicados sobre os aspectos fisiológicos ou do processo fermentativo com a bactéria são, geralmente, espécie-dependente e, às vezes, contraditórios (Sachidanandham et al., 1997; Farrera et al., 1998; Lacey et al., 2001; Maldonado-Blanco et al., 2003; Sarrafzadeh et al., 2005). Em razão das variações de especificidade observadas entre as diferentes linhagens da bactéria, há uma resposta diferencial de cada uma aos diferentes meios de cultivo e às condições operacionais empregadas na fermentação (Bernhard e Utz, 1993; Sachidanandham et al., 1997). O aprimoramento das linhagens já descobertas, dos processos de produção e de formulação dos meios de cultivo são considerados indispensáveis para o desenvolvimento futuro do mercado dos inseticidas à base de Bt (Lacey et al., 2001).

Um dos fatores mais relevantes para a otimização do processo de produção de bioinseticidas baseados em Bt com fins comerciais é a escolha do meio de cultivo. Os meios devem ter em sua composição os nutrientes necessários ao adequado desenvolvimento da bactéria, de forma a levar à produção de biomassa em elevadas concentrações, além de favorecer elevadas taxas de esporulação e síntese das δ-endotoxinas (Bernhard e Utz, 1993; Yang e Wang, 1998; Poopathi et

al., 2002). Entretanto, embora a síntese do cristal protéico esteja intrinsecamente ligada ao processo de esporulação Bt, vários autores sustentam que elevadas concentrações de esporos não implicam necessariamente em alta atividade tóxica do meio fermentado (Avignone-Rossa e Mignone, 1993; Morris et al., 1996; Schnepf et al., 1998; Lacey et al., 2001). De acordo com López y López (2000), meios de cultivo que levam a altas concentrações celulares, não necessariamente levam a altas concentrações de esporos e endotoxinas em fermentações com Bt. Segundo Yang e Wang (1998), para a otimização da composição em nutrientes dos meios de cultivo de Bt é preciso investigar separadamente as três fases gerais do desenvolvimento da bactéria: o crescimento vegetativo, a esporulação e a lise celular.

A composição de meios de cultivo para Bt deve conter uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e sais minerais, em concentrações adequadas. Estas exigências nutricionais variam, no entanto, de acordo com a variedade ou subespécie da bactéria empregada na fermentação (Arcas et al., 1987). Bt metaboliza glicose pela via glicolítica para produzir principalmente piruvato e acetil CoA (Lüthy et al., 1982; Nickerson et al., 1974). Quando a glicose é exaurida do meio, acetil CoApassa a ser assimilado, pelo ciclo dos ácidos tricarboxílicos , para o fornecimento de energia necessária ao crescimento e à esporulação (Benoit et al., 1990; Liu et al., 1994; Mignone e Avignone-Rossa, 1996). Além de glicose, algumas linhagens de Bt podem utilizar outros carboidratos como fonte de carbono, incluindo sacarose, frutose, lactose, galactose, maltose e xilose (Rogoff e Yousten, 1969; Içgen et al., 2002b; Panarotto, 2006). Açúcares mais complexos, como inulina, são também metabolizados pela bactéria (Özkan et al., 2003). Como são igualmente produtoras de amilases e proteases, matérias-primas amiláceas e protéicas podem ser usadas na composição do meio de fermentação (Rogoff e Yousten, 1969; Yang e Wang, 1998). Segundo alguns autores, o tipo de açúcar utilizado no meio de cultivo pode influenciar na produção de endotoxinas (Yang e Wang, 1998; Sachidanandham et al., 1997; Özkan et al., 2003, Panarotto, 2006).

Extrato de levedura constitui a fonte nitrogenada mais comumente usada na composição de meios de cultivo em estudos sobre a fermentação com Bt (Sikdar et al., 1991; Vallejo et al., 1999; Khuzhamshukurov et al., 2001; Anderson e Jayaraman, 2003). Este componente apresenta em sua composição material protéico (73-75%), aminoácidos livres e oligopeptídeos de diferentes massas moleculares, além de vitaminas, sais minerais e polissacarídeos,

predominantemente mananas e glicanas (Sommer, 1996; Sacksinchai et al., 2001). Porém, o emprego de extrato de levedura em processos industriais de fermentação é limitado devido ao seu alto custo.

