Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS DO SISTEMA ABO COM NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES DE SEMICONDUTORES
ANTONIO TEIXEIRA DE SALES NETO
Recife-PE, Brasil Fevereiro, 2012
Universidade Federal de Pernambuco Centro de Ciências da Saúde Departamento de Ciências Farmacêuticas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
MARCAÇÃO DE ANTÍGENOS ERITROCITÁRIOS DO SISTEMA ABO COM NANOPARTÍCULAS FLUORESCENTES DE SEMICONDUTORES
ANTONIO TEIXEIRA DE SALES NETO (Bolsista CAPES)
Orientação: Profª Dra. Beate Saegesser Santos Co-orientação: Profª Dra. Adriana Fontes
Recife-PE, Brasil Fevereiro, 2012
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFPE como parte dos requisitos necessários para a obtenção de título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Recife, 28 de fevereiro de 2012.
Defesa de Dissertação de Mestrado de Antonio Teixeira Sales Neto defendida e APROVADA, por decisão unânime, em 28 de fevereiro de 2012 e cuja Banca Examinadora foi constituída pelos seguintes professores:
PRESIDENTE E PRIMEIRA EXAMINADORA INTERNA: Beate Saegesser Santos do Depto. de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE.
Assinatura:___________________________________ SEGUNDA EXAMINADORA INTERNA: Ana Cristina Lima Leite do Depto. de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco - UFPE.
Assinatura: ___________________________________
PRIMEIRA EXAMINADORA EXTERNA: Norma Lucena Cavalcante Licínio da Silva do Depto. De Imunologia do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ.
Assinatura: __________________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Dedico este trabalho a minha mãe, Maria da Paz, e minhas irmãs, Rosanny e Rosimery.
A todos que me ajudaram nesta empreitada...
... a equipe do laboratório de Citometria de Fluxo da Fundação Hemocentro de Ribeirão Preto: Patrícia Palma, Daiane dos Santos, Camila Menezes e Carmen Simão que me receberam com muito carinho e atenção; ...a Fundação HEMOPE Recife, pelas amostras fornecidas; ...Dra. Valéria Pereira, pelo auxílio nas análises em citometria de fluxo no Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães; ...do grupo de pesquisa NanoBio (Nanotecnologia Biomédica), que colaboraram diretamente neste projeto pelo apoio essencial; ...minha co-orientadora, Profa .Dra. Adriana Fontes, pela valiosa contribuição e amizade; ...minha orientadora, Profa. Dra. Beate Saegesser Santos por ter aceitado me conduzir no desenvolvimento deste trabalho e pelo conhecimento e disposição diante das minhas limitações; ...e a todos que indiretamente contribuíram a cada dia...
Resumo
Os Quantum dots (QDs) ou ponto quânticos vem sendo cada vez mais aplicados na área de diagnóstico por fluorescência como uma alternativa mais estável em comparação com os corantes orgânicos usualmente aplicados. Em comparação a estes, os QDs têm características ópticas peculiares que os dão vantagens como: resistência ao fotoescurecimento, possuírem um estreito espectro de emissão e uma larga banda de absorção. Uma vez recobertos, estas nanoestruturas podem ser bioconjugadas a alvos biológicos ou mesmo a anticorpos tornando-se fluoroimunoensaios com grande especificidade. Este foi o objetivo deste manuscrito, onde CdS/Cd(OH)2 - emissão no verde - tendo como agente estabilizante o polifosfato de sódio ([(NaPO3)]n) e CdTe sintetizados com telúrio metálico, Cd(ClO4)2, ácido mercaptosuccínico (AMS) - emissão no laranja - e ácido mercaptopropiônico (AMP) - emissão no verde - como agentes estabilizantes, foram bioconjugados por formação de bases de Shiff e por adsorção a anticorpos do sistema sanguíneo ABO e, posteriormente, usados na marcação simples (A e B) e dupla (AB) de eritrócitos previamente fenotipados sendo o tipo O foi usado como controle negativo. Os QDs foram caracterizados opticamente através de espectroscopias de absorção e emissão e estruturalmente através de técnicas de microscopias eletrônica de transmissão, pela qual pode ser confirmada a sua cristalinidade, e também a difração de raio-X, revelando diâmetros médios de ~3 nm para o QD-AMS, ~2 nm para o QD-AMP e ~7,5 nm para o CdS/Cd(OH)2. Através da Citometria de Fluxo, os sistemas QDs-anitocorpos demonstraram especificidade obtendo-se valores de 28,4% para os bioconjugados com CdS/Cd(OH)2-anti-A, 70,64% para o tipo A com o sistema CdTe/CdS-anti-A em FL2 (canal laranja), 37,73% para o tipo B com o sistema CdTe/CdS-anti-B em FL1 (canal verde) e 58,24% de dupla marcação detectada em ambos os canais. Os resultados dos QDs CdS/Cd(OH)2, QD-AMS e QD-AMP bioconjugados a anticorpos do sistema ABO mostram especificidade da técnica e abrem a possibilidade de determinação de fenótipos fracos desse sistema. Além disso, serve de modelo para a bioconjugação com outros anticorpos e consequentemente, para o diagnóstico de várias doenças.
Abstract
The quantum dots (QD) or quantum point has been increasingly applied in the diagnostic area fluorescence as a more stable in comparison with organic dyes is usually applied. In comparison to these, QD have optical characteristics which provide unique advantages such as resistance fotoescurecimento, having a narrow emission spectrum and a broadband absorption. Once coated, these nanostructures to be bioconjugadas biological targets or even becoming fluoroimunoensaios antibodies with high specificity. This was the aim of this manuscript, where CdS/Cd(OH)2 - emission in the green - as having a stabilizing agent sodium polyphosphate ([(NaPO 3)]n) and synthesized CdTe with tellurium metal, Cd(ClO4)2, acid mercaptosuccínico (AMS) - emission in the orange - mercaptopropionic acid (MPA) - emission in the green - as stabilizing agents, by formation of bioconjugates were of Schiff bases and adsorption system ABO blood antibodies and subsequently used in single marking ( A and B) and double (AB) of erythrocytes and the type previously phenotyped O was used as negative control. The optically QD were characterized by absorption and emission spectroscopies and structurally by techniques of transmission electronic microscopy, in which can be confirmed its crystallinity, and also the X-ray diffraction, showing an average diameter of ~3 nm to QD-AMS, ~2 nm for the QD-AMP and ~ 7.5 nm for the CdS/Cd(OH)2. By Flow Cytometry, QD-anitocorpos systems showed specificity to yield values of 28.4% for the bioconjugate with CdS/Cd(OH)2 anti-a, 70.64% type A with the system CdTe-anti-A FL2 (channel orange), 37.73% type B with the system CdTe-anti-B-FL1 (green) and 58.24% of double labeling found in both channels . The results of the QDs CdS/Cd(OH)2, QD-AMS and QD-AMP bioconjugates to antibodies of the ABO system show specificity of the technique and open the possibility of determining weak phenotypes of the system. Moreover, it serves as a model for bioconjugation with other antibodies and hence for the diagnosis of various diseases.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
[(NaPO3)]n Polifosfato de Sódio
AMP Ácido Mercaptopropiônico
AMS Ácido Mercaptosuccínico
anti-A anticorpos anti-A Anti-B anticorpos anti-B Cd(ClO4)2 Perclorato de Cádmio Cd(OH)2 Hidróxido de Cádmio
CdO Óxido de Cádmio
CdS Sulfeto de Cádmio
CdSe Seleneto de Cádmio
CdSe Seleneto de Cádmio
CdTe Telureto de Cádmio
EDC 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FSC "Forward Scatter" ou Ângulo de dispersão Frontal
Fuc L-Fucose
G Guanina
g/mL Gramas por militro
Gal D-Galactose
GalNAc N-acetilgalactosamina GlcNAc N-acetilglucosamina
Glut Glutaraldeído
HCl Ácido Clorídrico
HClO4 Ácido Perclórico
IgA Imunoglobulina A
IgG Imunoglobulina G
IgM Imunoblobulina M
ISBT International Society of Blood Transfusion
˗N=C= carbodiimida
NaOH Hidróxido de Sódio
nm Nanômetro
PBS 1X Tampão Fosfato
QD Quantum dots
SSC "Side Scatter" ou Ângulo de Dispersão Lateral sulfo-NHS N-hidroxi-sulfo-sucinamida
TPSA Antígeno Prostático Específico Total
ua Unidades Arbitrárias
UV Ultra Violeta
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Emissão de suspensões contendo nanocristais de CdSe/ZnS de diferentes diâmetros, excitadas com lâmpada na região do UV.
