UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
WENDELL MEDEIROS DE AZEVEDO
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BIOATIVA DO ÓLEO E DA MANTEIGA DE CACAY (Caryodendron orinocense Karst.) E AVALIAÇÃO DO
EFEITO INDUTOR NA PRODUÇÃO DE LIPASE
NATAL - RN 2020
WENDELL MEDEIROS DE AZEVEDO
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E BIOATIVA DO ÓLEO E DA MANTEIGA DE CACAY (Caryodendron orinocense Karst.) E AVALIAÇÃO DO
EFEITO INDUTOR NA PRODUÇÃO DE LIPASE
Dissertação de Mestrado apresentado ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Caninde de Sousa Junior
Coorientadora: Prof. Dra. Cristiane Fernandes de
Assis
NATAL - RN 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial do Centro Ciências da Saúde - CCS Azevedo, Wendell Medeiros de.
Caracterização físico-química e bioativa do óleo e da manteiga de cacay (Caryodendron orinocense Karst.) e avaliação do efeito indutor na produção de lipase / Wendell Medeiros de Azevedo. - 2020.
73f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. Natal, RN, 2020.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Canindé de Sousa Junior. Coorientador: Profa. Dra. Cristiane Fernandes de Assis.
1. Capacidade antioxidante - Dissertação. 2. Atividade antibacteriana - Dissertação. 3. Aspergillus terreus -
Dissertação. 4. Fermentação em estado sólido (FES) - Dissertação. I. Sousa Junior, Francisco Canindé de. II. Assis, Cristiane Fernandes de. III. Título.
RN/UF/BSCCS CDU 615.011
Aos pesquisadores e professores que se empenham em defesa da ciência e educação brasileira.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por ter me dado sabedoria em minhas escolhas e decisões.
Aos meus queridos orientadores, Prof. Dr. Francisco de Sousa Junior e Profª. Drª. Cristiane de Assis. Sempre solícito, Francisco se mostrou um orientador exemplar. Levarei comigo sua disciplina. Cristiane, orientadora desde a iniciação científica, proporcionou-me a paixão pela pesquisa e ensino. Levarei comigo sua positividade.
À minha família e amigos, em especial aos meus pais, Edilza Medeiros e Genaldo Azevedo, por todo o apoio e incentivo.
Aos professores do programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPgCF) que contribuíram com o aprimoramento do meu conhecimento científico e aos pesquisadores que contribuíram com o desenvolvimento deste trabalho. Meus agradecimentos especiais ao Prof. Dr. Matheus Pedrosa, participante de minhas bancas de seleção e qualificação; ao Prof. Dr. Everaldo Silvino por toda sua experiência; à Profa. Drª. Karla Suzanne, por todas as sugestões dadas e à Drª. Nathalia Araújo por ter aceitado o convite para a banca de defesa e pelo suporte na realização da atividade antibacteriana.
Agradeço em especial à minha parceira de bancada, Larissa Oliveira. Fico muito feliz em ver o quanto você evoluiu e se dedicou ao desenvolvimento da pesquisa. Agradeço também a Gabriela Ramos pela ajuda e dedicação.
Ao apoio técnico, José Maciel, Tatiana Moura, Judite Teodósio e Luiz Ricardo. Maciel, sou grato por todo o apoio durante os experimentos de bancada, conselhos e amizade.
Aos meus colegas e pós-graduandos: Karen Barros, Gabrielle Mahara, Keith Hellen, Ellane Ribeiro, Waleska Medeiros, Pedro Ivo, Isaiane Medeiros, Fernanda Pontes e aos demais integrantes dos laboratórios de Bromatologia e Enzimologia que compartilharam a mesma bancada durante experimentos e dividiram informações e conhecimentos.
Aos secretários do PPgCF, Fábia Freire e Gibson Feitosa por todos os esclarecimentos prestados.
Ao apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001.
“O maior laboratório natural do planeta é a Amazônia. De lá há de vir as mais completas respostas e melhores soluções para nossa desafiante biodiversidade.”
RESUMO
O cacay (Caryodendron orinocense Karst.) é uma árvore típica da Amazônia que apresenta uma composição nutricional rica em ácidos graxos poli-insaturados e compostos antioxidantes. No entanto, suas propriedades bioativas e seu potencial indutor lipídico são pouco estudados. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades físico-químicas e bioativas do óleo e da manteiga de cacay e óleo de coco (cocos nucifera), como também o potencial indutor para a produção de lipase por Aspergillus terreus NRRL – 255 utilizando fermentação em estado sólido (FES). Inicialmente, realizou-se a determinação do perfil dos ácidos graxos e a caracterização físico-química das amostras, além da determinação da capacidade antioxidante e atividade antibacteriana in vitro. Além disso, resíduos agroindustriais foram caracterizados visando o emprego como suportes sólidos não inertes para a FES. O potencial indutor lipídico para a produção de lipase fúngica também foi avaliado e o processo de produção de lipase foi otimizado por delineamento experimental. Por fim, as lipases produzidas foram caracterizadas frente a influência do pH, temperatura, íons metálicos e surfactantes. No que diz respeito ao perfil lipídico e às características físico-químicas, o óleo de cacay apresentou uma elevada concentração de ácidos graxos poli-insaturados (58,32%) e alto número de insaturações (116,35 cg I2.g-1).
Em contrapartida, a manteiga de cacay e o óleo de coco apresentaram uma maior estabilidade contra a peroxidação lipídica (7,77 e 5,99 meq.kg-1) e elevado percentual de
ácidos graxos saturados (69,09% e 78,4%), respectivamente. A fração hidrofílica do óleo de cacay obteve destaque na quantificação de compostos fenólicos totais (326,27 mg EAG.kg-1) e na capacidade antioxidante in vitro (156,57 µmol TE.g-1), segundo o ensaio de sequestro do radical DPPH. Além disso, o óleo de cacay demonstrou atividade antibacteriana contra as bactérias gram-positivas Bacillus cereus (44,99%), Enterococcus
faecalis (27,76%) e Staphylococcus aureus (11,81%). No que se refere a produção de
lipase, o presente estudo encontrou no farelo de trigo boas características como suporte sólido não inerte, como o alto índice de absorção de água (3,65 g H2O.g-1) e, como melhor
indutor lipídico, a manteiga de cacay, com atividade lipolítica de 308,14 U.g-1. Após avaliação da produção de lipase por delineamento fatorial fracionário 25-1, os efeitos dos
fatores temperatura e tempo foram considerados estatisticamente significativos e otimizados por delineamento composto central rotacional 22, sendo possível encontrar o valor crítico de 27,36°C para a temperatura e atividade máxima de 2.867,18 U.g-1. Quanto a caracterização da lipase, uma atividade relativa máxima foi observada no pH 7,0 e na temperatura de 35 ºC e um efeito inibitório foi encontrado para os íons Ca2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+ e Cu2+. Um incremento de sua atividade foi percebido com a redução da concentração de dodecil sulfato de sódio (SDS) e aumento de Triton X-100. Por fim, o óleo de cacay apresentou uma rica composição de ácidos graxos poli-insaturados e propriedades bioativas que podem justificar sua exploração industrial. Por outro lado, a manteiga de cacay mostrou ser um excelente indutor da atividade lipolítica, indicando potencial biotecnológico para a produção de lipases industriais.