Alguns autores relatam que, além de uma fonte de nitrogênio orgânico, a presença de uma fonte de nitrogênio inorgânico é essencial para o desenvolvimento do processo (Farrera et al., 1998; Saksinchai et al., 2001; Anderson e Jayraman, 2003). Segundo Dahod (1999), sulfato de amônio, nitrato de amônio, nitrato de potássio e nitrato de sódio são exemplos de alguns sais que podem ser empregados como fonte de nitrogênio na composição de meios de cultivo, os quais, quando combinados com nitrogênio orgânico, auxiliam no crescimento celular. O sal sulfato de amônio é utilizado na composição da maioria dos meios de cultivo em estudo das diferentes variedades de Bt: B. t. kurstaki (Kang et al., 1992; Saksinchai et al., 2001), B. t. israelensis (Sikdar et al., 1991; Mignone e Avignone-Rossa, 1996), B. t. galleriae (Anderson e Jayraman, 2003), B. t. darmstadienesis (Wu e Chen, 2001). Rodrigues (2006) demonstrou que nitrato de amônio interfere negativamente no crescimento de Bti, enquanto citrato de amônio e ferro III favorece a produção de biomassa e a esporulação da bactéria. A esporulação foi inibida quando cloreto de amônio foi usado como fonte inorgânica de nitrogênio.

Íons metálicos como Ca2+ e Mn2+, K+ e Mg2+ são considerados importantes e essenciais no cultivo de Bt (Yang e Wang, 1998). Bernhard e Utz (1993) destacam a importância dos íons Ca2+ e Mn2+ na esporulação da bactéria, mas, de acordo com dados de Pessanha (2005), estes íons influenciaram negativamente o crescimento da bactéria em meios formulados com caldo de cana-de-açúcar. De acordo com Yao et al. (2002, 2003), os íons Mn2+ e Cu2+ atuam como elementos-traço essenciais, podendo estimular ou inibir o crescimento de Bt de acordo com as concentrações empregadas. Içgen et al. (2002a) mostraram que a presença de Zn2+ e íons Ca+2 no meio de cultivo para Bt auxiliaram na produção de toxina. A influência de Cu+2 também foi observada por Yao et al. (2003). Rodrigues (2006) verificou que a presença de íons Fe2+ no meio favoreceram claramente o crescimento e a esporulação de Bti e que íons molibdato tiveram influência negativa sobre o crescimento.

A produção comercial de bioinseticidas à base de Bt é feita em fermentação submersa conduzida em sistema descontínuo, utilizando-se meios complexos contendo os nutrientes necessários ao adequado desenvolvimento do microrganismo (Rowe e Margaritis, 2003). Diversas matérias-primas e substratos

não refinados e de baixo custo têm sido avaliados como fontes alternativas de nutrientes para o processo, principalmente resíduos da agroindústria. Saksinchai et al. (2001), em estudos com a finalidade de avaliar a substituição de extrato de levedura comercial por autolisado de levedura de cervejaria (Meio BYE) na composição do meio de cultivo de Bacillus thuringiensis kurstaki (Btk), observaram que, em meio composto com extrato de levedura comercial (Meio DYE), foi obtido um número total de esporos de 2,6x109 ufc/mL, enquanto que no Meio BYE o número foi de 1x108 ufc/mL. No entanto, a suplementação do Meio BYE com 3,0 mg/L de FeSO4.7H2O permitiu alcançar um número total de esporos de 2,8x109 ufc/mL, valor ligeiramente inferior ao obtido com o Meio DYE, também suplementado com 3,0 mg/L de FeSO4.7H2O (3,6x109 ufc/mL). O íon Fe2+ foi identificado como fator limitante no Meio BYE para a obtenção de números de esporos similares aos obtidos com o meio formulado com extrato de levedura comercial.