Figura 2: Esquema de um quantum dot (QD) passivado (camada cinza) e funcionalizada com Glutaraldeído.
Figura 3: Fotodegradação em função do tempo. Linha superior: antígenos nucleares marcados com CdSe 630 estreptavidina (vermelho) e microtúbulos marcados com Alexa Fluor 488 (verde), simultaneamente. Linha inferior: microtúbulos foram marcados com quantum dots 630-estreptavidina (vermelho), e antígenos nucleares foram corados com Alexa 488 (verde). O tempo de exposição é indicado em segundos.
Figura 4: Comparação dos perfis de emissão e excitação entre a Rodamina 6G e CdSe (ua: unidades arbitrárias)
Figura 5: Comparação entre diferentes quantum dots e fluoróforos utilizados em análises
Figura 6: Estruturas químicas dos Ácidos mercaptopropiônico AMP (superior) e mercaptosuccínico AMS (inferior).
Figura 7: Bioconjugação de quantum dot (funcionalizado com terminações carboxílicas) a anticorpos mostrando dois tipos de ligação, covalente e sufidril-amina.
Figura 8: Modelo da membrana eritrocitária que carrega os grupos sangüíneos. Figura 9: Síntese dos antígenos ABO.
Figura 10: Configuração de filtros e espelhos para compor 5 parâmetros específicos: FSC, SSC e fluorescências verde, laranja e infravermelho (> 650nm).
Figura 11: Perfis de dot-plots de sangue total características das populações celulares nos parâmetros FSC x SSC e posterior separação em Gates para análise das populações mais homogêneas separadamente.
Figura 12: Exemplo de gráfico de citometria de fluxo mostrando em seus quatro quadrantes a positividade e negatividade de marcação para dois antígenos celulares numa população celular sendo analizados por fluoróforo
detectados nos filtros FL1 e FL2 (verde e laranja, respectivamente).
Figura 13: Esquematização da bioconjugação QDs-anti-A e sua ligação aos antígenos eritrocitários (1) e imagens de microscopia de fluorescência de hemácias (2).
Figura 14: Esquema de síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 (1) (CHAVES, 2006, adaptada); Aspecto final da suspensão (2) e a mesma sob UV (3).
Figura 15: Monitoramento visual das fases da redução do telúrio. A coloração violeta refere-se à presença da espécie Na-Te-Te-Na(aq).
Figura 16: Solução precursora de cádmio (1) e a mesma após injeção de solução contendo íons Te2- (2).
Figura 17: Aspecto final da suspensão de CdTe - AMS (1); Suspensões de AMS (esquerda) e AMP (direita) (2) e as mesmas sob UV (3).
Figura 18: Da esquerda para direita tobserva-se as proporções de bioconjugados 50:1, 25:1 e 12,5:1 (v/v) do AMP (amareladas) e as mesmas proporções de bioconjugados para o AMS ( esverdeadas).
Figura 19: Difratograma de raios-X de pó representativo de amostra de CdS/Cd(OH)2. Figura 20: Espectros de Absorção e emissão normalizada do CdS/Cd(OH)2 (excitado
em 337 nm).
Figura 21: Difratograma de Raios-X de pó do CdTe - AMS.
Figura 22: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - AMS sintetizada.
Figura 23: Imagem HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMS. Barra: 5 nm. Figura 24: Difratograma de Raios X de pó de CdTe - AMP.
Figura 25: Imagens HR-MET de nanopartículas de CdTe - AMP. Barra: 2 nm.
Figura 26: Espectros de absorção e emissão normalizados da suspensão de CdTe - AMP sintetizada.
Figura 27: Dot-plots obtidos na citometria de fluxo na marcação com CdS/Cd(OH)2. 1: Células tipo A não marcadas; 2: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut; 3: Células tipo A incubadas com CdS/Cd(OH)2 -Glut-anti-A 100:1; 4: Células tipo -Glut-anti-A incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 20:1; 5: Células tipo O incubadas com CdS/Cd(OH)2-Glut-anti-A 100:1.
Figura 28: Histogramas de hemácias marcadas com CdTe - AMS - anti-A. 1: hemácias tipo A com QD; 2: hemácias tipo A com QD-anti-A; 3: hemácias tipo O com QD-anti-A.
Figura 29: Gráfico que demonstra a diferença percentual da marcação de hemácias em duas concentrações diferentes quantificadas através de citometria de fluxo.
Figura 30: Gráfico evidenciando a diferença percentual da marcação com a variação de bioconjugado em cada amostra observada através de citometria de fluxo. Figura 31: Dot-plots de hemácias duplo marcadas com QD - AMS e Glicoforina - FITC.
Em (1) hemácias tipo A evidenciando a dupla marcação e em (2) hemácias tipo O demonstrando marcação apenas da glicoforina.
Figura 32: Gráfico dos percentuais de hemácias marcadas com bioconjugados após 2 h, 24 h e formalizados, observados através de citometria de fluxo.
Figura 33: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe - AMS - anti-A foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%. Figura 34: Histogramas de hemácias tipo A (1) e tipo O (2) onde o bioconjugado CdTe
- AMP - anti-B foram incubados com as duas suspensões celulares a 1%. Figura 35: Dot-plots da dupla marcação com os sistemas CdTe - AMS - anti-A e CdTe -
AMP - anti-B em hemácias tipo AB a 1% nas proporções 1,5:1 (1) e 3:1 (2) bioconjugado:células.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Descrição dos componentes da síntese com seus respectivos valores para cada QD preparado.
SUMÁRIO
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO ... 16
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS ... 19
2.1 OBJETIVO GERAL ... 19
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19
CAPÍTULO 3: REFERENCIAL TEÓRICO ... 20
3.1 NANOESTRUTURAS ... 20 3.2 QUANTUM DOTS ... 21 3.2.1 Aplicações Biológicas ... 23 3.3 SISTEMA ABO ... 30 3.3.1 Grupos Sanguíneos ... 30 3.3.2 Sistema ABO ... 31
3.3.3 Estrutura e Biossíntese do Sistema ABO... 33
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO ... 35
3.4.1 Fundamentos ... 35
3.4.2 Aplicações em Eritrócitos ... 40
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA EXPERIMENTAL ... 42
4.1 QUANTUM DOTS DO TIPO CdS/Cd(OH)2 ... 42
4.1.1 Síntese e Passivação ... 42
4.1.2 Funcionalização ... 43
4.1.3 Bioconjugação ... 44
4.1.4 Imunomarcação Simples com CdS/Cd(OH)2 ... 44
4.2 QUANTUM DOTS DO TIPO CdTe - AMS e CdTe - AMP ... 45
4.2.1 Síntese e Funcionalização ... 45
4.2.2 Bioconjugação QDs - anticorpos ... 48
4.2.3.1 Formalização (Fixação da Fluorescência) ... 50
4.2.3.2 Imunomarcação Dupla com CdTe - AMS e CdTe - AMP ... 50
4.3. CARACTERIZAÇÃO ÓPTICA E ESTRUTURAL DOS QDs ... 51
4.3.1 Caracterização Estrutural ... 51
4.3.2 Caracterização Óptica ... 52
CAPÍTULO 5: RESULTADOS E DISCUSSÃO... 54
5.1 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E ÓPTICA DOS QDs ... 54
5.1.1 Caracterização Óptica e Estrutural do CdS/Cd(OH)2 ... 54
5.1.2 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMS ... 56
5.1.3 Caracterização Óptica e Estrutural do CdTe - AMP ... 58
5.2 ANÁLISES DE CITOMETRIA DE FLUXO ... 60
5.2.1 Imunomarcação Simples de Eritrócitos com CdS/Cd(OH)2... 60
5.2.2 Imunomarcações Simples com CdTe ... 62
5.2.2.1 Otimização parâmetros da marcação ... 63
Variação do Hematócrito ... 64
Avaliação da Concentração do Bioconjugado ... 65
5.2.2.2 Dupla Marcação QD e Glicoforina ... 65
5.2.2.3 Estabilidade do Bioconjugado após 24 horas e Formalização ... 67
5.2.2.4 Imunomarcações Simples ... 68
Hemácias tipo A com CdTe - AMS - anti-A ... 68
Hemácias tipo B com CdTe - AMP - anti-B ... 69
5.2.2.5 Imunomarcações Duplas ... 70
5.2.2.6 Discussão ... 71
CAPÍTULO 6: CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ... 73
CAPÍTULO 7: REFERÊNCIAS ... 75
16
CAPÍTULO 1: INTRODUÇÃO
Uma ferramenta muito útil como método de diagnóstico é a imunofluorescência. Essa técnica baseia-se em uma reação imunológica revelada com um corante fluorescente, ou fluorocromos, que conjugado a um anticorpo, favorece a localização da reação entre os antígenos e os anticorpos conjugados. Estas reações antígeno-anticorpo podem ser visualizadas por microscopias adequadas ou outras técnicas como a citometria de fluxo e desta forma, o padrão da fluorescência da sonda ou mesmo sua ausência podem ser utilizados na obtenção de diagnósticos confiáveis e importantes para a clínica médica.
