Avaliação imunodulatória da lectina de sementes de Cratylia mollis (Cramoll 1,4) em linfócitos experimentais

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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO. AVALIAÇÃO IMUNOMODULATÓRIA DA LECTINA DE SEMENTES DE Cratylia mollis (CRAMOLL 1,4) EM LINFÓCITOS EXPERIMENTAIS. Recife, 2009.

(2) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO – DOUTORADO CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS. Tese de doutoramento apresentada ao Doutorado em Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco como pré-requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração em Biotecnologia.. Doutoranda: CRISTIANE MOUTINHO LAGOS DE MELO. Orientadora: Prof.ª Dr.ª Patrícia Maria Guedes Paiva. Co-Orientadora: Prof.ª Dr.ª Luana Cassandra B. Barroso Coelho. Co-Orientadora: Prof.ª Dr.ª Maria Tereza dos Santos Correia. 15.

(3) Melo, Cristiane Moutinho Lagos de Avaliação imunodulatória da lectina de sementes de Cratylia mollis (Cramoll 1,4) em linfócitos experimentais / Cristiane Moutinho Lagos de Melo. – Recife: O Autor, 2009. 122 folhas: il., fig., tab. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Ciências Biológicas, 2009. Inclui bibliografia. 1. Biotecnologia 2. Imunomodulação. I. Título.. 660.6. CDD (22.ed.). Lectinas. 3.. Cramoll. 1,4. 4.. UFPE/CCB - 2009-203.

(4) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. 16.

(5) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. AGRADECIMENTOS. Agradeço aos meus pais por toda colaboração, incentivo e compreensão para realização de mais este trabalho em minha vida. A minha filha que, embora pequenina, sempre aceitou as minhas ausências, participou das minhas privações e cresce compreendendo que só trabalhando e estudando é que podemos alcançar as metas mais difíceis. À Prof.ª Dr.ª Maria Tereza dos Santos Correia por sua participação e incentivos ao longo de todos esses anos de minha vida acadêmica. Meu sincero respeito, carinho e admiração por esta profissional. À Prof.ª Dr.ª Luana Cassandra pelo incentivo, ajuda e participação em etapas importantes deste doutorado, bem como a indicação para o estágio na UNICAMP. À Prof.ª Dr.ª Patrícia Maria Guedes Paiva pelas orientações bem direcionadas, pela parceria e pelas sugestões na escrita dos trabalhos. À Dr.ª Valéria Alves Rego Pereira pela amizade, respeito e total dedicação oferecidos a mim neste último ano de doutorado. Obrigada Valéria por sua co-participação nos experimentos, na escrita dos papers, na minha indicação para o Aggeu Magalhães e, principalmente, pela injeção de ânimo do meu dia a dia. Ao prof. Dr. Aníbal Eugênio Vercesi pela oportunidade de estágio em seu laboratório de Bioenergética localizado na Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP. Agradeço especialmente o seu respeito, carinho e incentivo nos meses que permaneci em seu laboratório bem como as demonstrações de afeto e construtivismo profissional oferecidas em outras oportunidades. Aos colegas de laboratório da UNICAMP, Bruno, Karina, Marcos e Josiane pela ajuda na realização dos experimentos, Luciane, Juliana, Carina, Ruth, Paolo, Thiago, Márcia e Kívia pela amizade e momentos de descontração e, especialmente, Mariana, Ana Catarina e Natália por toda ajuda, cuidado e carinho que me ofereceram. Aos colegas de laboratório de Recife (CPqAM), Maria Carolina, Arthur, Fabiana, Andresa, Marina, Amanda e Lucas por toda a ajuda em prol do desenvolvimento dos experimentos. desta. tese.. Agradeço. intensamente. a. vocês. que. me. ajudaram. incondicionalmente na realização dos ensaios e espero um dia retribuir toda a ajuda que vocês me dispuseram nestes últimos meses. 17.

(6) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. Agradeço ainda à Heloísa do Departamento de Análises Estatísticas do CPqAM que analisou os meus dados sem limitações de horários e locais, me fornecendo os resultados quase que imediatamente à obtenção dos mesmos. À equipe do Biotério, especialmente, Giuliana Schirato e Maria Conceição pelo suporte técnico e ajuda na realização dos experimentos. À Adenilda, secretária do CCB por toda ajuda, facilitação e amizade oferecidos e à Neide e Miron, secretários do Departamento de Bioquímica, pela prestatividade de sempre. Agradeço, por fim, ao programa de Pós-Graduação do Centro de Ciências Biológicas no qual concluí meu Mestrado e estou concluindo meu Doutorado, ao CNPq pelo financiamento da Bolsa de Doutorado, a CAPES pelo estágio realizado na UNICAMP através do projeto de intercâmbio entre Pós-graduações dentro do país, a FACEPE, a FINEP e a FIOCRUZ pelo financiamento, instalações e suporte para a realização dos experimentos.. 18.

(7) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. “Disseram: Que não vencerás em teus empreendimentos; Que o teu doente querido está em clima de morte; Que atravessarás longa noite de provações; Que não mais encontrarás o trabalho que mais desejas; Que não te recuperarás de certas perdas sofridas; Que não realizarás os sonhos que acalentas; Que os entes amados distantes de ti nunca mais te voltarão ao convívio; Que o desgaste do corpo físico não mais te permitirá as realizações que tanto almejas; Que, por essa ou por aquela falta, andarás sobre a Terra constantemente sobre pedras e espinhos. Tudo isso disseram... Entretanto, continua agindo e servindo, orando e esperando, porque as opiniões de Deus são diferentes”. Emmanuel/Francisco Cândido Xavier. 19.

(8) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. À Amandinha, maior incentivo e mais puro amor que Deus concretizou em minha vida. Dedico.. 20.

(9) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. LISTA DE ABREVIATURAS. Cramoll 1,4. Lectina de Cratylia mollis isoformas 1 e 4 associadas. PMNs. Células Polimorfonucleares. TGF-α e β. Fator de Crescimento Transformante α e β. IL-1 a IL-22. Interleucinas. IFNγ. Interferon γ. CD4+. Linfócito T CD4. CD8+. Linfócito T CD8. EROs. Espécies Reativas de Oxigênio. [Ca2+]cit. Cálcio citosólico. Con A. Lectina de Canavalia ensiformis (Concanavalina A). PHA. Lectina de Phaseolus vulgaris (Fitohemaglutinina). NaCl. Cloreto de Sódio (Solução fisiológica). Th0. Linfócito T CD4 inativo. Th1. Resposta imune tipo 1. Th2. Resposta imune tipo 2. Th3. Resposta imune tipo 3. APCs. Células Apresentadoras de Antígenos. NO. Óxido Nítrico. 21.

(10) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. LISTA DE TABELAS. TABELA 1 TABELA 2. TABELA 3. 25. Discriminação das diferentes subpopulações de linfócitos T Caracterização das citocinas da imunidade inata, seus alvos e mecanismos de ação Caracterização das citocinas da imunidade adquirida, seus alvos e mecanismos de ação. 28. 29. 22ix.