Em estudo comparativo sobre os efeitos de vários meios nutritivos na atividade entomopatogênica de três linhagens de Bt, Khuzhamshukurov et al. (2001) relataram que a substituição de glicose por melaço como fonte de carbono não influenciou na atividade tóxica de Bt. Meios formulados com extrato de levedura e melaço levaram a um número de esporos de 6,4x109 ufc/mL, tendo a substituição do extrato de levedura por extrato de batata levado a resultados muito similares (6,3 x109 ufc/mL).

Vimala Devi et al. (2005) ressaltam que o custo do processo de produção de Bt é ainda elevado e reafirmam a necessidade de emprego de resíduos agroindustriais, como melaço de cana-de-açúcar, ou de sementes de diversas leguminosas para a formulação do meio. Os autores reportam que grãos de cevada podem ser utilizados com sucesso como fonte de carbono e nutrientes para crescimento e esporulação da bactéria, embora contenha baixo conteúdo de proteína.

Ernandes et al. (2003) testaram manipueira, um resíduo obtido do processamento de mandioca, como fonte de nitrogênio, e observaram um crescimento lento, mas contínuo, resultando em esporulação relevante.

Salama et al. (1983) testaram a influência da adição de extratos de batata, batata doce, e cenoura na composição do meio de cultivo para três linhagens de Bt. Os melhores resultados foram obtidos com a variedade B.t. kurstaki , tendo o extrato de cenoura levado a uma maior produção de esporos (8x108/mL), em comparação

com os resultados obtidos com os extratos de batata (39x107/mL) e de batata doce (25x107/mL). Por outro lado, um comportamento bem diferente foi observado com a variedade B. t. entomocidus. Neste caso, extrato de cenoura levou aos menores resultados (4x107/mL), seguido de extrato de batata, o qual levou a um número de esporos de 7x107/mL e extrato de batata doce, que levou a obtenção de um número maior de esporos (10x107/mL). Os resultados obtidos com a variedade B. t. entomocidus foram significativamente inferiores aos obtidos com a variedade B. t. kurstaki, reforçando o fato de os resultados obtidos com a utilização de diferentes matérias-primas variarem de acordo com a variedade empregada no processo.

Em estudo comparativo de quatro diferentes formulações de meio para o cultivo de Bti, Poopathi et al. (2002) verificaram que a densidade ótica (D.O) final (72 h) alcançada na fermentação de meio composto com extrato de batata (PE) foi similar à observada em cultivo realizado com Meio LB (Luria Bertani), usado como referência. No entanto, a adição de sacarose (5 g/L) ao meio levou a uma queda significativa na produção de biomassa, cerca de 65,5%, enquanto a utilização de 5 g/L de grão-de-bico desidratado permitiu a obtenção de um valor de D.O comparável ao obtido nos Meios LB e PE. As toxinas produzidas em todos os meios alternativos foram altamente efetivas contra todas as espécies de mosquitos testadas (Culex quinquefasciatus, Anopheles stephensi e Aedes aegypti), não tendo havido diferença significativa dos resultados observados para o Meio LB.

Maldonado-Blanco et al. (2003) observaram um rendimento de 108 esporos/mL com Bti em meio composto com farelo de soja, suplementado com sais minerais. Vora e Shethna (1999) relatam um rendimento entre 1010 e 1011 esporos/mL de B. t. kurstaki (taxa de esporulação = 96%) em meio composto com sais minerais, peptona e cistina (40 mg%) ou meios compostos com farinha desengordurada de semente de algodão, linho ou amendoim, também suplementados com cistina.

Materiais menos usuais, geralmente abundantes nas regiões em que os estudos são realizados, têm sido avaliados, como é o caso da cama de galinheiros (Salama et al., 1983; Adams et al., 1999), pupas de bicho da seda (Alves et al., 1997), lodos de estações de tratamento de esgoto doméstico (Vidyarthi et al., 2002), entre outros. Vidyarthi et al. (2002) relataram que a produção de células e de esporos de Bt em meio composto com lodo de esgoto doméstico foi comparável aos resultados obtidos em meios composto com soja e extrato de levedura (TSY) e com farelo de soja comercial. A maior atividade larvicida foi obtida em meio à base de

lodo de esgoto doméstico. Luna et al. (2004) avaliaram o cultivo de Bti utilizando o sobrenadante da floculação e sedimentação da biomassa da própria bactéria, com a finalidade de minimizar os custos do produto formulado em larga escala. Segundo estes autores, o pH decresceu após 6 h de cultivo e em cerca de 24 h a glicose foi totalmente consumida.