Na maioria dos casos, os marcadores fluorescentes empregados nesta, e em outras técnicas de fluorescência, são corantes orgânicos com características limitantes como a fotodegradação e a citotoxicidade. No campo de novos classes de fluorocromos os quantum dots (QD), ou pontos quânticos, surgem como alternativas viáveis e seguras com algumas características superiores aos corantes orgânicos mais utilizados. Entre essas características podem ser citadas: elevada fotoestabilidade; largo espectro de absorção; estreito espectro de emissão; marcação de estruturas biológicas em células ou fixadas ou em suspensão; emissão em diversos comprimentos de onda para um mesmo material; obtenção de resultados com tempos de incubação da ordem de alguns minutos e baixa citotoxicidade (SANTOS, 2008).
Foi publicado em 1982 por Henglein e colaboradores um dos primeiros trabalhos sobre síntese e caracterização óptica de QDs de Sulfeto de Cádmio (CdS) e co-colóides de Sulfeto de Cádmio e Zinco (CdS-ZnS) obtidos em meio coloidal aquoso (HENGLEIN, 1982). Porém, apenas em 1998 é que essa nova classe de materiais passou a ser utilizada com finalidades para análises biológicas (ALIVISATOS, 1998; CHAN, 1998). Desde então, inúmeras aplicações vem surgindo em diversos campos das ciências da saúde como no diagnóstico de câncer (NIDA et al, 2005), em métodos microbiológicos (XUE, 2009) e em imunohematologia (LIRA, 2010).
A aplicação biológica dos QDs é possível através da funcionalização das nanopartículas onde os nanocristais inorgânicos são recobertos com moléculas,
geralmente orgânicas, que farão o elo entre estes e os alvos biológicos que se pretendem marcar. Podendo ser efetuadas funcionalizações com estruturas complexas usando, por exemplo, concanavalina (SANTOS et al., 2006) ou imunoglobulinas (FARIAS et al., 2005). A funcionalização com imunoglobulinas, por exemplo, permite a marcação de antígenos específicos, tais como os do sistema ABO, importantes para a classificação sangüínea.
O sistema ABO norteia transfusões sangüíneas e, até mesmo, transplantes de órgãos, visto a distribuição destes antígenos em várias células do corpo. Dependendo da tipagem sangüínea de um indivíduo, a imunoglobulina anti-A e/ou anti-B presentes no soro do indivíduo naturalmente podem constituir uma barreira para as transfusões de sangue e para o transplante de órgãos ABO incompatíveis (BATISSOCO & NOVARETT, 2003). Desta forma, transfusões de sangue com antígenos não compatíveis podem levar a graves reações imunológicas chamadas reações ou incidentes transfusionais que podem ocorrer com o paciente durante ou após a transfusão sangüínea podendo levá-lo a morte (LUDWIG & ZILLY, 2011).
Apesar dos anticorpos monoclonais anti-A e/ou anti-B reconhecerem e aglutinarem a maioria dos grupos do sistema ABO, a determinação daqueles que apresentam baixa expressão de antígenos é laboratorialmente trabalhosa, tendo que algumas vezes utilizar protocolos morosos e até mesmo técnicas de biologia molecular. Além disso, nos subgrupos ou variantes, há uma distinção na quantidade de antígenos e consequentemente também no padrão de distribuição destes nos eritrócitos A, B e O (H) (HOSOI, 2008) o que pode dificultar o método de hemaglutinação utilizado comumente.
Desta forma, a imunofluorescência com fluorocromos mais estáveis e versáteis, seja avaliada por microscopias ou pela citometria de fluxo, apresenta-se como uma ferramenta útil para as análises imunohematológicas, e diagnósticas, através da verificação dos padrões e perfis de intensidade de fluorescência característicos de cada tipo celular analisado. Por conseguinte, estes aspectos motivaram a realização deste trabalho onde QDs foram preparados, caracterizados e bioconjugados a anticorpos do sistema ABO para a fenotipagem de eritrócitos através da citometria de fluxo. Foram realizadas marcações com
QDs com emissões no verde e no laranja, além de duplas marcações simultâneas
CAPÍTULO 2: OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Marcação de antígenos eritrocitários do sistema ABO com QDs do tipo CdS/Cd(OH)2 e CdTe conjugados a anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente,
para imunofenotipagem do sistema ABO usando quantificação por citometria de fluxo como metodologia de avaliação.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Síntese de QDs do tipo CdS/Cd(OH)2 em meio aquoso e
funcionalizados com glutaraldeído;
2. Síntese de QDs do tipo CdTe em meio aquoso e funcionalizados com ácido mercaptosuccínico (AMS) ou ácido mercaptopropiônico (AMP); 3. Caracterização óptica e estrutural dos nanocristais obtidos;
4. Bioconjugação dos nanocristais aos anticorpos anti-A e anti-B;
5. Imunomarcação, com os bioconjugados, eritrócitos do tipo A e do tipo B usando o tipo O como controle negativo;
CAPÍTULO 3: REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 NANOESTRUTURAS
Nos últimos anos, pesquisas em química e física têm focado em grande parte na síntese de nanopartículas de semicondutores, metálicas e/ou magnéticas, tais como: nanofios, pontos quânticos (quantum dots), nanotubos e nanobastões.
As razões para isso são as novas propriedades que esses materiais apresentam por estarem em escala nanométrica, as quais geram novas aplicações em vários campos extremamente importantes, como, por exemplo, em catálise, revestimentos, têxteis, armazenamento de dados, biotecnologia e indústrias biomédicas e farmacêuticas (DRBOHLAVOVA et al., 2009).
A utilização de nanopartículas, com ênfase na química coloidal, aliada às técnicas microscópicas, eletroquímicas e espectroscópicas, tem gerado grande contribuição para a melhoria da visualização e caracterização de materiais biológicos nas últimas décadas. O uso de diferentes sondas nanoestruturadas (como, por exemplo, nanopartículas de metais e óxidos, nanotubos de carbono e nanoestruturas poliméricas) associadas a biomoléculas vem sendo utilizadas tanto em técnicas físico-químicas que auxiliam uma melhor compreensão de sistemas biológicos bem como em ferramentas terapêuticas. A síntese de novos marcadores fluorescentes, como os QDs, tem possibilitado o aumento da capacidade de visualização, manipulação, caracterização de sistemas biológicos e no desenvolvimento de aplicações médicas (CHAVES, 2006).
3.2 QUANTUM DOTS
Quantum dots, ou nanocristais de semicondutores, são uma nova classe de
marcadores fluorescentes de tamanhos nanométricos constituídos de poucas centenas a poucos milhares de átomos que exibem propriedades ópticas diferentes dos cristais macroscópicos do mesmo material, conhecidos como “bulks”. (MICHALET, 2008).
Eles são geralmente formados de materiais binários de átomos dos grupos II - VI, III - V ou IV - VI da tabela periódica e possuem propriedades ópticas diferenciadas dos materiais originais macroscópicos (devido aos efeitos de quantização dos estados eletrônicos que descrevem o material) as quais podem superar as apresentadas pelos corantes orgânicos convencionais (MEDINTZ, 2005; MICHALET, 2008). Controlando-se o tamanho dos quantum dots, pode-se conseguir a sintonização do comprimento de onda de emissão para um mesmo material. As partículas menores tendem a emitir em regiões próximas ao azul, enquanto que as maiores devem apresentar luminescência em regiões mais próximas ao vermelho chegando ao infravermelho (CHAVES, 2006; DRBOHLAVOVA, 2009).