Palavras-chave: Capacidade antioxidante; atividade antibacteriana; Aspergillus terreus;
ABSTRACT
The cacay (Caryodendron orinocense Karst.) is a typical Amazonian tree that presents a nutritional composition rich in polyunsaturated fatty acids and antioxidant compounds. However, its bioactive properties and lipid inducing potential are poorly studied. Thus, the present study aims to evaluate the fatty acids profile, physicochemical, and bioactive properties of cacay oil and butter and coconut oil (cocos nucifera) as the potential inducer to lipase production from Aspergillus terreus NRRL - 255 by solid state fermentation (SSF). Initially, the fatty acids profile by gas chromatography and physicochemical characterization were performed, as well as the determination of antioxidant capacity and antibacterial activity in vitro. In addition, agro-industrial wastes were characterized for use as non-inert solid supports by SSF. The potential of the lipid inducer for fungal lipase production was also evaluated, and the lipase production process was optimized by experimental design. Finally, the lipases produced were characterized by the influence of pH, temperature, metal ions, and surfactants. Regarding the fatty acids profile and physicochemical characterization, cacay oil presents a high content of polyunsaturated fatty acids (58.32%) and a high unsaturation (116.35 cg I2.g-1). In contrast, cacay butter
and coconut oil have greater stability against lipid peroxidation (7.77 and 5.99 meq.kg-1) and a high saturated fatty acid (69.09% and 78.4%), respectively. The hydrophilic fraction of cacay oil was highlighted in the quantification of total phenolic compounds (326.27 mg GAE.kg-1) and antioxidant capacity in vitro (156.57 μM TE.g-1), by DPPH radical scavenging assay. The cacay oil showed antibacterial activity against gram-positive bacteria Bacillus cereus (44.99%), Enterococcus faecalis (27.76%), and Staphylococcus
aureus (11.81%). Regarding lipase production, the present study found favorable results
for wheat bran as a non-inert solid support, such as the high water absorption index (3.65 g H2O.g-1) and, as the best lipid inducer, cacay butter, with a lipolytic activity of 308.14 U.g -1. After assessing lipase production by 25-1 fractional factorial design, the effects of
temperature and time factors were considered statistically significant and optimized by 22 central rotational composite design, being possible to find the critical value of 27.36 °C for temperature and maximum activity of 2,867.18 U.g-1. Regarding the characterization of the
lipase, a maximum relative activity was observed at pH 7.0 and temperature of 35 ºC and an inhibitory effect was found for Ca2+, Mn2+, Zn2+, Fe2+, and Cu2+ ions. An increase of lipase activity was found with the reduction of sodium dodecyl sulfate (SDS) concentration and increase of Triton X-100. Finally, cacay oil presented bioactive properties which might justify its industrial exploitation. On the other hand, the use of cacay butter as a lipid inducer showed a high lipolytic activity, indicating a potential biotechnology to produce industrial lipases.
Keywords: Antioxidant capacity; antibacterial activity; Aspergillus terreus; solid state
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fruto do cacay em cachos (A) e fruto seco com sementes em evidência (B)... 15 Figura 2 - Aspecto macroscópico (A) e microscópico (B) do Aspergillus terreus. ... 21 Figura 3 - Amostras produzidas e fornecidas pela empresa Plantus LTDA...25 Figura 4 - Fluxograma para a obtenção das frações hidrofílicas (FH) e lipofílicas (FL). ... 28 Figura 5 - Resíduos agroindustriais utilizados como suporte sólido não inerte ... 32 Figura 6 - Aspergillus terreus ativado em placa com meio PDA.. ... 33 Figura 7 - Meio de cultivo contendo farelo de trigo como suporte sólido não inerte antes (A) e após (B) fermentação em estado sólido (FES). ... 34 Figura 8 - Diagrama de Pareto para o efeito estimado de cada variável do planejamento fracionário 25-1 sobre a resposta da atividade enzimática. ... 53 Figura 9 - Diagrama de Pareto para avaliação do efeito estimado das variáveis do DCCR sobre a resposta da atividade enzimática. ... 55 Figura 10 - Superfície de resposta das variáveis temperatura e tempo de fermentação sobre a resposta da atividade enzimática... 56 Figura 11 - Valores preditos versus valores observados para a avaliação do modelo estatístico. ... 57 Figura 12 - Efeito do pH na atividade da lipase produzida por Aspergillus terreus. ... 58 Figura 13 - Efeito da temperatura na atividade da lipase produzida por Aspergillus terreus. ... 59
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Fatores e níveis utilizados no delineamento fatorial fracionário 25-1. ... 36 Tabela 2 - Fatores e níveis utilizados no delineamento composto central rotacional 22. .... 36 Tabela 3 - Perfil dos ácidos graxos das amostras. ... 38 Tabela 4 - Caracterização físico-química do óleo de cacay, coco e da manteiga de cacay. 40 Tabela 5 - Quantificação dos compostos fenólicos totais (CFT) nos extratos hidrofílicos das amostras. ... 43 Tabela 6 - Atividade antioxidante das amostras e suas frações hidrofílicas (FH) e lipofílicas (FL). ... 44 Tabela 7 - Inibição de crescimento bacteriano (%) para o óleo de cacay. ... 46 Tabela 8 - Parâmetros utilizados para a caracterização dos resíduos agroindustriais. ... 47 Tabela 9 – Efeito de diferentes substratos indutores na produção de lipase de A. terreus por FES. ... 50 Tabela 10 - Matriz do delineamento fatorial fracionário 25-1 com codificação e níveis das variáveis utilizados para o estudo de produção de lipase de A. terreus por FES. ... 52 Tabela 11 - DCCR com codificação e níveis das variáveis para o estudo de produção de lipase de A. terreus por FES. ... 54 Tabela 12 - Análise de variância (ANOVA) para o modelo estatístico. ... 57 Tabela 13 - Efeito dos íons metálicos, agente quelante e surfactantes na atividade da lipase produzida por Aspergillus terreus. ... 60
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 12 2 OBJETIVOS ... 14 2.1 Objetivo geral ... 14 2.2 Objetivos específicos ... 14 3 REFERENCIAL TEÓRICO ... 15
3.1 Características gerais sobre o cacay ... 15
3.2 Lipídios vegetais: qualidade e composição química ... 16
3.2.1 Propriedades bioativas de lipídios vegetais: capacidade antioxidante... 17
3.2.2 Propriedades bioativas de lipídios vegetais: atividade antibacteriana ... 18
3.3 Enzimas industriais: lipases e suas características ... 19
3.4 Métodos de produção de lipase microbiana ... 20
3.5 Fungos filamentosos na produção de lipase: Aspergillus terreus ... 20
3.6 Resíduos agroindustriais e suas potencialidades biotecnológicas ... 22
3.7 Lipases e suas aplicabilidades no mercado global ... 22
4 METODOLOGIA ... 25
4.1 Material ... 25
4.2 Determinação do perfil lipídico ... 26
4.2.1 Metilação dos ácidos graxos ... 26
4.2.2 Perfil dos ácidos graxos por cromatografia gasosa ... 26
4.3 Caracterização físico-química ... 27
4.4 Obtenção das frações hidrofílicas (FH) e lipofílicas (FL) das amostras ... 27
4.5 Determinação dos compostos fenólicos totais (CFT) ... 28
4.6 Capacidade antioxidante in vitro ... 29
4.6.1 Capacidade antioxidante através do sequestro do radical DPPH ... 29
4.7 Determinação da atividade antibacteriana in vitro ... 30
4.8 Produção de lipase ... 31
4.8.1 Caracterização dos resíduos agroindustriais ... 31
4.8.2 Microrganismo ... 33
4.8.3 Triagem do indutor lipídico ... 33
4.8.4 Obtenção do extrato enzimático bruto ... 34
4.8.5 Determinação da atividade lipolítica ... 35
4.8.6 Delineamento experimental ... 35
4.8.6.1 Delineamento fatorial fracionário ... 35
4.8.6.2 Delineamento composto central rotacional (DCCR) ... 36
4.8.7 Caracterização da lipase ... 36
4.9 Análises estatísticas ... 37
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 38
5.1 Caracterização das amostras ... 38
5.1.1 Perfil dos ácidos graxos ... 38
5.1.2 Caracterização físico-química... 39
5.1.3 Determinação dos compostos fenólicos totais (CFT) ... 42
5.1.4 Capacidade antioxidante in vitro ... 44
5.1.5 Atividade antibacteriana in vitro ... 45
5.2 Produção de lipase por FES ... 47
5.2.1 Caracterização dos resíduos agroindustriais ... 47
5.2.2 Triagem do indutor lipídico ... 50
5.2.3 Delineamento experimental ... 51
5.2.4 Caracterização da lipase ... 58
6 CONCLUSÃO ... 63
1 INTRODUÇÃO
O cacay (Caryodendron orinocense Karst.) é uma árvore típica da Amazônia, membro da família Euphorbiaceae que cresce ao longo da base da Cordilheira dos Andes e em terras baixas amazônicas adjacentes. O óleo, obtido por extração a frio de suas sementes, apresenta uma composição nutricional rica em ácidos graxos poli-insaturados e antioxidantes (RADICE et al., 2014). Contudo, suas propriedades bioativas são pouco investigadas.