De acordo com Winkler (1983), os custos do meio de cultivo podem representar até ¾ dos custos operacionais dos processos fermentativos industriais Por isso, as indústrias de fermentação investigam continuamente fontes alternativas de nutrientes que, além de satisfazer as necessidades nutricionais do microrganismo empregado, sejam as mais baratas possíveis. A utilização de cana-de-açúcar, como matéria prima para processos fermentativos, tem a vantagem de, além do baixo custo do caldo, gerar um resíduo, o bagaço de cana, que pode ser usado como fonte barata de energia no próprio processo.

Pessanha (2005) verificou que caldo de cana-de-açúcar constitui uma matéria prima apropriada para a composição de meio de cultivo para Bti. Observou também a necessidade da adição de uma fonte de nitrogênio orgânico na composição do meio de cultivo para a obtenção de elevadas concentrações celulares e de esporos, uma vez que meios formulados com caldo de cana de açúcar e extrato de levedura permitiram a obtenção de elevadas concentrações celulares e de esporos.

Levando em conta os resultados obtidos por Pessanha (2005), e com o intuito de dar continuidade ao estudo do processo fermentativo com Bti em meios formulados com caldo de cana-de-açúcar e outros substratos, pretende-se determinar algumas formulações de meio que permitam a maximização da produção de biomassa, de esporos e de δ-endotoxinas pela bactéria.

2

–

Avaliar o efeito da composição de meios formulados com caldo de cana-de-açúcar, extrato de levedura e sulfato de amônio, em diferentes concentrações, sobre a produção de células e de esporos de Bacillus thuringiensis var. israelensis.

Avaliar a cinética de crescimento e de consumo de substrato, e a produção de esporos, em meios com diferentes fontes de carbono, comparando-se os resultados obtidos na fermentação em frascos agitados e em biorreator de bancada.

3

–

3.1 Microrganismo

A bactéria Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti), sorotipo H-14, cepa IPS 82, obtida no Instituto Pasteur de Paris, foi utilizada em todos os experimentos. A cultura foi mantida em tubos de ensaio sob refrigeração (4 °C).

3.2 Matéria-prima 3.2.1 Obtenção

O caldo de cana-de-açúcar, matéria-prima utilizada neste trabalho para o preparo dos meios de fermentação, foi doado pela Usina Paraíso, situada em Tocos, distrito de Campos dos Goytacazes, RJ. Todo o volume de caldo de cana (50 L) foi coletado de uma única vez.

A coleta foi feita pessoalmente, na própria moenda industrial, tomando-se todos os cuidados para evitar o aumento da contaminação do caldo. Para tanto, o seguinte procedimento foi seguido: após a moagem da cana-de-açúcar, o caldo foi acondicionado em galões de 20 L, os quais foram acondicionados em caixa de isopor contendo gelo picado, e transportado até as dependências do Laboratório de Biotecnologia, na UENF. O caldo passou por uma primeira etapa de filtragem em peneira comum, para retirada de bagacilhos e impurezas maiores, sendo todo o volume acondicionado em um único recipiente com capacidade de 100 L, previamente higienizado. Após esta etapa, todo o volume de caldo foi homogeneizado, novamente filtrado em tamiz de malha mais fina que a peneira utilizada na primeira etapa de filtragem, para retirada das sujidades menores, sendo acondicionado manualmente em garrafas plásticas de 0,5 L, as quais foram estocadas em freezer a –20 ºC.

3.2.2 Tratamento

O caldo de cana-de-açúcar necessita ser submetido a um tratamento prévio de clarificação com o objetivo de remover substâncias responsáveis por sua turbidez e possíveis inibidores do crescimento microbiano (Lima et al., 2001).

Para a realização dos tratamentos, um volume adequado de caldo foi descongelado e filtrado em papel filtro. O tratamento de clarificação consistiu na precipitação das substâncias dissolvidas e em suspensão no caldo pela ação do

calor, por meio do aquecimento até fervura do caldo, resfriamento a temperatura ambiente, centrifugação e correção do pH para 8,0 com hidróxido de cálcio (Ca(OH)2). Em seguida foi feita uma segunda centrifugação e posterior correção do pH para 6,0 com ácido clorídrico (HCl) 1 N (Berbert-Molina, 1998).

