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NAICE ELEIDIANE SANTANA MONTEIRO
Efeito das proteínas do soro do leite bovino sobre alterações
metabólicas causadas por uma dieta hiperlipídica no
camundongo C57BL/6: disbiose intestinal, resposta inflamatória e
parâmetros associados
CAMPINAS 2015
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Engenharia de Alimentos
NAICE ELEIDIANE SANTANA MONTEIRO
Efeito das proteínas do soro do leite bovino sobre alterações
metabólicas causadas por uma dieta hiperlipídica no
camundongo C57BL/6: disbiose intestinal, resposta inflamatória e
parâmetros associados
Orientador: Profº. Dr. Jaime Amaya Farfan Co-orientador: Profª. Dra. Fernanda de Pace
CAMPINAS 2015
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Mestra em Alimentos e Nutrição na Área de Nutrição Experimental e aplicada à Tecnologia de Alimentos.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA NAICE ELEIDIANE SANTANA MONTEIRO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. JAIME AMAYA FARFAN
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BANCA EXAMINADORA
__________________________________ Profº. Dr. Jaime Amaya Farfan
Orientador
__________________________________ Profº. Dr. Mário Roberto Maróstica Júnior
Titular
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
______________________________ Profª Dra. Julia Laura Delbue Bernardi
Titular
Pontifícia Universidade Católica de Campinas (PUC CAMPINAS)
_______________________________ Profª Dra. Elisa de Almeida Jackix
Suplente
Universidade Metodista de Piracicaba (UNIMEP)
______________________________ Profº Dr. Wilton Marlindo Santana Nunes
Suplente
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“Se procurar bem você acaba encontrando.
Não a explicação (duvidosa) da vida,
Mas a poesia (inexplicável) da vida”.
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DEDICATÓRIA
A minha família, por ter permanecido ao meu lado, me incentivando a percorrer este caminho, por compartilhar todas as angústias e dúvidas, me apoiando incondicionalmente nos momentos mais difíceis.
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AGRADECIMENTOS
A Deus, por todos os dias da minha vida e por me dirigir a cada passo, iluminando constantemente meu caminho e me dando forças para seguir sempre em frente. À minha mãe Maria Aparecida e a meus avós Leontina e Américo, que tanto se esforçaram pela minha formação pessoal e profissional. Ao Nino, razão de muitos momentos de alegria e descontração.
Ao meu esposo, Raildo Monteiro, por tanto amor e dedicação e por ser um ouvinte atento de tantas dúvidas e inquietações, sempre me incentivando a prosseguir. Ao Profº Dr. Jaime Amaya Farfan pela orientação e oportunidade de realização deste trabalho.
À Profª. Dra. Fernanda de Pace pela co-orientação, sempre tão gentil e paciente. À Aline Rissetti Roquetto, companheira de trabalho nestes últimos dois anos. À Kelly Ferreira dos Santos pela amizade e acolhimento assim que cheguei ao Laboratório de Fontes Proteicas/DEPAN.
Agradecimento especial ao Profº Dr. Mário Saad e sua equipe do Laboratório de Investigação Clínica em Resistência à Insulina (Licri) da Faculdade de Ciências Médicas (FCM–UNICAMP), pela fundamental participação no desenvolvimento desta pesquisa.
Ao Profº Áureo Yamada e à Técnica Stephanie Federighi do Departamento de Histologia e Embriologia/ IB – UNICAMP, por toda ajuda prestada na parte histológica.
A Susana Correa, pelo auxílio no Laboratório de Ensaios Biológicos e a Carla Greghi, Carolina Moura e Eder Muller pela colaboração nas análises desenvolvidas no Laboratório de Fontes Proteicas DEPAN – FEA/UNICAMP.
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Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos, ao Departamento de Alimentos e Nutrição e à Faculdade de Engenharia de Alimentos por viabilizarem a execução do projeto.
À Hilmar Ingredients (EUA) pela doação dos produtos do soro de leite, através da Doremus do Brasil, SP.
Agradeço a todos os membros da banca examinadora por aceitarem o convite e pelas valiosas contribuições
Meu reconhecimento sincero a tantos outros que despretensiosamente colaboraram na execução deste estudo.
i SUMÁRIO Resumo...v Abstract...vii 1. Introdução Geral...1 Referências...4
CAPÍTULO 1: Revisão de Literatura...6
1. Obesidade...7
1.1 Aspectos epidemiológicos da obesidade...8
1.2 Inflamação crônica induzida pela obesidade...11
1.3 A microbiota intestinal em indivíduos saudáveis...17
1.4 A microbiota intestinal em indivíduos doentes...19
1.5 Tecido hepático, microbiota intestinal e NAFLD...21
1.6 Relação entre obesidade, microbiota e inflamação...25
1.7 Tipificação da microbiota...28
1.8 Proteínas do soro do leite...29
Referências...35
CAPÍTULO 2: Proteínas do soro do leite mitigam a deposição excessiva de gordura epididimal, sem alterar a composição corporal de camundongos C57BL/6 alimentados com dieta hiperlipídica...47
Resumo...48 Abstract...49 1. Introdução...50 2. Objetivo...51 3. Material e métodos...51 3.1 Ensaio biológico...51
ii
3.3 Ingestão dietética e ganho ponderal dos animais...53
3.4 Preparo das carcaças dos animais...54
3.4.1 Determinação da composição centesimal das carcaças...54
3.5 Análise estatística...54
4. Resultados...55
4.1 Parâmetros antropométricos...55
4.2 Composição centesimal das carcaças...57
5. Discussão...57
6. Conclusão...60
Agradecimentos...60
Referências...61
CHAPTER 3: Whey protein, but not casein, avert cecal dysbiosis, lipopolysaccharide formation and inflammation marker expression in mice fat-rich diet...63
Abstract...64
1. Introduction...66
2. Materials and methods ...67
2.1 Animals and experimental protocol...67
2.2 Experimental diets...67
2.3 Blood for biochemical analysis and LPS determination...69
2.4 Biomarkers of the inflammatory process...69
2.4.1 Tissue extraction and protein quantification...69
2.4.2 Western Blotting...70
2.5 Determination of serum concentrations of LPS...71
2.6 Sequencing the intestinal microbiota...72
iii 2.8 Statistical analysis...73 3. Results...73 3.1 Biochemical parameters...73 3.2 Inflammatory profile...74 3.3 Endotoxemia...77 3.4 Intestinal Microbiota...77 3.5 Histopathologic profile...83 4. Discussion...84 5. Conclusion...92 Abbreviations………..…92 Competing interests………..………...…93 Author’s Contributions………..……….93 Acknowledgements...93 References...94 Conclusão geral...97 ANEXO...98
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RESUMO GERAL
Caracterizada como um dos mais importantes problemas que a saúde pública enfrenta atualmente no Brasil e no mundo, a obesidade está associada a um quadro de inflamação subclínica, que predispõe à resistência à insulina e ao desenvolvimento de diabetes mellitus, além de representar fator etiológico para diversas outras doenças crônicas não transmissíveis. Sabendo da importância que os alimentos com propriedades bioativas podem ter no tratamento da obesidade é que a utilização das proteínas do soro do leite na dieta vem sendo alvo de diversos estudos, devido aos benefícios que podem trazer à saúde humana. Dentre as propriedades da whey protein, citam-se a capacidade de regular a função imune, atuar como agente antimicrobiano, estimular a síntese de proteína muscular, suprimir o apetite e atuar na redução da gordura corporal, além das propriedades de aumentar a expressão gênica de proteínas anti-estresse (HSPs) e de ativar o transportador de glicose GLUT4, ambas descobertas pelo nosso grupo da FEA. O presente estudo teve como objetivo investigar o impacto que as proteínas do soro do leite, seja na sua forma íntegra ou na forma hidrolisada, podem exercer sobre a homeostase e a proteção do organismo de camundongos, contra os danos causados por uma dieta hiperlipídica. Para alcançar este objetivo, 34 camundongos C57BL/6 recém-desmamados foram divididos em quatro grupos de forma aleatória e alimentados com as seguintes dietas: grupo controle normolipídico (AIN93-G), grupo controle hiperlipídico (HFCAS), grupo hiperlipídico com substituição da caseína pela proteína do soro de leite concentrada (HFWPC), e grupo hiperlipídico, com adição da proteína do soro do leite hidrolisada (HFWPH), por 9 semanas. Os camundongos foram acompanhados quanto ao consumo alimentar e ganho de peso por meio de avaliação poderal em dias alternados, parâmetros bioquímicos e de endotoxemia avaliados por técnicas convencionais, biomarcadores inflamatórios analisados por western blot, além da avaliação do perfil histopatológico do fígado e do estudo metagenômico da microbiota intestinal. Os resultados demonstraram que alimentação com a formulação contendo whey protein, em ambas as formas, por 9 semanas, não diminuiu ganho de peso em comparação aos demais tratamentos, mas foi efetiva
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em reverter a disbiose causada pela dieta gordurosa, reduzir o processo inflamatório para níveis indistinguíveis do controle, em atenuar a infiltração gordurosa no tecido hepático, além de modular a microbiota intestinal. A caseína não mostrou tais propriedades.