A composição química dos lipídios vegetais influencia diretamente em suas propriedades bioativas. Dentre os principais compostos, destacam-se os ácidos graxos poli-insaturados e os compostos polifenólicos. Lipídios com elevadas concentrações desses compostos podem apresentar propriedades de interesse alimentício, farmacêutico e cosmético, como a capacidade antioxidante e atividade antibacteriana, atuando como agentes promotores de conservação de alimentos, reduzindo as perdas nutricionais e trazendo melhorias para a saúde e estética humana (OROIAN; ESCRICHE, 2015; SHAHIDI; ZHONG, 2015; KOUBAA et al., 2016).
No que diz respeito ao interesse biotecnológico, o uso e a avaliação de óleos e gorduras como indutores lipídicos para a produção de lipases têm crescido consideravelmente nas últimas décadas, uma vez que estas enzimas apresentam um mercado global em franca expansão (MARKETS AND MARKETS, 2018).
As lipases (EC 3.1.1.3) são enzimas classificadas como hidrolases de éster de glicerol ou acil-hidrolase de triacilglicerol, apresentando uma excelente capacidade de catalisar reações de esterificação, transesterificação e interesterificação de lipídios. Apesar de presentes em diversas espécies de animais, plantas e microrganismos, as lipases microbianas são preferidas pela indústria devido sua estabilidade, quimio e enantiosseletividade e baixo custo de produção (FAOUZI et al., 2015; LEE et al., 2015; PRIJI et al., 2015; RAMOS-SANCHEZ et al., 2015; ULLHAH et al., 2015; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
Com o intuito de desenvolver novas tecnologias, lipases microbianas vêm sendo alvo de estudos de produção, otimização e caracterização. Uma das áreas de pesquisa envolvendo essas enzimas se concentra no uso de microrganismos, resíduos agroindustriais e substratos indutores para a determinação das melhores condições de se
obter lipases amplamente ativas e de alta qualidade (BEHERA; RAY, 2016; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
No que se refere à produção de lipases microbianas, a fermentação em estado sólido (FES) vem sendo considerada como a principal escolha para a produção enzimática, uma vez que esse processo além de apresentar uma maior estabilidade térmica e produtividade, permite a utilização de resíduos agroindustriais como suportes sólidos não inertes, reduzindo o custo de produção bem como também o problema da poluição ambiental (SETHI et al., 2016; OLIVEIRA et al., 2017; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
Além disso, a FES na produção de lipase tem sido mais eficiente com a utilização de fungos, que secretam enzimas extracelulares, facilitando a recuperação da lipase a partir dos meios de fermentação. Ademais, apresentam excelente tolerância a altas condições de pressão osmótica, baixa atividade de água e alta capacidade de colonização em substratos sólidos. Dentre os fungos, destaca-se o Aspergillus terreus, fungo filamentoso pertencente à família Trichomaceae, amplamente distribuído em solos de climas tropicais e subtropicais (SETHI; NANDA; SAHOO, 2016; MUSA et al., 2017).
Quanto as aplicações industriais, as lipases apresentam forte apelo mercadológico nas indústrias alimentícia, química, têxtil, farmacêutica e cosmética. Dentre essas, destaca-se o uso das lipases pela indústria cosmética em produtos para a limpeza, tratamento anticelulite e emagrecimento corporal, com a função de remoção de células mortas do estrato córneo da pele. Além do mais, a indústria cosmética tem buscado o emprego de enzimas como ativos naturais em produtos específicos para o cuidado pessoal, os chamados “cosméticos funcionais” ou “cosmecêuticos” (ANSORGE-SCHUMACHER; THUM, 2013).
Desse modo, visando a utilização de substratos pouco estudados, naturais e de elevada concentração de compostos bioativos em sua composição, buscou-se a avaliação das características físico-químicas e bioativas bem como do potencial indutor para a produção de lipases do óleo e da manteiga de cacay e do óleo de coco (cocos nucifera), uma vez que o óleo de coco é incorporado na manteiga de cacay durante sua produção.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar as propriedades físico-químicas e bioativas do óleo e da manteiga de cacay e do óleo de coco, assim como o potencial indutor na produção de lipases por
Aspergillus terreus NRRL-255 utilizando fermentação em estado sólido (FES).
2.2 Objetivos específicos
a) Determinar o perfil de ácidos graxos e a caracterização físico-química das amostras;
b) Realizar a quantificação dos compostos fenólicos totais presentes nas frações hidrofílicas das amostras;
c) Avaliar a capacidade antioxidante in vitro das amostras e das frações hidrofílicas e lipofílicas;
d) Determinar a atividade antibacteriana in vitro do óleo de cacay;
e) Selecionar um resíduo agroindustrial como suporte sólido não inerte para a produção de lipases por fermentação em estado sólido, com base na composição química;
f) Analisar diferentes fontes lipídicas como indutores para a produção de lipase empregando o farelo de trigo como suporte sólido não inerte;
g) Realizar uma triagem das variáveis mais significativas para produção de lipases, utilizando-se de um planejamento fracionário 25-1 com triplicata no ponto central; h) Identificar a condição ótima para a produção de lipases utilizando o delineamento
composto central rotacional (DCCR) do tipo 22 com as variáveis significativas do planejamento fracionário;
i) Determinar o efeito do pH, temperatura, íons metálicos, agente quelante e surfactantes na atividadeenzimática.
3 REFERENCIAL TEÓRICO
3.1 Características gerais sobre o cacay
O cacay (Caryodendron orinoncense Karst.), conhecido popularmente como “noz de Barinas”, é uma árvore de madeira avermelhada e fibrosa de aproximadamente 20 metros de altura (PADILLA; ALVAREZ; ALFARO, 1996). Pertence à família Euphorbiaceae e cresce em solo latino-americano nas bases orientais e ocidentais da Cordilheira dos Andes, mais especificamente na Venezuela, Equador, Peru e Colômbia, a uma altitude de 400 a 1.200 metros, com temperatura ambiente de 24 ºC a 30 °C (PADILLA; ALFARO; CHÁVES, 1998).
Seu fruto cresce em cachos nas extremidades dos ramos e contém três sementes, com comprimento de 2,0 a 3,5 cm e um diâmetro de 1,0 a 1,5 cm, conforme ilustrado na Figura 1. É considerado um alimento não convencional, consumido de diversas maneiras pelos agricultores da região dos Andes (PÉREZ; ALFARO, PADILLA 1999).
Figura 1 – Fruto do cacay em cachos (A) e fruto seco com sementes em evidência (B).
Fonte: (A) Cacay oil organic, 2019. Disponível em: <https://www.purenature.co.nz/products/cacay-oil>. Acesso em: 20 de jun. de 2019; (B) DATTU, Maleka, 2019. Disponível em:
<https://merumaya.com/blogs/news/cacay-oil-the-new-miracle-beauty-oil>. Acesso em: 20 de jun. de 2019.
As sementes apresentam um alto teor de lipídios, variando de 33% a 80%, de acordo com o local de origem (PADILLA; ALVAREZ; ALFARO, 1996). Segundo Pérez et al. (1999), o óleo bruto, obtido a partir da extração das sementes, apresenta boas características organolépticas (sabor, cor e aroma). Sua composição química é predominantemente formada por ácidos graxos poli-insaturados, dos quais se destaca o ácido linoleico. Além da alta concentração de ácido linoleico, o óleo de cacay contém antioxidantes, como o retinol e tocoferol (RADICE et al., 2014).
B A
Apesar de todas essas particularidades, as propriedades químicas e funcionais do óleo de cacay são pouco estudadas. Entretanto, tem-se investigado seu uso para fins comerciais visando sua aplicabilidade pela indústria cosmética (ALFARO; PADILLA; PÉREZ, 2000).
3.2 Lipídios vegetais: qualidade e composição química
A determinação da composição química de lipídios vegetais permite conhecer suas propriedades bioativas, avaliar sua qualidade e direcionar para a produção no setor industrial (CORREIA et al., 2014).
Sabe-se que a qualidade do lipídio vegetal bruto está correlacionada às condições de colheita, exposição à radiação solar, condições de armazenamento (temperatura e umidade) e ao processo de extração que pode ser realizado por solventes, altas temperaturas e prensagem a frio. O uso destes métodos pode influenciar nas características físico-químicas e na estabilidade oxidativa das amostras. Dentre esses processos, destaca-se a prensagem a frio por não degradar os compostos bioativos presentes nas sementes (RAMALHO; SUAREZ, 2013; TOHIDI, RAHIMMALEK, ARZANI, 2017).