A centrifugação foi feita, em todos os casos, a 25.000 x g por 10 minutos (Centrífuga Beckman Coulter, modelo Allegra 64R) a uma temperatura de10 ºC.

3.3 Meios de Cultivo

A viabilidade das culturas foi mantida por meio de repicagens mensais, utilizando a técnica de semeadura em superfície de meio sólido, Agar Nutriente, cuja composição é mostrada na Tabela 1.

Tabela 1 – Composição do Meio de cultivo Agar Nutriente.

Componente Concentração (g/L)

Extrato de carne 3,0

Peptona de carne 5,0

Agar-agar 18,0

Os componentes foram dissolvidos em água destilada e levados ao forno de microondas para fusão do agar-agar, sendo o meio acondicionado em tubos de ensaio com rolha de algodão e gaze e esterilizados em autoclave a 121°C por 20 minutos. Os tubos foram resfriados a temperatura próxima a 50 ºC, inclinados em ângulo de 30º até completa solidificação (temperatura ambiente) e mantidos sob refrigeração a 4 ºC.

Para o preparo dos inóculos e como base para a formulação de alguns dos meios avaliados, a formulação do meio GYS (Rogoff e Yousten, 1969), em termos de sais minerais, foi utilizada como base. A composição deste meio está descrita na Tabela 2.

Tabela 2 – Composição do Meio de cultivo GYS. Componente Concentração (g/L) Extrato de levedura 12,0 (NH4)2SO4 3,0 MgSO4.7H2O 1,5 CaCl2.2H2O 0,12 MnSO4.H2O 0,09 K2HPO4 1,5 KH2PO4 1,5 Sacarose 10,0

A composição dos meios avaliados no primeiro grupo de ensaios em frascos agitados (Item 3.4.3) está descrita na Tabela 3. O caldo foi diluído de forma a se obter concentrações de açúcares redutores totais (S0) de 10, 20 e 30 g/L. Extrato de levedura (EL) foi utilizado nas concentrações de 12,0, 17,0 e 22,0 g/L, enquanto sulfato de amônio foi empregado nas concentrações de 0, 2,5 e 5,0 g/L.

Tabela 3 – Composição dos meios de cultivo nos ensaios em frascos agitados. Concentração (g/L) Componente M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 Extrato de levedura 22,0 22,0 22,0 22,0 12,0 12,0 12,0 12,0 17,0 17,0 17,0 17,0 (NH4)2SO4 5,0 5,0 - - 5,0 5,0 - - 2,5 2,5 2,5 2,5 Sacarose* 30,0 10,0 30,0 10,0 30,0 10,0 30,0 10,0 20,0 20,0 20,0 20,0 K2HPO4 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 KH2PO4 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5

* Sacarose oriunda do caldo de cana

Os meios avaliados no segundo grupo de ensaios em frascos agitados e nos ensaios em biorreator tiveram sua composição baseada no meio GYS (Rogoff e Yousten, 1969), alterando-se apenas a fonte de carbono (açúcar). Em todos os meios, foi utilizada uma concentração inicial de substrato de 10 g/L, com exceção do

Meio YS, o qual só apresentou extrato de levedura e sais em sua composição. A Tabela 4 mostra a composição dos meios avaliados no segundo grupo de ensaios em frascos agitados e nos ensaios em biorreator.

Tabela 4 – Composição dos meios de cultivo do segundo grupo de ensaios em frascos agitados e dos ensaios em biorreator de bancada.