A Figura 1 mostra dez diferentes emissões de cor do quantum dot CdSe/ZnS excitado com uma lâmpada próxima ao UV (Ultravioleta). Da esquerda para a direita, do azul ao vermelho, a emissão máxima é localizada em 443, 473, 481, 500, 518, 543, 565, 587, 610 e 655 nm.
Figura 1: Emissão de suspensões contendo nanocristais de CdSe/ZnS de diferentes diâmetros, excitadas com lâmpada na região do UV. (FORTINA, 2005)
A síntese das nanopartículas pode ser feita basicamente de duas formas:
“top-down” e “bottom-up”. No caso do “top-down”, se constrói um material
macroscópico e esse vai sendo desgastado, por um laser, até se chegar à estrutura e no tamanho desejado. Já no “bottom-up”, o material é construído juntando-se átomos e/ou moléculas através de reações químicas (SCHMID, 2004).
A síntese coloidal, um exemplo de síntese bottom up, ocorre por reações que permitem relativo controle da nucleação e crescimento dos nanocristais. O precursor é uma molécula, ou um complexo, que contem um ou mais átomos necessários para o crescimento do nanocristal que uma vez introduzidos na reação, se decompõem, dando forma a uma nova espécie reativa (os monômeros). Estes irão causar a nucleação e o crescimento dos nanocristais suspensos em meio líquido (CHAVES, 2004).
A síntese coloidal de QDs pode ser realizada em meio orgânico ou aquoso. A síntese em solvente orgânico envolve tipicamente três principais componentes: um ou vários precursores organometálicos, algum surfactante orgânico e um solvente, todos misturados juntos no mesmo recipiente (MICHALET, 2008). Neste caso o crescimento dos cristais é controlado pela reação a temperaturas altas (200 - 300oC). Recentemente QDs fluorescentes usados para imagem biológica tem sido obtidos através de reações químicas de precursores inorgânicos a temperaturas relativamente baixas (80-90oC). De uma forma geral a síntese dos
QDs envolve duas etapas principais, a formação do núcleo (core) e a passivação,
que é a formação de uma casca de algumas monocamadas de átomos (conhecida por shell). A função desta nova camada é reduzir a quantidade de defeitos presentes na superfície dos nanocristais, que surgem a partir de ligações não compartilhadas. A nova camada balanceia o equilíbrio iônico destas ligações aumentando a eficiência da emissão original do cristal através da formação de uma camada fina de um novo semicondutor com melhor fluorescência. A formação da casca pode ser induzida pela deposição de outro composto numa etapa posterior á formação do core ou pela reação de hidrólise dos agentes estabilizantes a base de tióis, os quais acabam sendo incorporados na estrutura
externa das partículas. Esta deposição de certa forma ocorre de forma não controlada e contínua.
A ligação com sistemas biológicos se dá através da funcionalização dos nanocristais, uma etapa na qual pequenas moléculas orgânicas, capazes de formar interações químicas com a superfície dos quantum dots, introduzem novos grupos funcionais a estes para que possam se complexar com diferentes componentes biológicos (CHAVES, 2006). A Figura 2 mostra o esquema de um
quantum dot passivado e funcionalizado, pronto para a bioconjugação.
Figura 2: Esquema de um quantum dot (QD) passivado (camada cinza) e funcionalizada com Glutaraldeído.
3.2.1 Aplicações Biológicas
Os QDs são nanopartículas com notáveis propriedades ópticas com aplicações in vivo, in vitro e in situ (CHAN, 2002; SUKHANOVA & NABIEV, 2008).
Quando conjugados à biomoléculas específicas QDs tem sido utilizados em hibridização de DNA, imunoensaios e imagens fluorescentes de cortes histológicos com tempo limitado. Podemos dividir suas aplicações em dois principais grupos, a saber: biosensores e marcadores para imagens biológicas (DRBOHLAVOVA, 2008).
Diferentes cristais apresentando diferentes cores de emissão podem ser usados para imagens simultâneas em marcações internas e/ou de superfícies de células vivas. Além disso, com uma camada inerte recobrindo-os acredita-se que os nanocristais adquirem menor toxicidade em relação a alguns corantes orgânicos. Outra importante vantagem é a alta fotoestabilidade que permite o monitoramento em tempo real de caminhos/processos intracelulares por longos períodos, minutos ou até horas (CHAN, 2002). Segundo Chan & Nie (1998), a emissão do CdSe (t1/2= 960 s) é quase 100 vezes maior que a da rodamina 6G
(t1/2= 10 s). A Figura 3 mostra o efeito do fotoescurecimento em uma marcação de
fibroblastos com CdSe- estreptavidina e AlexaFluor 488 (CHAN, 1998).
Figura 3: Fotodegradação em função do tempo. Linha superior: antígenos nucleares marcados com CdSe 630 estreptavidina (vermelho) e microtúbulos marcados com Alexa Fluor 488 (verde), simultaneamente. Linha inferior: microtúbulos foram marcados com quantum dots 630-estreptavidina (vermelho), e antígenos nucleares foram corados com Alexa 488 (verde). O tempo de exposição é indicado em segundos (MEDINTZ, 2005).
Os quantum dots são altamente luminescentes (a intensidade de fluorescência de um único CdSe é de aproximadamente 20 moléculas de rodamina 6G) (CHAN, 1998) e apresentam larga faixa de comprimento de onda para excitação com picos de fluorescência simétricos e larguras relativamente estreitas (20 - 50 nm). A Figura 4 ilustra o exemplo comparativo entre os perfis de absorção e emissão do CdSe e da Rodamina 6G.
Figura 4: Comparação dos perfis de emissão e excitação entre a Rodamina 6G e CdSe (ua: unidades arbitrárias) (CHAN, 2002).
Eles possuem comprimento de fluorescência ajustável pelo tamanho da partícula. Sob circunstâncias ideais, estes nanocristais podem ter um elevado rendimento quântico, elevada absorbância e faixas estreitas de emissão podendo também fornecer diferentes emissões (mudando o tamanho dos nanocristais) usando um único comprimento de onda para excitação. O que significa que com diferentes composições químicas e diâmetros eles podem substituir todos os corantes orgânicos conhecidos utilizados nas suas atuais áreas de aplicação para detecção e diagnóstico médico (SUKHANOVA & NABIEV, 2008), como demonstrado na Figura 5. Teoricamente, com o uso de seis cores e dez níveis de intensidade, pode-se marcar um milhão de proteínas ou seqüências de ácidos nucléicos (CHAN, 2002).
Figura 5: Comparação entre diferentes quantum dots e fluoróforos utilizados em análises
(SUKHANOVA & NABIEV, 2008, adaptada)
Para que os QDs tenham especificidade por células e tecidos é necessário fazer a suas conjugações com biomoléculas que sejam capazes de reconhecer moléculas alvo nas células ou tecidos, como por exemplo, as imunoglobulinas. Uma boa conjugação é aquela onde o sistema resultante tem compatibilidade com os sistemas biológicos, como: pH fisiológico, baixa toxicidade, isotonicidade, hidrofilicidade e que as propriedades fluorescentes das sondas e das biomoléculas conjugadas sejam mantidas.
Os tipos de conjugações de QD com biomoléculas mais conhecidos são: (1) utilização de um agente de acoplamento, como por exemplo, o EDC, 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida; (2) ligação direta da superfície do QD com
proteínas que tenham grupamentos tiol ou resíduos de polihistidina; (3) utilizando o glutaraldeído formando bases de Schiff com a superfície do QD a qual contenha grupamento amina, e após redução do glutaraldeído forma-se uma amina secundária estável, e; (4) adsorção ou ligação não covalente (HERMANSON, 2008).
