Tí
tulo
N ome do A utorEste trabalho descreve as principais características,
potencialidades, propriedades funcionais e de
digestibilidade da levedura cervejeira submetida a
diferentes tratamentos de ruptura celular, bem
como o efeito da incorporação desse subproduto
cervejeiro em hambúrgueres.
Orientador: Darlene Cavalheiro
Coorientador: Aniela Pinto Kempka
Pinhalzinho, 2018 DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
APLICAÇÃO DE LEVEDURA
CERVEJEIRA EM PRODUTOS
CÁRNEOS
AN GÉLIC A PA TRÍ CI A B ERTOLO | AP LIC AÇÃO D E LE V ED RA CERVE JEIRA EM PROD UTOS CÁR N EOSUNIVERSIDADE DO ESTADO DE SANTA CATARINA – UDESC CENTRO DE EDUCAÇÃO SUPERIOR DO OESTE – CEO
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
ANGÉLICA PATRÍCIA BERTOLO
APLICAÇÃO DE LEVEDURA CERVEJEIRA EM PRODUTOS CÁRNEOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade do Estado de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientadora: Prof. Dra. Darlene Cavalheiro Coorientadora: Prof. Dra. Aniela Pinto Kempka
Pinhalzinho, SC 2018
Ficha catalográfica elaborada pelo(a) autor(a), com Auxílio do programa de geração automática da
Biblioteca Setorial do CEO/UDESC
Bertolo, Angélica Patrícia
Aplicação de levedura cervejeira em produtos
cárneos / Angélica Patrícia Bertolo. - Chapecó , 2018. 67 p.
Orientadora: Darlene Cavalheiro
Co-orientadora: Aniela Pinto Kempka
Dissertação (Mestrado) - Universidade do Estado de Santa Catarina, Centro de Educação Superior do Oeste, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, Chapecó, 2018.
1. Saccharomyces cerevisiae. 2. Rompimento celular. 3. Características. 4. Propriedades funcionais. 5. Hambúrgueres. I. Cavalheiro, Darlene. II. Pinto Kempka, Aniela. , .III.
Universidade do Estado de Santa Catarina, Centro de Educação Superior do Oeste, Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos. IV. Título.
APLICAÇÃO DE LEVEDURA CERVEJEIRA EM PRODUTOS CÁRNEOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia de Alimentos, da Universidade do Estado de Santa Catarina, como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Banca Examinadora:
________________________________ Prof. Dra. Darlene Cavalheiro – Orientadora Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC
________________________________ Prof. Dra. Georgia Ane Raquel Sehn
Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC
_________________________________ Prof. Dra. Stefany Arcari
Instituto Federal de Santa Catarina – IFSC SMO
_________________________________ Prof. Dra. Elisandra Rigo
Universidade do Estado de Santa Catarina – UDESC
Dedico este trabalho aos meus pais, meu companheiro Michel, irmãs e cunhados, sogros e sobrinhos que compartilharam desta conquista demonstrando apoio, amor, carinho e incentivo.
À Deus pela vida, por todas as bênçãos, por toda proteção.
Aos meus pais Deorildes e Ermínio Bertolo agradeço primeiramente, pelo dom da vida, pela educação que me proporcionaram, por serem meus maiores exemplos de honestidade e caráter; pelo constante apoio e incentivo; por todo amor, carinho, compreensão, zelo e confiança que sempre depositaram em mim.
À minha professora orientadora Darlene Cavalheiro, exemplo de comprometimento e dedicação, por toda disponibilidade, atenção, carinho e amizade. Por nunca ter medido esforços para me auxiliar, prestando grande ajuda, incentivo e apoio em todas as etapas deste trabalho, pelas sugestões e orientações; por todo conhecimento transmitido, paciência e compreensão. Sem você nada disso teria sido possível!
À minha professora coorientadora Aniela Pinto Kempka agradeço pela oportunidade, confiança, incentivo e apoio. Por toda ajuda, esclarecimentos e orientações no decorrer deste trabalho.
À banca, composta pelas professoras Dra. Georgia Sehn e Dra. Stefany Arcari agradeço pelo aceite do convite, por todas as considerações que foram muito pertinentes ao trabalho, pelas correções, pelo tempo dedicado, pelas palavras... Muito obrigada!!!
Ao meu amor Michel Schuh por toda a ajuda nesses dois anos do mestrado. Você esteve comigo em todos os momentos, a começar pela decisão em realizar esta pós-graduação. Acompanhou minha aprovação e comemorou comigo a aquisição da bolsa e manteve-se firme, ao meu lado, segurando minha mão quando, por vezes, o mundo pareceu desabar sobre minha cabeça. Por ter sido meu alicerce, minha base, minha calmaria. Por ter me auxiliado em tudo o que estava ao seu alcance; pela paciência e compreensão quando mais precisei. Enfim, obrigada por tudo que já fez e ainda faz por mim. Eu amo você!
À minha família que me amparou em todos os momentos, especialmente minhas irmãs Cleusa, Elizete, Marizete, Clair e Silvane por todo amor, união, carinho, confiança e amizade; por todos os conselhos e momentos alegres que juntas compartilhamos.
Aos meus sogros, Sueli e Tarcísio Schuh por terem me dado abrigo nesse período, por abrirem sua casa, fazendo com que eu me sentisse uma filha! Jamais vou esquecer tudo o que fizeram por mim. Sem a ajuda de vocês, provavelmente eu não estaria concluindo essa etapa tão importante pra mim. Obrigada por toda ajuda, apoio, carinho e incentivo.
todo especial ao meu pequeno sobrinho Yago, que tornou os meus dias muito mais leves, com seu carisma e amor.
Às minhas amigas do mestrado, Fabiane Paula Werlang Schuster e Mariane Wolf, com as quais eu compartilhei a maior parte dessa trajetória, obrigada por estarem sempre por perto, por terem compartilhado comigo de muitos momentos de felicidade, pelas lágrimas, risadas, desabafos, confiança, amizade e apoio. Com toda certeza, vocês estarão sempre no meu coração.
A todos os demais amigos e colegas, muito obrigada.
A todos os demais professores, obrigada por todo conhecimento transmitido, pela dedicação e carinho. Agradeço em especial, à professora Elisandra Rigo pelos conselhos e mãos sempre estendidas para ajudar.
“Não se deve ir atrás de objetivos fáceis, é preciso buscar o que só pode ser alcançado por meio dos maiores esforços.” (Albert Einstein)
Devido à alta produção e diversidade de produtos químicos e alimentícios no mercado, surge a necessidade de controle dos resíduos e subprodutos provenientes do beneficiamento e da industrialização destes. Muitos resíduos e subprodutos são descartados de maneira incorreta, resultando em transtornos ambientais. Um exemplo de subproduto industrial produzido em grandes quantidades é a biomassa da levedura Saccharomyces sp., a qual é utilizada para três principais atividades: setor sucro-alcooleiro, setor de bebidas alcóolicas e o setor de panificação. Dentre estas diferentes fontes destaca-se a levedura da indústria cervejeira, a qual trata-se de um subproduto da fermentação da cerveja descartado após diminuição da eficiência fermentativa. Parte dessa levedura é destinada à ração animal, entretanto, pesquisas demostram que sua aplicação na alimentação humana surge como uma alternativa viável, proporcionando um amplo aproveitamento desta. Além disso, existe uma tendência mundial em substituir as proteínas tradicionais por fontes proteicas de micro-organismos unicelulares. Tendo isso em vista, e conhecendo-se as propriedades nutricionais e tecnológicas deste subproduto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a levedura cervejeira em sua forma natural (LN) e submetida a diferentes processos de ruptura celular [método mecânico com uso de ultrassom (LRM) e autólise modificada com uso de NaCl e etanol (LAM)], quanto às propriedades funcionais e de digestibilidade, comparando-as com a proteína texturizada de soja (PTS). A ruptura celular com ultrassom (LMR) provocou um aumento na capacidade de formação de espuma, na sua estabilidade e também na capacidade de retenção de óleo (8,82 mL de óleo/g de proteína). A autólise modificada (LAM) resultou em maior capacidade de retenção de água (14,50 g de água/g proteína) e índice de solubilidade em água (superior a 64 %), com diminuição de suas propriedades emulsificantes. O estudo mostrou que a levedura cervejeira pode ser aplicada como um ingrediente funcional e tecnológico na indústria de alimentos, com expressiva capacidade tecnológica e potenciais aplicações. Nesse sentido, o presente trabalho descreve o efeito da incorporação de levedura cervejeira em hambúrgueres. As características físicas, químicas e sensoriais foram avaliadas na formulação padrão (F-P) com adição de 4 % de proteína texturizada de soja (PTS) e formulações adicionadas de 4 % de levedura natural limpa LN) e 4 % de levedura submetida ao rompimento mecânico (F-LRM). Não foram observadas diferenças significativas quanto à composição físico-química para as diferentes formulações testadas. Entretanto, a adição de levedura resultou na diminuição da perda de massa por cocção, bem como, maior rendimento na cocção, demonstrando positivo aspecto tecnológico. Ainda, foi observado que alguns atributos sensoriais não diferiram significativamente entre as diferentes formulações, com exceção da aparência global, sabor e intenção de compra que foi maior para a F-P. Sugere-se que resultados superiores poderiam ser ancorados com o desamargamento da biomassa antes da aplicação industrial.