Concentração (g/L) Componente

CC SYS GYS FYS YS

Extrato de levedura 12,0 12,0 12,0 12,0 12,0 (NH4)2SO4 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 MgSO4.7H2O 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 CaCl2.2H2O 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 MnSO4.H2O 0,09 0,09 0,09 0,09 0,09 K2HPO4 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 KH2PO4 1,5 1,5 1,5 1,5 1,5 Sacarose 10,0 * 10,0 # _{- - -} Glicose - - 10,0 - - Frutose - - - 10,0 -

* Sacarose oriunda do caldo de cana

#

Sacarose PA

3.4 Condições de Cultivo

3.4.1 Preparo das culturas estoque

A manutenção das culturas (estoque) foi feita por semeadura, por estria simples, em superfície de Meio Agar Nutriente em tubos inclinados, incubados a 30ºC por 96 horas, tempo suficiente para garantir uma taxa de esporulação da cultura superior a 90%. Os tubos foram armazenados a 4ºC e utilizados por, no máximo, seis meses, quando é feita nova repicagem.

3.4.2 Preparo do inóculo

Frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 25 mL de meio, cobertos com rolha de algodão e gaze, foram inoculados por transferência direta (alçada) com esporos do microrganismo provenientes da cultura estoque. Os frascos foram incubados em estufa bacteriológica a 30 ºC por 15 h. Um volume adequado (5% v/v) desta cultura foi centrifugado a 4.100x g por 10 min (Centrífuga Eppendorf modelo 5804R) e o sedimento resultante foi utilizado como inóculo.

3.4.3 Ensaios de fermentação

Os ensaios de fermentação foram realizados em duas etapas. Na primeira etapa os ensaios foram feitos em frascos agitados. Frascos Erlenmeyer de 1.000 mL, contendo 200 mL de meio, cobertos com manta de algodão e gaze foram inoculados com 5% (v/v) de inóculo e incubados em agitador de movimento recíproco (Incubadora/Agitadora NOVA ÉTICA mod. 430 RDB) a 30 ºC e 115 min-1 até dissociação total dos grumos formados durante a esporulação e início da lise celular.

Na segunda etapa os ensaios foram realizados em sistema descontínuo, utilizando-se biorreator de bancada B.BRAUN BIOTECH modelo BIOSTAT B, que permite o controle automático de pH, temperatura, nível de espuma, agitação e vazão de ar, por meio de uma unidade de controle digital composta por um microprocessador e um software específico. A cuba do fermentador (2 L de volume útil), contendo o meio de fermentação, e já instalados o condensador, os filtros de ar, as sondas para controle no nível de espuma e para controle da temperatura e as tubulações de silicone utilizadas para a retirada de amostras e adições de meio, antiespumante e base, foi esterilizada a 121 ºC por 20 min. Os eletrodos de pH e de oxigênio dissolvido foram tratados com álcool etílico 70% (v/v) e enxaguados com água destilada esterilizada antes da instalação na cuba do reator. A calibração dos eletrodos foi feita momentos antes da inoculação. Foi utilizado um volume de meio de 1,5 L e a sua inoculação foi feita com 5% (v/v) de inóculo. Foram utilizadas temperatura de 30 ºC, agitação de 300 min-1 e aeração de 0,33 vvm. O pH foi corrigido para 7,0 no início da fermentação com KOH 5M e controlado automaticamente pela adição da mesma base, ao longo do processo, de modo a não atingir valores inferiores a 5,5.

O primeiro grupo de ensaios em frascos agitados teve como objetivo testar diferentes meios de cultivo formulados com caldo de cana-de-açúcar, extrato de

levedura e sulfato de amônio, em diferentes concentrações (Tabela 3). As condições avaliadas e o número de ensaios foram determinados por um planejamento experimental. As variáveis de processo testadas foram a concentração inicial de açúcar (S0), a concentração extrato de levedura (EL) e a concentração de sulfato de amônio (SA). Foi utilizado um planejamento fatorial completo 23, com quatro repetições do ponto central. Esta metodologia permite avaliar o efeito de cada uma das variáveis em estudo, assim como verificar se há efeito de interação entre as mesmas sobre o processo (Barros Neto et al., 1995).

A Tabela 5 mostra os fatores e os níveis das variáveis analisados. A Tabela 6 apresenta a matriz do planejamento experimental fatorial 23, contendo os fatores e os níveis codificados. A Tabela 7 apresenta esta mesma matriz, com os valores reais de cada variável utilizados nas diferentes formulações de meio. Os limites de cada variável foram escolhidos com base em dados da literatura (Avignone-Rossa et al., 1990; Liu e Tzeng, 1998; Pessanha, 2005).