Especificamente para a conjugação de pontos quânticos funcionalizados com moléculas que possuam grupamento carboxilatos como o ácido mercaptopropiônico (AMP) ou o ácido mercaptosuccínico (AMS), pode-se utilizar os agentes de acoplamento o 1-etil-3-3-dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC) e o N-hidroxi-sulfo-sucinamida (sulfo-NHS) para ativar esse carboxilatos e possibilitar a formação de ligações amidas entre o QD e a proteína que se deseja conjugar. O sulfo-NHS por meio de formação de seu intermediário (éster), que apresenta maior estabilidade frente ao formado pelo EDC, ao interagir com uma amina primária oriunda da proteína, promove a formação da ligação amida pela conjugação. Isso ocorre via formação do intermediário reativo instável o-acilisouréia, produto de um carbono do grupamento ˗N=C= (carbodiimida) da molécula do EDC e o grupamento carboxilato dos QDs (HERMANSON, 2008). A Figura 6 ilustra a estrutura do AMP e AMS.
Figura 6: Estruturas químicas dos Ácidos mercaptopropiônico AMP (superior) e mercaptosuccínico AMS (inferior).
O glutaraldeído é uma molécula que contém dois grupamentos aldeídicos, sendo um em cada uma de suas extremidades, esse fato possibilita a ligação dessa molécula à porção amina das proteínas, formando bases de Schiff. Por possuir essa afinidade por aminas o glutaraldeído pode ser usado como agente funcionalizante inespecífico para qualquer tipo de proteínas ou como agente de
ligação entre os QDs e biomoléculas capazes de se ligar especificamente a certas estruturas biológicas, como os anticorpos. Para estas finalidades o glutaraldeído deve ser utilizado em concentrações menores que 0,1%, pois em concentrações maiores pode causar fixação de estruturas biológicas, bem como fazer ligações indesejáveis ou inativar biomoléculas (MENEZES, 2006).
Um outro mecanismo de conjugação que pode ser feito como anteriormente citado é a adsorção. Este é um termo utilizado para descrever o fenômeno no qual moléculas que estão presentes em um líquido ou gás, concentram-se espontaneamente sobre uma superfície sólida. O mecanismo de adsorção é baseado em atrações hidrofóbicas (Van der Waals do tipo London) ou por interação eletrostática, sendo, portanto, um método simples e flexível, largamente utilizado atualmente e será o método adotado nesta monografia. Na adsorção não há desnaturação do anticorpo como pode acontecer quando se usa o EDC, sendo esta um método economicamente satisfatório pois dispensa o uso de outras substâncias.
A adsorção de proteínas é um processo que tem um papel fundamental na área de biomateriais. Na verdade, superfícies de biomateriais em contato com o meio biológico, como sangue ou soro, são imediatamente revestidos por proteínas. A adsorção passiva tem sido estudada extensivamente para imobilização de imunoglobulinas em microplacas de poliestireno e em microesferas (HERMANSON, 2008).
Independentemente do tipo de conjugação utilizado, três fatores são crucias para o resultado final do conjugado: (1) o planejamento estratégico da conjugação; (2) a capacidade de controlar com precisão as proporções de
QD/proteína; (3) resultados homogêneos com orientação homogênea das
proteínas na superfície do QD. No entanto, quando um desses três fatores não é seguido criteriosamente podem ser produzidos conjugados de proteínas que não são funcionais (MEDINTZ, 2005)
É grande o número de trabalhos de marcação de diversos antígenos como proteínas e carboidratos, em vários imunoensaios (DRBOHLAVOVA, 2009). Kerman et al. (2007) estudou a aplicação dos quantum dots em imunoensaio tipo sanduíche para detecção de antígeno prostático específico total (TPSA), um
importante marcador tumoral (KERMAN, 2007). Yang et al. (2004) desenvolveu um imunoensaio para detecção de traços abaixo de 0,1 ng/mL de antígenos de Hepatite B com sucesso (YANG, 2004; SEYDACK, 2005). Já Goldman et al. (2004), desenvolveu vários trabalhos com anticorpos IgG para marcação de diversos antígenos como, por exemplo, toxina colérica e enterotoxina estafilocócica B (GOLDMAN, 2004; HUANG, 2005). A Figura 7 ilustra um exemplo de duas possíveis ligações dos quantum dots a anticorpos.
Figura 7: Bioconjugação de quantum dot (funcionalizado com terminações carboxílicas) a anticorpos mostrando dois tipos de ligação, covalente e sufidril-amina (GAO, 2005, adaptada).
Alguns passos para o uso de anticorpos conjugados a quantum dots são descritos por Zhang et al. (2003) onde a imunoreação ocorre no mesmo meio em que o antígeno está disperso. Inicialmente os anticorpos são ligados a partículas. Então esta suspensão é incubada com o meio contendo antígenos. Considerando que uma molécula de antígeno pode ligar-se a dois anticorpos (e, portanto, a nanocristais bioconjugados a eles), a imunoreação resulta, assim, em um processo de agregação. A detecção é tipicamente baseada nas mudanças das
propriedades ópticas, uma vez que duas ou mais partículas estão em íntima proximidade (ZHANG, 2003; SEYDACK, 2005).
No campo da hematologia, podemos citar alguns trabalhos publicados que descrevem o uso dos quantum dots CdSe/ZnS para marcação fixa de eritrócitos humanos (TOKUMASU, 2003), linfomas de células T (HOSHINO, 2004) e aplicações em citometria de fluxo (LIRA, 2010).
3.3 SISTEMA ABO
3.3.1 Grupos Sanguíneos
O mosaico fluido no qual constitui a membrana eritrocitária e os sistemas de grupos sanguíneos são testemunhos inequívocos da hereditariedade onde a diversidade expressa na membrana eritrocitária define a identidade biológica de cada indivíduo (MURADOR, 2007).
O significado biológico da grande variedade de antígenos eritrocitários ainda é pouco compreendido. E é possível que vários destes antígenos devem ter proporcionado uma vantagem seletiva no passado para terem alcançado uma freqüência maior que 1% na população humana. Algumas das funções atribuídas a esses antígenos na superfície das hemácias incluem: transporte de membrana, adesão celular, atividade enzimática e participação na eritropoiese (DANIELS, 2001).
A maioria dos antígenos eritrocitários corresponde a moléculas de carboidratos associadas a proteínas da membrana plasmática, formando as glicoproteínas, ou a moléculas de fosfolipídios da membrana, que forma os glicolipídios (SAMPEDRO, 1998). A Figura 8 mostra um esquema de membrana eritrocitária na qual estão representados alguns antígenos de grupos sangüíneos.
Figura 8 - Modelo da membrana eritrocitária que carrega os grupos sangüíneos. (HOSOI, 2008, adaptada)
De acordo com International Society of Blood Transfusion (ISBT), existem 308 antígenos reconhecidos, dos quais 270 estão descritos em 30 sistemas de grupos sanguíneos (DANIELS, 2001). O conhecimento destes tem contribuído para o entendimento de alguns dos mecanismos básicos da herança genética e a mais de um século de sua descoberta continua sendo de grande interesse prático e conceitual (DEL PEON-HIDALGO, 2002).
3.3.2 Sistema ABO
Em 1900 o cientista austríaco Karl Landsteiner encontrou, através de diferenças sorológicas no sangue de diferentes pacientes, três diferentes tipos sangüíneos (A, B, e O) (LANDSTEINER, 1900). Dois anos depois, em 1902, von DeCastello e Stürli, seus colaboradores, descobriram um quarto tipo, o AB (VON DECASTELLO & STÜRLI, 1902). Estava formado assim o primeiro grupo sanguíneo da história.
O sistema de grupo sangüíneo ABO é até hoje considerado o mais importante sistema de grupo sangüíneos na medicina clínica transfusional e é caracterizado pela expressão de dois antígenos carboidratos (A e B) expressados na membrana das hemácias. Não estando restritos apenas à membrana dos eritrócitos, podendo ser encontrados também em uma grande variedade de células como linfócitos, plaquetas, endotélio capilar venoso e arterial, células sinusoidais do baço, medula óssea, mucosa gástrica, além de secreções e outros fluidos como saliva, urina e leite (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003). Possui também dois anticorpos plasmáticos (anti-A e anti-B) que aparecem após o nascimento (MATTOS & MOREIRA, 2004; HOSOI, 2008).