Palavras-chave: Saccharomyces cerevisiae. Rompimento celular. Características.
Due to the high production and diversity of chemical and food products on the market, there is a need to control residues and by-products from processing and industrialization. Many wastes and by-products are disposed of incorrectly, resulting in environmental disturbances. An example of an industrial byproduct produced in large quantities is the yeast biomass Saccharomyces sp., Which is used for three main activities: the sugar and alcohol sector, the alcoholic beverages sector and the bakery sector. Among these different sources, the yeast of the brewing industry stands out, which is a byproduct of the discarded beer fermentation after the reduction of the fermentative efficiency. Part of this yeast is intended for animal feed, however, research shows that its application in human food appears as a viable alternative, providing a wide use of this. In addition, there is a worldwide trend to replace traditional proteins with protein sources of unicellular microorganisms. The objective of the present work was to evaluate the brewer's yeast in its natural form (NY) and submitted to different processes of cell rupture (mechanical method with ultrasound use (MRY), and modified autolysis with NaCl and ethanol (MYA), as well as functional and digestibility properties, compared with soybean textured protein (TSP). Ultrasonic cell rupture (MRY) caused an increase in foamability, stability and oil retention capacity (8.82 ml oil / g protein). Modified autolysis (MYA) resulted in a higher water retention capacity (14.50 g water / g protein) and a water solubility index (greater than 64 %), with a decrease in its emulsifying properties. The study showed that brewer's yeast can be applied as a functional and technological ingredient in the food industry, with significant technological capability and potential applications. In this sense, the present work describes the effect of the incorporation of brewer's yeast in hamburgers. Physical, chemical and sensory characteristics were evaluated in the standard formulation (PF) with the addition of 4 % soybean texture protein (TSP) and formulations added of 4 % pure natural yeast NY) and 4 % yeast submitted to mechanical disruption (F-MRY). No significant differences in physico-chemical composition were observed for the different formulations tested. However, the addition of yeast resulted in the reduction of the mass loss by cooking, as well as, a higher cooking yield, demonstrating a positive technological aspect. Furthermore, it was observed that some sensory attributes did not differ significantly between the different formulations, except for the overall appearance, taste and purchase intent that was higher for F-SP. It is suggested that higher results could be anchored with biomass depletion prior to industrial application.
Tabela 1 - Composição química da levedura de cerveja ... 20 Tabela 2 - Teor de aminoácidos g% em leveduras secas da fermentação de cervejarias ... ...21 Tabela 3 - Composição percentual de levedura natural (LN), levedura rompida mecanicamente (LRM), levedura autolisada modificadamente (LAM) e proteína texturizada de soja (PTS)... ...32 Tabela 4 - Análise de cor para os parâmetros da levedura natural (LN), levedura rompida mecanicamente (LRM) e levedura autolisada modificadamente (LAM) ... 36 Tabela 5 - Capacidade de absorção de água (g de água/g de proteína) e capacidade de retenção de óleo (mL de óleo absorvido/g de proteína) da levedura natural, levedura rompida mecanicamente, levedura autolisada modificadamente e proteína texturizada de soja .. 40 Tabela 6 - Capacidade de retenção de água (g de água/g de proteína) e índice de solubilidade em água (%) da levedura natural, levedura rompida mecanicamente, levedura autolisada modificadamente e proteína texturizada de soja ... 42 Tabela 7 - Digestibilidade in vitro da levedura natural, levedura rompida mecanicamente, levedura autolisada modificadamente e proteína texturizada de soja ... 43 Tabela 8 - Formulações, padrão e com adição de levedura natural e rompida mecanicamente de hambúrguer bovino...49 Tabela 9 - Resultados da caracterização físico-química dos hambúrgueres padrão e com levedura natural e levedura rompida mecanicamente em substituição à proteína texturizada de soja ... 53 Tabela 10 - Resultados da cor instrumental e da variação de cor dos hambúrgueres padrão e adicionados de levedura natural e levedura rompida mecanicamente em substituição à proteína texturizada de soja ... 54 Tabela 11 - Resultados das propriedades físicas/tecnológicas dos hambúrgueres padrão e adicionados de levedura natural e levedura rompida mecanicamente em substituição à proteína texturizada de soja ... 55 Tabela 12 - Resultados das médias dos atributos sensoriais no teste de escala hedônica e na intenção de compra dos hambúrgueres padrão e adicionados de levedura natural e levedura rompida mecanicamente em substituição à proteína texturizada de soja ... 58 Tabela 13 - Índices de aceitabilidade (%) para as diferentes formulações de hambúrgueres ... 58
Figura 1 - Microfotografias das células de levedura S. cerevisiae para os diferentes tratamentos ... 35 Figura 2 - Efeito do pH sobre (A) atividade emulsificante (AE) e (B) estabilidade da emulsão (EE) para diferentes amostras de levedura a 7 % (m/v) de proteína ... 37 Figura 3 - Efeito do pH sobre (A) capacidade de formação de espuma (CFE) e (B) estabilidade da espuma (EEs) após 30 min para diferentes amostras de levedura a 3 % (m/v) de proteína ... 39
1 INTRODUÇÃO ... 15
2 LEVEDURA RESIDUAL CERVEJEIRA: CARACTERÍSTICAS E POTENCIAIS APLICAÇÕES ... 17
2.1 Introdução ... 17
2.2 Levedura residual cervejeira e suas principais características ... 18
2.3 Valor nutritivo da levedura como subproduto da cerveja ... 19
2.4 Aplicações da levedura residual cervejeira ... 21
2.5 Fatores limitantes na utilização de levedura cervejeira ... 22
2.6 Processos de obtenção de derivados de levedura ... 23
2.7 Conclusão ... 24
3 LEVEDURA CERVEJEIRA (SACCHAROMYCES CEREVISIAE): AVALIAÇÃO DE PROCESSOS DE ROMPIMENTO CELULAR, COMPOSIÇÃO QUÍMICA, PROPRIEDADES FUNCIONAIS E DIGESTIBILIDADE ... 25
3.1 Introdução ... 25
3.2 Material e métodos ... 26
3.2.1 Obtenção da levedura de cerveja ... 26
3.2.2 Autólise modificada com cloreto de sódio e etanol ... 26
3.2.3 Rompimento mecânico com ultrassom ... 27
3.2.4 Eficiência de ruptura ... 27
3.2.5 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 27
3.2.6 Caracterização físico-química... 28
3.3 Propriedades funcionais ... 28
3.3.1 Propriedades emulsificantes ... 28
3.3.2 Propriedades de espuma ... 29
3.3.3 Capacidade de absorção de água (CAA) ... 30
3.3.4 Capacidade de retenção de óleo (CRO) ... 30
3.3.5 Capacidade de retenção de água (CRA) e índice de solubilidade em água (ISA) .. 31
3.3.6 Digestibilidade in vitro ... 31
3.4 Análise estatística ... 32
3.5 Resultados e discussão ... 32
3.5.2.2 Propriedades espumantes ... 38
3.5.2.3 Capacidade de absorção de água e retenção de óleo ... 40
3.5.2.4 Capacidade de retenção de água e índice de solubilidade em água ... 41
3.6 Digestibilidade in vitro... 43
3.7 Conclusão ... 44
4 APLICAÇÃO DE LEVEDURA CERVEJEIRA NATURAL E ROMPIDA MECANICAMENTE EM HAMBÚRGUER DE CARNE BOVINA EM SUBSTITUIÇÃO A PROTEÍNA TEXTURIZADA DE SOJA ... 46
4.1 Introdução ... 46
4.2 Material e métodos ... 47
4.2.1 Obtenção da levedura cervejeira ... 48
4.2.2 Aplicação da levedura cervejeira em hambúrgueres ... 48
4.2.3 Caracterização físico-química do produto cárneo ... 49
4.2.4 Avaliação das propriedades físicas/tecnológicas do produto cárneo ... 50
4.2.5 Análises microbiológicas dos hambúrgueres ... 51
4.2.6 Análises sensoriais ... 51 4.2.7 Avaliação estatística ... 52 4.3 Resultados e discussão ... 52 4.4 Conclusão ... 59 5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 60 REFERÊNCIAS ... 61
1 INTRODUÇÃO
Existe uma infinidade de resíduos e subprodutos provenientes do beneficiamento e industrialização de produtos químicos e alimentícios, os quais, em sua maioria, são descartados no meio ambiente gerando impactos ambientais. Entre estes, destaca-se a biomassa da levedura Saccharomyces sp., um subproduto gerado em grande escala a partir de duas principais fontes: setor sucro-alcooleiro (produção do etanol) e setor de bebidas alcóolicas (produção de cerveja, vinho, cachaça).