No que se refere às principais substâncias bioativas presentes nos lipídios vegetais, os compostos fenólicos se destacam por serem substâncias de ampla distribuição, complexidade e variada estrutura química, podendo ser apresentados desde compostos de anel aromático simples aos grandes complexos polifenólicos de alta massa molecular. São importantes substâncias atuantes na qualidade nutricional, sensorial e no aumento do tempo de prateleira (CONDELLI et al., 2015; OROIAN; ESCRICHE, 2015).
A composição lipídica influencia algumas propriedades físico-químicas como também quantifica o número de ácidos graxos saturados e insaturados presentes nos óleos e gorduras vegetais (MEDEIROS et al., 2013). Óleos com altas concentrações de ácidos graxos insaturados apresentam efeitos antienvelhecimento e antirrugas, sendo importantes matérias-primas para a produção de alimentos, produtos farmacêuticos e cosméticos. Além do mais, sabe-se que a identificação e quantificação de ácidos graxos poli-insaturados e compostos polifenólicos estão diretamente correlacionadas às propriedades antioxidantes e antibacteriana (KOUBAA et al., 2016).
3.2.1 Propriedades bioativas de lipídios vegetais: capacidade antioxidante
Dentre as principais propriedades bioativas presentes nos lipídios vegetais, a capacidade antioxidante merece maior destaque. Os antioxidantes são compostos capazes de inibir ou retardar danos oxidativos causados por radicais livres. Dentre as principais classes de antioxidantes de origem natural, destacam-se os tocóis, carotenóides, esteróis e compostos polifenólicos (SHAHIDI; ZHONG, 2015).
A análise da capacidade antioxidante tem se tornado um desafio, uma vez que a maioria dos métodos foram desenvolvidos para amostras hidrofílicas e os lipídios apresentam uma natureza hidrofóbica, dificultando sua homogeneização em meio aquoso. Além disso, a turbidez gerada pelas amostras oleosas pode ocasionar resultados falso positivos e não reprodutíveis (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011).
Dessa forma, diferentes ensaios químicos para a quantificação das propriedades antioxidantes têm se destacado. Esses ensaios variam em mecanismos, condições de detecção, substratos oxidantes e formas de expressão dos resultados (SHAHIDI; ZHONG, 2015).
Dois mecanismos têm sido relatados para a capacidade antioxidante de lipídios vegetais: O mecanismo HAT (Hydrogen Atom Transfer) supõe que o antioxidante reage com o radical livre através da transferência de átomos de hidrogênio. Por outro lado, o mecanismo SET (Single Electron Transfer) sugere que o oxidante doe um elétron à molécula antioxidante. Logo, destacam-se os ensaios de sequestro dos radicais DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) e ABTS [2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)], pois são métodos aplicáveis e adaptáveis à determinação de antioxidantes em lipídios vegetais, como também por apresentarem os dois mecanismos de reação (HAT e SET) (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011; OROIAN; ESCRICHE, 2015).
Assim, esses métodos têm sido utilizados para determinar a capacidade antioxidante associada à sua composição rica em compostos polifenólicos presentes nos óleos vegetais extraídos da faveleira (Cnidoscolus quercifolius), gengibre (Zingiber
officinale) e oliva (Olea europaea) (CONDELLI et al., 2015; ADARAMOLA;
ONIGBINDE, 2017; RIBEIRO et al., 2017).
Por fim, a determinação da capacidade antioxidante contribui com a investigação da estabilidade oxidativa e com a bioatividade de componentes presentes nos lipídios vegetais, os quais podem despertar o interesse por parte das indústrias alimentícia,
farmacêutica e cosmética, uma vez que os compostos antioxidantes aumentam o tempo de estocagem dos alimentos, reduzem as perdas nutricionais e trazem melhorias para a saúde e estética humana (CASTELO-BRANCO; TORRES, 2011; SHAHIDI; ZHONG, 2015).
3.2.2 Propriedades bioativas de lipídios vegetais: atividade antibacteriana
Além do potencial antioxidante presente nos lipídios vegetais, um efeito antibacteriano tem sido relatado para os óleos vegetais (CHOUHAN; SHARMA; GULERIA, 2017). A utilização de óleos vegetais como antissépticos tópicos pela medicina popular tem tomado o interesse de pesquisadores para a investigação de suas propriedades antibacterianas (NASCIMENTO et al., 2007).
Uma característica importante dos óleos é sua hidrofobicidade, que lhes permite uma maior facilidade de permear na membrana celular bacteriana e, eventualmente, resultar em sua morte. Entretanto, a hidrofobicidade e complexidade dos óleos vegetais são características que dificultam o desenvolvimento de técnicas capazes de mensurar sua atividade antibacteriana in vitro (NASCIMENTO et al., 2007).
Apesar de tais dificuldades, vários bioensaios são bem conhecidos e comumente utilizados. Os mais apropriados são métodos de diluição para a determinação da concentração inibitória mínima (MIC - Minimum Inhibitory Concentration), uma vez que estes oferecem a possibilidade de estimar a concentração do agente antibacteriano testado (CHOUHAN; SHARMA; GULERIA, 2017).
Uma atividade antibacteriana em potencial tem sido relatada para óleos derivados de capim limão (Cymbopogan citratus), lavanda inglesa (Lavandula officinalis), orégano (Origanum vulgarae) e pimenta da Jamaica (Pimenta dioica) (CHOUHAN; SHARMA; GULERIA, 2017).
Assim, óleos que apresentam propriedades antibacterianas podem atuar como agentes promotores de conservação de alimentos, produção de inseticidas e alternativas para o tratamento de doenças infecciosas, tornando-se uma poderosa ferramenta contra a resistência bacteriana (OROIAN; ESCRICHE, 2015).
É importante destacar, ainda, que os óleos vegetais têm sido cada vez mais valorizados para aplicações industriais. A biotecnologia oferece uma série de mecanismos capazes de desenvolver novas alternativas e tecnologias de modo a aprimorar a qualidade e a versatilidade em seu uso (LU et al., 2011).
3.3 Enzimas industriais: lipases e suas características
Enzimas são biocatalisadores que aumentam consideravelmente a velocidade das reações bioquímicas, diminuindo a energia de ativação sem serem efetivamente consumidas na reação (BENKOVIC; HAMMES-SCHIFFER, 2003).
As perspectivas do uso industrial das enzimas microbianas aumentaram muito no século XXI e aumentam continuamente à medida que elas apresentam potencial significativo para atender a demanda da população em rápido crescimento (SINGH et al., 2016). O mercado global de enzimas industriais é impulsionado por três principais categorias: amilases, proteases e lipases (GUERRAND, 2017).
As lipases (EC 3.1.1.3) são importantes enzimas pertencentes a classe das hidrolases que catalisam reações de hidrólise parcial ou completa de triacilgliceróis insolúveis, liberando ácidos graxos, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. O seu sítio ativo é geralmente caracterizado por uma tríade de serina, histidina e um resíduo ácido (ácido aspártico ou glutâmico). São enzimas extremamente versáteis com uma excelente capacidade de catalisar reações de esterificação, transesterificação e interesterificação de lipídios (COLLA et al., 2016; JAVED et al., 2018; GEOFFRY; ACHUR, 2018; PASCOAL et al., 2018).
São enzimas presentes em diversas espécies de animais, plantas e microrganismos. No entanto, a maioria das lipases utilizadas em indústrias é de origem microbiana devido à sua estabilidade em amplas faixas de temperatura e pH, quimio e enantiosseletividade e baixo custo de produção (KADEMI; LEBLANC; HAUDE, 2006; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
As lipases comerciais têm sido desenvolvidas por empresas por meio de modificações biomoleculares utilizando diferentes métodos para que possam ser utilizados como potenciais biocatalisadores em aplicações específicas. É importante destacar, ainda, que uma das áreas de pesquisa em franca expansão atualmente se concentra no uso de diferentes microrganismos, suplementos e substratos, para encontrar as melhores formas para maximização da produção de lipases utilizando condições operacionais que facilitem a redução dos custos de produção em escala industrial (KADEMI; LEBLANC; HAUDE, 2006; RIGO et al., 2010).