Indivíduos que não apresentam um antígeno particular de grupo sangüíneo podem produzir anticorpos naturais contra aquele antígeno ausente. Quando os eritrócitos do indivíduo possuem antígeno A e/ou B, os anticorpos correspondentes, anti-A e/ou anti-B, estão ausentes no soro. Por outro lado, se o indivíduo carece de antígenos A e/ou B, o plasma contém o anticorpo contra ambos os antígenos ausentes. Por conseguinte, o indivíduo do tipo A terá anticorpos anti-B no soro; o indivíduo do tipo B terá anticorpos anti-A no soro; o indivíduo do tipo O terá isoanticorpos anti-A e anti-B no soro e, o indivíduo AB não apresentará isoanticorpos no soro (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003; HOSOI, 2008).
As imunoglobulinas anti-A e anti-B podem ser IgM, IgG ou IgA e alguns soros podem conter as três classes. Indivíduos não imunizados possuem, predominantemente IgM, embora, IgG e IgA também possam estar presentes. Estes anticorpos não estão presentes em recém nascidos, mas aparecem no primeiro ano de vida. Os anticorpos detectados no soro de neonatos são usualmente IgG de origem materna, porém podem ocasionalmente ser IgM produzidas pelo feto. Geralmente, aglutininas são detectadas primeiro aos três meses de idade e continuam aumentando em título até alcançar níveis adultos entre 5 e 10 anos (DANIELS, 2001).
Ainda não está totalmente esclarecida a razão pela qual o organismo é estimulado a produzir anticorpos contra os antígenos A ou B ausentes, todavia, aparentemente existem antígenos semelhantes às estruturas ABO na natureza
que de algum modo produzem sensibilização natural. A hipótese mais disseminada é a de uma reação cruzada com epítopos de antígenos expressos em bactérias, vírus, plantas e até mesmo em alimentos que possuem estrutura similar a dos antígenos A e B levando a produção destes anticorpos (DANIELS, 2001; HOLSOI, 2008).
Esse perfil que o sistema ABO apresenta quanto a distribuição de antígenos e presença de anticorpos naturais circulantes contra o antígeno ausente gera um grande obstáculo para a transfusão sangüínea podendo resultar em respostas imunológicas expressivas entre os anticorpos preexistentes que se ligam às células transfundidas, ou os anticorpos do sangue transfundido se ligam às células do paciente (WITTIG, 2006).
Estas reações podem provocar: hemólise imediata, mediada pelo sistema complemento; fagocitose extensiva das hemácias revestidas por anticorpos e complemento; liberação exacerbada de hemoglobina que pode chegar a níveis tóxicos para células renais; febre alta; choque; coagulação intravascular disseminada, etc. (LUDWIG & ZILLY, 2007).
3.3.3 Estrutura e Biossíntese do Sistema ABO
Os alelos responsáveis por esses antígenos não os codificam diretamente, pois são carboidratos, e não proteínas. Eles codificam enzimas chamadas glicosiltransferases, que adicionam moléculas de carboidrato às moléculas de proteína ou de lipídio presentes na membrana celular da hemácia anticorpos (DANIELS, 2001). No caso do sistema ABO elas são responsáveis pela transferência de resíduos específicos de açúcar. Estas enzimas catalisam as reações de transglicolização entre o substrato aceptor e o açúcar receptor (BATISSOCO & NOVARETTI, 2003).
A transferase A, a α1→3-N-acetilgalactosamina transferase, e a transferase B, a α1→3-N-galactosil transferase, têm estruturas similares, sendo que sua especificidade será determinada pelos aminoácidos localizados próximos ao sítio de ligação da enzima com seu respectivo açúcar resultando na adição dos resíduos de N-acetilgalactosamina (GalNAc), transferase A, e Galactose (Gal), transferase B, na ligação α1→3 da galactose terminal do antígeno H. O grupo sangüíneo AB apresenta a atividade das duas transferases (A e B), enquanto o grupo O não possui as transferases A e B, mas apresenta o antígeno H em grande quantidade na superfície das hemácias tipo O pela ação da transferase H.
O primeiro passo para síntese dos antígenos ABO é a adição da L-fucose na ligação α1→2 no terminal galactose (Gal) de um precursor comum ligado a lipídeos ou proteínas pela α1,2-fucosiltransferase (H transferase), resultando no antígeno H ou O. Seis diferentes tipos de precursores são conhecidos, sendo o Tipo 1 (Galβ1→3GlcNAcβ-R) e o Tipo 2 (Galβ1→4GlcNAcβ-R) as estruturas mais freqüentes. O Tipo 1 é a substância em secreções e tecidos e o Tipo 2 é o antígeno da superfície da hemácias. Os antígenos A, B, O (H) na superfície dos eritrócitos são definidos por carboidratos determinantes, GalNAcα1→(Fucα1→2)3Galβ1→ 4GlcNAcβ-R, Galα1→(Fucα1→ 2)3Galβ1→4GlcNAcβ-R e (Fucα1→ 2)Galβ1→ 4GlcNAcβ-R, respectivamente, os quais são sintetizados a partir da estrutura do antígeno H pela ação das glicosiltransferases específicas produtos dos genes ABO (PORETZ, 1972; SHACHTER, 1973; HAKOMORI, 1984).
A Figura 9 esquematiza a biossíntese dos antígenos ABO a partir do precursor tipo 2 que está na superfície dos eritrócitos.
Figura 9: Síntese dos antígenos ABO. (HOSOI, 2008, adaptada)
3.4 CITOMETRIA DE FLUXO
3.4.1 Fundamentos
A citometria de fluxo é um recurso emergente na medicina que permite uma rápida análise qualitativa e quantitativa de células em suspensão (NAKAGE,
2005). Por meio desta técnica, propriedades físicas e biológicas de uma célula podem ser estudadas. População e subpopulações celulares em uma amostra podem ser determinadas pelo número e tipo de antígeno da membrana celular, citoplasma ou mesmo do núcleo, propiciando a sua quantificação e classificação imunológica (imunofenótipo) (GUILHERME, 2008). Ela também possibilita a análise multiparamétrica, fornecendo informações adicionais tais como análise simultânea de dois ou mais antígenos, e informações morfológicas (CAVALCANTI JÚNIOR, 2004).
O citômetro de fluxo é o aparelho utilizado para avaliação da emissão de fluorescência das células (FACS – “Fluorescence Activated Cell Sorter”) podendo alguns aparelhos serem capazes de separar fisicamente as células, de acordo com as características citométricas estabelecidas.
Sua estrutura é composta basicamete de três diferentes sistemas físicos complementares:
1. de fluxo: onde com o auxílio de um líquido isotônico as células são transportadas, uma a uma, na câmara de fluxo ou “flow cell” para que sejam posicionadas no centro de um feixe de laser;
2. óptico: que consiste em um feixe de laser que ao interagir com a célula sofre espalhamento e pode gerar fluorescência, que é captada por um conjunto de filtros ópticos que separam estas pelos seus comprimentos de onda para detecção;
3. eletrônico: responsável pela conversão dos sinais de luz detectados em sinais eletrônicos que são processados e analisados por sistema computacional.
A Figura 10 mostra uma representação de um citômetro FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) para leitura de cinco parâmetros.
Figura 10: Configuração de filtros e espelhos para compor 5 parâmetros específicos: FSC, SSC e fluorescências verde, laranja e infravermelho (> 650nm) (BD Bioscience, 2000, adaptada).
A suspensão é introduzida por aspiração no citômetro, e conduzida através de um fluxo de líquido isotônico até a câmara de fluxo. Nesse compartimento, o laser incide sobre cada célula, sendo uma parte, bloqueada frontalmente ("Forward Scatter" ou FSC) e outra parte dispersada lateralmente ("Side Scatter" ou SSC). A fração FSC é relativa ao tamanho da célula e a SSC representa a complexidade intracitoplasmática, que nas células sangüíneas caracteriza a granulosidade interna (CAVALCANTI JÚNIOR, 2004). Correlacionando as medidas FSC e SSC é possível diferenciar grupos celulares em uma população de células heterogêneas. Na Figura 11 são representadas diferentes populações celulares onde o eixo X do gráfico representa a complexidade e granulosidade da célula (SSC) e o eixo Y representa o tamanho da célula (FSC).
Figura 11: Perfis de dot-plots de sangue total características das populações celulares nos parâmetros FSC x SSC e posterior separação em Gates para análise das populações
mais homogêneas separadamente.