O Brasil ocupa o segundo lugar no ranking mundial de produção de etanol e o terceiro lugar no ranking de produção de cerveja. Em vista disso, a biomassa da levedura Saccharomyces sp. representa para o Brasil um subproduto de interesse, devendo este ter um destino correto. Tipicamente, a quantidade total de biomassa da levedura Saccharomyces produzida na fermentação por cerveja lager, por exemplo, é de cerca de 1,7 kg.m-3 a 2,3 kg.m
-3
de produto final (HELLBORG; PISKUR, 2009; HUIGE, 2006). Assim, por exemplo, em 2016, foram produzidos no Brasil mais de 14 bilhões de litros de cerveja (CERVBRASIL, 2016), consequentemente, foram gerados aproximadamente 24 milhões de quilos de levedura residual. Dessa forma, estudos que buscam viabilizar a aplicação dessa biomassa podem contribuir para duas principais vertentes: viabilidade econômica e ação ambientalmente correta.
Há uma tendência mundial em substituir as proteínas tradicionais por fontes proteicas oriundas de micro-organismos unicelulares como fungos, bactérias, algas e leveduras. A proteína derivada de micro-organismos unicelulares é uma fonte não convencional alternativa, podendo substituir proteínas convencionais de alto custo. Entre as vantagens do uso de proteínas de micro-organismos unicelulares podem ser citadas: o seu rápido crescimento; o alto rendimento de biomassa; a capacidade de usar uma variedade de substratos; pode ser manipulado geneticamente para aumento de rendimento e melhora na composição, e não necessita de grandes áreas para a sua produção. A biomassa de levedura pode ser empregada na indústria de alimentos para produzir concentrados e isolados proteicos de levedura, mantendo suas propriedades funcionais e valores nutritivos (FERREIRA et al., 2010).
Uma das proteínas não-cárneas mais empregadas no Brasil em produtos cárneos, como mortadela, salsicha e hambúrguer é a proteína texturizada de soja (PTS), a qual é adicionada com a finalidade de diminuir custos e melhorar a estabilidade da emulsão (YAMADA et al., 2010). Entretanto, a alergia à proteína da soja é uma das mais comuns, atingindo aproximadamente 0,4 % das crianças (SAVAGE et al., 2010). Ela é desencadeada pelo
próprio sistema imunológico que confunde a proteína de soja por uma substância prejudicial, referida como um alergeno (KATTAN, COCCO; JÄRVINEN, 2011).
A utilização da levedura cervejeira como fonte proteica em produtos cárneos cozidos tem sido avaliada com resultados positivos com relação as suas propriedades emulsificantes, realçador de sabor (pois apresenta grande quantidade de ácido glutâmico) e cor, capacidade de retenção de água e aromatizante (YAMADA et al., 2010; PANCRAZIO et al., 2016).
A levedura inativada termicamente apresenta significativo caráter proteico podendo ser utilizada na alimentação humana e animal em sua forma íntegra ou de derivados de levedura, tanto para enriquecimento nutritivo e funcional, bem como um coadjuvante de produção (flavorizante, antioxidante, emulsificante) (YAMADA et al., 2003).
Ainda, a ruptura celular da levedura pode proporcionar aumento significativo no teor proteico e melhora na digestibilidade, tendo em vista que a parede celular é rompida proporcionando a exposição dos componentes intracelulares (BABAYAN et al., 1981). Técnicas de fracionamento e rompimento celular podem potencializar o uso dessa proteína microbiana em dietas para humanos (CHARPENTIER et al., 1986; SGARBIERI et al., 1999).
Neste sentido, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a levedura cervejeira em sua forma natural (LN) e submetida a diferentes processos de ruptura celular [método mecânico com uso de ultrassom (LRM) e autólise modificada com uso de NaCl e etanol (LAM)], quanto às suas características, propriedades funcionais e de digestibilidade, comparando-as com a proteína texturizada de soja (PTS). Além disso, o presente trabalho descreve também o efeito da incorporação de levedura cervejeira em hambúrgueres, onde as características físicas, químicas e sensoriais foram avaliadas em diferentes formulações.
Esse trabalho foi separado em cinco capítulos, sendo eles: Capítulo 1 – apresenta uma introdução referente ao subproduto cervejeiro, justificando seu estudo; Capítulo 2 – apresenta às principais características desse subproduto, bem como suas potencialidades; Capítulo 3 – apresenta o estudo de processos de ruptura celular [método mecânico com uso de ultrassom (LRM) e autólise modificada com uso de NaCl e etanol (LAM)] e sua capacidade de influenciar nas características físico-químicas, propriedades funcionais e de digestibilidade da levedura cervejeira, comparando com a levedura em sua forma natural (LN) e à proteína texturizada de soja, amplamente utilizada na indústria alimentícia e com potencial alergênico; Capítulo 4 – avaliação da incorporação de levedura cervejeira em hambúrgueres e sua influência nas características físicas, químicas, microbiológicas e sensoriais deste produto cárneo; Capítulo 5 – considerações finais.
2 LEVEDURA RESIDUAL CERVEJEIRA: CARACTERÍSTICAS E POTENCIAIS APLICAÇÕES
Este capítulo apresenta às principais características da levedura cervejeira, seu valor nutritivo, bem como suas potencialidades e possibilidades de aplicação.
2.1 Introdução
A cerveja é uma bebida milenar estando entre as cinco bebidas mais consumidas mundialmente. Na indústria de alimentos e bebidas, o setor cervejeiro detém importante
posição na economia, com uma estimativa de produção mundial anual superior a 190 bilhões de litros no ano de 2016 (KIRIN BEER UNIVERSITY, 2016). De acordo com a Associação Brasileira da Indústria da Cerveja (2016) o Brasil ocupa o terceiro lugar no ranking mundial de produção de cerveja, com quase 14 bilhões de litros por ano, representando 1,6 % do PIB Nacional.
A cerveja é considerada uma bebida nutritiva, pois apresenta em sua composição proteínas, carboidratos (glicose, maltose, frutose, etc.), sais minerais (cálcio, fósforo, potássio, magnésio, etc.) e vitaminas do complexo B (BRIGGS et al., 2004; ALIYU; BALA, 2011). É uma bebida obtida a partir da fermentação alcoólica do mosto cervejeiro oriundo do malte de cevada e água potável, por ação de levedura, com a adição de lúpulo (Brasil, 2009). No entanto, durante sua fabricação, vários resíduos e subprodutos são gerados, sendo os mais comuns os grãos de malte, lúpulo e levedura excedente da fermentação (MUSSATTO; DRAGONE; ROBERTO, 2006).
Em indústrias cervejeiras, a produção da cerveja inicia-se com o processo de brassagem, o qual compreende as etapas de moagem do malte, mosturação, clarificação e fervura (FILLAUDEAU; BLANPAIN-AVET; DAUFIN, 2006). Na sequência realiza-se o resfriamento do mosto e a aeração deste, seguida de fermentação, maturação e filtração. Na etapa de fermentação a levedura é adicionada ao mosto, convertendo os açúcares presentes no malte em etanol e dióxido de carbono. Na etapa de maturação, tem-se a separação da biomassa de levedura do restante do sobrenadante. Após a filtração, a cerveja segue para envase e pasteurização, enquanto parte da levedura é novamente adicionada ao processo de fermentação e a parte excedente é descartada (MUSSATTO; DRAGONE; ROBERTO, 2006).
A biomassa da levedura Saccharomyces sp. representa para o Brasil um subproduto de interesse, pois além de ser gerada durante a fabricação de bebidas fermentadas, como cerveja, cachaça e vinho, também é originada durante a produção de etanol. Em vista disso, estudos que buscam viabilizar a aplicação dessa biomassa para outras finalidades podem contribuir para duas principais vertentes: viabilidade econômica e ação ambientalmente correta.