3.4 Métodos de produção de lipase microbiana
Diferentes técnicas de produção de lipase microbiana têm sido desenvolvidas em busca de enzimas específicas, estáveis e de maior rendimento. Nesse contexto, a fermentação submersa (FS) e a fermentação em estado sólido (FES) são métodos amplamente utilizados e que têm demonstrado os melhores resultados para produção enzimática (RIGO et al., 2010; SALIHU et al., 2012).
Na FS, o microrganismo cresce em um meio contendo o substrato dissolvido em um meio líquido. Por outro lado, na FES o processo envolve o cultivo de microrganismos em suportes naturais ou sintéticos em uma quantidade limitada de fase líquida livre. Na FES, os microrganismos não crescem apenas na superfície do material sólido, mas também penetram profundamente os espaços intercelular e intracelular do suporte, mostrando um estreito contato ou associação com ele (SALIHU et al., 2012; RAMOS-SANCHEZ et al., 2015).
Apesar da FS apresentar uma maior homogeneidade do meio de cultivo e maior facilidade para controlar os parâmetros de temperatura e pH, a fermentação em estado sólido (FES) tem se mostrado vantajosa, uma vez que requer baixa quantidade de água, menores níveis de repressão catabólica, fornece um meio mais concentrado, permite uma melhor recuperação do produto, maior estabilidade térmica e alta produtividade quando comparada ao processo de FS (SETHI; NANDA; SAHOO, 2016; ORTIZ et al., 2017).
Uma análise econômica comparativa de processos de produção de lipases em estados sólidos e submersos por Penicullium restrictum revelou que o processo de FS pode exigir um investimento de capital 78% maior do que na FES. Essa análise traz a vantagem da FES especialmente com relação ao seu menor custo (CASTILHO et al., 2000).
FES na produção de lipase tem sido mais eficiente quando utilizado fungos filamentosos, seguido de bactérias e leveduras (MAHANTA; GUPTA; KHARE, 2008).
3.5 Fungos filamentosos na produção de lipase: Aspergillus terreus
Os fungos filamentosos são reconhecidos atualmente como os melhores produtores de lipase extracelular, além de apresentarem o processo de extração e purificação relativamente fácil. Eles são considerados proeminentes para aplicação
industrial em virtude da maior estabilidade e ampla especificidade de substrato (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
Dentre os fungos filamentosos, o gênero Aspergillus tem sido relatado como preferido para a produção de lipase. O mesmo pode ser encontrado em todo o mundo e apresenta mais de 180 espécies oficialmente reconhecidas, algumas de forte interesse industrial para a produção de alimentos e enzimas (CONTESINI et al., 2010).
O Aspergillus terreus (Figura 2), fungo saprotrófico, termotolerante, capaz de se reproduzir de forma sexuada e assexuada, encontrado em regiões de clima tropical e subtropical, é especialmente adequado para a FES, devido ao seu modo de crescimento em hifas, boa tolerância a baixa atividade de água e altas condições de pressão osmótica, o que o torna competitivo em relação a outros microrganismos para bioconversão de substratos sólidos (CONTESINI et al., 2010; SETHI; NANDA; SAHOO, 2016).
Figura 2 - Aspecto macroscópico (A) e microscópico (B) do Aspergillus terreus.
Legenda: (A): Colônias com aspecto de camurça e reverso de tonalidade marrom. (B): Cabeça aspergilar com conídios globosos ou elipsoides de parede lisa. Fonte: COMACLE et al., 2016.
Segundo Gulati et al. (1999), o Aspergillus terreus foi capaz de produzir lipase com um efetivo custo-benefício em um intervalo de tempo inferior a 60 horas e elevado rendimento enzimático, tanto em termos de produção como de purificação. Ótimos rendimentos de lipase também foram encontrados em estudos utilizando o A. terreus para a produção de lipase em meios de cultivo com diferentes resíduos agroindustriais (DAMASO et al., 2008; SETHI; NANDA; SAHOO, 2016).
B
A
3.6 Resíduos agroindustriais e suas potencialidades biotecnológicas
Os resíduos agroindustriais são recursos em potencial para o uso biotecnológico por serem produzidos em grandes quantidades e por apresentarem um uso ainda limitado. Além disso, apresentam um baixo custo, fácil acessibilidade e composição nutritiva contendo fontes de carbono, nitrogênio e minerais (CONTESINI et al., 2010).
O uso de resíduos agroindustriais como suporte sólido não inerte na FES tem se mostrado uma alternativa viável e adaptável ao processo, visto que o seu uso reduz consideravelmente o custo de produção de lipase bem como o problema de poluição ambiental. Dentre os resíduos agroindustriais utilizados como suporte sólido não inerte para a produção de lipases fúngicas, destacam-se as tortas de óleos e os resíduos fibrosos (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
As tortas são subprodutos ricos em fontes de carbono e nitrogênio obtidos após a extração do óleo de sementes. Estudos relatam a torta do óleo de castor, torta do óleo de mostarda e torta de óleo de sésamo como bons subprodutos para a produção de lipase (SALIHU et al., 2012; SETHI; NANDA; SAHOO, 2016; JAIN; NAIK, 2018).
Resíduos agroindustriais fibrosos são subprodutos de origem lignocelulósica. Esses são classificados nutricionalmente em resíduos de baixa e alta digestibilidade e são amplamente utilizados em processos de FES por atuarem como suporte sólido não inerte para o crescimento microbiano além de apresentarem nutrientes em sua composição (SALIHU et al., 2012).
Dentre os resíduos fibrosos, destaca-se para a produção de lipase microbiana o farelo de trigo, parte mais externa do grão, conhecido por ser obtido por um processo de moagem na obtenção da farinha de trigo. Rico em carboidratos, proteínas, fibras e minerais, o farelo de trigo tem sido considerado como excelente meio para a produção de lipase fúngica por FES quando suplementado com indutores lipídicos (azeite, óleo de gergelim e mostarda) (MADRUGA; CAMARA, 2000; MAHADIK et al., 2002; MALA et al., 2007).
3.7 Lipases e suas aplicabilidades no mercado global
As lipases são o terceiro maior grupo de enzimas de interesse biotecnológico no mercado global. Seu forte apelo mercadológico se deve as propriedades multifacetadas
e sua versatilidade inata principalmente nas indústrias alimentícia, química, têxtil, farmacêutica e cosmética (CONTESINI et al., 2010; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
No que se refere a produção de sabores e melhora da palatabilidade de alimentos, ésteres de ácidos graxos de cadeia curta e álcoois são compostos aromáticos importantes para a indústria alimentícia e podem ser sintetizados por esterificação catalisada por lipase. Outra aplicabilidade na indústria de alimentos se dá por modificação da estrutura de lipídios, produzindo ingredientes com propriedades benéficas e uma menor quantidade de calorias (MESSIAS et al., 2011). A realização de processos de interesterificação por lipase reduzindo o teor de gordura saturada sem produzir gordura trans tem sido relatado como substituto dos processos de hidrogenação parcial (UPRITCHARD et al., 2005).
Lipases termoestáveis e tolerantes para um meio alcalino são utilizadas em detergentes comerciais atuando na hidrólise de manchas gordurosas, favorecendo o processo de limpeza e solubilização de biomoléculas em água. No que se refere a indústria oleoquímica, a atividade catalítica das lipases, como a transesterificação, tem sido utilizada na produção de biodiesel. Vale salientar também a importância de lipases no tratamento de efluentes de laticínios e matadouros. O uso de lipase neste sistema de tratamento é mais eficaz em termos de custo, uma vez que indústrias podem pagar multas ambientais severas com a descarga de resíduos com altos níveis de gorduras (CONTESINI et al., 2010; GEOFFRY; ACHUR, 2018).
O tratamento de fibras de polietileno tereftalato (PET) por lipase mostra uma série de vantagens frente aos procedimentos químicos. Lipases atuam em tecidos PET melhorando sua hidrofobicidade e capacidade antiestática. Outro uso de lipases, na indústria têxtil, se dá através da remoção de lubrificantes e do processo de desengraxe de produtos de couro (CONTESINI et al., 2010).