(11) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. LISTA DE FIGURAS. FIGURA 1. Caracterização da leguminosa Cratylia mollis. A e B – formação arbustiva do feijão camaratu; C – sementes de C. mollis.. 22. Estrutura tridimensional da Cramoll 1. A - Representação da estrutura FIGURA 2. terciária da lectina. B - sítio de ligação MeαMan e os íons Ca2+ e. 23. Mn2+. FIGURA 3. Caracterização da transformação da célula T CD4+ ou Th0 em seus subtipos celulares.. 30. Mecanismo de ativação dos linfócitos T a partir do contato de células T FIGURA 4. presentes nos órgão linfóides com uma célula apresentadora de. 31. antígeno (APC). FIGURA 5. Processo de ativação linfocitária envolvendo superprodução de EROs e Ca2+.. 35. 23 x.

(12) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. RESUMO. Cramoll 1,4 é uma lectina com especificidade de ligação para glicose/manose e é extraída de sementes da leguminosa Cratylia mollis Mart. Cramoll 1,4 apresenta atividade antitumoral e mitogênica sobre linfócitos. O objetivo deste estudo foi investigar a atividade imunomodulatória de Cramoll 1,4, em animais tratados in vivo e células cultivadas in vitro. Ratos albinos Wistar (Rattus norvegicus), com nove semanas de idade e fêmeas, foram tratados com injeção intraperitoneal de Cramoll 1,4 (235 µg/ml em dose única) e após sete dias linfócitos esplênicos foram isolados e mantidos em cultura para a análise da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), níveis de cálcio, expressão de citocinas e viabilidade celular. Linfócitos isolados de baço dos camundongos BALB/c (machos, 5 semanas de idade) foram cultivados em meio RPMI suplementado e em seguida foram utilizados nos ensaios de atividade citotóxica de Cramoll 1,4, produção de IFN-γ, IL-10 e óxido nítrico. Camundongos BALB/c foram também previamente imunizados com injeções intraperitoneais de Cramoll 1,4 (100 µg/ml) em dose única durante dois dias e seis dias após este procedimento os linfócitos esplênicos foram isolados para a análise da resposta proliferativa dessas células, investigação da estimulação das populações de células imunes (linfócitos T CD3, CD4+, CD8+, NK e CD11b) e determinação dos níveis intracelulares de IL-10 e IFN-γ. As lectinas de sementes da planta Canavalian ensiformes (Concanavalina A - Con A) e da planta Phaseolus vulgaris (Fitohemaglutinina - PHA) foram usadas como controles positivos. Cramoll 1,4 promoveu a ativação da resposta efetora de linfócitos esplênicos de ratos através do aumento da produção de EROs citosólico e mitocondrial, aumento dos níveis citosólicos de Ca2+ e indução da produção de IL-1β, sem promover aparente dano celular. Cramoll 1,4 em sua concentração atóxica induziu a resposta Th1 específica através da produção de IFN-γ, suprimiu a produção de NO e promoveu alterações em células CD3, CD4+ e NK provenientes do sangue periférico dos camundongos. Os dados obtidos revelaram a atividade imunomodulatória desta lectina, através do aumento do balanço energético de EROs, de Cálcio, da produção de citocinas e da indução da resposta Th1 específica, bem como revelou sua habilidade em induzir proliferação em linfócitos experimentais de baço, caracterizando a atividade imunoestimulatória da Cramoll 1,4. Palavras-chave: Cramoll 1,4, lectinas, imunomodulação, citocinas, imunoestimulação.. 24 xi.

(13) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. ABSTRACT. Cramol 1,4 is a lectin that link specificity for glucose/mannose and is extracted from seeds of the leguminosae Cratylia mollis Mart. Cramoll 1,4 shows antitumor and mitogenic activity in lymphocytes. The aim of this study was investigate immunomodulatory activity of Cramoll 1,4 on animals treated in vivo and cultivated cells in vitro. Albinus Wistar rats (Rattus norvegicus), with nine weeks age and females, were treated with intraperitoneal injection of Cramoll 1,4 (235 µg.ml-1 unique dose) and after seven days splenic lumphocytes were isolated and maintained in cultivate medium for analyses of reative oxygen species production (ROS), Calcium levels, cytokines expression and cellular viability. Mice spleen lymphocytes (BALB/c, male, 5 weeks age) were cultivated on RPMI completed medium and before were utilized on citotoxity assays, IFN-γ, IL-10 and nitric oxide production. Mice still previously immunized with intraperitoneal injections of Cramoll 1,4 (100 µg.mL-1) unique dose for two days and six days after this procedure spleen lymphocytes were isolated for proliferative response of these cells, immune cells profile investigation (CD3, CD4+, CD8+, NK and CD11b) and determination of IL-10 and IFN-γ intracellular levels. Canavalian ensiformis seeds lectin (Concanavalin A - Con A) and Phaseolus vulgaris seeds lectin (Phitohemaglutinin - PHA) were utilized like positive controls. Cramoll 1,4 promotes effectors response activation on rat spleen lymphocytes through increase of cytosolic and mitochondrial ROS production, increase of cytosolic levels of Ca2+ and induction of IL-1β production, without promotes cellular damage. Cramoll 1,4 in non toxic concentration induces Th1 specify response through IFN-γ production, inhibited NO production and promotes changes on CD3, CD4+ and NK T cells on murine peripheral blood. Data obtained shows immunomodulatory activity of this lectin through increase of ROS energetic balance, increase of Calcium, cytokine production and through Th1 specify response induction. Cramoll 1,4 still show proliferation induction on experimental spleen lymphocytes characterizing, with this, your immunostimulatory activity. Key words: Cramoll 1,4, lectins, immunomodulation, cytokines, immunostimulation.. 25 xii.

(14) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. SUMÁRIO. LISTA DE ABREVIATURAS. viii. LISTA DE TABELAS. ix. LISTA DE FIGURAS. x. RESUMO. xi. ABSTRACT. xii. CAPÍTULO 1 1. REVISÃO DA LITERATURA. 15. 1.1 LECTINAS: ORIGEM, DESCOBERTA E CONCEITO. 15. 1.2 LECTINAS COMO FERRAMENTAS NA IMUNOMODULAÇÃO. 18. 1.3. LECTINA. DE. Cratylia. mollis:. ORIGEM. E. APLICAÇÕES. BIOTECNOLÓGICAS. 21. 1.4 RESPOSTA IMUNE E O PROCESSO DE ATIVAÇÃO LINFOCITÁRIA. 24. 2. OBJETIVOS. 38. 2.1 OBJETIVOS GERAL. 38. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 38. 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 39. CAPÍTULO 2. 51. CRAMOLL 1,4 LECTIN INCREASES ROS PRODUCTION, CALCIUM LEVELS AND CYTOKINE EXPRESSION IN TREATED RAT SPLEEN CELLS CAPÍTULO 3. 90. IMMUNOMODULATORY RESPONSE OF CRAMOLL 1,4 LECTIN ON EXPERIMENTAL LYMPHOCYTES CAPÍTULO 4. 106. IMMUNOPHENOTYPING STUDIES AND IFN-γ PRODUCTION ON LYMPHOCYTE OF IMMUNIZED MICE WITH CRAMOLL 1,4 LECTIN 4. CONCLUSÕES. 122. 26.

(15) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. Capítulo 1 INTRODUÇÃO. 27.