Palavras chave: obesidade, proteínas do soro do leite, inflamação, microbiota
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ABSTRACT
Recognized as one of the most important issues currently facing public health in Brazil and in the world, obesity is associated to a subclinical inflammation framework, which predisposes to insulin resistance and the development of diabetes mellitus, in addition to representing an etiological factor for several other chronic diseases. Owing to the bioactive properties that the milk whey proteins may have on human health, such as the ability to regulate immune function, act as an antimicrobial agent, stimulate protein synthesis, suppress appetite thus helping to reduce body fat, besides the two newly discovered functions from our laboratory regarding the up-regulation of protective HSPs and activation of the glucose transporter 4 (GLUT4), it is thought that these proteins may also have anti-inflammatory action and, therefore, this study was designed to investigate the impact that whey protein, either in its normal form or in the hydrolyzed form, may exert on homeostasis protecting the mouse from the adverse effects of a high-fat diet. To accomplish this, 34 C57BL/6 male mice were randomly divided into four groups that received the following diets for 9 weeks: Normolipidic control (AIN93-G), Hyperlipidic control (HFCAS), Hyperlipidic with whey protein concentrate instead of casein (HFWPC) and a Hyperlipidic group with hydrolyzed whey protein (HFWPH) as the only source of protein. Diet intake and weight gain were monitored and recorded every other day. Biochemical parameters and endotoxemia were evaluated using commercial kits, and inflammatory biomarkers were analyzed by western blotting, besides the evaluation of histopathological liver profile and metagenomic study of the intestinal microbiota. The results showed that feeding the formulation contendowheyprotein, in both its forms, for 9 weeks, not decreased weight gain compared to the other treatments, but was effective in reversing dysbiosis caused by high-fat diet, reduce inflammation to levels indistinguishable control and mitigate the fatty infiltration of the casein , in addition to modulate the gut microbiota. Casein did not show such properties.
Keywords: obesity, whey protein, inflammation, gut microbiota, high fat diet,
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1. Introdução Geral
A prevalência da obesidade tem tomado proporções epidêmicas no Brasil e no mundo. Um levantamento realizado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que cerca de 500 milhões de adultos e 43 milhões de crianças com até 5 anos de idade já possuam sobrepeso ou obesidade (WHO, 2012).
Atualmente a obesidade é entendida como um processo inflamatório, onde há aumentada produção de citocinas pró-inflamatórias. Tais substâncias são deletérias à ação da insulina no músculo, em demais tecidos periféricos como fígado e tecido adiposo, além de ter importante atuação nas funções centrais do hipotálamo, diminuindo a capacidade desta glândula de controlar a ingestão alimentar e regular o gasto energético, tendendo sempre ao balanço positivo (CINTRA, ROPELLE, MORAES, PAULI, 2011).
Em animais alimentados com dieta hiperlipídica foi demonstrado que, nas primeiras 24 horas de dieta, ocorre produção exacerbada de marcadores inflamatórios, a qual se mantém elevada durante os primeiros 3 dias, mas é seguida de uma normalização transitória, que pode durar de 2 a 3 semanas, para depois subir novamente aos níveis iniciais. Esse padrão temporal equipara-se ao que é visto no consumo alimentar quando há mudança de uma dieta normolipídica para uma hiperlipídica (THALER et al., 2013). Estudos atuais também demonstram importante correlação entre microbiota e o estado inflamatório na obesidade, devido à endotoxemia metabólica que lipopolissacarídeos bacterianos causam ao ativar o sistema imune (CANI; DELZENNE, 2010; CANI et al., 2012; KIM et al., 2012; LEE; LEE; CHOUE, 2013; MCALLAN et al., 2013).
Visando à modulação do estresse oxidativo, da inflamação e da disbiose intestinal propõe-se a hipótese de que a ingestão de alimentos protéicos geradores de peptídeos bioativos, como as proteínas do soro do leite, se traduza em potenciais benefícios para a saúde como: o controle glicêmico, o controle do ganho de peso e a diminuição do processo inflamatório, que são
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passos iniciais contra o desenvolvimento de doenças crônicas transmissíveis e não transmissíveis.
Considerando as propriedades que as proteínas do soro lácteo hidrolisadas têm demonstrado em proteger vários tecidos no rato contra os efeitos danosos do estresse, aumentando a expressão de HSPs, e colocando em funcionamento a via alternativa do transportador GLUT-4 para aumentar a captação da glicose circulante, propõe-se as seguintes hipóteses:
Hipótese 1. A microbiota intestinal, de forma coerente com os
efeitos protetores apontados acima, possa também ser modulada de forma positiva em função da dieta, resultando na possível remediação da inflamação subclínica.
Hipótese 2. O consumo da proteína do soro do leite hidrolisada
possa reverter ou neutralizar o descontrole do peso corpóreo que resulta do consumo de uma dieta obesogênica. De ser esse o caso, seria possível observar um grau de saciedade normal, com aumento da sensibilidade à leptina e a insulina, com a consequente melhora da inflamação.
A literatura fornece subsídios da existência de uma importante correlação entre microbiota intestinal e o estado inflamatório que ocorre na obesidade e, um estudo propondo a utilização das propriedades protetoras das proteínas hidrolisadas do soro de leite estaria substanciado ainda no mesmo princípio de que a dieta tem influência direta sobre a microbiota intestinal. Do ponto de vista prático, a busca e o desenvolvimento de intervenções alimentares que contribuam para a regularização da homeostase entre hospedeiro e microbiota, seria suficiente justificativa para empreender um estudo nesse sentido.
O trabalho teve como objetivo geral relacionar o consumo de caseína e proteínas do soro do leite, nas formas concentrada e hidrolisada, à produção de citocinas pró-inflamatórias e alterações na microbiota intestinal de camundongos, verificando de forma mais específica a presença de lipopolissacarídeos e parâmetros bioquímicos no soro (glicose, proteínas totais, albumina, ácido úrico, triglicerídeos, colesterol total e colesterol-HDL), a
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presença de esteatose hepática por meio de técnica histológica, a dosagem das proteínas TNF (fator de necrose tumoral alfa), IL4 (interleucina quatro), IL6 (interleucina seis), IL8 (interleucina oito), IL10 (interleucina dez), IL1Ra (antagonista do receptor da interleucina 1), IL1β (Interleucina 1 Beta), TLR4 (toll-like receptor 4), MyD88 (proteína adaptadora do fator de diferenciação mielóide 88), todas em músculo gastrocnêmio pela técnica de western blot e a caracterização da composição da microbiota intestinal por sequenciamento do RNAr 16S.
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Referências
CANI, P. D.; DELZENNE, N. M. Involvement of the gut microbiota in the development of low grade inflammation associated with obesity: focus on this neglected partner. Acta Gastroenterol Belg. v.73 n.2, p.267-9, 2010.
CANI, P. D.; OSTO, M.; GEURTS, L.; EVERARD, A. Involvement of gut microbiota in the development of low-grade inflammation and type 2 diabetes associated with obesity. Gut Microbes. v.3, n.4,p.279-88, 2012.