Os resultados foram analisados empregando-se como variável resposta as concentrações totais de células e de esporos e a taxa de esporulação. Os resultados foram analisados estatisticamente utilizando-se os programas Statistica 5.0 e Design-Expert 6.0, que calculam os efeitos principais e de interação, com seus respectivos níveis de significância. Com os dados quantificados dos efeitos, o programa fornece um modelo matemático que permite construir uma superfície de resposta. Esta, por sua vez, permite definir as condições mais adequadas que levam à obtenção dos valores máximos das variáveis resposta, dentro da faixa de estudo de cada uma das variáveis independentes.

Tabela 5 – Valores das variáveis independentes empregadas no planejamento fatorial completo 23.

Níveis

Fator -1 0 +1

S0 10 20 30

EL 12 17 22

SA 0 2,5 5,0

Tabela 6 – Matriz do planejamento fatorial completo 23 com quatro repetições do ponto central.

Meio EL SA S0 M1 + + + M2 + + - M3 + - + M4 + - - M5 - + + M6 - + - M7 - - + M8 - - - M9 0 0 0 M10 0 0 0 M11 0 0 0 M12 0 0 0

Tabela 7 – Matriz do planejamento fatorial com as formulações dos meios de cultivo a serem estudados.

Meio EL SA S0 M1 22,0 5,0 30,0 M2 22,0 5,0 10,0 M3 22,0 0 30,0 M4 22,0 0 10,0 M5 12,0 5,0 30,0 M6 12,0 5,0 10,0 M7 12,0 0 30,0 M8 12,0 0 10,0 M9 17,0 2,5 20,0 M10 17,0 2,5 20,0 M11 17,0 2,5 20,0 M12 17,0 2,5 20,0

O segundo grupo de ensaios em frascos agitados teve como objetivo avaliar a influência de diferentes fontes de carbono sobre a produção de biomassa e esporulação da bactéria. Quatro diferentes formulações foram testadas (Tabela 4).

Os ensaios em biorreator de bancada tiveram como objetivo avaliar o processo fermentativo, com maior controle das condições de processo, sobretudo de transferência de oxigênio. Além das quatro formulações avaliadas em ensaios em

frascos agitados, uma quinta formulação foi incluída (Meio YS), composto apenas com extrato de levedura e sais (Tabela 4).

3.5 Métodos Analíticos

3.5.1 Coleta de amostras

Nos ensaios em frascos agitados, amostras de meio foram coletadas periodicamente para a determinação do pH, da concentração celular, da concentração de açúcar, do número de células totais e de esporos por meio do método de contagem em Câmara de Neubauer (Item 3.5.4), bem como para a observação da morfologia celular por microscopia de contraste de fase.

O sistema utilizado para retirada de amostras nos ensaios em biorreator de bancada consistiu em um tubo de aço inoxidável, cuja extremidade situava-se próxima ao fundo da cuba, conectado a uma mangueira de silicone que, após passagem por uma bomba peristáltica, retornava à cuba do biorreator. O meio de fermentação foi circulado por cerca de 2 minutos por este sistema a fim de remover resíduos de amostras anteriores. As amostras foram retiradas com seringa e agulha descartáveis, através de um septo de silicone adaptado à tubulação. Variáveis de processo como pH, temperatura e oxigênio dissolvido foram acompanhadas ao longo da fermentação.

3.5.2 pH

As medidas de pH das amostras de meio fermentado nos ensaios em frascos agitados foram feitas em pHmetro (DIGIMED DM 20).

3.5.3 Morfologia celular

As variações da morfologia celular ao longo da fermentação foram acompanhadas pela observação de preparações a fresco do meio fermentado em microscópio de contraste de fase (JENA modelo Jenamed 2) com aumento de 400x. Neste método, os materiais mais densos aparecem claros, ao passo que parte das células que têm densidade próxima à da água (como o citoplasma) aparecem escuras, tornando possível a análise da estrutura celular sem utilizar corantes ou matar o organismo (Pelczar et al., 1996). As preparações a fresco são especialmente úteis para a observação de aspectos relativos à motilidade do microrganismo e ao processo de esporulação, características inerentes à espécie

Bti. As células esporuladas e os esporos de Bti são perfeitamente visíveis nas condições utilizadas no preparo das lâminas, o que tornou possível a contagem em Câmara de Neubauer (Item 3.5.4).