(16) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. 1. INTRODUÇÃO. 1.1 LECTINAS: ORIGEM, DESCOBERTA E CONCEITO. O estudo das lectinas teve início em 1888 quando Stillmark, investigando constituintes de algumas plantas da família Euphorbiaceae (mamona) concluiu que sementes extraídas da planta Ricinus communis, denominada ricina, apresentava atividade aglutinante em células sanguíneas (STILLMARK e RICIN, 1888; KOCOURECK apud LIENER, et al., 1986). Na verdade Ricinus communis contém duas proteínas ligadoras de galactose, denominadas aglutininas e toxinas, sendo as últimas altamente tóxicas para as células eucarióticas. As proteínas toxinas da ricina contém duas subunidades, A e B. A subunidade A (30 kDa) incorpora-se ao citosol celular impedindo a síntese de proteína através da inativação de ribossomos sendo, por esta propriedade, denominada Proteína Inativadora de Ribossomo (Ribosome-Inactivating Protein – RIP) e a subunidade B (33 kDa) liga-se a receptores de superfície celular que contenham o resíduo terminal de galactose (OLSNES e PIHL, 1980; ENDO et al., 1987). Atualmente atividades enzimáticas foram atribuídas à ricina e às toxinas relacionadas, mas ainda é incerto se estas tem um papel importante na fisiologia da intoxicação (MADDALONI et al., 2004; OLSNES, 2004). Em 1889, Hellin obteve um resultado de hemaglutinação similar, utilizando o extrato de Abrus precatorius (jequiriti), chamando a proteína de abrina (SHARON e LIS, 1987). Na década de 60, relataram-se as descobertas acerca da mitogenicidade da lectina de Phaseolus vulgaris - PHA (NOWELL, 1960) e da intensa aglutinação de células transformadas pela lectina de germe de trigo, Triticum vulgares - WGA (AUB et al., 1963). Estas observações aumentaram o interesse pela atividade biológica das lectinas e, principalmente pelo estudo da Concanavalina A (Con A), lectina obtida pela extração de sementes da planta Canavalia ensiformes por Inbar e Sanchs em 1969, verificando-se também a aglutinação preferencial de células malignas. A partir 28.

(17) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. dessas descobertas iniciais houve um impulso nas pesquisas básicas e aplicadas sobre as lectinas, o que se mantém até os dias atuais através da lectinologia. Primeiramente Sharon e Lis (1972) incluíram no conceito de lectina todas as proteínas obtidas de plantas, microorganismos ou animais de origem não imunológica, que se ligam a carboidratos, sendo especificas ou não para um determinado grupo sangüíneo. Já em 1980, Goldstein e colaboradores conceituaram lectinas como sendo proteínas ou glicoproteínas de origem não imune, ligantes de carboidratos capazes de aglutinar células e/ou precipitar glicoconjugados. O fato de existirem lectinas que são monovalentes, não dotadas da capacidade de aglutinar células cria a necessidade de ampliar este conceito. Ultimamente o conceito de lectinas tem-se tornado cada vez menos restritivo, com definições como a de Peumans e Van Damme (1995) de que lectinas são proteínas que possuem ao menos um domínio não catalítico que se liga reversível e especificamente a um monossacarídeo ou oligossacarídeo. Segundo Grangeiro (1997), lectinas são proteínas ou glicoproteínas amplamente distribuídas na natureza, e que se combinam, especificamente, com receptores da superfície celular, ligando-se às células e chegando, eventualmente, a provocar a aglutinação das mesmas. As proteínas classificadas como lectinas possuem como propriedade comum a habilidade de reconhecer e se ligar reversivelmente e com alta especificidade a resíduos de carboidratos, sem, contudo, alterar a estrutura química dos ligantes (CAVADA, 1980). As lectinas estão presentes em todas as classes e famílias de organismos, sendo encontradas em vegetais superiores, algas, fungos, animais (vertebrados e invertebrados), bactérias e em vírus. Em vegetais, elas são detectadas em centenas de espécies de plantas. A maioria das lectinas vegetais é obtida de semente, principalmente de leguminosas, onde são acumuladas no período de maturação e desaparecem após a germinação. As lectinas constituem cerca de 10% das proteínas totais de semente, porém a quantidade isolada é. 29.

(18) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. pequena: varia entre 0,1-1% deste total (LORIS, 2002; SHARON e LIS, 2004b; ALENCAR et al., 2005). Lectinas de origem bacteriana, viral e animal possuem a função de mediar inúmeros eventos de reconhecimento biológico, como: defesa do hospedeiro, fertilização, desenvolvimento, infecção parasitária, metástase tumoral e inflamação pela decifração dos glico-códigos presentes na estrutura das glicanas ligadas aos glicoconjugados da membrana celular. Em contraste, os papéis fisiológicos das lectinas vegetais ainda não foram completamente elucidadas. Diversos experimentos indicam que as lectinas vegetais são proteínas de defesa contra animais herbívoros e possuem função na simbiose entre as bactérias fixadoras de nitrogênio (Rhizobium spp.) e as raízes de leguminosas (CAVADA et al., 2001). O interesse no potencial biotecnológico das lectinas deve-se a sua habilidade de ligação a carboidratos com especificidade considerável, sendo excelentes modelos de estudo de interações proteína-carboidrato em nível atômico (RINI, 1995). Recentes avanços na bioquímica, clonagem molecular e análise estrutural das lectinas têm revelado a ocorrência de famílias, divididas de acordo com a estrutura e evolução, conhecidas das proteínas. Entre elas podem-se destacar as lectinas de leguminosas (RABIJNS et al., 2000), proteínas inativadoras do ribossomo tipo-2 (VAN DAMME et al., 2000b), lectinas ligadoras de quitina que contêm domínios específicos (STOEVA et al., 2001), lectinas de monocotiledôneas ligadoras de manose (VAN DAMME et al., 2000a) e as lectinas relacionadas à Jacalina (BOURNE et al., 1999). Os genes para lectinas foram conservados durante a evolução especialmente nas leguminosas. Parece que os genes da lectina do feijão comum evoluíram por duplicação e divergência de um gene ancestral (todos os genes ainda são unidos) e as proteínas resultantes adquiriram propriedades biológicas diferentes. Isto, provavelmente, também é válido para outras leguminosas. Nos cereais, as lectinas parecem ter se originado por repetições que. 30.

(19) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. surgiram por duplicação deste domínio. Esta combinação de fusão e duplicação de genes de defesa pode ter dado para as plantas uma vantagem evolutiva criando proteínas novas com especificidade diversa (CHRISPEELS e RAIKHEL, 1991). As sementes de leguminosas são fontes ricas de lectinas, mas estas também são encontradas nas partes vegetativas das plantas, porém geralmente em concentrações menores (PUSZTAI, 1991). Cerca de uma centena delas já foram encontradas e caracterizadas bioquímica e biologicamente (CAVADA, 2001). De uma forma geral, as lectinas de leguminosas consistem de duas ou quatro subunidades, com massa molecular variando entre 20 kDa e 40 kDa e cada uma das subunidades possui um sítio de ligação para carboidratos, sendo que o processo é dependente da presença simultânea de Ca2+ e Mn2+ (ou outro metal de transição) (SHARON e LIS, 1990).. 1.2 LECTINAS COMO FERRAMENTAS NA IMUNOMODULAÇÃO. Muitos estudos têm demonstrado o importante papel das lectinas em modelos médicos e biológicos e a especificidade de ligação dessas proteínas tem sido considerada uma ferramenta importante na compreensão da sinalização e modulação da resposta biológica (GOSH et al., 1999; CECHINEL et al., 2001; LOPES et al., 2005; DAS et al., 2007; GOSH e MAITI 2007; KHIL et al., 2007; SONG, et al., 2007; SÁ et al., 2009). Algumas lectinas podem identificar a superfície celular através de sua ligação à porção carboidrato do glicocálice e muitos estudos têm utilizado estas proteínas para detectar alterações na composição desses carboidratos (SARKAR et al., 1991; REMANI et al., 1994; BEUTH et al., 1995). Podem ainda ser utilizadas na caracterização de diferentes estágios de desenvolvimento de parasitas (KENNEDY et al., 1995), estimulação de proliferação linfocitária em humanos (BARRAL-NETTO et al., 1992; KIPATRICK, 1999) e na produção. 31.