Importantes aplicações de lipases na síntese de princípios ativos farmacêuticos estão correlacionadas à resolução de racematos. Considerando a enantiosseletividade de lipases para uma série de substratos, é notável a busca da indústria farmacêutica por enantiômeros ativos, visto que muitas moléculas são quirais e apenas um dos enantiômeros apresentam a atividade biológica desejada, enquanto a outra pode causar efeitos adversos (PASCOAL et al., 2018; LAI et al., 2019).
A indústria cosmética tem empregado lipases como ativos naturais em produtos específicos para o cuidado pessoal, os chamados “cosméticos funcionais” ou
“cosmecêuticos”. Assim, lipases podem ser encontradas em produtos para a limpeza da pele, tratamento anticelulite, produtos para emagrecimento corporal, maquiagens e máscaras faciais. Estes produtos atuam muitas vezes em associação com outras enzimas através de um leve afrouxamento do estrato córneo da pele, ajudando na remoção de sujeiras, remoção de depósitos de gordura e células mortas. Muitos estudos estão sendo desenvolvidos com o intuito de superar os desafios de estabilidade enzimática e da relação custo-benefício. Espera-se, nos próximos anos, uma maior implementação do uso de lipases como bioativos em produtos cosméticos (ANSORGE-SCHUMACHER; THUM, 2013).
B C 4 METODOLOGIA
4.1 Material
As amostras de óleo de cacay, óleo de coco e manteiga de cacay (Figura 3) foram produzidas e gentilmente fornecidas pela Empresa Plantus Indústria e Comércio de Óleos, Extratos e Saneantes LTDA (Nísia Floresta, Brasil). A manteiga de cacay, analisada no presente estudo, apresenta em sua constituição 30% de óleo de cacay e 70% de óleo de coco.
Figura 3 – Amostras produzidas e fornecidas pela empresa Plantus LTDA.
Legenda: (A) óleo de cacay; (B) óleo de coco; (C) manteiga de cacay. Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
A aquisição das amostras foi resultante de uma amostragem por conveniência de um único lote produzido no primeiro trimestre de 2018. Os produtos adquiridos apresentam selo IBD (Inspeções e Certificações Agropecuárias e Alimentícias), garantindo a conformidade com as leis sanitárias e às certificações orgânicas do mercado interno, norte americano e europeu.
O transporte das amostras foi realizado em caixa térmica até o laboratório de Bromatologia, Departamento de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e armazenadas em geladeira a uma temperatura de 4 °C sob proteção do ar e controle da luminosidade.
O uso do óleo de cacay, óleo de coco e manteiga de cacay está autorizado pelo Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (SisGen) sob número de cadastro: A679EA3.
4.2 Determinação do perfil lipídico
4.2.1 Metilação dos ácidos graxos
As amostras foram submetidas ao processo de saponificação com NaOH e esterificação dos ácidos graxos com metanol na presença de HCl de acordo com a metodologia proposta por Hartman e Lago (1986) modificada.
Em um tubo de ensaio com tampa rosqueável, 50 mg das amostras foram levadas para banho-maria (QUIMIS, Q334M-28, Diadema, São Paulo) a 70 ºC por 15 minutos com 2,5 mL de NaOH (0,5 N) em metanol. Após o arrefecimento dos tubos à temperatura ambiente, foram adicionados 7,5 mL do reagente de esterificação (96 partes de metanol para 4 de HCl). Os tubos foram novamente levados para o banho-maria a 70 ºC por 10 minutos e resfriados após o tempo decorrido de análise.
Com o intuito de extrair os ésteres metílicos, foram adicionados 2 mL de hexano com pureza ≥ 97% (Sigma - Aldrich, St. Louis, EUA) e 5 mL de solução saturada de NaCl (20%). Após agitação dos tubos (Even, VX - 38, Araucária, Brasil) por 1 minuto, transferiu-se a fase orgânica para frascos de vidro âmbar onde foram filtradas com membrana filtrante de 0,22 µm. Esta etapa foi realizada por mais de uma vez de modo a garantir uma melhor extração. Os frascos foram vedados e armazenados a -18 ºC para posterior análise cromatográfica.
4.2.2 Perfil dos ácidos graxos por cromatografia gasosa
Os perfis dos ácidos graxos foram determinados por cromatografia gasosa no Laboratório de Combustíveis e Materiais (NPE-LACOM) da Universidade Federal da Paraíba após metilação dos ácidos graxos para produzir os ésteres metílicos correspondentes. Perfis cromatográficos foram registrados e as porcentagens foram determinadas por uma curva de calibração com padrões de ésteres metílicos, utilizando um espectrômetro de massa para cromatografia em fase gasosa GCMS-QP2010 (Shimadzu, Kyoto, Japão) equipado com uma coluna Durabound DB-23 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm). A temperatura do injetor e do detector foram fixados em 230 °C e temperatura da coluna em 90 °C. O gradiente de eluição na coluna foi de 90 a 150 °C (10°C/min), 150 a 200 °C (2 °C/min) e 200 a 230 °C (10 °C/min) em um tempo total de corrida de 39 minutos. O gás
transportador foi Hélio (ALCÂNTARA et al., 2019).
4.3 Caracterização físico-química
Realizou-se a caracterização físico-química para as amostras de óleo e manteiga de cacay e óleo de coco. As amostras semissólidas à temperatura de armazenamento (óleo de coco e manteiga de cacay) foram fundidas (temperatura não maior que 10 ºC do seu ponto de fusão) e, quando necessário, filtradas para a remoção de quaisquer impurezas e traços de umidade. Verificou-se a ausência de sedimentos presentes nas amostras antes da realização das análises.
Foram realizadas as determinações de umidade e matéria volátil por secagem em estufa (Soc Fabbe, São Paulo, Brasil) a 105 ºC ± 1 (método Ca 2d-25); índice de refração por refratômetro Abee digital de bancada (QUIMIS, Q767BD, Diadema, Brasil) à temperatura de 40 ºC (método Cc 7-25) e índices de saponificação (método Cd 3-25), iodo (método Cd 1d-92), acidez (método Cd 3d-63) e peróxido (método Cd 8b-90) por titulometria (AOCS, 2009). A densidade foi determinada através de um densímetro (Anton Paar®, DAM 4500, São Paulo, Brasil) e os resultados foram expressos em kg.m-3 a 20 ºC.
4.4 Obtenção das frações hidrofílicas (FH) e lipofílicas (FL) das amostras
Para a quantificação dos compostos fenólicos totais (CFT) e determinação da capacidade antioxidante foi realizada a extração dos compostos bioativos nas amostras de óleo e manteiga de cacay e óleo de coco, conforme metodologia proposta por Arranz et al. (2008) com modificações.
Uma extração metanólica foi realizada conforme a Figura 4. Para isso, 10 g da amostra foi misturada com 20 mL de metanol. A mistura foi agitada em incubadora de bancada com agitação orbital (QUIMIS, Q816M20, Diadema, Brasil) à temperatura ambiente e 300 rpm por 20 minutos. Após a extração, o sobrenadante foi recuperado em centrífuga (CENTRIBIO, 80-2B, São Paulo, Brasil) a 2.500 rpm por 10 minutos. Com o intuito de se obter uma melhor extração, o processo foi repetido por mais duas vezes. Por fim, obteve-se uma fração hidrofílica (FH) (sobrenadante) e fração lipofílica (FL) (precipitado) para cada uma das amostras analisadas. Cada uma das frações foram secas em rotaevaporador acoplado a bomba à vácuo (BUCHI, V-700, Uster, Suíça) a 30°C e
liofilizadas (LioTop, L101, São Carlos, Brasil). O extrato seco obtido foi mantido sob congelamento (-20 ºC) até a realização das análises.
Figura 4 - Fluxograma para a obtenção das frações hidrofílicas (FH) e lipofílicas (FL).
Fonte: Autoria Própria, 2019.