2.2 Levedura residual cervejeira e suas principais características
A levedura Saccharomyces cerevisiae é amplamente utilizada na produção de etanol, produtos de panificação, assim como no processamento de bebidas alcóolicas fermentadas (cervejas, vinho, cachaça). Na fabricação de cervejas, essa espécie de levedura é o bioagente responsável por converter os açúcares solúveis (glicose, maltose) presente no malte, em etanol e dióxido de carbono, processo conhecido como fermentação alcóolica. Quando a fermentação é encerrada, segue-se o período de maturação, onde a massa de levedura excedente é recuperada por sedimentação natural (MUSSATTO; DRAGONE; ROBERTO, 2006).
Devido seu rápido crescimento durante a etapa de fermentação, a massa da levedura pode multiplicar-se cerca de 3 a 5 vezes, gerando um excedente de produção, tornando-se o segundo maior resíduo das cervejarias (BRIGGS et al., 2004). O processo de reciclo da levedura é uma prática comum nas indústrias cervejeiras, entretanto, há limitação no número de reutilização, de forma a manter a eficiência de produção e a qualidade da bebida (OLAJIRE, 2012).
A sangria da levedura, processo que visa a secagem após lavagem ou destilação e retirada do álcool remanescente, é um método proveitoso para remoção da massa celular excessiva, gerando uma biomassa úmida, conhecida como leite de levedura, a qual é utilizada principalmente como fonte proteica para ração animal (YAMADA et al., 2010). O excedente de células de levedura gerados nas destilarias de álcool ou bebidas fermentadas, inativadas termicamente ou não, podem ser usados diretamente (células íntegras de levedura) ou processados para obtenção de vários derivados, como o autolisado e extratos (HALÁSZ; LÁSZTITY, 1991; SGARBIERI et al, 1999).
Dessa forma, o excedente de levedura da fermentação alcoólica pode ser aproveitado na alimentação animal e humana em sua forma íntegra ou de derivados de levedura, tanto para enriquecimento nutritivo e funcional (MUSSATTO; DRAGONE; ROBERTO, 2006), como
um coadjuvante de produção (flavorizante, antioxidante, emulsificante) de alimentos (RAMOS et al., 2011).
2.3 Valor nutritivo da levedura como subproduto da cerveja
O valor nutritivo da levedura de cerveja depende de diversos fatores, como o substrato utilizado no meio onde a levedura está inserida, o tratamento da massa fluida, as concentrações de sais e o meio de cultura de onde provém a levedura (OLIVEIRA et al., 2010).
A levedura cervejeira é considerada segura, apresenta significativo caráter proteico (entre 40 % e 58 %), com a presença de aminoácidos essenciais (lisina, leucina) (VIEIRA et al., 2016; CABALLERO-CÓRDOBA; PACHECO; SGARBIERI, 1997), carboidratos, sais minerais, particularmente selênio (FERREIRA et al., 2010; HALÁSZ; LÁSZTITY, 1991) e vitaminas do complexo B (B1, B2, B6, ácido pantotênico, niacina, ácido fólico e biotina) (BEKATOROU et al., 2006; FERREIRA et al., 2010; VIEIRA; BRANDÃO; FERREIRA, 2013).
Segundo Cozzolino (2007) a qualidade nutricional ou biológica de uma proteína reflete a biodisponibilidade de aminoácidos essenciais, e na presença destes, em quantidades necessárias ao crescimento e à manutenção do organismo. O valor nutritivo, ou biológico, das proteínas da levedura é considerado bom, representando 80-85 % do valor da caseína (VILELA; SGARBIERI; ALVIM, 2000).
De acordo com Sgarbieri et al. (1999) e Yamada et al. (2003), as células de levedura de cervejaria e de seus derivados variam na composição centesimal, aproximadamente, em proteínas de 32-62 %; extrato etéreo em 0,4-8,5 %; ácido ribonucleico (RNA) em 1,8-9,8 % e cinzas em 4-12,5 %. Estes limites distantes podem ser referentes à variação da concentração dos derivados, estando relacionada às técnicas de processamento e ao estágio de “vida” da levedura. Na Tabela 1 estão descritos os dados da literatura referentes à composição centesimal de leveduras provenientes de cervejarias (em base seca).
Tabela 1 - Composição química da levedura de cerveja
Componentes (%) SGARBIERI et al. (1999) YAMADA; SGARBIERI (2005)
Proteína (N x 5,8) 48,74 39,6 Extrato etéreo 3,33 0,5 Cinzas 8,55 4,6 Umidade NA NA Carboidratos totais 35,00 62,8 NA - não apresentado.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Os componentes que aparecem em maior concentração na biomassa de levedura cervejeira são as proteínas, que variam entre 40-48 % (BUTOLO, 1996). Poucos dados acerca da composição exata dos componentes da proteína estão disponíveis. De acordo com Soboleva e Popova (1988) há uma tendência de fracionar as proteínas baseada na solubilidade. A maior parte das proteínas nativas de leveduras pertence às solúveis em água e/ou sal (albuminas e globulinas).
O teor de minerais das células de leveduras íntegras pode atingir até 10 % do peso seco da célula, sendo os principais componentes o fósforo (1516 mg/100 g), potássio (2035 mg/100 g), cálcio (147 mg/100 g), magnésio (143 mg/100 g) e selênio (687 µg/g) (HALÁSZ; LASZTITY, 1991; YAMADA; SGARBIERI, 2005; DEMIRCI; POMETTO, 1999). O selênio está presente principalmente na levedura de cerveja, sendo recomendado na prevenção de estados carenciais, caracterizados pela queda de cabelo, retardo do crescimento, deficiência reprodutiva, cardiomiopatias, necrose, degeneração do fígado e do pâncreas (LEVANDER, 1989).
Os carboidratos constituem 45 a 55 % do peso seco da levedura, sendo representados, em média, por 33 % de trealose, 27 % de glucanas, 21 % de mananas e 12 % de glicogênio (SARWAR et al., 1985).
A fração de extrato etéreo é baixa e compreende, aproximadamente, proporções iguais de triglicerídios e fosfatídeos (SARWAR et al., 1985). Segundo Schnell e Akin (1979) a composição de extrato etéreo da levedura Saccharomyces sp. depende da natureza do meio de crescimento e varia entre 4 e 7 %, contendo majoritariamente ácidos graxos de cadeia longa, com aproximadamente 20, 40 e 15 % de ácidos oleico, linoleico e linolênico, respectivamente. A biomassa de levedura de cervejarias também tem sido relatada com perfil aminoacídico equilibrado quanto à presença de aminoácidos essenciais, tendo como referência o padrão estabelecido pela FAO/WHO (CABALLERO-CÓRDOBA; SGARBIERI, 2000). Na Tabela 2 estão descritos os dados da literatura referentes aos teores de aminoácidos em levedura provenientes de cervejarias.
Tabela 2 - Teor de aminoácidos (mg/100 mg proteína) em leveduras secas da fermentação de cervejarias
Aminoácidos SGARBIERI et al. (1999)¹ CABALLERO-CÓRDOBA;
SGARBIERI (2000)² Metionina* 2,50 ND Triptofano* 1,45 1,10 Fenilalanina* 5,30 ND Isoleucina* 5,64 5,64 Lisina* 7,13 7,13 Leucina* 8,84 8,84 Valina* 6,20 6,20 Treonina* 6,16 6,16 Histidina* 2,06 2,06 Cistina* 0,84 ND Metionina* + Cisteína ND 2,84 Fenilalanina* + Tirosina ND 9,98 Alanina 7,07 ND Arginina 4,11 ND Tirosina 4,68 ND Ácido Aspártico 11,98 ND Ácido Glutâmico 13,15 ND Prolina 4,45 ND Serina 6,13 ND Glicina 4,93 ND
* aminoácidos essenciais; ND – não determinado. ¹Células de levedura integral; ²Biomassa de levedura. Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
2.4 Aplicações da levedura residual cervejeira
A levedura cervejeira é comercializada em sua maioria como alimento para animais, com custo inferior, após a inativação da levedura pelo calor. Estudos mostram que as leveduras secas são uma excelente fonte de proteína para suínos e ruminantes (HUIGE, 2006), podendo auxiliar também no crescimento de peixes (LARA-FLORES et al., 2003), e como fonte de nutrientes para o crescimento de micro-organismos exigentes ou a formação de produtos relacionados (FERREIRA et al., 2010).
A biomassa de levedura pode ser utilizada na indústria de alimentos para produzir concentrados de proteína de levedura (e isolados) enquanto ainda retêm suas propriedades funcionais e valores nutritivos. Produtos de levedura de cerveja são normalmente encontrados na forma de pós, flocos ou comprimidos, ou em forma líquida. A levedura líquida contém fermento digerido enzimaticamente para melhor digestão, absorção e utilização. Estes
produtos podem ser aspergidos em alimentos, usados como tempero ou misturados com leite, sucos, sopas e molhos (FERREIRA et al., 2010).