(20) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. de interferon gama (SHIBUYA et al., 1986). Atuam como reagentes policlonais para investigar as bases moleculares e controle da ativação e proliferação de linfócitos; para identificar e fracionar células do sistema imune e atuar como drogas (SINGH, et al., 2004). Induzem a produção de histamina (GOMES et al., 1994) e de óxido nítrico em ratos (ANDRADE et al., 1999), promovem um efeito protetor in vivo contra infecção pela Leishmania amazonensis em camundongos BALB/c (BARRAL-NETTO et al., 1996), aumentam ainda a produção de macrófagos e linfócitos em administrações intraperitoneais em camundongos C3H/HeJ (RODRIGUEZ et al., 1992). Lectinas isoladas da planta Artocarpus heterophyllus (Jacalina) podem ser utilizadas no processo de purificação das imunoglobulinas A (IgA), especificamente a subclasse IgA1 e D (IgD) humanas, sendo ambas as Imunoglobulinas competidoras pelo mesmo sítio de ligação da lectina (ROQUE-BARREIRA e CAMPOS-NETO, 1985; KONDOH et al., 1986; AUCOUTURIER et al., 1987; ZEHR e LITWIN, 1987; HAGIWARA et al., 1988). A jacalina exibe ligação específica ao antígeno de células T associado a células tumorais (JEYAPRAKASH et al., 2002; BENOIST et al., 2009) e ativa linfócitos T, especialmente CD4+ e Natural Killer (NK) e tem sido usada para investigar a proliferação de células mononucleres do sangue periférico (PBMC) em pacientes portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS) (BUNN-MORENO e CAMPOS-NETO,1981; PINEAU et al., 1989, 1990; KAY et al., 1990; LAFONT et al., 1994; TAMMA et al., 1996, 2003). A partir de extratos de plantas conhecidas como Mistletoe (ML) foram identificadas três lectinas, MLI (Viscum album Var. agglutinin – VAA), MLII (Viscum album Var. coloratum agglutinin – VCA) e MLIII (FRANZ et al., 1981; HOLTSKOG et al., 1988; STAUDER e KREUSER, 2002; MENGS e GOTHEL, 2002). Assim como a Jacalina e a Abrina as lectinas Mistletoe são proteínas inativadoras de ribossomo e têm sido usadas na. 32.

(21) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. medicina tradicional como agentes imunomodulatórios e modificadores da resposta biológica (JUNG et al., 1990; STEIN, 2000; THIES et al., 2005). Os diversos estudos demonstram uma atividade não específica de estimulação do sistema imune, com aumento do número e da atividade de células T (especialmente CD8), NK e neutrófilos (BEUTH et al., 1995) sendo estes mecanismos de ação realizados através da interação da lectina com carboidratos presentes na superfície de células imunocompetentes (HAJTO et al., 1990). Lectinas Mistletoe induzem ainda a liberação do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon-γ (IFN-γ), interleucinas 1, 2, 3, 5, 6, 10, 23 (IL-1, -2, -3, -5, -6, -10, -23) (HEINY e BEUTH, 1994; BAXEVANIS et al., 1998) e modulam a resposta imunológica diferenciando as resposta Th1 e Th2 (YOON et al., 2003; LYU e PARK, 2006, 2009; LEE et al., 2007). A lectina Abrina (AAG), isolada das sementes de Abrus precatorius, é uma lectina com ligação específica à galactose e semelhantemente à Mistletoe é considerada um imunoadjuvante (GHOSH e MAITI, 2007). AAG tem apresentado citotoxicidade e atividade antitumoral em ensaios cancerígenos e apresenta-se como uma lectina promissora no tratamento desta patologia tendo em vista seu potencial de indução de imunidade antitumoral (resposta Th1 e ativação de linfócitos NK) e inibição do sarcoma 180 em modelos animais (TUNG et al., 1979, 1981; HEGDE et al., 1991; OHBA et al., 2004; NARAYANAN et al., 2004, 2005; BHUTIA et al.2008a,b; BHUTIA et al., 2009) Lectinas como a Con A e a PHA têm sido extensivamente usadas no estudo da função linfocitária há vários anos (MOHD e KHAN, 2003). A Con A pode se ligar às glicoproteínas de superfície de leucócitos (PINK et al., 1983; PESCHKE et al., 1990), linhagem de células transformadas e não-transformadas (OZANNE e SAMBROOK, 1971;. CLINE e. LIVINGSTON, 1971) e por se ligar ao receptor de células T (CD3) e outras moléculas coreceptoras da superfície celular de células imunes, a Con A induz uma alta resposta mitogênica associada a expressão e secreção de citocinas específicas (DISABATO et al.,. 33.

(22) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. 1989; PANI et al., 2000; TRIPATHI e MAITI, 2005). Nos experimentos in vivo a Con A tem demonstrado atividade imunoestimulante e inflamatória (SHIER, 1976; TANIGUCHI et al., 1989; BAINTNER et al., 2007). A Concanavalina A estimula ainda a síntese de DNA em linfócitos B (ANDERSSON et al., 1972; GUNTHER et al., 1973) e devido a excelente estabilidade química da Con A na temperatura corporal humana, estudos mais avançados estão utilizando esta lectina em biosensores (BALLERSTADT e EHWALD, 1994; BALLERSTADT et al., 2004a,b). Do extrato de Phaseolus vulgaris são obtidos dois compostos ativos, a mucoproteína PHA-M e a glicoproteína PHA-P, sendo a PHA-P, também denominada “Purified Phytohemagglutinin” o componente mais potente e mais extensivamente investigado devido a suas propriedades hemoaglutinantes e leucoaglutinantes (RIGAS e TISDALE, 1969; RIGAS e HEAD, 1969). A lectina PHA-P atua como um poderoso mitógeno induzindo proliferação linfocitária, ativando as funções efetoras citotóxicas das células NK e macrófagos e estimulando a expressão e secreção de citocinas e quimiocinas específicas (WIMER, 1990; WIMER e MANN, 2002), possui ainda atividades anti-virais e antifúngicas (D’COSTA e HURWITZ, 2003) e estudos relacionados à terapia anti-tumoral têm demonstrado a eficácia do tratamento com esta lectina (CUMMING e KORNFELD, 1982; RAEDLER e SHREIBER, 1988; WIMER, 1997; KASUYA et al., 2008).. 1.3 LECTINA DE Cratylia mollis: ORIGEM E APLICAÇÕES BIOTECNOLÓGICAS. Cratylia mollis Mart., popularmente conhecida como feijão camaratu ou camaratuba, é uma planta forrageira da região semi-árida do estado de Pernambuco (Figura 1). É perene, de grande resistência à seca e serve de alimentação para o gado tanto no período chuvoso quanto no da estiagem (SILVA et al., 1986). Esta planta pertence à família Fabaceae, tribo. 34.