CINTRA, D. E.; ROPELLE, E. R.; MORAES, J. C.; PAULI, J. R. Obesidade e Diabetes – Fisiopatologia e sinalização celular. São Paulo: Editora Sarvier, 2011, 424p.
KIM, K-A.; GU, W.; LEE, I-A; JOH, E-H.; KIM, D-H. High Fat Diet-Induced Gut Microbiota Exacerbates Inflammation and Obesity in Mice via the TLR4
Signaling Pathway. PLoS One, v.7, n.10, 2012.
LEE,H.; LEE, I. S.; CHOUE, R. Obesity, Inflammation and Diet. Pediatr. Gastroenterol Hepatol Nutr., v.16, n. 3, p.143-152, 2013.
MCALLAN, L.; KEANE, D.; SCHELLEKENS, H.; ROCHE, H. M.; KORPELA, R.; CRYAN, J. F.; NILAWEERA, K. N. Whey protein isolate counteracts the effects of a high-fat diet on energy intake and hypothalamic and adipose tissue
expression of energy balance-related genes. Br. J. Nutr. v.110, n.11,p. 2114-26, 2013.
THALER, J. P.; STEPHAN, J. G.; DORFMAN, M.; WISSE, B. E.; SCHWARTZ, M. W. Hypothalamic inflammation: Marker or mechanism of obesity
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WORD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Obesity and Overweight. Geneva, Switzerland, 2012. Disponível em: <http://www.who.int/nutrition/challenges/en/ > acesso em 14 abr.2013.
6 CAPÍTULO 1
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1. Obesidade
Caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal, de forma a comprometer a saúde do indivíduo, a obesidade é consensualmente descrita como doença de caráter multifatorial, onde fatores históricos, políticos, socioeconômicos, culturais, psicossociais e biológicos estão agindo em conjunto, devendo, portanto, serem alvos independentes dos esforços de prevenção e intervenção. Em geral, os fatores mais estudados na etiologia da obesidade são os biológicos relacionados ao estilo de vida, como dieta e prática de atividade física (WANDERLEY; FERREIRA, 2010).
O Índice de massa corpórea (IMC) é uma das ferramentas mais utilizadas para predição de obesidade. Seu cálculo é realizado por meio da divisão do peso em quilos pelo quadrado da estatura em metros (kg/m2), sendo que a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS) delimita IMC igual ou superior a 25 kg/m2 como sobrepeso e IMC igual ou superior a 30 kg/m2 como obesidade. O IMC apesar de simples é um importante referencial na avaliação antropométrica do indivíduo, pois está positivamente correlacionado com a porcentagem de gordura corporal, hiperinsulinemia e produção de citocinas pró-inflamatórias (WHO, 2011).
A intensa transição demográfica, epidemiológica e nutricional que o Brasil vem experimentando nos últimos 20 anos consolidou a obesidade como um agravo nutricional associado a altas taxas de incidência de diabetes, doenças cardiovasculares e câncer, o que modificou o perfil de morbi-mortalidade da população. O comportamento alimentar inadequado, devido à ingestão de dieta com alto teor de lipídios, em especial os de origem animal, carboidratos simples e pobre em fibras, vitaminas e minerais, aliado à redução da atividade física, tem promovido a obesidade principalmente entre as famílias de menor renda. Ao longo do tempo, o perfil nutricional de crianças e adolescentes brasileiros também mudou, a prevalência do baixo peso está em declínio, contrapondo-se aos altos índices de sobrepeso e obesidade que predizem doenças de cunho nutricional na vida adulta (PINHEIRO; FREITAS; CORSO, 2004; FLORES et al., 2013).
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Estudos indicam que a exposição prolongada a dietas ricas em gordura saturada promovem a apoptose de neurônios com função central no controle do peso, além da resistência a sinais anorexígenos, que ocorre principalmente pela ativação de TLR4, um indutor de estresse do retículo endoplasmático, que leva ao aumento da expressão de citocinas pró-inflamatórias no hipotálamo. Tais fenomenos explicam a dificuldade na manutenção do peso corporal em indivíduos obesos quando conseguem emagrecer através de dietas de restrição calórica (MORAES et al., 2009; MILANSKI et al., 2009). A presença na região hipotalâmica de grandes quantidades de gordura saturada, proveniente da dieta ingerida, induz a processos de apoptose. O hipotálamo, ao identificar longas cadeias lipídicas saturadas, logo as associa àquelas presentes nas membranas de bactérias e o organismo então as interpreta como ameaça respondendo de forma a ativar o sistema imune com a liberação local de substancias pró inflamatórias, dentre as quais se encontram as adipocinas, o TNFα, a IL6 e a leptina (VELLOSO, 2009). Reconhecendo-se então a obesidade como um processo inflamatório complexo, percebe-se que somente a prescrição de uma dieta reduzida em termos de calorias é insuficiente para o efetivo controle do peso corporal, havendo a necessidade da substituição dietética de gorduras saturadas por insaturadas, que promovam a melhoria da inflamação (VELLOSO, 2009).
1.1 Aspectos Epidemiológicos da Obesidade
A prevalência de sobrepeso e de obesidade tem aumentando progressivamente no Brasil e no mundo, sendo considerada como um importante problema de saúde pública, tanto para países desenvolvidos como em desenvolvimento. A obesidade é uma doença crônica, de caráter epidêmico e multicausal associada ao surgimento de co-morbidades, como, por exemplo, doenças coronarianas, diabetes, câncer e problemas músculo-esqueléticos, que se não tratadas podem tornar-se incapacitantes, onerando a sociedade e o sistema de saúde (PI-SUNYER, 1991; WHO, 2014). Além das implicações na
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saúde, a obesidade e o sobrepeso trazem também conseqüências socioeconômicas substanciais. Finkelstein et al. (2014) ao avaliarem os custos médios durante a vida de uma criança obesa comparado-a a uma criança eutrófica, observaram que o custo per capita de uma criança obesa corresponde a cerca de 19 mil dólares a mais do que para uma criança com peso dentro da normalidade.
Atribui-se à obesidade um custo direto de 2 a 8% do gasto total com saúde, em países industrializados. Entretanto, os valores reais devem extrapolar facilmente os estimados, visto que nesta porcentagem não são contabilizadas as doenças associadas. Um estudo conduzido entre 2008 e 2010 sobre os custos ligados a obesidade no Sistema Único de Saúde (SUS) revelou que o gasto estimado com doenças relacionadas ao sobrepeso e obesidade atinge quase US$ 2,1 bilhões por ano no Brasil, o equivalente a US$ 1,4 bilhões com hospitalizações e US$ 679 milhões com procedimentos ambulatoriais (BAHIA et al., 2012).
Dados da Pesquisa de Orçamentos Familiares (POF) 2008/2009 também demonstraram importante aumento nos números da prevalência de obesidade no país, principalmente entre crianças na faixa de 5 a 9 anos de idade. O excesso de peso entre crianças foi de 33,5% e obesidade 14,3%, enquanto que entre adolescente esses números são de 20,5% e 4,9%, respectivamente. Em adultos observou-se aumento constante de excesso de peso e obesidade, onde cerca de metade da população masculina (50,1%) e feminina (48%) possui excesso de peso. Entre os indivíduos avaliados 14,8% estavam obesos, sendo que as mulheres apresentaram-se mais obesas (16,9%) do que os homens (12,5%) (IBGE, 2010).
Por conta da relevância das doenças crônicas não transmissíveis (DCNT) e sua possibilidade de prevenção, o Ministério da Saúde tem realizado anualmente desde 2006 o Vigitel – Vigilância de Fatores de Risco e Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico, fruto de uma parceria entre Ministério da Saúde e o Núcleo de Pesquisas Epidemiológicas em Nutrição e Saúde da Universidade de São Paulo (Nupens/USP). O Vigitel 2011 trouxe dados alarmantes, onde mais da metade da população brasileira maior de 18 anos
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estava acima do peso, sendo 48,5% com sobrepeso/excesso de peso (IMC > 25kg/m2) e 15,8% com obesidade (IMC > 30kg/m2). Ao desmembrarmos este resultado observa-se que o percentual masculino passou de 11%, em 2006, para 16% em 2011, mantendo os mesmos valores entre mulheres. De modo geral, o estudo tem encontrado aumento crescente na prevalência de excesso de peso, diabetes e hipertensão arterial sistêmica entre indivíduos adultos desde sua concepção. Entretanto, a tendência de crescimento contínuo de excesso de peso e obesidade pela primeira vez estabilizou entre 2012 e 2013, provavelmente devido ao aumento no consumo recomendado de frutas e hortaliças (5 porções diariamente) e também pelo possível aumento da prática de atividade física atrelada ao lazer (VIGITEL, 2013).