A aplicação de derivados de levedura ou de células íntegras, inativadas, têm sido bastante enfatizados na literatura como ingrediente flavorizante e funcional (STEWART; GILLIAND, 1979; JUNILLA et al., 1981) e, complemento nutritivo dos alimentos (DZIEZAK, 1987). O valor nutritivo, particularmente da proteína, de preparados de células íntegras e rompidas mecanicamente e de concentrados proteicos de Saccharomyces sp., também vem ganhando espaço na literatura (HALÁSZ; LÁSZTITY, 1991; CABALLERO-CÓRDOBA; SGARBIERI, 2000).
Diversos trabalhos avaliaram a utilização desses derivados de levedura em alimentos, entre eles estão: extrato de levedura em salsichas (YAMADA et al., 2010) e presuntos (PANCRAZIO et al., 2016); autolisado desidratado em pão de queijo (RAMOS et al., 2011); autolisado e extrato em farinhas de milho (ALVIM et al., 2002) e macarrão (SANTUCCI et al., 2003); autolisado desidratado em farinhas à base de mandioca (PINTO, 2011) e mingau de tapioca (PINTO et al., 2010).
2.5 Fatores limitantes na utilização de levedura cervejeira
A utilização da levedura íntegra em produtos alimentícios é geralmente limitada devido ao odor e sabor indesejáveis da levedura seca (HALÁSZ; LÁSZTITY, 1991). Segundo Sgarbieri et al. (1999) a levedura residual do processo de produção de cerveja também apresenta gosto acentuadamente amargo, devido à adsorção superficial de componentes amargos, como resinas, taninos e óleos essenciais, provenientes do lúpulo usado na fabricação da cerveja.
O sabor amargo da levedura residual de cervejarias é inerente ao produto. Entretanto, o amargor pode ser reduzido ou totalmente eliminado no processo. Dentre as práticas mais comuns para reduzir o amargor podem ser citadas lavagens sucessivas e tratamento alcalino, tendo em vista que os principais componentes amargos provêm de resinas e taninos (SGARBIERI et al, 1999).
Outro fator limitante na utilização da biomassa de levedura como fonte proteica para consumo humano é o seu alto conteúdo de ácido nucleico, principalmente o ácido ribonucleico (RNA), que pode atingir um terço do total proteico da célula (WASLIEN et al., 1970). A ingestão diária de no máximo 2 g de ácidos nucléicos por adulto tem sido bem tolerada, limitando a ingestão de levedura ao redor de 20 g/dia (REED;
NAGODAWITHANA, 1991). Diversas técnicas têm sido empregadas com sucesso na redução dos ácidos nucléicos da biomassa microbiana, entre elas: a) limitação dos ácidos nucléicos durante a fermentação (VILKARI; LINKO, 1977); b) produção de concentrados proteicos com teores reduzidos de RNA (DAMODARAM; KINSELLA, 1984); c) hidrólise e extração de ácidos nucléicos de células íntegras pela ação de reagentes (VILKARI; LINKO, 1977); d) hidrólise e extração de ácidos nucléicos através de enzimas endógenas ou exógenas (SCHACHTEL, 1982).
Além disso, a presença de parede celular rígida, resistente às enzimas digestivas torna os componentes intracelulares parcialmente indisponíveis, dificultando sua aplicação (GALVEZ; RAMIREZ; GARIBAY, 1990; YAMADA et al., 2003). Rosales (1984) verificou em seu estudo que isolados proteicos de células de levedura tem melhor biodisponibilidade de nutrientes e menores teores de ácidos nucléicos, comparado às células íntegras. Desta forma, técnicas de processamento como fracionamento e autólise, poderão potencializar o uso da proteína da levedura em dietas para humanos.
2.6 Processos de obtenção de derivados de levedura
As células que são envolvidas apenas por membranas celulares apresentam relativa facilidade de ruptura, podendo ser alcançada por simples variação da pressão osmótica ou aplicação de ultrassom de baixa intensidade, devido sua fragilidade. Por outro lado, células constituídas de parede celular requerem condições mais específicas de rompimento; é o caso das leveduras que apresentam, além da membrana plasmática, a parede celular constituída principalmente por polímeros rígidos de glucanas, mananas e quitina (CHARPENTIER et al., 1986).
Sgarbieri et al. (1999) desenvolveram uma metodologia para limpeza e desamargamento da biomassa cervejeira com adição de hidróxido de sódio como agente alcalinizante e subsequentes processos para obtenção de derivados da levedura, tais como: o autolisado, obtido pelo processo de autólise das células por adição de álcool etílico e cloreto de sódio, sob temperatura controlada com posterior secagem em Spray drier; o extrato de levedura e parede celular, obtidos pelo fracionamento do autolisado, por centrifugação, em parte solúvel e insolúvel, respectivamente.
Yamada et al. (2003) também definiram uma metodologia para a obtenção do concentrado proteico, através do precipitado de células, por meio de rompimento da parede celular, adição de trimetafosfato de sódio, seguido de centrifugação e liofilização.
A separação de compostos de levedura intracelular para uso em aplicações alimentares requerem meios eficientes de separação da parede celular. Várias metodologias para a separação/rompimento da levedura foram relatadas por outros autores, entre elas, destacam-se: métodos físicos, como temperaturas elevadas (TANGÜLER; ERTEN, 2009), ultrassom (GAO et al., 2014), alta pressão (SHYNKARYK et al., 2009); métodos químicos, com a utilização de álcalis, solventes orgânicos, detergentes e ácidos (YAMADA et al., 2010; ISHII et al., 2016); e métodos enzimáticos (TORRESI et al., 2014). Ainda, alguns reagentes e técnicas podem ser empregados para isolamento da proteína de levedura com baixo teor de RNA (FERREIRA et al., 2010).
2.7 Conclusão
A partir do exposto, nota-se que a levedura residual cervejeira representa uma importante linha de estudo referente as suas características e possibilidades de aplicação, já que a proteína derivada de micro-organismos unicelulares é uma fonte alternativa viável, podendo substituir proteínas convencionais de alto custo. A biomassa de levedura pode ser empregada na indústria de alimentos para produzir concentrados e isolados proteicos de levedura, mantendo suas propriedades funcionais e valores nutritivos, podendo ainda ser aplicada como um coadjuvante de produção.
3 LEVEDURA CERVEJEIRA (SACCHAROMYCES CEREVISIAE): AVALIAÇÃO DE
PROCESSOS DE ROMPIMENTO CELULAR, COMPOSIÇÃO QUÍMICA,
PROPRIEDADES FUNCIONAIS E DIGESTIBILIDADE
Este capítulo apresenta o estudo de diferentes processos de ruptura celular [método mecânico com uso de ultrassom (LRM) e autólise modificada com uso de NaCl e etanol (LAM)] e sua capacidade de influenciar nas características físico-químicas, propriedades funcionais e de digestibilidade da levedura cervejeira, comparando com a levedura em sua forma natural (LN) e à proteína texturizada de soja, amplamente utilizada na indústria alimentícia e com potencial alergênico.
3.1 Introdução
A levedura Saccharomyces cerevisiae é amplamente utilizada na produção de etanol, produtos de panificação, assim como no processamento de bebidas alcóolicas (cervejas, vinho, cachaça). Na produção de cervejas, essa espécie de levedura é o bioagente responsável por converter os açúcares solúveis presente no malte em etanol e dióxido de carbono, processo conhecido como fermentação alcóolica (STEWART, 2016).
Devido ao seu rápido crescimento durante a etapa de fermentação, a massa da levedura pode multiplicar-se cerca de 3 a 5 vezes, gerando um excedente de produção, tornando-se o segundo maior resíduo das cervejarias (BRIGGS et al., 2004). O processo de reciclo de levedo é uma prática comum nas indústrias cervejeiras, entretanto, há limitação no número de reutilização, de forma a manter a qualidade da bebida (OLAJIRE, 2012).
O excedente de levedura da fermentação alcoólica pode ser aproveitado na alimentação animal e humana em sua forma íntegra ou de derivados de levedura, tanto para enriquecimento nutritivo e funcional (MUSSATTO; DRAGONE; ROBERTO, 2006), e também como um coadjuvante de produção (flavorizante, antioxidante, emulsificante) de alimentos (RAMOS et al., 2011). Com relação ao uso da levedura e seus derivados para produção de sopas desidratadas e produtos cárneos, Kollar, Sturkik e Sajbidor (1992) ressaltam a importância de algumas propriedades funcionais específicas, como absorção de água e óleo, retenção de água e atividade emulsificante.