(23) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. Phaseoleae, subtribo Dioclinae, que contém os gêneros Canavalia e Dioclea, botanicamente relacionados com a C. mollis. Vegeta desde as Guianas até Minas Gerais, encontra-se em cultivo sistemático em canteiros do Banco Ativo de Germoplasma de forrageiras do Centro de Pesquisa Agropecuária do Trópico do Semi-Árido (BAG/CPATSA) como banco de proteínas. A planta é atualmente obtida por coleta em Ibimirim, município de Pernambuco, sua classificação botânica foi realizada e encontra-se catalogada sob o número 51.130, na coleção do Departamento de Botânica Sistemática da Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária (IPA), Recife – PE. O seu teor de proteína bruta presente nas sementes é em torno de 20% da matéria seca e sua escala de macronutrientes e micronutrientes é definida como N>Ca>K>Mg>P e Fe>Mn>Zn>Cu>Na, respectivamente (SILVA, 1992). A. B. C. Figura 1: Caracterização da leguminosa Cratylia mollis. A e B – formação arbustiva do feijão camaratu; C – sementes de C. mollis. Fonte: Correia e Coelho (1995).. 35.

(24) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. A partir das sementes de Cratylia mollis foram purificadas formas múltiplas de lectinas denominadas Cramoll 1, (Figura 2) Cramoll 2, Cramoll 3 e Cramoll 4. Foi purificada ainda, através de cromatografia de afinidade em Gel Sephadex 75, uma preparação contendo as formas 1 e 4 associadas sendo denominada Cramoll 1,4 (PAIVA & COELHO, 1992; CORREIA & COELHO, 1995). A. B. Figura 2: Estrutura tridimensional da Cramoll 1. A - Representação da estrutura terciária da lectina. B - sítio de ligação MeαMan e os íons Ca2+ e Mn2+.. A Cramoll 1,4 apresenta certa estabilidade até 80 °C, ponto isoelétrico em torno de 8,6 e caráter básico. Possui ainda uma banda principal de 31 kDa e dois fragmentos da banda principal de 16 e 14 kDa. É fortemente inibida por metil α-D-manosídeo, o que entra em acordo com a classe de lectinas glicose/manose sendo similar as lectinas isoladas das leguminosas Canavalia ensiformis e Lens culinaris (LIMA et al., 1997; HONG et al., 2001). De fato alguns estudos têm encontrado similaridades entre a lectina Cramoll 1,4 e a lectina extraída de sementes da planta Canavalia ensiformis, a Concanavalina A (Con A). A lectina Cramoll 1 apresenta 236 resíduos em sua seqüência de aminoácidos e a Con A apresenta 237 resíduos. Cramoll 1 apresenta ainda 82% da seqüência de aminoácidos idêntica à Con A e. 36.

(25) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. estas lectinas diferem entre si em 42 resíduos embora tenham sua arquitetura topológica essencialmente idêntica (SOUZA et al., 2003). Entretanto, diferenças estruturais foram identificadas por cromatografia líquida de rápida resolução de proteínas e por cromatografia líquida de alta performance desde que estas duas lectinas apresentaram distintos padrões de eluições e ligações específicas a tumores humanos benignos e malignos (TAVARES et al., 1996). A Cramoll 1 mostra forte ligação a tecidos neoplásicos malignos humanos, particularmente aqueles derivados de glândulas mamárias, útero, rim e cérebro e inibiu o crescimento acelerado do carcinoma de células epidermóides (Hep-2) (BELTRÃO et al., 1998). Experimentos envolvendo atividade antiinflamatória (CECHINEL et al., 2001), Cramoll livre e encapsulada em lipossomas com atividade antitumoral (ANDRADE et al., 2004) e atividade mitogênica de lifócitos (MACIEL et al. 2004), mostraram um alto desempenho da lectina de C. mollis na imunomodulação. A Cramoll já foi cristalizada demonstrando duas diferentes formas de cristal (TAVARES et al., 1996) e suas propriedades físico-químicas e potencial eletroquímico já foram descritos (BASZKIN et al., 2000; SOUZA et al., 2002). Outros dados ainda não publicados demonstraram a atividade cicatricial induzida em camundongos normais e imunodeprimidos e o efeito anti-parasitário da Cramoll 1,4 revelando algumas atividades imunomoduladoras desta lectina.. 1.4 RESPOSTA IMUNE E O PROCESSO DE ATIVAÇÃO LINFOCITÁRIA. Estudos revelam que a resposta imune é complexa e envolve muitos componentes plasmáticos como citocinas, fatores de crescimento, fatores do complemento, proteínas quinase, receptores celulares, níveis celulares de cálcio (Ca2+) e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) (SIKKELAND et al., 2007).. 37.

(26) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. Após a entrada de determinado antígeno no organismo animal, entra em ação a imunidade inata, que utiliza mecanismos de reconhecimento molecular para detectar a presença desses antígenos não levando necessariamente à imunidade prolongada. A resposta imune adaptativa, que é mais tardia, em contraste, focaliza especificamente o invasor em questão gerando memória imunológica para o mesmo, através da seleção clonal de células imunes para esse agente oportunista. As células responsáveis por ambas as respostas imunes, são, principalmente, os linfócitos, os granulócitos e as células teciduais relacionadas a eles (BENJAMINE et al. 2002; PARHAM, 2001). Para a resposta imune inata são recrutadas células polimorfonucleares (PMNs) para a área onde se encontra o antígeno, além de citocinas, proteínas plasmáticas (interleucinas e sistema complemento) e imunoglobulinas de resposta inicial (GOLDMAN e PRABHAKAR, 2000). Os linfócitos são as únicas células capazes de reconhecimento especializado e de distinguir diferentes determinantes antigênicos, sendo responsáveis pela especificidade e memória imunológica. Essas células são divididas em subpopulações (Tabela 1) de acordo com suas moléculas de superfície, por meio do sistema de designação de “cluster” (“CD”) sendo, portanto, classificado pelo seu fenótipo (GOLDMAN e PRABHAKAR, 2000; PARHAM, 2001).. Tabela 1: Discriminação das diferentes subpopulações de linfócitos T Função imunológica. Marcador de superfície. Linfócitos B. Quando ativados são denominados plasmócitos e liberam anticorpos (imunoglobulinas) mediadores da resposta imune humoral. Atuam ainda na geração da memória imunológica. CD19. Linfócitos “Natural Killer” (NK). Atuam tanto na imunidade inata quanto na adquirida e exterminam inespecificamente certos tipos de células tumorais e células infectadas por vírus.. CD16. Linfócito. 38.