Mesmo diante da estabilização dos índices de obesidade a estimativa para o futuro não é animadora, pois estima-se que em 2025 cerca de 25% dos brasileiros estarão obesos e esta projeção desfavorável não se restringe apenas ao Brasil, pois a Organização Mundial da Saúde (OMS) projeta já para 2015 uma população mundial de 2,3 bilhões de adultos com sobrepeso e 700 milhões de obesos (WHO, 2011).
Segundo o Department of Health and Human Services (2001) indivíduos obesos têm risco de morte prematura 50% a 100% maior que indivíduos eutróficos, além de apresentarem três a quatro vezes mais sintomas de ansiedade, depressão e serem estigmatizados e discriminados socialmente. A prevalência de obesidade infantil também é algo preocupante, por ser comumente vista em famílias onde pai e mãe também são obesos, compreende-se que não somente as influências genéticas, mas também o comportamento obesogênico adotado pela família é determinante. Um indivíduo obeso durante sua infância ou adolescência possui 70% de chance de tornar-se um adulto com sobrepeso ou obesidade. Por isso reduzir os índices desta doença é uma prioridade de saúde pública que beneficia não somente a saúde, mas também a economia de um país, sendo fundamental o investimento em campanhas contra a obesidade infantil, pois este é o melhor modo de diminuir a obesidade na vida adulta.
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1.2 Inflamação crônica induzida pela obesidade
A resposta inflamatória é classicamente definida por infecção e/ou lesão tecidual que causa rubor, tumor, calor e dor, com tendência a evoluir para resolução e homeostase (MEDZHITOV, 2008). Evidências atuais indicam que a obesidade resulta de um quadro inflamatório crônico e subclínico de baixa intensidade que se manifesta de forma sistêmica perpetuando-se e agravando-se ao longo da vida do indivíduo de acordo com seu estilo de vida. Fatores como: o descontrole da ingestão calórica e a diminuição do dispêndio energético, seja por causas ambientais, emocionais ou genéticas determinam a obesidade em indivíduos sedentários (EGGER; DIXON, 2011).
Do ponto de vista celular e molecular, a obesidade é uma doença crônica, na qual os processos de infiltração de células inflamatórias e ativação da rede de citocinas estão intimamente envolvidos, havendo exacerbada produção de substâncias, em especial as pró-inflamatórias nos âmbitos central e periférico. O tecido adiposo foi por muito tempo considerado como um tecido de função restrita a de reservatório energético. Entretanto, diversos estudos vêm provando ao longo dos anos que sua atividade fisiológica e importância é crucial para os processos imunológicos e inflamatórios. Uma ampla variedade de hormônios, fatores de crescimento, proteínas da via do complemento e citocinas de caráter pró e anti-inflamatório são produzidas pelo tecido adiposo, como por exemplo, leptina, adiponectina, resistina, visfatina, assim como as interleucinas, interferon gama (IFN), fator de necrose tumoral (TNF), com distintos papéis fisiológicos o tornam um importante órgão endócrino (LEE; LEE; CHOUE, 2013; KERSHAW; FLIER, 2004).
Em obesos, o tecido adiposo inflamado e hipertrofiado exibe sinais como hipóxia, estresse do retículo endoplasmático, alterações da função mitocondrial, produção elevada de espécies reativas de oxigênio (EROs), aumento das concentrações intracelulares de ácidos graxos não esterificados (ácidos graxos livres), produção descontrolada de citocinas pró-inflamatórias e ativação das vias de sinalização envolvidas na apoptose celular. Entretanto, evidências recentes têm colocado a inflamação hipotalâmica numa posição de destaque na
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fisiopatologia da obesidade, sugerindo que a inflamação em tecidos periféricos possa ser prevenida ou até mesmo revertida quando a inflamação central é controlada (KAWASAKI et al., 2012).
A suposta relação entre inflamação em tecidos metabólicos atrelada à obesidade e resistência à insulina originou-se em 1993, com a descoberta da produção de TNF-α pelo tecido adiposo. Este mesmo grupo demonstrou em trabalhos posteriores que a resistência à insulina induzida em animais obesos era dependente dos níveis de TNF-α. Tais achados culminaram na descoberta de outras citocinas inflamatórias, que corroboram a hipótese da inflamação como base molecular da obesidade (HOTAMISLIGIL; SHARGILL; SPIEGELMAM, 1993). Mecanismos distintos, porém sinérgicos, são responsáveis pela inicialização da inflamação subclínica, induzindo a ativação das quinases IKK e JNK, que são as mesmas ativadas na resposta inata pelo TLR4 em resposta a lipopolissacarídeos e ácidos graxos. Esse processo mediado por moléculas inflamatórias também pode interferir na sinalização de insulina, pela atuação da IKKβ na fosforilação direta do substrato do receptor de insulina (IRS-1 e IRS-2) em resíduos de serina e também pela ativação indireta do NF-кB, um fator de transcrição que estimula produção de vários marcadores pró-inflamatórios. A sinalização de insulina ainda pode ser prejudicada pela ativação da JNK, que pode ser ativada pela via do TLR4 ou também pela presença de TNF-α (PAULI et al, 2009).
A obesidade induz a uma importante infiltração de macrófagos tanto no tecido adiposo quanto no tecido muscular (depósitos adiposos entre as fibras musculares). Didaticamente os macrófagos podem ser classificados em dois grupos distintos, M1 – que são macrófagos classicamente ativados, secretores de citocinas pró-inflamatórias como IL1β, IL6 e TNF-α, recrutados e ativados durante a obesidade; e o grupo M2 – macrófagos ativados de forma alternativa, responsáveis por citocinas anti-inflamatórias, como IL1Ra e IL10. Entretanto, evidências recentes revelam um cenário mais complexo na polarização de macrófagos, que vão além da classificação binária M1/M2, expondo diferentes perfis de macrófagos com diferentes atuações no contexto da obesidade (ESSER et al, 2014).
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Um estudo com animais alimentados com dieta hiperlipídica demonstra que o início da produção exacerbada de marcadores inflamatórios se dá logo nas primeiras 24 horas de ingestão da dieta, mantendo níveis altos nos primeiros 3 dias, seguido de uma faixa de normalização transitória, que pode durar de 2 a 3 semanas, mas retornando novamente aos elevados níveis iniciais, com tendência a manter-se elevados. Esse padrão temporal equipara-se ao que é visto no consumo alimentar quando há mudança de uma dieta normolipídica para uma dieta hiperlipídica (THALER et al., 2013).
O estado inflamatório é caracterizado pela produção de uma ampla variedade de mediadores bioquímicos que trabalham em uma complexa rede. Evidencias demonstram que variações genéticas envolvidas na etiologia da inflamação e distúrbios metabólicos podem interagir com fatores ambientais, como por exemplo, a dieta, predispondo alguns indivíduos à maior vulnerabilidade que outros. A citocina TNF-α envolvida na inflamação atrelada à obesidade é uma citocina pleiotrópica, com papel central na inflamação, mediadora chave da resistência à insulina devido a sua participação na fosforilação de IRS-1. O Fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) é primeiramente secretado por células mielóides via ativação da MAPK e NFκB, resultando na liberação de outras citocinas inflamatórias como IL1β e IL-6. Em humanos obesos os níveis de TNF- α plasmáticos e no tecido adiposo são altos, mas com a redução de peso, os indicadores tendem a diminuir. O TNF-α também induz indiretamente a resistência à insulina, por inibir a diferenciação de pré-adipócitos a adipócitos maduros, através de PPARy, além de atuar no metabolismo lipídico, promovendo lipólise e secreção de ácidos graxos livres, os quais contribuem para um aumento na produção de glicose hepática (CURTI et al, 2011; MAKKI; FROGUEL;WOLOWCZUK, 2013).