Ainda, a levedura cervejeira é considerada segura para consumo humano, apresenta significativo caráter proteico (entre 40 % e 58 %), com a presença de aminoácidos essenciais
(lisina, leucina) (VIEIRA et al., 2016), carboidratos, sais minerais e vitaminas do complexo B (BEKATOROU et al., 2006; FERREIRA et al., 2010; VIEIRA; BRANDÃO; FERREIRA, 2013).
Nesse contexto, o presente trabalho avaliou a levedura cervejeira na sua forma natural e submetida a diferentes processos de ruptura celular quanto às propriedades funcionais e de digestibilidade, comparando-as com a proteína texturizada de soja (PTS), amplamente utilizada como ingrediente tecnológico na indústria de alimentos.
3.2 Material e métodos
A seguir estão descritas as metodologias e materiais empregados na pesquisa.
3.2.1 Obtenção da levedura de cerveja
A suspensão de células de levedura resultante, predominantemente, da produção de cerveja do tipo pilsen utilizada nos ensaios foi cedida por uma indústria cervejeira da cidade de Chapecó, Santa Catarina, Brasil, com reciclo da levedura em até cinco vezes.
A metodologia aplicada para obtenção da levedura natural limpa e levedura submetida à autólise modificada com NaCl e etanol foi adaptada de acordo com a metodologia descrita por Sgarbieri et al. (1999).
Para a obtenção da levedura natural esta foi centrifugada (Centribio, Cienlab, Brasil) por 10 min a 2500 rpm para retirar o excesso de água. Após o descarte do sobrenadante, foi adicionada água destilada na proporção 2:1 (v/v) para eliminar as impurezas. O processo de lavagem e centrifugação foi realizado duas vezes, sendo obtida a levedura natural limpa (LN). Parte da LN foi submetida ao processo de congelamento em ultrafreezer (IULT 335 D, Indrel, Brasil) por 24 h a uma temperatura média de -86 ºC e após liofilizada por 24 h em um liofilizador de bancada (TFD5503, Ilshin Lab. Co. Ltd., Coréia), a -61 ºC e pressão de 67 mbar, triturada com auxílio de almofariz e pistilo e peneirada (mesh 32 mm/μm). A outra parte de levedura natural limpa foi submetida aos diferentes métodos de rompimento celular: físico com uso de ultrassom e autólise modificada com uso de solvente (etanol – Dinâmica) e sal (cloreto de sódio – Synth).
Para obter a levedura autolisada modificadamente (LAM), a levedura natural limpa foi ressuspensa em água destilada na proporção de 1:1 (p/v) com adição de etanol (7 % v/m) e NaCl (2 % m/m). A mistura foi levada para a incubadora (Luca-223, Lucadema, Brasil) durante 24 h a 55 ºC e 150 rpm. Após as 24 h, o processo foi interrompido com tratamento térmico a 85 ºC por 15 min em banho-maria (Dubnoff Luca 157/28, Lucadema, Brasil). A LAM foi disposta em placas de Petri, congelada em ultrafreezer, liofilizada, triturada e peneirada, seguindo os mesmos parâmetros da LN.
3.2.3 Rompimento mecânico com ultrassom
Para a obtenção da levedura rompida mecanicamente (LRM), a levedura natural foi adicionada em erlenmayer de 250 mL, com água destilada na proporção 1:1 (m/v) e submetida em banho de ultrassom (Q335D, Quimis, Brasil), por uma hora, frequência de 40 kHz, com temperatura máxima de 30 ºC. Após, a LRM foi disposta em placas de Petri, congelada em ultrafreezer, liofilizada, triturada e peneirada, seguindo os mesmos parâmetros da LN.
3.2.4 Eficiência de ruptura
Os tratamentos de ruptura foram acompanhados pela contagem celular em câmara de Neubauer (40x/0.65) utilizando corante azul de metileno (LEE; ROBINSON; WANG, 1981), antes e após o tratamento de rompimento da amostra. A eficiência do rompimento foi avaliada pela porcentagem de células rompidas em cada amostra, como apresentado na Equação 1.
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖ê𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑟𝑢𝑝𝑡𝑢𝑟𝑎 (%) =𝑁𝑅
𝑁𝑇∗ 100
Equação 1
onde:
NR representa o número de células contadas na câmara de Neubauer após o rompimento;
NT representa o número de células contadas na câmara de Neubauer antes do rompimento.
3.2.5 Microscopia eletrônica de varredura (MEV)
As amostras foram fixadas em superfície adesiva condutora e recobertas com ouro em sputter coater (SCD 050, Baltech, Brasil), de modo a torná-las condutoras, adequando-as à
análise. Foi utilizado um microscópio eletrônico de varredura de emissão de campo (FEG) (JSM6701F, JEOL, Brasil) equipado com sistema de microanálise por espectrometria de raios X (EDS), do Laboratório de Microscopia Eletrônica da UDESC-Joinville. As análises foram executadas com 15 kV de tensão de aceleração de elétron, e analisadas no MEV através de imagens formadas por elétrons secundários.
3.2.6 Caracterização físico-química
A caracterização físico-química das amostras (LN, LRM, LAM) foi realizada após liofilização, determinando-se: teor de cinzas, por calcinação em mufla (Q-318M24, Quimis, Brasil), método nº 923.03; teor de extrato etéreo por meio do extrator de Soxhlet (LUCA-145/6, Lucadema, Brasil), método nº 945.16A; teor de umidade por método gravimétrico nº 934.01 com secagem da amostra em estufa (Centribio, Cienlab, Brasil). O teor de nitrogênio foi determinado por micro Kjeldahl (LUCA-341/02, Lucadema, Brasil), método nº 945.18 e o teor de proteína foi calculado utilizando fator de conversão de 5,8. O teor de carboidratos totais foi obtido por diferença. As mesmas análises foram realizadas para a proteína texturizada de soja (Jasmine), para fins de comparação (fator de conversão proteico = 5,46). A cor foi determinada por colorimetria (EZ 0374 4500L, Hunter Lab MiniScan, Brasil), operando no sistema CIE (L*a*b*), onde L* representa a luminosidade e a* e b* são as coordenadas de cromaticidade. As análises foram realizadas em triplicata, de acordo com as metodologias descritas pela AOAC Internacional (2005). A atividade de água (Aw) a 25 °C foi mensurada em determinador de Aw (Pre Water Activity Analyzer, Decagon, Brasil).
3.3 Propriedades funcionais
Na sequência estão descritas as metodologias empregadas para o estudo das propriedades funcionais da levedura cervejeira.
A atividade emulsificante (AE) e a estabilidade da emulsão (EE) foram determinadas segundo o método descrito por Wang e Kinsella (1976), com pequenas modificações. Foram preparadas suspensões de levedura com 7 % (m/v) de proteína em diferentes tampões (pH 5,2, 5,7, 6,2, 6,7 e 7,2). A faixa de pH foi definida em função do pH de hambúrgueres, pois um dos objetivos desse trabalho é avaliar a incorporação da levedura cervejeira em produtos cárneos. As análises foram realizadas em triplicata para cada pH avaliado. As suspensões foram dispersas em agitador de haste mecânico (TE-139, Tecnal, Brasil) a 2600 rpm por 2 min. Após a dispersão, foi adicionado óleo de soja (Soya) à mistura (1:1 v/v), a qual foi novamente homogeneizada em agitador de haste mecânico (TE-139, Tecnal, Brasil) a 2600 rpm por 4 min. A emulsão formada foi dividida igualmente em tubos Falcon e centrifugada a 3200 rpm durante 5 min (Centribio, Cienlab, Brasil). A atividade emulsificante foi expressa como a razão entre a altura da camada emulsionada e a altura do conteúdo total no tubo (Equação 2). A estabilidade da emulsão foi determinada de forma semelhante à atividade emulsificante exceto que a emulsão no tubo foi aquecida em banho-maria a 80 °C (Dubnoff LUCA 157/28, Lucadema, Brasil) durante 30 min e, subsequentemente, resfriada em água corrente por 15 min, antes da centrifugação. A estabilidade da emulsão foi determinada pela razão entre a altura da camada emulsionada após aquecimento e a altura do conteúdo total no tubo (Equação 3).