(27) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. Linfócitos CD3. Precursores de toda a linhagem de linfócitos e a partir de citocinas específicas passam a se diferenciar em linfócitos efetores e de memória. CD3. Linfócitos T auxiliares. Atuam exclusivamente na imunidade mediada por células funcionando como auxiliares dos linfócitos B na produção de anticorpos. Ativam ainda macrófagos.. CD4. Linfócitos T citotóxicos. Atuam de maneira antígeno-específica e são citotóxicas contra células tumorais e células infectadas com patógenos intracelulares.. CD8. Linfócitos T supressores / reguladores. São linfócitos que tanto suprimem quanto regulam as atividades efetoras dos linfócitos B e T.. CD8. Modificado a partir de Abbas e Lichtman (2005).. Os linfócitos T auxiliares apresentam ainda comportamentos distintos entre si desenvolvendo, com isso, “versões polarizadas da resposta imune”. Esta polarização, que está relacionada ao tipo de atividade das citocinas específicas produzidas por estas células T, dividiu os linfócitos T auxiliares em Th0, Th1, Th2, Th3 e linfócitos T γ/δ sendo as respostas Th1 e Th2 amplamente estudadas na imunologia (KOURILSKY e TRUFFA-BACHI, 2001). Linfócitos T γ/δ não foram ainda bem estudados, mas os estudos experimentais afirmam que estes linfócitos produzem IL-4, IL-10 e TGF-β além de bloquearem os linfócitos T citotóxicos e células NK. Na verdade estes linfócitos estão relacionados com as citocinas produzidas pelos linfócitos α e β (FERRICK et al., 1995; SEO et al., 1999). Os linfócitos Th0 são na verdade precursores das células Th1 e Th2 e produzem as interleucinas 2, 4, 5 e IFN-γ. Na presença da IL-4 transformam-se em Th2 e na presença de IL-12 tornam-se Th1. A resposta Th1 é definida pela produção de interferon gama (INF-γ) e está associada com a imunidade mediada por células, incluindo reações de hipersensibilidade tardia, recrutamento e ativação de macrófagos inflamatórios e leucócitos e respostas citotóxicas que levam a proteção contra microrganismos celulares. Os linfócitos Th1 respondem otimamente aos 39.

(28) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. antígenos apresentados pelas células B, utilizando como co-estimulante o CD80 e produzem ainda IL-2, linfotoxinas e fator de necrose tumoral, não possuindo receptores para a IL-1 e (TNF-β) (CHTANOVA e MACKAY, 2001). A resposta Th2 é caracterizada pela produção de IL-4 e IL-5 e está associada com a imunidade humoral, incluindo a ativação de eosinófilos e mastócitos levando a proteção contra microrganismos extracelulares. Os linfócitos Th2 respondem otimamente aos antígenos apresentados pelos macrófagos e células dendríticas mielóides, são especificamente ativados por sinais gerados pelo CD86 e mediante o estímulo do antígeno ou na presença de IL-1, citocina fundamental em seu processo de ativação, produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 (YANG et al., 2005). O subtipo Th3 foi identificado posteriormente por produzir elevados níveis do fator de crescimento transformante β (TGFβ), além de IL-4 e IL-10 em quantidades variáveis. As células Th3 apresentam um fenótipo imunossupressor de tolerância oral e autoimunidade em modelos experimentais (SING et al., 1999). Além das células T CD4+, que deram origem ao paradigma Th1/Th2, outros tipos celulares como linfócitos T CD8+, células dendríticas, macrófagos e células NK também produzem citocinas de ambos os tipos, ou seja, tipos 1 e 2 (KIM et al., 2002). Isso levou a divisão do estudo das respostas imunológicas em “resposta do tipo 1 ou tipo 2” intrinsecamente relacionadas aos tipos de citocinas produzidas pelas diferentes populações celulares (KOURILSKY e TRUFFA-BACHI, 2001). Como foi visto anteriormente algumas citocinas desempenham um papel fundamental nas atividades linfocitárias e atuam quer seja ativando as funções efetoras dos linfócitos quer seja inibindo ou determinando a parada (“código de parada”) dessas células imunes. De fato estes compostos, que são polipeptídeos e glicoproteínas produzidos por diversos tipos celulares atuam por meio de interação de grande afinidade com os receptores de superfície de diferentes células (ESTAQUIER e AMEISEN, 1997). Abbas e Lichtman (2005) demonstram. 40.

(29) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. claramente (Tabelas 2 e 3) a amplitude de citocinas e sua atuação diferenciada nas imunidades inata e adquirida.. Tabela 2: Caracterização das citocinas da imunidade inata, seus alvos e mecanismos de ação Citocina. Principais células produtoras. Principais células alvo e efeitos biológicos. Fator de Necrose Tumoral (TNF). Macrófagos, células T. Células endoteliais: ativação (inflamação, coagulação). Neutrófilos: ativação Muitos tipos celulares: apoptose. IL-1. Macrófagos, células endoteliais e algumas células epiteliais. Células endoteliais: ativação (inflamação, coagulação). Quimiocinas. Macrófagos, células endoteliais, células T, fibroblastos e plaquetas. Leucócitos: quimiotaxia, migração nos tecidos. IL-12. Macrófagos, dendríticas células. Células T: diferenciação em Th1 Células NK e células T: síntese de IFN-γ, aumento da atividade citotóxica. IFN-α, IFN-β. IFNα: macrófagos IFNβ: fibroblastos. Todas as células: estado antiviral, aumento da expressão de MHC I Células NK: ativação. IL-10. Macrófagos, células T (manutenção de Th2). Macrófagos, células dendríticas: inibição da produção de IL-12 e expressão de moléculas co-estimuladoras MHC. IL-6. Macrófagos, endoteliais células, T células. Proliferação celular e anticorpos pela célula B. IL-15. Macrófagos, outras. Células NK: proliferação de células T (especialmente linfócitos T CD8+. IL-18. Macrófagos. Células NK e células T: síntese de IFN-γ. ativação. produção. e. de. Modificado a partir de Abbas e Lichtman (2005).. Três citocinas, produzidas por células acessórias, desenvolvem uma função fundamental na iniciação de respostas Th1 e Th2. A IL-12, que induz a transformação de linfócitos T CD4+ em células Th1 além de induzirem a produção de IFN-γ por estas células; a IL-4 que induz a transformação de linfócitos T CD4+ em células Th2 e a IL-10, citocina de atuação regulatória, que inibe a diferenciação das células Th1 e a síntese de citocinas nestas células (HUNTER e REINER, 2000). 41.