(http://www.dpmdiagnostica.com.br/produtos_infinicyt.html, 2012)
Uma vez que uma célula ou partícula passa através da luz laser, os sinais de SSC, FSC e os sinais de fluorescência, são encaminhados para fotomultiplicadoras (detectores) através de um sistema de espelhos e filtros ópticos. A detecção da fluorescência de um corante particular é otimizada através da presença de um filtro na frente da fotomultiplicadora, o qual permite que apenas uma faixa estreita de comprimento de onda atinja o detector. Esta faixa espectral de luz está perto do pico máximo de emissão do corante fluorescente. Esses filtros são chamados bandpass (passa banda). Por exemplo, o filtro utilizado para o FITC (Isotiocianato de Fluoresceína) é rotulado 530/30. Este número dá as características da banda espectral transmitida: 530 ± 15 nm. Outros filtros utilizados no citômetro de fluxo são tipo shortpass (filtros que transmitem comprimentos de onda da luz igual ou inferior a um determinado comprimento de
onda), e o filtro tipo longpass, (o qual transmitem comprimentos de onda igual ou superior a um determinado comprimento de onda) (BD Biosciences, 2000).
A incidência do laser sobre fluoróforos causará a emissão de luz de diferentes comprimentos de onda (por exemplo: FITC - verde; Ficoeritrina - laranja) que será captada pelos detectores/filtros (FL1, FL2), cujo número e quantidade será dependente de cada aparelho (CAVALCANTI JUNIOR, 2004), gerando o gráfico de resultados do tipo histogramas ou dot plot (Figura 11). Caso as células expressem o antígeno em estudo, elas serão detectadas pelo citômetro através da fluorescência emitida pelo marcador ligado ao anticorpo.
No caso da expressão de mais que um antígeno de interesse, pode-se efetuar marcação múltipla e as células mostrarão diferentes combinações de anticorpos - fluoróforos, dando o perfil multiparamétrico que a técnica possui, ou seja, várias avaliações podem ser feitas ao mesmo tempo.
A imunofenotipagem consiste na identificação de populações de células distintas com diferentes antígenos marcados com anticorpos fluorescentes específicos (ROITT, 1999). Caso as células expressem o antígeno em estudo, ela será detectada pelo citômetro, pois estarão marcadas com um anticorpo conjugado a um fluorocromo. No caso das mesmas expressarem outros antígenos para os quais se inclui a incubação com diferentes anticorpos específicos, as células mostrarão diferentes combinações de anticorpos-fluoróforos.
A Figura 12 mostra um exemplo de gráfico gerado para análise de fluorescência.
Figura 12: Exemplo de gráfico de citometria de fluxo mostrando em seus quatro quadrantes a positividade e negatividade de marcação para dois antígenos celulares numa população celular sendo analizados por fluoróforo detectados nos filtros FL1 e FL2 (verde e laranja, respectivamente).
3.4.2 Aplicações em Eritrócitos
Segundo Weiss (2002) a análise dos eritrócitos pode ser realizada usando sangue total com anticoagulante ou com hemácias isoladas da camada eritrocitária após a centrifugação. As aplicações da citometria de fluxo na avaliação dos eritrócitos geralmente consiste na quantificação de reticulócitos, pesquisa de eritroparasitas e detecção de anticorpos anti-eritrocitários (WEISS, 2000; NAKAGE, 2005). Além de detecção e quantificação de pequenas populações de eritrócitos com alterações genéticas, de hemácias transfundidas e de hemácias fetais em sangue materno (GARRATTY & ARNDT, 1999) e também registros de trabalhos com imunofenotipagem do sitema ABO.
Farias e col. (2005) mostraram um novo capítulo nesse campo da imunohematologia, bioconjugando QDs a anticorpos anti-A na marcação de eritrócitos humanos e sua avaliação por microscopia de fluorescência Figura 13. Outro trabalho utilizando QDs em células sanguíneas humanas foi o realizado por Lira e cols. (2010) no qual análises por citometria de fluxo foram realizadas.
Figura 13: Esquematização da bioconjugação QDs-anti-A e sua ligação aos antígenos eritrocitários (1) e imagens de microscopia de fluorescência de hemácias (2).
CAPÍTULO 4: METODOLOGIA EXPERIMENTAL
4.1 QUANTUM DOTS DO TIPO CdS/Cd(OH)2
4.1.1 Síntese e Passivação
A síntese do CdS seguida da sua passivação com Cd(OH)2 foi realizada
segundo metodologia Weller e colaboradores (FOJTIK, 1984). A funcionalização com Glutaraldeído (Glut) seguiu o trabalho de Menezes (2006).
O primeiro passo é a preparação das nanopartículas de sulfeto de cádmio (CdS). Em um balão contendo água deionizada (95,5 mL) são adicionados estabilizante polifosfato de sódio [(NaPO3)]n 0,0051 g/mL (com n igual à 9) (2,0
mL) e uma solução 0,01 molL-1 perclorato de cádmio Cd(ClO4)2 (2,5 mL)
preparado a partir de óxido de cádmio (CdO) (0,642 g) e ácido perclórico (HClO4)
(1,44 mL), também com água deionizada, e sob agitação. Para 0,005 mols de CdO, foi utilizado 0,01 mol de HClO4.
Em seguida, o pH da solução é elevado com NaOH até o valor de 8,5; (valor necessário para uma luminescência no comprimento de onda de 500nm após passivação). O balão é vedado com um septum de borracha.
Com auxílio de uma seringa é adicionado à solução gás sulfídrico H2S (750
μl). A solução resultante é agitada continuamente durante 10 min, na qual após este tempo observamos a mudança da coloração de incolor para amarelo. Através desta observação, verificamos a formação das nanopartículas de sulfeto de cádmio. A solução é mantida à temperatura de aproximadamente 10o C até a passivação realizada aproximadamente após 24 h de preparação das nanopartículas de sulfeto de cádmio.
Para esta etapa o pH da suspensão é novamente ajustado com solução de NaOH, elevando-o para 10,5. Em seguida, é adicionado lentamente perclorato de
cádmio Cd(ClO4)2 à 0,01 molL-1 (6 mL), sob agitação constante. A adição lenta do
Cd(ClO4)2 evita a formação de grandes aglomerados de hidróxido de cádmio.
O esquema geral da síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 está
demonstrado na Figura 14.
Figura 14: Esquema de síntese e passivação do CdS/Cd(OH)2 (1) (CHAVES, 2006, adaptada); Aspecto final da suspensão (2) e a mesma sob UV (3).
4.1.2 Funcionalização
Finda a etapa de passivação, segue-se a funcionalização do CdS/Cd(OH)2,
neste caso com Glutaraldeído (Glut), um agente bidentado utilizado para fixação de células em microscopia, mas quando utilizado em pequenas quantidades, pode ter outra função como a interação com as nanopartículas de CdS e dar a estas a possibilidade de ligação a materiais biológicos (SALES-NETO, 2009).
A funcionalização dos nanocristais foi realizada usando-se Glut a 0,01% do volume de suspensão de QD, deixando-os por 2 horas ao abrigo da luz antes da bioconjugação. O pH foi corrigido para um valor próximo ao fisiológico usando-se
NaOH e HCl (pH ~ 8.0), e após esta etapa, 14 mL de suspensão de QDs foram funcionalizados utilizando-se 1,4 mL de Glut a 0,01%.
4.1.3 Bioconjugação
A partir da etapa de funcionalização, os QDs funcionalizados com Glut foram incubados em duas proporções com anticorpos anti-A sendo elas: 100:1 e 20:1 QD-anti-A (v/v). Os sistemas ficaram overnight (tempo de 24 h) a temperatura ambiente para a formação do bioconjugado CdS/Cd(OH)2 - Glut -
anti-A.
4.1.4 Imunomarcação Simples com CdS/Cd(OH)2
O sangue utilizado foi coletado a partir de vasos periféricos em tubo de EDTA e posteriormente lavado, com PBS 1X ou solução salina (NaCl) a 0,9%, para serem obtidos hematócritos a 5% suspensos no mesmo fluido isotônico utilizado na lavagem. Os seguintes sistemas foram incubados na marcação sendo a concentração CdS/Cd(OH)2 - Glut - anti-A:células, de 3:1 (v/v):
1. Suspensão de hemácias tipo A com QDs não funcionalizados (controle negativo 1);
2. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut (controle negativo 2); 3. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 100:1;
4. Suspensão de hemácias tipo A com QDs-Glut-anti-A 20:1; 5. Suspensão de hemácias tipo O com QDs-Glut-anti-A 100:1.
Após a incubação, o material foi submetido à centrifugação (rpm: 1800; 145 g) por 30 s e após este procedimento, o sobrenadante foi desprezado sendo adicionado ao pellet de hemácias 500 µL por amostra teste.