3.5.4 Obtenção do número de células e esporos

O número de células vegetativas (CV), de células esporuladas (CE) e de esporos livres (EPL), ao final da fermentação, foi obtido por meio de contagem em câmara de Neubauer. Alíquotas de 10 µL de meio fermentado, convenientemente diluídas em solução salina, foram aplicadas sobre a superfície da câmara, cobertas com lamínula e observadas em microscópio de contraste de fase (JENA mod. Jenamed 2) com aumento de 400x. A partir da média dos valores obtidos na contagem de 4 campos de cada diluição da amostra, feita em triplicata, foram calculados o número total de células (CT), o número total de esporos (ET) e a taxa de esporulação (TSP), levando-se em conta as diluições utilizadas para cada amostra. Para cada amostra, duas ou três diluições independentes foram feitas, de modo a se obter entre 15-40 células vegetativas, células esporuladas ou esporos por campo.

O número total de células (CT) foi obtido pelo somatório do número total de células vegetativas (CV), células esporuladas (CE) e esporos livres (EPL) (CT=CV+CE+EPL). O número total de esporos foi calculado pela soma de CE e EPL (ET=CE+EPL). A taxa de esporulação foi calculada dividindo-se o número total de esporos pelo número total de células e multiplicando-se o resultado por 100 (valor em percentagem) [TSP=(ET/CT) x 100].

3.5.5 Concentração celular

A concentração celular nas primeiras horas do cultivo foi quantificada indiretamente pela medida da absorbância de suspensões diluídas do meio fermentado, convertida em concentração (massa de matéria seca por unidade de volume) por uma equação que descreve o trecho linear de uma curva de calibração. Para a construção da curva, foi utilizada uma suspensão de células de Bti produzida em meio GYS, nas mesmas condições adotadas para os ensaios de fermentação, conforme o seguinte procedimento (Berbert-Molina, 1998):

• 30 mL do meio fermentado foram centrifugados a 5.000 x g por 20 minutos a 10 ºC (Centrífuga Eppendorf modelo 5804R), descartando-se o sobrenadante;

• O pellet foi homogeneizado em água destilada e centrifugado nas mesmas condições, sendo esta operação repetida duas vezes;

• As células foram transferidas para cadinhos de porcelana, previamente secos e pesados, os quais foram colocados em estufa a 85 ºC por 24 h;

• Após resfriamento por 20 min em dessecador, os cadinhos foram pesados e a concentração celular foi calculada dividindo-se a massa seca de células pelo volume inicial de meio fermentado;

• Paralelamente às operações de determinação da massa seca de células, a absorbância das amostras, convenientemente diluídas, foi medida a 610 nm em espectrofotômetro MICRONAL modelo B582;

• A absorbância de cada uma das suspensões de células foi correlacionada com a concentração celular correspondente e, com os pontos do trecho linear da reta obtida, foi definida a equação, por regressão linear, a ser utilizada no cálculo da concentração celular das amostras de fermentação durante os diferentes ensaios.

Nos ensaios em biorreator, a determinação da concentração celular foi feita de duas formas. Nas primeiras horas de cultivo, enquanto não se observava a formação de grumos, a biomassa era quantificada indiretamente por turbidimetria, conforme descrito acima. A partir do momento em que se observava a floculação da cultura, as medidas de concentração celular passavam a ser feitas diretamente por gravimetria, seguindo o mesmo procedimento usado nos quatro primeiros passos da metodologia descrita acima.

3.5.6 Concentração de açúcares redutores totais

A medida da concentração de açúcares redutores totais foi feita pelo método de DNS (ácido 3,5 di-nitrosalicílico) (Miller, 1959). Este método baseia-se na formação de um complexo de cor castanho-alaranjado, por redução do ácido 3,5-dinitrosalicílico a 3-amino-5-nitrosalicílico pelos açúcares redutores. A concentração desse complexo corado é proporcional à concentração de açúcares redutores na amostra.