𝐴𝐸(%) = altura da camada emulsionada
altura do conteúdo total da suspensão∗ 100
(Equação 2)
𝐸𝐸 (%) =altura da camada emulsionada após aquecimento
altura do conteúdo total da suspensão ∗ 100
(Equação 3)
3.3.2 Propriedades de espuma
A capacidade de formação de espuma (CFE) e a estabilidade da espuma (EEs) foram determinadas utilizando o método de Malik, Sharma e Saini (2017) adaptado. A solução de levedura com 3 % (m/v) de proteína em pHs 5,2, 5,7, 6,2, 6,7 e 7,2 foi dispersa em agitador de haste mecânico (TE-139, Tecnal, Brasil) na velocidade máxima (2600 rpm) durante 5 min. Todo o conteúdo foi transferido imediatamente para uma proveta e o volume da espuma foi medido. A porcentagem de aumento de volume foi calculada com base nos volumes inicial da
solução e após a formação da espuma de acordo com Canella (1978). A alteração no volume de espuma foi medida no tempo zero e 30 min após, indicando a estabilidade da espuma. As análises foram realizadas em triplicata para cada pH avaliado.
3.3.3 Capacidade de absorção de água (CAA)
Para a determinação da CAA foi utilizada a metodologia descrita por Malik, Sharma e Saini (2017), com pequenas modificações. A massa de amostra, equivalente a 1 g de proteína, foi misturada com 10 mL de água destilada e homogeneizada durante 1 min em vortex (Phoenix Luferco AP56, Tecnal, Brasil) em velocidade máxima e temperatura ambiente (20 ± 2 °C). A mistura foi deixada em repouso durante 30 min e depois centrifugada a 4000 rpm por 30 min (Centribio, Cienlab, Brasil). O sobrenadante foi descartado e os tubos foram invertidos a 45° durante 25 min para drenar o líquido restante do sedimento de proteína. A capacidade de absorção de água foi avaliada em triplicata e calculada como:
𝐶𝐴𝐴 =𝑎 − 𝑏 𝑐
Equação 4 onde:
a é a massa do tubo com amostra úmida após a drenagem do líquido. b é a massa do tubo com amostra seca.
c é a massa de amostra equivalente a 1 g de proteína.
3.3.4 Capacidade de retenção de óleo (CRO)
Para a determinação da CRO foi utilizada a metodologia descrita por Wasswa et al. (2007), adaptada. Em um tubo Falcon quantificou-se a massa de amostra, equivalente a 0,5 g de proteína e adicionou-se 10 mL de óleo de soja (Soya). A mistura foi homogeneizada durante 30 s em vortex (Phoenix Luferco AP56, Tecnal, Brasil) por duas vezes em velocidade máxima e temperatura ambiente (20 ± 2 °C). A dispersão de óleo foi centrifugada (Centribio, Cienlab, Brasil) por 30 min a 4000 rpm. Após, determinou-se o volume de óleo separado sendo a CRO calculada como o volume (mL) de óleo absorvido por massa de proteína (g). A CRO de cada amostra foi avaliada em triplicata.
3.3.5 Capacidade de retenção de água (CRA) e índice de solubilidade em água (ISA)
Foram determinados segundo Anderson et al. (1969), adaptada. A massa de amostra foi quantificada em quantidade equivalente a 2,5 g (bs) de proteína e misturada em 30 mL de água destilada. A mistura foi mantida sob agitação por 30 min a 300 rpm e 20 °C (Luca-223, Lucadema, Brasil) e, posteriormente, centrifugada (Centribio, Cienlab, Brasil) a 4000 rpm por 30 min. O sedimento foi quantificado e, no sobrenadante, determinado o resíduo seco (sólidos solúveis) após evaporação em estufa a 105 °C até massa constante. As análises foram realizadas em triplicata e os resultados calculados de acordo com as Equações 5 e 6:
𝐶𝑅𝐴 = 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑟𝑒𝑠í𝑑𝑢𝑜 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑖𝑓𝑢𝑔𝑎çã𝑜 (𝑔) 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑠 (𝑔) − 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑟𝑒𝑠í𝑑𝑢𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑣𝑎𝑝𝑜𝑟𝑎çã𝑜 (𝑔) Equação 5 𝐼𝑆𝐴 (%) =𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑜 𝑟𝑒𝑠í𝑑𝑢𝑜 𝑑𝑒 𝑒𝑣𝑎𝑝𝑜𝑟𝑎çã𝑜 (𝑔) 𝑚𝑎𝑠𝑠𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑠)(𝑔) ∗ 100 Equação 6 3.3.6 Digestibilidade in vitro
A avaliação nutricional foi realizada mediante a determinação da digestibilidade in vitro, proposta por Sgarbieri (1996). Inicialmente, quantificou-se uma quantidade de amostra equivalente a 0,5 g de proteína. Foi preparada uma solução de 1,5 mg de pepsina por mL de HCl 0,1 N e adicionado 15 mL desta solução à amostra, após foi adicionado 0,5 mL de solução de merthiolate incolor, homogeneizado manualmente e levado ao banho-maria (Dubnoff LUCA 157/28, Lucadema, Brasil) a 37 ºC por 3 h, com agitação periódica. Após, os tubos contendo as amostras foram resfriados e o pH ajustado em 8,0 com uma solução de NaOH 0,2 N. Uma solução de 0,5 mg.mL-1 de pancreatina foi preparada com solução tampão fosfato pH 8,0. 10 mL da solução de pancreatina foram adicionados ao produto hidrolisado pela pepsina e levado novamente ao banho-maria a 37 ºC (Dubnoff LUCA 157/28, Lucadema, Brasil), por 24 h com agitação periódica (a cada 5 h). Após o tempo de hidrólise foram adicionados 5 mL de uma solução de TCA 5 % (ácido tricloroacético) à amostra e centrifugada (Centribio, Cienlab, Brasil) por 15 min a 5000×g (9500 rpm) para separação do material insolúvel. O filtrado foi coletado para determinação do nitrogênio digerido, pelo
método de micro Kjeldhal (AOAC, 2005). A digestibilidade in vitro foi avaliada em triplicata e expressa como porcentagem de nitrogênio digerido em relação ao nitrogênio total na amostra inicial, conforme Equação 7.
𝐷𝑖𝑔𝑒𝑠𝑡𝑖𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 (%) = 𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔ê𝑛𝑖𝑜 𝑑𝑖𝑔𝑒𝑟𝑖𝑑𝑜
𝑁𝑖𝑡𝑟𝑜𝑔ê𝑛𝑖𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑛𝑎 𝑎𝑚𝑜𝑠𝑡𝑟𝑎∗ 100
Equação 7
3.4 Análise estatística
A avaliação estatística dos dados obtidos em triplicata foi realizada com o Software STATISTICA 13.2 Trial (Statsoft) pela análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey a 5 % de significância.
3.5 Resultados e discussão
A seguir serão apresentados os resultados obtidos na pesquisa quanto à composição química e propriedades funcionais da levedura cervejeira em sua forma natural e tratada por diferentes métodos.
3.5.1 Composição química
Na Tabela 3 encontram-se os resultados obtidos na caracterização físico-química das amostras submetidas aos diferentes tratamentos em base seca (BS).
Tabela 3 - Composição percentual da levedura natural (LN), levedura rompida mecanicamente (LRM), levedura autolisada modificadamente (LAM) e proteína texturizada de soja (PTS) Componente (g/100 g de BS) LN LRM LAM PTS Proteína 42,83 ± 0,11a 43,80 ± 0,62a 39,32 ± 0,87b 42,81 ± 1,03 Extrato etéreo 1,45 ± 0,40ab 2,04 ± 0,41a 1,25 ± 0,48b 0,14 ± <0,01 Cinzas 1,74 ± 0,17b 2,36 ± 0,30b 13,14 ± 0,67a 6,77 ± 0,05 Umidade 0,07 ± <0,01c 0,10 ± <0,01a 0,09 ± <0,01b 0,14 ± <0,01 Carboidratos totais 53,91 51,70 46,48 48,64 Atividade de água 0,161 ± 0,044a 0,172 ± 0,008a 0,194 ± 0,010a -
Valores expressos como média±desvio padrão. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p ≤ 0,05) pelo teste de Tukey. BS – base seca.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Os componentes que aparecem em maior quantidade para todas as amostras, de acordo com os resultados apresentados na Tabela 3, são os carboidratos totais, provavelmente com predomínio de açúcares solúveis (PLATA et al., 2013), seguidos por proteínas.
Foi possível verificar uma diferença no teor de carboidratos (Tabela 3) sendo de 46,48 %, 51,70 % e 53,91 % para a LAM, LRM e LN, respectivamente. Essa diferença deve-se provavelmente ao aumento do teor de cinzas observado para a LAM. Segundo Sarwar et al. (1985), os carboidratos constituem cerca de 45 a 55 % da matéria seca da levedura, o que corresponde com os valores encontrados no presente trabalho.
O teor de proteína (Tabela 3) para LN e LRM não apresentaram diferença significativa entre si. Apenas para a LAM foi observado um menor teor de proteína. Essa diferença pode ser devido aos valores relativos de nitrogênio ou proteína, devido à presença de mais ou menos carboidratos e cinzas no conteúdo final da célula. Estudos relatam que a porcentagem encontrada de proteínas para leveduras cervejeiras varia entre 32-62 % (SGARBIERI et al., 1999; YAMADA; SGARBIERI, 2005; PINTO et al., 2013; YAMADA et al., 2003).