IL-6 é secretada pelo tecido adiposo, músculo, fígado, além de outras células como as pancreáticas, macrófagos, osteoblastos e miócitos. Citocina pleiotrópica essencial no processo inflamatório, participa da síntese de outras citocinas com potencial anti-inflamatório e regula negativamente alvos inflamatórios. Sua expressão correlaciona-se com ganho de peso, aumento da
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circunferência de cintura e dos níveis de ácidos graxos livres. Portanto, essa proteína tem sido classificada como pró e anti-inflamatória, dependendo do contexto em que está inserida e de seus níveis. Estudos demonstram que durante o exercício, IL-6 atua de forma anti-inflamatória, pois aumenta a absorção de glicose no músculo esquelético, levando à hipertrofia muscular, miogênese e oxidação de ácidos graxos mediada por AMPK. Entretanto, no tecido adiposo e fígado, a IL-6 age de forma pró-inflamatória, promovendo resistência à insulina através da regulação da SOCS3 (supressor de sinalização citocina 3) que, por sua vez, compromete o receptor de insulina IRS1 (MAUER et al., 2014; CURTI et al., 2011; MAKKI; FROGUEL; WOLOWCZUK, 2013).
Normalmente produzida por monócitos em resposta à lipopolissacarídeos, IL-1 ou TNF-α, a IL-8 são correlacionados a parâmetros como IMC, circunferência dia cintura, Proteína C reativa (PCR), HDL e score HOMA, o que faz dessas citocinas marcadores importantes em condições de aterosclerose, obesidade e diabetes (KIM et al., 2006). A IL-4 é uma citocina de caráter anti-inflamatório, que regula o metabolismo de lipídios e da glicose, aumentando a sensibilidade à insulina, além promover lipólise em adipócitos maduros através da fosforilação da perilipina e inibição da diferenciação de adipócitos através da STAT6. A IL-4 ainda promove polarização de macrófagos, do estado M1 para o M2, reduzindo a inflamação em tecidos adiposos e, portanto, impedindo a incidência de resistência à insulina (TSAO et al, 2014).
Segundo Charles et al (2011) IL-10 é uma citocina de caráter anti-inflamatória, produzida por macrófagos e células dendríticas que age atenuando processos inflamatórios induzidos por TNF-α, IL-6 e IL-1, sendo um exemplo clássico de feedback negativo, pois inibe a própria célula que a produz (macrófagos), além de também inibir IL1-β, IL-6, IL-8, TNF-α e como mencionado, se auto inibir.Negativamente correlacionada com o IMC e níveis de glicose em jejum, baixos níveis de IL-10 estão associados com propensão a síndrome metabólica e diabetes mellitus.
O IL1Ra é um inibidor de IL1β, sendo considerada uma citocina anti inflamatória com função reguladora negativa no controle e atenuação da resposta
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inflamatória. IL1β regula a produção de uma variedade de mediadores inflamatórios, como IL-6, ICAM-1 e E selectin, sendo associada com distúrbios metabólicos em obesos, como dislipidemia e resistência a insulina (CURTI et al, 2011).
Além dessas proteínas envolvidas na sinalização celular inflamatória, alguns receptores e moléculas adaptadoras também possuem fundamental importância dentro do processo. Exemplo disso são os Toll like receptors (TLR), proteínas transmembranares responsáveis por detectar presença de patógenos invasores no organismo. Expresso em várias células do sistema imune como linfócitos, macrófagos, células dendríticas é possível encontrar esses receptores em adipócitos, enterócitos e células endoteliais. O TLR4, éum subtipo responsável pelo reconhecimento de lipopolissacarídeos de bactérias gram negativas e ácidos graxos saturados. Os lipopolissacarídeos são um complexo glicolipídico composto por um polissacarídeo hidrofílico e um domínio hidrofóbico (lipídio), a interação de LPS com TLR4 presentes nas membranas de monócitos e macrófagos induz a síntese das citocinas pró- inflamatórias já citadas (TNFα, IL1β,IL-6, IL-8), que atuam mediando o processo inflamatório por meio de interações com receptores em células alvo (AKIRA; TAKEDA, 2004; MILANSKI et al, 2009).
Quando um TLR associa-se a um de seus ligantes podem ser ativadas duas vias sinalizatórias, dependente e não-dependente, do fator de diferenciação mielóide 88 (MyD88) (AKIRA; TAKEDA, 2004). A MyD88 é uma molécula adaptadora, que ao se unir à porção plasmática do receptor permite o recrutamento de outras proteínas, como TRAF-6 (fator 6 associado ao receptor de TNF-α) e IRAK, que proporcionaram a fosforilação do complexo IkB quinase (IKK). No citoplasma da célula encontra-se o NFKB associado a uma proteína inibidora IkB, a fosforilação desse complexo liberta o NFKB que migra para o núcleo e inicia a transcrição de genes de citocinas inflamatórias, incluindo IL1β, IL-6 e TNF-α e também para IkB, desse modo o ligante recém sintetizado suprime a atividade de NFKB, o qual retorna a sua posição citosólica, cessando a produção de agentes pró-inflamatórios, conforme esquematizado na Figura 1 (CINTRA; ROPPELE; MORAES; PAULI, 2011).
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Figura 1. Ativação da via do NFKB por meio da ligação de lipopolissacarídeos ao receptor do tipo Toll Like receptor 4 (TLR-4). DD= domínio de morte, Tradd= TRAF associada ao domínio de morte, RIP= proteína de interação com receptor, TRAF-2= fatores associados ao receptor de TNF. Retirado de Cintra; Ropelle; Pauli, 2011.
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1.3 A microbiota intestinal em indivíduos saudáveis
A microbiota intestinal humana é atualmente reconhecida como um “órgão microbiótico” que abriga entre 10 e 100 trilhões de microorganismos, das quais grande parte se aloja no cólon intestinal. A microbiota intestinal compreende inúmeros microorganismos vivendo simbioticamente no trato digestório do ser humano. Este complexo ecossistema é composto pela microbiota residente ou endógena, que vive aderidas às membranas das mucosas do trato gastrointestinal por um período prolongado e a microbiota transitória ou exógena que atravessa a barreira gastrointestinal. Este ecossistema complexo é composto por micro-organismos aeróbios, anaeróbios e facultativos (THE HUMAN MICROBIOME PROJECT CONSORTIUM, 2012).
As diferentes regiões anatômicas intestinais muito diferem em termos de pH, fluxo de digestão, disponibilidade de substrato e tensão de oxigênio. O intestino grosso, caracterizado por um fluxo digestivo lento, pH de neutro para levemente ácido, possui a maior quantidade de espécies microbianas; comunidades estas dominadas por anaeróbios estritos. O intestino delgado possui uma quantidade consideravelmente menor de micro-organismos devido às condições ambientais não tão favoráveis, como o trânsito digestivo relativamente curto (3-5 h) e a concentração alta de sais biliares (FLINT et al., 2012).
Embora existam mais de 50 filos de bactérias descritos até o momento, a microbiota intestinal humana é dominada pelos filos: Bacteroidetes e Firmicutes, enquanto Proteobacteria, Verrucomicrobia, Actinobactérias, Fusobactérias e Cianobactérias estão presentes em proporções menores. O epitélio intestinal está recoberto por uma espessa camada de muco, e tanto o lúmen, quanto o mucu, representam regiões distintas, contendo uma microbiota específica. Por exemplo, Bacteroides, Bifidobacterium, Streptococcus, membros da família Enterobacteriacea, Enterococcus, Clostridium, Lactobacillus, e Ruminococcus são comumente encontrados no conteúdo intestinal e nas fezes, enquanto que os Clostridium, Lactobacillus e
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Enterococcus são detectados no muco e criptas epiteliais do intestino delgado (SERIKOV et al, 2010).