4.5 Determinação dos compostos fenólicos totais (CFT)
A determinação dos compostos fenólicos totais (CFT) foi realizada conforme metodologia descrita por Singleton e Rossi (1965) com modificações. Nesse caso, utilizou-se as frações hidrofílicas (FH) das três amostras solubilizadas em metanol a uma concentração de 5 mg/mL. 10 g da amostra + 20 mL de metanol Coleta do sobrenadante (FH) Precipitado (FL) Adição de 20 mL de metanol Coleta do sobrenadante (FH) Precipitado (FL) Adição de 20 mL de metanol Coleta do sobrenadante (FH)
Combinação dos extratos das frações hidrofílicas
Secagem em rotaevaporador 30°C Liofilização Armazenamento das amostras a -20°C Coleta do precipitado (FL) Secagem em rotaevaporador a 30°C Liofilização Armazenamento das amostras a -20°C
Em tubos de ensaio, foram pipetados 1 mL do reagente Folin-Ciocalteau 50% (v/v) e 400 µL da amostra. Os tubos foram agitados e após 3 minutos foram adicionados 400 µL de carbonato de sódio (Na2CO3) a 7,5% (p/v). Realizou-se o preparo do branco
onde a amostra foi substituída por metanol. Os tubos foram incubados a 37°C em banho-maria (QUIMIS, Q334M-28, Diadema, Brasil) por 30 minutos sob proteção da luz. Em seguida, as absorbâncias foram mensuradas a um comprimento de onda de 750 nm em espectrofotômetro UV/Vis (Biospectro, SP-220, Curitiba, Brasil).
O conteúdo de compostos fenólicos totais (CFT) foi calculado a partir da curva analítica do ácido gálico (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) nas concentrações de 10-150 µg/mL. Os resultados foram expressos em miligramas de ácido gálico equivalente por kilograma de amostra (mg EAG.kg-1).
4.6 Capacidade antioxidante in vitro
A capacidade antioxidante foi determinada nos óleos de cacay e coco, na manteiga de cacay e em suas respectivas frações hidrofílicas (FH) e lipofílicas (FL). Para isso, procedeu-se o preparo das amostras e das frações, as quais foram diluídas em n-hexano de modo a haver uma padronização, tornando os resultados comparáveis diretamente.
4.6.1 Capacidade antioxidante através do sequestro do radical DPPH
A determinação da capacidade antioxidante através da redução do radical livre estável DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil) foi realizada segundo o método descrito por Brand-Williams et al. (1995) com modificações. Dessa forma, foram adicionados 200 µL de uma solução etanólica de DPPH (0,04 mg/mL) e 40 µL das amostras, previamente diluídas, em cada cavidade da microplaca de 96 poços. Um controle foi realizado substituindo-se as amostras por n-hexano.
Após 25 minutos de reação em ambiente escuro à temperatura ambiente, procedeu-se a análise em leitor de microplacas (Biochrom Asys, UVM340, Cambridge, Reino Unido) a 517 nm. Uma curva de calibração foi construída com concentrações de 10 - 200 µM de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). Os resultados
foram expressos em µmol de Trolox equivalente (TE) por grama (g) de amostra (µmol TE.g-1).
4.6.2 Capacidade antioxidante pela captura do radical livre ABTS
A avaliação do potencial antioxidante pelo método do radical ABTS [2,2’-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico)] foi realizado conforme a metodologia proposta por Rufino et al. (2007) com adaptações.
Resumidamente, preparou-se uma solução do radical catiônico ABTS com 1 mL de solução de ABTS (7 mM) e 17,6 µL de solução de persulfato de potássio (140 mM). A solução foi mantida no escuro por 16 horas a temperatura ambiente e diluída com etanol até absorbância de aproximadamente 0,7 a 734 nm. O ensaio foi realizado em penumbra, adicionando-se 20 µL de amostra e 280 µL da solução diluída do radical ABTS em cada poço da microplaca de 96 poços. Um controle foi realizado substituindo-se as amostras por n-hexano. A amostra foi incubada ao abrigo da luz por 6 minutos e a análise realizada em leitor de microplaca (Biochrom Asys, UVM340, Cambridge, Reino Unido) a 734 nm.
Uma curva de calibração foi construída com concentrações de 0 a 800 µM de Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico). Os resultados foram expressos em µmol de Trolox equivalente (TE) por grama (g) de amostra (µmol TE.g-1).
4.7 Determinação da atividade antibacteriana in vitro
A avaliação da atividade antibacteriana in vitro foi realizada apenas para o óleo de cacay em virtude dos melhores resultados observados na capacidade antioxidante. Para isso, em tubo de vidro estéril, 0,8 mL do óleo foi diluído em 4,2 mL de água estéril e 0,05 mL de Tween 80. A amostra foi agitada durante 5 minutos em agitador de tubo do tipo vortex (Even, VX-38, Araucária, Brasil), obtendo-se uma concentração inicial de 16%, equivalente a 144 mg/mL, considerando a densidade do óleo igual a 0,9 g/mL.
Seguiu-se a metodologia proposta por Guo et al. (2013) com modificações. A atividade foi avaliada contra as bactérias gram-negativas Escherichia coli (ATCC 25912),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Salmonella paratyphi (ATCC 14028) e
29212) e Staphylococcus aureus (ATCC 6538). As cepas foram ativadas em ágar Mueller Hinton (Merck, Darmstadt, Alemanha) duas vezes concentrado a 35 ºC por 24 horas.
Após ativação, a suspensão de microrganismos foi preparada diluindo-se uma colônia do microrganismo crescido em meio sólido (ágar Mueller Hinton) em 5 mL de solução salina 0,9% (p/v). Uma alíquota foi retirada para leitura em espectrofotômetro UV/Vis (Biospectro, SP-220, Curitiba, Brasil) a 625 nm com absorbância entre 0,08 a 0,10 (correspondente a uma concentração de 1x108 UFC/mL). Em seguida, foi retirado 100 µL
dessa suspensão e transferido para um tubo de vidro estéril contendo 9,9 mL de caldo Mueller Hinton duas vezes concentrado.
Em microplaca de 96 poços, 50 µL da solução de óleo de cacay em diferentes concentrações (144,00 mg/mL - 2,25 mg/mL) foram adicionados por diluição seriada juntamente com 50 µL de suspensão de microrganismos. Em paralelo, foi realizado um controle para a solução salina, diluente da amostra (4,2 mL de água estéril com 0,05 mL de Tween 80) e antibióticos (gentamicina (50 µg.mL-1) para as bactérias gram-negativas e vancomicina (20 µg.mL-1) para as bactérias gram-positivas), onde o volume da amostra adicionado em cada poço foi substituído pelo controle. Em seguida, realizou-se a leitura em espectrofotômetro de microplaca (Biochrom Asys, UVM340, Cambridge, Reino Unido) a 595 nm.
Após um período de incubação de 24 horas a 35 ºC e 200 rpm em incubadora de bancada com agitação orbital (QUIMIS, Q816M20, Diadema, Brasil) repetiu-se a leitura no mesmo comprimento de onda a fim de se avaliar a densidade ótica de crescimento bacteriano. O resultado da inibição de crescimento bacteriano foi expresso em porcentagem para a concentração de óleo com maior atividade.
4.8 Produção de lipase
4.8.1 Caracterização dos resíduos agroindustriais
Para a escolha do suporte sólido não inerte mais adequado para a produção de lipase por fermentação em estado sólido (FES), foram caracterizados os seguintes resíduos agroindustriais (Figura 5): farelo de trigo, farelo de milho, farelo de soja e farelo da casca de arroz, adquiridos em estabelecimentos comerciais da cidade do Natal/RN, Brasil.
A B C D Figura 5 – Resíduos agroindustriais utilizados como suporte sólido não inerte.
Legenda: Farelo de trigo (A); farelo de milho (B); farelo de soja (C); farelo da casca de arroz (D). Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
Quanto a composição química, foram realizadas as seguintes análises: Umidade (método 925.45b) por secagem direta em estufa (Soc Fabbe, São Paulo, Brasil) a 105 ºC; resíduo por incineração - cinzas (método 923.03) por aquecimento em mufla (Jung, 612, Blumenau, Brasil) a 550 – 570 ºC; proteínas pelo método de Kjeldahl modificado – fator de conversão do nitrogênio: 6,25 (método 920.87) e lipídios (método 920.39) por extração direta em Soxhlet (AOAC, 1996). A fibra bruta (método 044/IV) foi determinada conforme a metodologia proposta em Brasil (2008) e carboidratos pela diferença dos valores encontrados para umidade, cinzas, proteínas, lipídios e fibras para 100 g de amostra.
A granulometria foi determinada conforme o método 66-20 com adaptações (AACC, 2010). Desta forma, foram peneirados 20 g de uma amostra representativa em peneiras granulométricas (Bertel, Caieiras, Brasil) com diferentes diâmetros de abertura (10 mesh; 14 mesh; 16 mesh; 20 mesh; 28 mesh; 48 mesh). Esse processo foi realizado em triplicata. As frações deixadas nas peneiras foram pesadas e os resultados foram expressos em porcentagens.