Para o teor de extrato etéreo (Tabela 3), foi observada diferença estatística entre as amostras LRM e LAM, que não diferiram estatisticamente da LN. Esse resultado pode ser devido à composição da amostra, uma vez que nenhuma etapa do tratamento poderia ter causado essa diferença no conteúdo lipídico. Além disso, o conteúdo lipídico das células de levedura pode variar entre 0,4 e 8,5 % (SGARBIERI et al., 1999; YAMADA et al., 2003). A fração do extrato etéreo é baixa e compreende proporções aproximadamente iguais de triglicerídeos e fosfatídeos (SARWAR et al., 1985). Segundo Schnell e Akin (1979) a composição lipídica de levedura Saccharomyces sp. depende da natureza do meio de crescimento e varia entre 4 e 7 %.
O teor de cinzas diferiu significativamente apenas para a LAM (Tabela 3) devido ao uso de NaCl como agente plasmolizante na autólise modificada. O cloreto de sódio contribui para a decomposição da parede celular, facilitando a liberação de enzimas intracelulares. Entretanto, sua utilização é limitada devido ao elevado conteúdo de sal no produto final (LEE, 1996). O teor de minerais da levedura cervejeira pode atingir até 10 % da massa seca da célula, sendo os principais componentes o fósforo (1516 mg/100 g), potássio (2035 mg/100 g), cálcio (147 mg/100 g), magnésio (143 mg/100 g) e selênio (687 µg/g) (HALÁSZ; LASZTITY, 1991; YAMADA; SGARBIERI, 2005; DEMIRCI; POMETTO, 1999).
A umidade apresentou diferença significativa entre as amostras, sendo maior para LRM, seguida da LAM e menor para LN. No tratamento de ruptura celular aplicado na LRM
e LAM, ambas são ressuspensas em água, enquanto que a LN permanece concentrada, não sofrendo o processo de diluição e com isso, obtendo ao final do processo de liofilização menor teor de água na composição final.
Os resultados da análise de atividade de água para as diferentes amostras (Tabela 3) não apresentaram diferença significativa entre si, sendo todos abaixo de 0,2, os quais estão de acordo de acordo para alimentos desidratados (0,6), impossibilitando o crescimento de micro-organismos, tornando os alimentos microbiologicamente estáveis (SILVA; MARSAIOLI JR., 2003).
O tratamento de ruptura mecânica não proporcionou variação significativa na composição química da amostra quando comparada à levedura natural, enquanto que, o tratamento por autólise modificada acarretou em diminuição significativa no teor de proteína e aumento do teor de cinzas.
De acordo com Oliveira et al. (2010) a composição química do extrato de levedura depende de diversos fatores, tais como: qualidade do substrato, condições de cultivo e concentração de nutrientes. Para as leveduras de fermentação, outro fator importante que deve ser levado em consideração, são os números de reciclos de produção que pode influenciar na sua composição química devido às sucessivas centrifugações e lavagens.
A eficiência de ruptura foi avaliada por contagem de células, antes e depois do tratamento das amostras. O tratamento com ultrassom resultou em 42 % de eficiência de ruptura, enquanto que, para o tratamento de autólise modificada as células permaneceram inalteradas. A caracterização das células foi realizada através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). A Figura 1 apresenta as imagens em superfície lisa, para os diferentes tratamentos com aumento de 1.000 e 5.000 vezes.
Figura 1 - Micrografias das células de levedura S. cerevisiae para os diferentes tratamentos (superfície lisa)
Superfície lisa: (A – B) levedura natural (LN); (C – D) levedura rompida mecanicamente (LRM); e (E – F) levedura autolisada modificadamente (LAM).
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Pela imagem apresentada na Figura 1 percebe-se que a LAM (E e F) está com a superfície aparentemente danificada quando comparada com a LN (A e B), possivelmente pela presença do sal e do etanol no processo de autólise modificada. Essas deformações podem estar relacionadas à toxicidade do etanol ou até mesmo devido à interação química entre os componentes utilizados na autólise modificada, que podem ter provocado a rugosidade da amostra. A LRM (C e D) apresenta desidratação das células mais acentuadas
A B
C D
que a LN, o que sugere o rompimento da parede celular e saída do material interno da célula devido ao tratamento com ultrassom.
Na Tabela 4 estão descritos os resultados da análise colorimétrica para a levedura natural (LN), levedura submetida à ruptura celular com uso de ultrassom (LRM) e levedura submetida à autólise modificada com NaCl e etanol (LAM).
Tabela 4 - Análise de cor para os parâmetros da levedura natural (LN), levedura rompida mecanicamente (LRM) e levedura autolisada modificadamente (LAM)
Parâmetros LN LRM LAM
L* 59,13 ± 0,55a 59,31 ± 1,79a 54,77 ± 2,76b
a* 4,52 ± 0,18b 4,45 ± 0,10b 5,50 ± 0,47a
b* 16,42 ± 1,60ab 16,78 ± 1,41a 15,00 ± 1,24b
ΔE - 1,77 5,26
Valores expressos em média ± desvio padrão. Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p≤0,05) pelo teste de Tukey.
Fonte: Elaborado pela autora, 2018.
Pela Tabela 4 é possível verificar que o parâmetro de luminosidade (L*) apresentou diferença estatística apenas para a LAM, indicando uma tonalidade mais escura com relação às demais amostras. Essa diferença pode ser justificada pelo tratamento ao qual a LAM foi submetida, podendo ocorrer alguma alteração durante o processo de autólise, realizado a temperatura de 55 ºC. Para o parâmetro a* (coordenada vermelho/verde), a LAM também diferiu estatisticamente em relação às demais amostras, indicando uma tonalidade menos esverdeada. Para o parâmetro b* (coordenada amarelo/azul) houve diferença significativa entre a LRM e a LAM. A LRM se apresentou mais amarelada em relação à LAM.
A variação de cor (ΔE), que relaciona a variação da luminosidade (ΔL*), cromaticidade a* (verde ao vermelho) e cromaticidade b* (azul e amarelo) da amostra de levedura natural (LN), considerada como amostra padrão, em relação às amostras submetidas aos tratamentos de ruptura (LRM e LAM) foi calculado como descrito por Lopes, Mattietto e Menezes (2005) (Tabela 4). Para o ΔE, segundo Francis e Clydesdale (1975), valores próximos de zero indicam que as amostras resultaram em um produto com características semelhantes ao controle e, diferenças, iguais ou superiores a dois, podem ser consideradas como uma diferença entre dois tratamentos perceptivelmente visíveis ao olho humano. Dessa forma, observa-se que o tratamento com ultrassom (LRM) não resulta em alteração perceptível na cor com relação à amostra padrão (LN). Já o tratamento de autólise modificada (LAM) interfere significativamente na cor da amostra, diferindo da amostra padrão (LN),
possivelmente devido ao tratamento térmico a que foi submetida durante a autólise modificada.
3.5.2 Propriedades funcionais
A seguir serão apresentados os resultados obtidos quanto às propriedades funcionais.
3.5.2.1 Propriedades emulsificantes
A Figura 2 apresenta os resultados obtidos de atividade emulsificante (AE) (%) e estabilidade da emulsão (EE) (%) para a levedura natural (LN), levedura submetida ao rompimento celular mecânico (LRM) e levedura submetida ao processo de autólise modificada (LAM). A proteína texturizada de soja (PTS) não apresentou atividade emulsificante na concentração proteica utilizada e, consequentemente, dados da estabilidade da emulsão também não foram determinados para esta. Lee e Lee (2009) avaliaram a atividade emulsificante da PTS tratada por enzimas proteolíticas em diferentes tempos de hidrólise e obtiveram incremento significativo da AE com o aumento do tempo de tratamento, enquanto a amostra controle (não tratada enzimaticamente) apresentou resultados positivos de 36,82 ± 1,86 %. As amostras de LN e LRM apresentaram boas propriedades emulsificantes, com AE de cerca de 50 % e EE próximo a 100 %, ainda maior do que os resultados encontrados por Lee e Lee (2009) para a PTS.
Figura 2 - Efeito do pH sobre a (A) atividade emulsificante (AE) e (B) estabilidade da emulsão (EE) para diferentes amostras de levedura a 7 % (m/v) de proteína
Levedura natural (LN); levedura rompida mecanicamente (LRM); levedura autolisada modificadamente (LAM). Os valores que não possuem a mesma letra são significativamente diferentes (p ≤ 0,05).