4.2 QUANTUM DOTS DO TIPO CdTe - AMS e CdTe - AMP
4.2.1 Síntese e Funcionalização
QDs de CdTe em meio aquoso foram sintetizados a partir de uma
adaptação de metodologia publicada anteriormente Santos et. al, 2007 (SANTOS, 2007). A síntese é realizada usando-se dois balões nos quais segue-se o seguinte procedimento para síntese de 100 mL de QD:
1. Em um balão (1) adiciona-se 0,013 g de telúrio (Te0) (Sigma Aldrich), 100 µL de NaOH a 2 M (ou 100 µL a 1 M) e 0,144 g de Boridreto de Sódio (NaBH4) (Sigma Aldrich). Em atmosfera inerte, contendo
Nitrogênio (White Martins), necessária para a redução do Telúrio, a reação seguirá sob aquecimento em temperatura controlada de 70 - 80° C e sob agitação constante até a completa redução do telúrio. A coloração desta reação passará de grafite inicialmente, passando por um roxo vívido característico da espécie química Na-Te-Te-Na, até a incolor (Te2-) que indicará o fim da redução; A Figura 15 ilustra as etapas da redução do telúrio visivelmente notada através da variação de coloração da solução. A formação de Te2- (incolor) passa pelo intermediário Na-Te-Te-Na de coloração lilás.
Figura 15: Monitoramento visual das fases da redução do telúrio. A coloração violeta refere-se à presença da espécie Na-Te-Te-Na(aq).
2. Em um segundo balão (2), o precursor de cádmio (Cd2+), 20 mL de Cd(ClO4)2 (Sigma Aldrich) em solução aquosa de concentração 0,01 M
e o estabilizante escolhido, o ácido mercaptosuccínico (AMS) (Sigma Aldrich), 0,3603 g em 5 mL de H2O, ou ácido mercaptosuccínico (AMP)
(Sigma Aldrich), 1,2 mL (4,9% (m/v) a pH 2,5), são adicionados. O pH desta solução é ajustado para aproximadamente 10,5 sob a temperatura ambiente;
3. O conteúdo do balão 1 é transferido com o auxílio de uma seringa para o balão 2 e a reação prosseguirá sob agitação e refluxo com a temperatura controlada entre 80 - 90° C por 4 h no caso do uso de AMP como estabilizante e 8 h no caso do AMS. A Figura 16 mostra a solução precursora de cádmio e o momento da injeção do telúrio reduzido.
Figura 16: Solução precursora de cádmio (1) e a mesma após injeção de solução contendo íons Te2- (2).
Ao final do processo de síntese, as suspensões apresentaram-se límpidas e com colorações acastanhadas para o AMS e laranja para o AMP, indicativo da formação dos QD. A Figura 17 ilustra o aspecto da suspensão de QDs ao término da síntese.
Figura 17: Aspecto final da suspensão de CdTe - AMS (1); Suspensões de AMS (esquerda) e AMP (direita) (2) e as mesmas sob UV (3).
A proporção molar de síntese utilizada de Cd:Te:AMS e Cd:Te:AMP foram 2:1:2,4 e 2:1:5,7, respectivamente. A Tabela 1 descreve os volumes de cada componente da síntese de 100 mL de QD.
Tabela 1: Descrição dos componentes da síntese com seus respectivos valores para cada QD preparado. Volume/Massa de Estabilizante (g/mL) Volume de Cd(ClO4)2 (mL) Massa do Telúrio (g) Massa de NaBH4 (g) CdTe - AMS 0,3603 g (em 5 mL de H2O) 20,00 0,0130 0,1440 CdTe - AMP 1,2 mL a 4,9 % 20,00 0,0130 0,1440 4.2.2 Bioconjugação QDs - anticorpos
No caso deste QD, não há a etapa de funcionalização visto que os estabilizantes já cumprem também esta função. Ao final da síntese, o CdTe já está recoberto por AMS, ou AMP, que fará a ligação com a molécula alvo, neste caso, anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente.
O CdTe - AMS e CdTe - AMP foram bioconjugados com as biomoléculas, o anticorpo monoclonal anti-A e anti-B (Fresenius Kabi e Lorne), respectivamente, por adsorção (SHI, 2009). Foi realizado o ajuste do pH dos QDs para 8,0 e os anticorpos ficaram em contato com os QDs por 2 horas a 25 ºC e ao abrigo da luz. As proporções entre QD-AMS:anti-A e QD-AMP:anti-B foram de 50:1, 25:1 e 12,5:1 (v/v). A estabilidade dos bioconjugados também foi testada após 24 horas de preparados. A Figura 18 ilustra os bioconjugados citados.
Figura 18: Da esquerda para direita observa-se as proporções de bioconjugados 50:1, 25:1 e 12,5:1 (v/v) do AMP (amareladas) e as mesmas proporções de bioconjugados para o AMS ( esverdeadas).
4.2.3 Imunomarcação Simples com CdTe - AMS e CdTe - AMP
Dois hematócritos foram feitos a 5% e 1% com hemácias previamente lavadas e ressuspensas no mesmo fluido isotônico utilizado na lavagem.
Os bioconjugados foram colocados em contato com uma suspensão a 5% e 1% na proporção de bioconjugado:células de 3:1 (v/v) seguido de uma incubação a temperatura ambiente por 30 minutos. Após esse tempo, o material incubado foi submetido a uma lavagem com o tampão escolhido, sob centrifugação (rpm: 1800; g: 652) por 30 segundos.
O pellet foi ressuspenso com 300 µL no mesmo tampão utilizado na lavagem e posteriormente, foi analisado em um citômetro de fluxo FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) e as análises foram realizadas com aquisição de 10.000 eventos/células para os filtros FL1 (λ = 515 - 530 nm) emissão correspondente a cor verde do CdTe - AMP, e FL2 (λ = 560 - 580 nm) emissão correspondente ao alaranjado emitido pelo CdTe - AMS. Para fins de comparação, todos os experimentos foram realizados nestas condições.
O software utilizado para o tratamento dos dados foi o Cell Pro (Cell Quest
TM
Software, Becton Dickinson Immunocytometry System, San Jose, CA, USA).
4.2.3.1 Formalização (Fixação da Fluorescência)
A tentativa de formalização foi realizada colocando-se um pool de hemácias incubadas junto com 500 µL de PBS - Formol que consiste numa solução de PBS 1X a 1% de formol. Esta solução é utilizada na rotina laboratorial para fixação de fluorescência em amostras que não serão processadas na citometria em um breve espaço de tempo logo após a incubação.
No momento da leitura, a amostra é centrifugadas nas mesmas condições já citadas e o pellet formado é ressuspenso em 300 µL de PBS 1X ou salina 0,9%.
4.2.3.2 Imunomarcação Dupla com CdTe - AMS e CdTe - AMP
Os mesmos passos iniciais da marcação simples foram aplicados neste experimento, porém as proporções de bioconjugados diferiram.
Na primeira situação 150 µL de cada QDs, CdTe - AMS e CdTe - AMP, bioconjugados a anticorpos anti-A e anti-B, respectivamente, foram incubados com uma suspensão de eritrócitos a 1% ficando em uma proporção final de 3:1 bioconjugado:células (150 µL de CdTe - AMS - A + 150 µL CdTe - AMP - anti-B: 100 µL de células tipo AB).
Já na segunda, 300 µL de cada bioconjugado supracitado foi colocado para incubação com a suspensão de eritrócitos (300 µL de CdTe - AMS - anti-A + 300 µL CdTe - AMP - anti-B: 100 µL de células tipo AB).
Em resumo, duas proporções de bioconjugados foram aplicados nas hemácias sendo estes 1,5:1 e 3:1 (v/v), de cada sistema (CdTe - AMS - anti-A e CdTe - AMP - anti-B), para cada incubação.