Para o índice de absorção de água (IAA), seguiu-se a metodologia descrita por Orzua et al. (2009) com modificações. Desta forma, os resíduos (farelo de trigo, farelo de milho, farelo de soja e farelo da casca de arroz) foram pesados (1,00 g ± 0,1 g) em tubos de sedimentação e suspendidos em 10 mL de água destilada. Os tubos foram agitados em agitador de tubo do tipo vortex (Even, VX-38, Araucária, Brasil) por 1 minuto e centrifugados (CENTRIBIO, 80-2B, São Paulo, Brasil) a 3.000 rpm por 10 minutos. Os sobrenadantes foram descartados e o IAA foi expresso em gramas de água no resíduo molhado por grama de resíduo seco (p/p), conforme a Equação 1.
IAA (p/p): (Peso resíduo molhado – Peso resíduo seco) / Peso resíduo seco (Equação 1)
4.8.2 Microrganismo
A linhagem fúngica utilizada foi a do Aspergillus terreus (NRRL-255), cedida pelo banco de microrganismos “ARS Culture Collection” (Peoria - Illinois, EUA). A cepa de Aspergillus terreus foi ativada em meio sólido PDA (potato dextrose agar) a 30 ºC por um período de 5 dias. Após ativação, as placas foram mantidas sob refrigeração a 4 ºC (Figura 6). Os repiques foram realizados a cada 3 meses para a manutenção do microrganismo.
Figura 6 - Aspergillus terreus ativado em placa com meio PDA.
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
4.8.3 Triagem do indutor lipídico
Após a definição do farelo de trigo como suporte sólido não inerte, uma triagem com diferentes indutores lipídicos foi realizada com o intuito de avaliar a capacidade de desenvolvimento fúngico e produção de lipase.
A fermentação em estado sólido (FES) foi realizada em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 9 g de farelo de trigo e 1 g do indutor (óleo de cacay, óleo de coco, manteiga de cacay e azeite de oliva extra virgem). Este último foi adquirido comercialmente no município de Natal/RN, Brasil e utilizado como padrão por apresentar excelentes resultados relatados na literatura (GEOFFRY; ACHUR, 2018).
Uma solução de sais foi preparada para a suplementação do meio com NaNO3
FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, MnCl e CuSO4.5H2O (0,001% p/v). Os frascos foram
esterilizados em autoclave (PRISMATEC, Itu, Brasil) a 121 ºC por 15 minutos.
O inóculo foi obtido através da extração dos esporos em placa com 2 mL de Tween 80 a 1% (p/v) seguido de diluição e contagem em câmara de Neubauer com o auxílio de microscópio binocular (Olympus, Waltham, EUA).
Após a contagem dos esporos, adicionou-se o inóculo a uma concentração final de 1,0 x 107 esporos/g de meio sólido e 7 mL da solução umidificante (solução de sais) aos
frascos em câmara de fluxo laminar (QUIMIS, Diadema, Brasil). Os frascos foram agitados manualmente e incubados em estufa (QUIMIS, Q317M, Diadema, Brasil) a 30º ± 1 ºC, conforme representado na Figura 7. Após 120 horas de fermentação, deu-se prosseguimento a etapa de extração do complexo enzimático.
Figura 7 – Meio de cultivo contendo farelo de trigo como suporte sólido não inerte antes (A) e após (B) fermentação em estado sólido (FES).
Fonte: Arquivo pessoal, 2019.
4.8.4 Obtenção do extrato enzimático bruto
A extração foi realizada com o auxílio de 50 mL de tampão Tris-HCl (0,05 M, pH 8) em incubadora de bancada (QUIMIS, Q816M20, Diadema, Brasil) a 37 ºC e 200 rpm por 30 minutos. Após extração, o conteúdo foi filtrado em papel filtro e centrifugado (CENTRIBIO, 80-2B, São Paulo, Brasil) a 3.000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foi utilizado para a determinação da atividade lipolítica imediatamente após a extração.
4.8.5 Determinação da atividade lipolítica
A atividade enzimática foi determinada pelo método da hidrólise do substrato cromogênico p-nitrofenil-palmitato - pNPP (Sigma – Aldrich, St. Louis, EUA) (SILVA et al., 2005). A solução A foi preparada a 3 mg/mL de pNPP dissolvida em isopropanol e a solução B com 450 mL de tampão Tris-HCl (0,05 M, pH 8), 0,5 g de goma arábica e 2 g de Triton X-100. A emulsão foi preparada gotejando-se 1 mL da solução A em 9 mL da solução B, ambas equilibradas a 37 ºC em banho-maria (QUIMIS, Q334M-28, Diadema, São Paulo) por 10 minutos.
A reação foi realizada em microplaca de 96 poços, adicionando-se 10 μL do extrato bruto enzimático e 90 μL da emulsão recentemente preparada. Determinou-se a absorbância em leitor de microplaca (DIATEK, DR200Bs, Wuxi, China) a 405 nm no tempo inicial e após 30 minutos de incubação a 37 ºC. O valor entre a leitura final e inicial corresponde ao p-nitrofenol liberado durante a reação. A quantidade de p-nitrofenol presente em cada poço foi calculada utilizando a equação da reta obtida pela curva de calibração (R2 = 0,9987) construída com concentrações de 0 – 140 µM.
Uma unidade de atividade lipolítica foi definida como a quantidade de p-nitrofenol liberado por minuto por volume de reação (μmol/min/mL).
4.8.6 Delineamento experimental
Os resultados dos testes anteriores permitiram os subsequentes desenhos experimentais, nos quais o farelo de trigo foi utilizado como suporte sólido não inerte e a manteiga de cacay como componente lipídico indutor. Os meios foram enriquecidos com a solução de sais nutrientes conforme descrito na seção 4.9.3 (triagem do indutor lipídico).
4.8.6.1 Delineamento fatorial fracionário
A otimização das condições de cultivo foi baseada nos métodos estatísticos multivariados (RODRIGUES; IEMMA, 2005). A princípio, utilizou-se o planejamento fatorial fracionário 25-1 com triplicata no ponto central, em um total de 19 ensaios, de modo a avaliar as variáveis independentes (concentração do indutor (manteiga de cacay), temperatura, pH, umidade e tempo de fermentação) que influenciam na atividade de lipase
(variável dependente). A atividade lipolítica foi determinada pelo método da hidrólise do substrato cromogênico p-nitrofenil-palmitato conforme relatado na seção 4.9.5. Os fatores e os níveis com codificações escolhidos para o delineamento estão apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 – Fatores e níveis utilizados no delineamento fatorial fracionário 25-1.
Fatores Níveis -1 0 +1 Indutor (%) 1 5,5 10 Temperatura (°C) 25 31 37 pH 6 8 10 Umidade (%) 60 70 80 Tempo (horas) 96 168 240
Fonte: Autoria Própria, 2019.
4.8.6.2 Delineamento composto central rotacional (DCCR)
Um delineamento composto central rotacional do tipo 22 foi aplicado para determinar os níveis ótimos dos fatores que apresentaram resultados estatisticamente significativos no planejamento fatorial fracionário. Desta forma, os parâmetros definidos e utilizados como variáveis independentes foram a temperatura e o tempo, analisados em cinco níveis codificados (−1,41, −1, 0, +1, +1,41) e três réplicas no ponto central, em um total de 11 ensaios. A variável resposta utilizada para a seleção das melhores condições foi a atividade lipolítica. Os fatores e os níveis com codificações utilizados estão apresentados na Tabela 2.
Tabela 2 - Fatores e níveis utilizados no delineamento composto central rotacional 22.
Fatores Níveis
-1,41 -1 0 +1 +1,41
Temperatura (°C) 19 21 26 31 33
Tempo (horas) 62 72 96 120 130
Fonte: Autoria própria, 2019.
4.8.7 Caracterização da lipase
Utilizou-se para a caracterização da lipase o extrato bruto enzimático obtido nas melhores condições definidas pelo planejamento experimental. Dessa forma, a avaliação do efeito do pH na atividade lipolítica foi realizada para os valores de 3,0 - 10,0.