(30) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. Tabela 3: Caracterização das citocinas da imunidade adquirida, seus alvos e mecanismos de ação. Citocina. IL-2. Principais células produtoras. Células T. Principais células alvo e efeitos biológicos Células T: proliferação, aumento da síntese de citocinas Células NK: proliferação e ativação. Células B: proliferação e síntese de anticorpos in vitro. Células T CD4+ (Th2). IL-4. Células B: regula a expressão de IgE Células T: diferenciação e proliferação de células Th2. Macrófagos: ativação mediada por IFN-γ Células T CD4+ (Th2). IL-5. Eosinófilos: ativação e aumento na produção. Células B: proliferação e produção de IgA. Células T CD8+ (Th1) e Células NK. Macrófagos: ativação e aumento das funções efetoras Células B: regula a expressão de IgG Células T: diferenciação em Th1 Outras células: aumento da expressão de moléculas MHC de classe I e II, aumento do processamento de antígeno e apresentação para as células T. Fator de crescimento transformante (TGFβ). Células T, macrófagos e outros tipos celulares. Células T: inibição da proliferação e funções efetoras Células B: inibição da proliferação e produção de IgA Macrófagos: inibição das funções efetoras. IL-13. Células T CD4+ (Th2). Células B: regula a produção de IgE Macrófagos: inibição das funções efetoras. IFNγ. Modificado a partir de Abbas e Lichtman (2005).. Nestes subtipos celulares ocorre o processo de regulação autócrina e inibição recíproca de crescimento e função. Neste contexto, as citocinas IL-2 e IL-4 são produzidas por células Th1 e Th2, respectivamente e favorecem o crescimento das mesmas (BOOTHBY et al., 2001). A produção de IFN-γ por células Th1 inibe a proliferação de células Th2, limitando o campo de difusão das citocinas do tipo 2. O contrário também ocorre e citocinas Th2 (IL-4 e. 42.

(31) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. IL-10) diminuem a produção de IFN-γ e o desenvolvimento do campo de difusão das citocinas do tipo 1, limitando a produção de IL-12 (Figura 3) (MUPHY e REINER, 2002). No processo de ativação linfocitária há o envolvimento de muitas células e proteínas específicas, essas proteínas, em sua grande maioria citocinas já relacionadas anteriormente, atuam como co-adjuvantes na resposta imunológica (SIKKELANDM et al., 2007; LAWRENCE & GILROY, 2007). produção de IL-4, IL-10 e TGFβ. Th3 Th0 (T CD4+ inativa). Tγ/δ. IL-4. IL-12. Th1. IL-1 ou antígeno. IFNγ IFNγ e IL-1 induzem a estimulação das atividades efetoras nas diferentes células. produção de IL-2 IL-4 IFNγ linfotoxinas. inibe a proliferação. diminuem a produção de IFNγ e limitam a produção de IL-12. Th2. produção de IL-2 IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-13 ativação de eosinófilos e mastócitos. Figura 3: Caracterização da transformação da célula T CD4+ ou Th0 em seus subtipos celulares. As respostas imunes mais estudadas são as do tipo 1 e 2. Neste esquema pode-se observar o importante papel das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-γ e sua atuação sinérgica promovendo um feedback de regulação da proliferação e ativação das funções efetoras das células Th1 e Th2.. 43.

(32) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. Os componentes celulares atuam na ativação dos linfócitos através das células apresentadoras de antígenos (APCs) sendo estas células dendríticas, fagócitos mononucleares e linfócitos B que, após entrar em contato com o antígeno, leva informações do mesmo aos linfonodos periféricos sensibilizando as células T presentes nestes centros germinativos secundários (Figura 4).. Reconhecimento do antígeno . . Expansão clonal . Ativação . Célula T CD4+ inativa . Funções efetoras . Diferenciação . Célula CD4+ efetora . Ativação de macrófagos, linfócitos B e outras células . Citocina IL‐2 Célula CD4+ de memória . Célula T CD8+ inativa Citocina IL‐2 . Célula CD8+ efetora . Extermínio de células‐alvo infectadas e ativação de macrófagos . Célula CD8+ de memória . Órgãos linfóides. Tecidos periféricos. Modificado a partir de Abbas e Lichtman (2005).. Figura 4: Mecanismo de ativação dos linfócitos T a partir do contato de células T presentes nos órgão linfóides com uma célula apresentadora de antígeno (APC). A ativação é mediada pela citocina IL-2. Uma vez ativadas através de sinalização célular as células T entram no processo de diferenciação e se tornam aptas a executar suas funções efetoras.. 44.

(33) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. Reconhecendo seu antígeno específico, o linfócito virgem ou inativo pára sua migração pelos tecidos linfóides e aumenta de tamanho. Sua cromatina nuclear torna-se menos densa, os nucléolos aparecem, os volumes do núcleo e do citoplasma aumentam e a síntese de novos RNAs e proteínas é induzida. Em poucas horas a célula se apresenta completamente diferente, o que caracteriza o estágio de diferenciação. Ocorre o processo de expansão clonal onde 1 clone dá origem a cerca de 1000 células-filhas de idêntica especificidade e uma vez ativadas as células T se tornam capazes de destruir células infectadas ou de ativar outras células do sistema imune (MUPHY e REINER, 2002). O mecanismo de ativação linfocitária envolve citocinas específicas da imunidade inata e adaptativa como relatado anteriormente e induzem às células T e B a iniciarem suas atividades efetoras. Porém, outras moléculas como o cálcio (Ca2+) e as espécies reativas de oxigênio (EROs) também desempenham um papel fundamental na indução e manutenção da resposta ativa dos linfócitos sendo sua sinalização considerado em alguns casos um sinal de vida ou de morte celular (BERRIDGE et al., 1998). As EROs, também denominadas produtos intermediários das reações de redução e oxidação (superóxido, peróxido de hidrogênio e radical hidroxila) atuam como moléculas citotóxicas na defesa do hospedeiro, na biosíntese hormonal, na fertilização, na sinalização celular e como bioprodutos de outras reações biológicas ou mensageiros do endotélio no processo de hipóxia (JOHNSON e GIULIVI, 2005). As EROs são encontradas na membrana plasmática das células e no interior de mitocôndrias. Estudos recentes sugerem que as espécies reativas podem ser importantes sinalizadores intracelulares, que são produzidas pela NADPH oxidase (enzima presente na membrana plasmática das células e que catalisa a produção de superóxido de hidrogênio) e pelas mitocôndrias e que podem contribuir para a estimulação do processo de adesão leucocitária ao endotélio (WOOD et al., 2000). De fato, EROs derivadas da NADPH oxidase desempenham um importante papel fisiológico na. 45.

(34) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. regulação de vários processos imunológicos e o aumento excessivo da produção de EROs, o que atualmente se denomina “estresse oxidativo”, está relacionado à várias patologias incluindo doenças cardiovasculares, hipertensão, arteriosclerose, diabetes, hipertrofia, falência cardíaca e isquemia (PARAVICINI e TOUYZ, 2008). Em contrapartida, a elevação não excessiva das espécies reativas de oxigênio por células fagocíticas promove a defesa do hospedeiro no combate à infecções, regulam a proliferação celular, regula mecanismos intracelulares de defesa, regula o ciclo celular, expressão de genes, bem como a participação em vias de sinalização sensíveis ao estado redox de moléculas (WILLIAMS e KWON, 2004; BURCH e HEINTZ, 2005; HAVENS et al., 2006; MANDER et al., 2006; DROGE, 2006). Evidências experimentais sugerem que a estimulação do receptor de células T (TCRs) induz a rápida produção de EROs (WILLIAMS e KNOW, 2004) e esta elevação nos níveis destes compostos ativa linfócitos esplênicos durante o desenvolvimento de células tumorais (DEGASPERI et al., 2006b). Observa-se ainda que a NADPH oxidase é uma fonte predominante destas espécies reativas e apresenta uma relação importante entre a homeostase intracelular de Ca2+ e a bioenergética da mitocôndria no processo de ativação linfocitária (RETH, 2002). Neste contexto, o aumento do Ca2+ citosólico livre leva a geração de EROs induzido pela NADPH oxidase e esta produção de EROs atua no retículo endoplasmático, presente no citosol das células imunes, induzindo esta organela a aumentar sua capacidade de liberação de Ca2+. Em contrapartida, o Ca2+ citosólico em altas concentrações, pode ativar também a NADPH oxidase (CHANDEL et al., 2000; BANFI et al., 2001; DEGASPERI et al., 2006). Sinais de Ca2+ são fundamentais na ativação dos linfócitos, em muitos aspectos de sua diferenciação e realização das funções efetoras, como na manutenção da estabilidade durante. 46.