O transplante de comunidades microbianas entre diferentes hospedeiros tem demonstrado que as espécies da microbiota intestinal apresentam um nível elevado de adaptação de um habitat para o outro, exemplo disso é o estudo de Ridaura et al. (2013), que descreveu o transplante de camundongos germ-free com a microbiota de humanos gêmeos, dos quais, um apresentava fenótipo obeso e o outro magro, produzindo “camundongos humanizados” e revelando que o fenótipo era transferido junto com a microbiota e que a microbiota de indivíduos magros pode invadir outra microbiota e reduzir tecido adiposo no camundongo obeso quando esta recolonização é atrelada a uma dieta saudável.
O aumento do tecido adiposo de camundongos que receberam microbiota de indivíduo obeso foi significantemente maior do que aquele registrado nos que receberam microbiota de indivíduo magro, ambos os grupos receberam dieta com 33% de gordura, inclusive notando-se maior peso da gordura epididimal em animais colonizados com comunidade intestinal de obesos. Outro achado foi sobre a microbiota de indivíduos obesos que pode influenciar a produção de metabólitos que caracterizam o próprio estado de obesidade, pois animais transplantados com microbiota de obeso exibiram alta expressão de genes envolvidos na resposta ao estresse e nos processos de desintoxicação, enquanto microbiota de magros induziu expressão de genes envolvidos na digestão de polissacarídeos, bem como maior fermentação de butirato e propionato. A maior capacidade para quebra e fermentação de polissacarídeos (carboidratos não digeríveis) da microbiota de indivíduos magros em comparação com a microbiota de obesos, está relacionada com diminuição do peso corporal e menor adiposidade (RIDAURA et al., 2013).
Esta adaptação não surpreende, já que a densa comunidade microbiana residente no intestino, referida como microbiota comensal, relaciona-se intensamente com o hospedeiro sendo essencial para muitos processos fisiológicos que incluem melhoria da barreira epitelial intestinal,
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desenvolvimento do sistema imunológico, resposta ao estresse e aquisição de nutrientes (KAMADA et al.; 2013).
O trato gastrointestinal durante a vida fetal é estéril, a partir do nascimento as bactérias da mãe e do ambiente iniciam a colonização do intestino do bebê. Essa colonização dependerá do tipo de parto (normal ou cesárea) e da alimentação (aleitamento materno exclusivo, leite de vaca ou fórmula industrial). Mesmo existindo filos bacterianos comuns entre humanos, há uma clara diferença na colonização bacteriana entre indivíduos, o que reforça a idéia de que cada pessoa, via de regra, tenha um subconjunto de suas próprias bactérias colonizando diferentes partes do corpo. Essa singularidade da comunidade microbiana de cada indivíduo parece ser estável ao longo do tempo em relação à população total, sendo determinante do estado de saúde (THE HUMAN MICROBIOME PROJECT CONSORTIUM, 2012)
No estado saudável os filos de bactérias dominantes em humanos são os Firmicutes, Bacteroidetes e Actinobactérias, com Proteobacteria e Verrucomicrobia presentes em menor número. Em adultos saudáveis o perfil da microbiota fecal se mantém estável ao longo do tempo. Mudanças na composição de macronutrientes da dieta claramente afetam a microbiota intestinal, sendo que a intensidade da alteração irá depender da composição original da microbiota, pois alguns grupos dominantes de bactérias são nutricionalmente menos exigentes e serão, portanto, afetados em menor proporção por mudanças dietéticas (FLINT et al., 2012).
1.4 A microbiota intestinal em indivíduos doentes
Evidências recentes demonstraram que existem diferentes composições bacterianas para indivíduos magros e obesos (TSUKUMO et al., 2009). Estes achados têm despertado grande interesse na comunidade científica, ampliando o horizonte de hipóteses sobre a influência que a microbiota intestinal exerçe na fisiopatologia da obesidade.
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O descontrole na ingestão calórica, além de afetar o balanço energético, promove mudanças na composição da microbiota intestinal, o que pode gerar obesidade e doenças metabólicas associadas (GREINER; BÄCKHED, 2011).
Indivíduos submetidos a uma mesma condição nutricional podem reagir de maneiras distintas em relação ao ganho de peso, mesmo possuindo características semelhantes. Essa maior susceptibilidade ao acúmulo de peso e hiperglicemia pode ter maiores explicações do que simples inadequações dietéticas e/ou sedentarismo. Estudos atuais demonstram uma importante correlação entre microbiota intestinal e o estado inflamatório que ocorre na obesidade (RODRIGUES, 2011).
Na obesidade humana, destaca-se a predominância de bactérias dos Phyla Firmicutes e Bacteroidetes, composição considerada fundamental para a homeostase energética do organismo, sistema imune e resposta inflamatória (PISTELLI; COSTA, 2010).
Os micro-organismos do Phylum Bacteroidetes são gram-negativos, possuem formato de bastonetes ou cocobacilos, são anaeróbios obrigatórios e não esporulados, e são encontrados normalmente no trato intestinal e nas mucosas. Os Bacteroidetes apresentam como produtos finais do metabolismo da glicose os ácidos succínico e acético (TORTORA; FUNKE; CASE, 2006). As bactérias do Phylum Firmicutes, maioria das quais possuem parede celular gram-positiva, têm forma de cocos ou bacilos, muitas vezes produzindo endósporos. Por ser um Phylum extenso costuma-se subdividi-lo em três classes: 1) Bacilli - aeróbios facultativos ou obrigatórios; 2) Clostridia - anaeróbios e 3) Mollicutes – não possuem parede celular. As classes Bacilli, e em particular Lactobacillus e Enterococcus têm sido as de maior interesse nutricional (TRABULSI; SAMPAIO, 2005).
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1.5 Tecido hepático, microbiota intestinal e NAFLD
Fundamental no metabolismo de glicose, lipídios e aminoácidos, o fígado participa não somente do metabolismo de macronutrientes, mas também do armazenamento de substâncias (ferro, vitaminas A, D e B12), da
degradação e excreção de hormônios, além de realizar outras funções como transformaçãoe excreção de drogas, produção de fatores hemostáticos e de ser um componente essencial na regulação do sistema imune (SCHINONI, 2006).
O fígado é um dos maiores órgãos sólidos do corpo humano, pesando cerca de 1,5 kg e consistindo de quatro lobos pouco definidos, que recebem sangue parcialmente desoxigenado da veia porta. O sangue provém do trato digestório, pâncreas e baço (75 a 80% do volume aferente) e da artéria hepática, um ramo do tronco celíaco que transporta de 20 a 25% do sangue oxigenado recebido pelo fígado. Nos capilares sinusóides, os sangues da veia porta e da artéria hepática misturam-se, convergindo para a veia central do lóbulo hepático. As veias centrais dão origem às veias sublobulares, e o sangue retorna ao coração pela veia cava inferior. O fluxo sanguíneo hepático total alcança entre 800 a 1200 mL/min, e embora a massa hepática não ultrapasse 2,5% do peso corpóreo, o fígado recebe aproximadamente 25% do débito cardíaco (EIPEL; KERSTIN; VOLLMAR, 2010).
O fígado recebe suprimento sanguíneo da artéria hepática e da veia porta, que por sua vez drenam o sangue das veias mesentéricas, este sangue não contém apenas produtos da digestão de nutrientes, mas também produtos oriundos de micro-organismos colonizadores do intestino. Portanto, o fígado é o primeiro órgão de exposição aos produtos da microbiota, funcionando como uma espécie de filtro (DUSEJA; CHAWLA, 2014).
Estruturalmente, o fígado é composto por hepatócitos, que atuam na síntese e secreção de substâncias; células endoteliais que revestem os sinusóides e ductos biliares revestidos por células epiteliais; células de Kupffer, que possuem intensa atividade fagocitária, englobando eritrócitos senescentes, materiais particulados e 99% dos micro-organismos presentes
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no sangue portal; além das células de Ito (células estreladas), cuja principal função é o armazenamento de vitamina A sob a forma de ésteres de retinol. Em situação de inflamação hepática as células de Ito perdem sua capacidade original e passam a secretar colágeno, exercendo importante função nos mecanismos de injúria, regeneração e fibrose hepática (KMIEĆ, 2001; CORMACK, 2003).
Estudos atuais demonstram forte associação entre alterações na microbiota intestinal em indivíduos obesos e desenvolvimento da esteatose hepática não-alcoólica (EHNA) ou NAFLD, do inglês "nonalcoholic fatty liver disease", ou doença hepática gordurosa não-alcoólica (DHGNA). A DHGNA é uma doença hepática crônica intimamente associada à obesidade e a resistência à insulina, que pode ser exacerbada pela microbiota intestinal por aumentar esteatose hepática, fibrose e inflamação (GANGARAPU; YILDIZ; INCE; BAYSAL, 2014).
Muitos estudos conduzidos com humanos e animais têm investigado a associação entre a EHNA e microbiota intestinal. A microbiota intestinal pode iniciar esteatose hepática através do aumento na absorção de monossacarídeos, produção de bioprodutos hepatotóxicos bacterianos, reação inflamatória crônica de baixa intensidade ou pelo metabolismo de ácidos biliares (PARK, SEO, YOUN; 2013).
Segundo Bäckhed et al. (2004) camundongos germ free possuem menores níveis de triglicérides do que camundongos convencionalmente colonizados, pois a alta absorção de monossacarídeos promove síntese de novo de ácidos graxos e triglicerídeos, elevando atividade da acetil CoA carboxilase (ACC) e ácido graxo sintase (FAS). Em camundongos obesos encontrou-se aumento nas concentrações séricas de bioprodutos hepatotóxicos como o etanol e dióis ativos, que estão diretamente relacionados à esteatose hepática (AMAYA-FARFAN, 1999). A relação entre inflamação, endotoxemia e esteatohepatite não alcoólica é associada a mecanismos que envolvem lipopolissacarídeos bacterianos, células de kuppfer, que são responsáveis por remover tais endotoxinas, CD14 e TLR4.
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Além disso, a microbiota também pode promover esteatose e lipoperoxidação através da estimulação de receptores farnesóides X (FXR) que provocam mudanças na secreção biliar (PARK, SEO, YOUN; 2013).
Em indivíduos obesos, achados clínicos e bioquímicos de alterações hepáticas são comuns. O principal produto bacteriano envolvido na patogênese da esteatose não alcoólica são os lipopolissacarídeos (LPS), componentes ativos das paredes celulares de bactérias gram negativas, mas que também são produzidos continuadamente pelo intestino de forma endógena através da morte destas mesmas bactérias. Essa translocação ocorre através dos capilares presentes nas paredes intestinais e é um mecanismo dependente de TLR4 (toll-like receptor 4). O transporte dos lipopolissacarídeos do lúmen intestinal para órgãos alvos é facilitado por lipoproteínas e quilomicrons, sintetizados pelos enterócitos em resposta ao conteúdo de gordura da dieta, e a absorção dos lipopolissacarídeos acaba ocorrendo durante a absorção de lipídios. Os LPS se ligam a lipopolysaccharide binding protein (LBP), que se liga ao CD14, proteína que pode estar na forma solúvel ou expressa em células inflamatórias. Juntos, o complexo LPS-LBP-CD14 ativa o TLR4 presente em células como monócitos, células de Kuppfer ou células estreladas, desencadeam uma cascata, incluindo proteínas como a c-Jun N-terminal kinase (JNK), factor nuclear kappa B (NFKB) e IFR3 (interferon regulatory factor-3). NFKB é translocado para o núcleo induzindo a expressão de diversas proteínas inflamatórias, como TNFα, IL1 e IL6. A sinalização do TLR4 pode promover resistência à insulina, inflamação, fibrogenese e esteatose hepática (MACHADO; PINTO, 2012).
O epitélio intestinal é uma barreira especializada que com a ajuda das proteínas de junção, seleciona a entrada de substâncias ao organismo, com o objetivo maior de prevenir a entrada de toxinas e bactérias danosas. Desordens na homeostase metabólica, entre microogranismos e hospedeiros, como ocorre na SIBO (Small intestinal bacterial overgrowth) onde há um crecimento anormal de bactérias no intestino delgado, podem causar ruptura
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das proteínas de junção, o que aumenta permeabilidade intestinal induzindo a translocação bacteriana, que é o transporte de micro-organismos e/ou de seus produtos metabólicos do lúmen intestinal para a corrente sanguínea. Obesidade é um importante fator de risco para desenvolvimento de NAFLD, e uma microbiota desregulada pode tanto induzir obesidade, pelo aumento da captação de energia da dieta, quanto causar SIBO, levando a maior permeabilidade intestinal, também culminando em NAFLD (FEROLLA et al., 2014).
Um exemplo da importância da microbiota intestinal no desenvolvimento da esteatose hepática não alcoólica é o estudo de LE ROY et al (2013) que avaliou dois grupos de ratos alimentados com uma mesma dieta hiperlipídica, ambos os grupos (A e B) apresentaram ganho de peso semelhante, porém um grupo (A) desenvolveu hiperglicemia e apresentou altas concentrações séricas de citocinas pró-inflamatórias, enquanto que o outro grupo (B) não teve alterações nas concentrações de glicose plasmática, apresentando baixos níveis de marcadores inflamatórios sistêmicos. Os autores transplantaram a microbiota do grupo A e B em ratos germ-free, alimentando este novo grupo com a mesma dieta hiperlipídica. Os animais que receberam a microbiota dos ratos do grupo A, apresentaram hiperglicemia em jejum, hiperinsulinemia, esteatose hepática, concentrações elevadas de triglicéridos no fígado e aumento da expressão de genes envolvidos na lipogênese de novo. Os animais que receberam a microbiota dos ratos do grupo B permaneceram normoglicêmicos com parâmetros metabólicos dentro da normalidade. Os autores concluíram que a microbiota determina a propensão ao desenvolvimento de NAFLD e ainda, enfatizaram que os filos associados ao fenótipo propenso a desenvolver NAFLD e o não propenso, são respectivamente, Firmicutes e Bacteroidetes.
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1.6 Relação entre obesidade, microbiota e inflamação
Em pessoas obesas, há maior quantidade de microorganismos do Phylum Firmicutes do que Bacteroidetes. Entretanto, com a perda de peso ocorre uma inversão na estrutura da microbiota. As bactérias do Phylum Bacteroidetes são benéficas, pois produzem ácidos graxos de cadeia curta, que possuem propriedades antiinflamatórias (LEY et al., 2006). Há uma importante relação entre as alterações da diversidade bacteriana intestinal e a inflamação que ocorre na obesidade, esta relação fica ainda mais evidenciada diante da introdução de dieta hiperlipídica, que acarreta no indivíduo obeso o aumento da permeabilidade intestinal e consequente endotoxemia metabólica (SNEDEKER; HAY, 2012).
A endotoxemia metabólica é causada pela entrada de lipopolissacarídeos (LPS) na corrente sanguínea. Estas substâncias liberadas durante a lise das células bacterianas ativam o sistema imune do indivíduo ao serem reconhecidas como antígenos. Portanto, a microbiota intestinal influi na imunidade inata e adaptativa, e na própria inflamação subclínica característica da obesidade (CANI; DELZENNE, 2010).
A presença de determinadas bactérias ou nutrientes (proteínas e lipídios) ativam os receptores Toll Like (TLRs), indicando às células imunes a necessidade de resposta. Tanto os lipopolissacarídios dietéticos, quanto os presentes nas paredes celulares das bactérias, possuem a capacidade de ativar o TLR4 e desencadear a síntese de substâncias pró-inflamatórias mediadoras da resistência à insulina e obesidade (CARICILLI; PICARDI; ABREU, 2011).
A relação entre obesidade, microbiota e inflamação ainda tem sido explicada por três possíveis mecanismos: o primeiro corresponde à excessiva extração de energia de polissacarídeos não-digeríveis (fibras dietéticas) pelas bactérias intestinais, o que resulta em maior glicose disponível para gerar energia e, portanto, aumento da lipogênese. Excetuam-se algumas fibras que possuem efeito prebiótico, como a inulina e o amido resistente, os quais são
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capazes de auxiliarem no controle do peso (DELZENNE; CANI, 2011; PEREIRA, 2007).