(35) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. a formação da sinapse entre as células T e as APCs e na formação das vesículas exocíticas nas células T citotóxicas (CTLs) (LEWIS, 2001; FESKE, 2007). Mudanças nos níveis de Ca2+ são consideradas um dos muitos caminhos pelos quais uma informação é transformada de sinais extracelulares para respostas efetoras intracelulares. Quando a sinalização de Ca2+ é estimulada nas células imunes, em resposta a antígenos, os níveis de Ca2+ são aumentados através da liberação deste íon pelas organelas intracitoplasmáticas ou sofrem influxo do meio extracelular através dos canais de cálcio (calcium release-activated channels (CRAC)) presentes membrana plasmática de ambas as células B e T (FESKE, 2006; LAZAREVIC et al., 2009). Neste contexto, a sinalização de Ca2+ é um importante sinal de ativação para muitas células levando estas a se diferenciarem, produzirem suas funções efetoras e direcionarem decisivamente sua transcrição gênica (ALFONSO et al., 2005; OH-HORA e RAO, 2008; VIG e KINET, 2009). A viabilidade do processo de ativação de linfócitos é conhecida pela manutenção de altos níveis de Ca2+ citosólico e EROs alicerçados pela abertura do poro de transição de permeabilidade da membrana plasmática mitocondrial levando, em alguns casos, à morte desta célula (Figura 5) (KOWALTOWSKI et al., 2001). Além disso, o aumento excessivo de Ca2+ promove a redução da mobilidade e altera a estrutura de membrana de células T, indicando, através do mecanismo de retroalimentação, um sinal de parada para as atividades efetoras desta célula e pode indicar o início de uma morte celular programada (apoptose) (BERRIDGE et al., 1998). De fato, a apoptose induzida em linfócitos ocorre quando estas células imunes recebem sinais de ativação (derivados da apresentação de antígenos) ou recebem altos estímulos (alta liberação intracitoplasmática de Ca2+ por exemplo) por um tempo muito longo (LEWIS, 2001; QUINTANA et al., 2004; SKULACHEV, 2006).. 47.

(36) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. Figura 5: Processo de ativação linfocitária envolvendo superprodução de EROs e Ca2+. Em muitos casos o limite entre a ativação das atividades efetoras e a indução da morte celular é definido pelo estresse oxidativo presente na célula imune.. Assim como as citocinas, o óxido nítrico (NO) é um importante mediador da resposta imune inespecífica. Este composto, produzido por macrófagos, é um radical, gasoso, instável, altamente reativo, derivado da oxidação do átomo de nitrogênio no terminal guanidino da Larginina pela ação catalítica da enzima óxido nítrico sintase (NOS), na presença do oxigênio molecular (O2) (PALMER et al., 1988; RYU et al., 1999). Por possuir um tempo de meia vida curta no sangue circulante, no plasma e em outros fluidos fisiológicos (cerca de 110 segundos) e após isso transformar-se rapidamente em nitrato através de sua oxidação por certas oxihemoproteínas como a oxihemoglobina e a oximioglobia, foram desenvolvidas estratégias alternativas para quantificá-lo, onde, são 48.

(37) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. analisados seus metabólitos, nitrito e nitrato, por serem mais estáveis. Desta forma, são geradas informações importantes na produção do NO in vivo, além de sua disponibilidade e metabolismo (BRYAN e GRISHAM, 2007). Estudos mostram que a regulação da produção do NO dentro de macrófagos ativados se dá através da produção de duas citocinas de efeitos antagônicos, o TNF-α e o TGF-β. Um parasito pode ativar o gene do TNF-α e este atuar como sinal autócrino para a produção de IFN-γ, que irá induzir a produção do NO. Outro mecanismo viável seria a indução da produção do TGF-β que atuaria como bloqueador da produção deste radical (GREEN et al., 1994). A regulação positiva da síntese de NO por TNF-α ocorre pela ocupação dos receptores desta citocina sobre a membrana de macrófagos e o envio de uma série de sinais que, em associação com co-estimuladores, tais como lipopolissacarídeo (LPS), levam a indução da óxido nítrico sintase induzida (iNOS). O efeito inibitório do TGF-β sobre a síntese de NO, em macrófagos cultivados in vitro com LPS, ocorre pela diminuição da estabilidade e tradução do mRNA da iNOS, além do aumento da degradação da própria enzima iNOS (BALESTIERI F. M. P., 1998). Observa-se então que o NO produzido em altos níveis por macrófagos e neutrófilos ativados tem ação citotóxica contra bactérias, parasitas, tumores e vírus, exercendo importante função na modulação do sistema imune (MONCADA et al., 1991; CROEN, 1993; KIM et al., 1999). Adicionalmente o NO possui, como funções principais no processo inflamatório, atividade de vasodilatação nas paredes do endotélio, atividades anti-coagulante e antimitogênica e inibição da produção de matriz extracelular (TANNER et al., 1999). Diversos estudos têm demonstrado a eficácia de compostos naturais, incluindo as lectinas isoladas de tecidos vegetais, na resposta imunológica. Semelhantemente a estes compostos, a lectina Cramoll 1,4 também vem sendo investigada quanto às suas atividades 49.

(38) Cristiane Moutinho Lagos de Melo. biotecnológicas e estudar alguns de seus efeitos imunomodulatórios pode tanto ampliar as perspectivas da utilização desta lectina como ferramenta em estudos in vivo e/ou in vitro como contribuir para o conhecimento do mecanismo de sinalização celular induzido pela mesma.. 50.

(39) Avaliação imunomodulatória da lectina Cramoll 1,4 em linfócitos experimentais. 2. OBJETIVOS. 2.1 OBJETIVO GERAL. Investigar a atividade imunomodulatória da lectina de Cratylia mollis (Cramoll 1,4), em animais tratados in vivo e células cultivadas in vitro.. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 2.2.1 Investigar a viabilidade dos linfócitos de animais tratados com a lectina Cramoll 1,4, através da produção de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs) e níveis de Cálcio citosólico ([Ca2+]cit);. 2.2.2 Investigar o percentual de inibição de células imunes produzido pela lectina, em diferentes concentrações, com o intuito de avaliar sua citotoxicidade;. 2.2.4 Dosar citocinas das respostas imunes Th1 e Th2 bem como mediadores químicos (NO e IFN-γ) em animais normais e previamente imunizados com diferentes mitógenos;. 2.2.5 Avaliar a atividade proliferativa e conhecer o nível de estimulação da lectina para as subpopulações de células imunes de baço e de sangue periférico bem como de citocinas relacionadas através de imunofenotipagem em camundongos normais e previamente imunizados com diferentes mitógenos.. 51.

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