Dietas hipercalóricas favorecem bactérias intestinais produtoras de enzimas capazes de quebrar polissacarídeos não digeríveis, introduzindo calorias adicionais à dieta e diminuindo o valor energético eliminado nas fezes. As interações das fibras dietéticas com a microbiota intestinal, o seu metabolismo e o metabolismo do hospedeiro, dependerão da extensão em que cada fibra seja fermentada. A incorporação de fibras à alimentação modifica o ambiente intestinal, afetando a retenção de água, formação de gel e produção de ácidos graxos de cadeia curta. A maioria das fibras dificulta a reabsorção de ácidos biliares e gorduras, aumentando assim a sua excreção e diminuindo consequentemente o colesterol circulante. Estas fibras também são capazes de diminuir a população das bactérias eficientes em extrair energia, o que regula o metabolismo de carboidratos que resulta da redução da glicemia pós-prandial e dos níveis de insulina. Por sua vez, esse quadro diminui o estímulo da síntese hepática de colesterol, promovendo também um efeito hipocolesterolemiante (FAVA et al., 2006; CHAUD et al., 2007; COX et al., 2013).
O segundo mecanismo consiste no surgimento de uma inflamação crônica subclínica, como resultado da maior quantidade de lipopolissacarídeos para a microbiota intestinal, o que conduz à obesidade e diabetes (TSUKUMO, 2009). Em estudos pareados, onde se utilizaram animais germ-free e animais cujos intestinos foram colonizados com bactérias típicas de indivíduos obesos, percebeu-se maior quantidade de bactérias gram-negativas (possuidoras de paredes celulares), as quais aproveitaram o excesso oportuno de lipopolissacarídeos para o seu próprio metabolismo e proliferação. Foi demonstrado, então, que o intestino destes animais possuía maior permeabilidade aos lipopolissacarídeos que, ao adentrarem a mucosa e se ligarem aos TLR4 e aos receptores CD14 das células, iniciaram reações em cadeia, gerando citocinas pró-inflamatórias capazes de causar endotoxemia metabólica (CANI et al, 2007).
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O terceiro mecanismo propõe que a microbiota intestinal possa induzir a regulação de genes do hospedeiro que modulam a forma em que a energia é gasta e armazenada. A microbiota normalmente encontrada em obesos se mostra capaz de suprimir a produção da enzima Fiaf (Fasting-Induced Adipose Factor), responsável pelo controle da atividade da lípase lipoproteica. A inibição da Fiaf faz com que a lipase lipoproteica aumente sua atividade e inicie a estocagem de calorias na forma de gordura nos adipócitos (CANI; DELZENNE, 2009).
A microbiota intestinal também promove maior absorção de monossacarídeos e aumenta a lipogênese hepática do indivíduo (lipogênese de-novo), em resposta ao aumento das enzimas acetil-CoA carboxilase (ACC) e ácido graxo sintase (FAS), e de suas proteínas mediadoras: ChREBP (carbohydrate-responsive element binding protein) e da SREBP-1 (sterol-responsive element binding protein), fortemente associadas ao aumento de tecido adiposo e de peso (BACKHED et al., 2004; RODRIGUES, 2011).
Camundongos germ-free, mesmo consumindo dieta rica em gordura e açúcar, estão protegidos da obesidade por possuírem mecanismos que aceleram o metabolismo de ácidos graxos. Este mecanismo baseia-se na existência de maior concentração da enzima Fiaf nestes indivíduos, promovendo a elevação da produção do co-ativador de PPAR-, responsável por aumentar a expressão de genes envolvidos na oxidação mitocondrial de ácidos graxos, além de aumentar a atividade da AMPK (adenosine monophosphate–activated protein kinase), enzima reguladora mestre do metabolismo energético (TURNBAUGH et al., 2006).
A microbiota adquirida pelo homem ou animal ao nascer pode ser modificada ao longo da vida por fatores genéticos, imunológicos, dietéticos e pelo uso de antibióticos. A dieta, em específico, influencia parâmetros como o tempo de trânsito intestinal, pH e a própria população bacteriana, já que mudanças na ingestão de algum macronutriente pode resultar em alterações da microbiota (SCOTT et al., 2013).
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Hábitos dietéticos são o maior fator de influência na diversidade da microbiota humana. Contudo, a microbiota consegue por si só causar ganho de peso, não sendo este ganho necessariamente mediado pelo aumento no consumo de alimentos. Isso ocorre tanto pela maior eficiência da transferência de calorias da dieta para o hospedeiro, quanto pela forma em que tais calorias são metabolizadas (MILLION et al., 2013).
1.7 Tipificação da microbiota
A microbiota intestinal é um complexo ecossistema composto por cerca de 500 a 1000 espécies diferentes, onde cada ser humano abriga entre 30 e 40 espécies predominantes, das quais constituídas em sua maior parte por micro-organismos anaeróbios obrigatórios. A investigação por métodos tradicionais de cultivo em muito restringe o conhecimento da microbiota intestinal humana, pois além das técnicas convencionais estarem sujeita a muitos erros de execução e interpretação, nem todos os micro-organismos que habitam o intestino humano podem ser cultivados em condições de laboratório (MUJICO et al., 2013; TANNOCK, 2002). A descoberta da existência de características invariantes e específicas nas subunidades do RNA ribossomal microbiano 16S, foi decisiva para a evolução das técnicas de análise das comunidades bacterianas, representando um significativo avanço no entendimento do microbioma humano. O RNAr 16S contém regiões ou sequências de bases de nucleotídeos altamente conservadas que carregam a assinatura do grupo filogenético e ainda da espécie, mesmo que intercaladas com regiões hipervariáveis (regiões V). Para se identificar as sequências de interesse, o DNA bacteriano é extraído da amostra e a região variável do RNAr 16S amplificada por PCR a partir do DNA. O uso de métodos moleculares tem sido aplicado com sucesso para a identificação de bactérias, independentes de serem ou não cultiváveis a partir de amostras como tecidos e fezes (MUJICO et al., 2013, TANNOCK, 2002).
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1.8 Proteínas do soro do leite
Alimentos funcionais com propriedades bioativas podem ter um importante papel no combate à obesidade, dentre estes, destacam-se as proteínas do soro do leite, que podem agir como agente antimicrobiano, anti- hipertensivo e regulador da função imune, reduzindo gordura corporal, além de atuar como supressor do apetite e estimulante da síntese proteica muscular (MORENO et al., 2014).
O leite bovino possui cerca de 3,25% de proteínas, constituídas por duas principais classes: caseína e proteínas do soro do leite (whey protein), nas proporções de 80 e 20%, respectivamente. Essa relação caseína:proteínas do soro é bastante variável entre as espécies de mamíferos. Por exemplo, no leite humano a proporção de proteínas do soro se inverte em comparação ao leite bovino, tendo 4 vezes mais caseina (20%) que proteinas do soro (80%) (PAL, ELLIS, DHALIWAL, 2010; SGARBIERI, 2004). As proteínas do soro do leite são proteínas globulares, estrututalmente estabilizadas por pontes de dissulfeto, constituídas pela frações principais beta-lactoglobulina, alfa-lactoalbumina, albumina do soro bovino (BSA), imunoglobulinas e glicomacropeptideos (GMPs) (HARAGUCHI; ABREU; PAULA, 2006).
O soro do leite é obtido durante o processo de produção do queijo e por muito tempo foi considerado um resíduo agroindustrial de baixo valor comercial, entretanto a descoberta de importantes propriedades biológicas e nutricionais permitiu a inclusão do soro de leite na fabricação de novos produtos pela indústria, e coincidentemente, eliminando o impacto ambiental negativo causado pelo descarte dos efluentes das fábricas de queijos.
O soro do leite bovino é um produto de alto valor nutritivo, rico em vitaminas, minerais, α-lactoalbumina e altos teores de aminoácidos indispensáveis, como os de cadeia ramificada. Além disso, as proteínas do soro são melhores fontes de energia e de aminoácidos quando comparadas as proteínas do ovo, carne, soja e até mesmo se comparadas à caseína (SGARBIERI, 2004).
