JULIANE ROCHA DE SANT’ANNA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E MOLECULAR DE ISOLADOS
SELVAGENS E MUTANTES DE Colletotrichum truncatum, E DA GENOTOXICIDADE DO ÓLEO DE Achillea millefolium ATRAVÉS DO CICLO PARASSEXUAL EM Aspergillus nidulans.
Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas.
JULIANE ROCHA DE SANT’ANNA
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E MOLECULAR DE ISOLADOS
SELVAGENS E MUTANTES DE Colletotrichum truncatum, E DA GENOTOXICIDADE DO ÓLEO DE Achillea millefolium ATRAVÉS DO CICLO PARASSEXUAL EM Aspergillus nidulans.
Prof(a). Dr(a). Marialba Avezum Alves de Castro-Prado
Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá – PR., Brasil)
Sant'Anna, Juliane Rocha de
S281c Caracterização genética e molecular de isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum truncatum, e da genotoxicidade do óleo de Achillea millefolium através do ciclo parassexual em Aspergillus nidulans /
Juliane Rocha de Sant'Anna. -- Maringá : [s.n.], 2009. 42 f. : il. color.
Orientadora : Prof. Dr. Marialba Avezum Alves de Castro-Prado.
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Celular e Molecular, 2009.
1. Mil-folhas (Achillea millefolium) - Plantas medicinais. 2. Mil-folhas (Achillea millefolium) - Óleo essencial - genotoxicidade. 3. Mil-folhas
(Achillea millefolium) - Óleo essencial - Aspergillus
nidulans. 4. Soja - Colletotrichum truncatum -
Variabilidade genética - RAPD. I. Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração: Biologia Celular e Molecular. II. Título.
BIOGRAFIA
AGRADECIMENTOS
A ti Deus Pai, por tudo o que tens feito, por tudo o que vais fazer, por tuas promessas e por tudo o que és, eu quero te agradecer com todo o meu ser.
Minha gratidão e o meu respeito a minha orientadora Dra Marialba Avezum Alves de Castro Prado, pelos ensinamentos transmitidos, pelo exemplo de profissionalismo e de amor à pesquisa, pelo incentivo, estímulo, apoio e por sua amizade.
Ao Professor Edilson N. Kaneshima, pelos ensinamentos, apoio e incentivo.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudo concedida.
A todas as colegas do Laboratório de Genética de Microorganismos pelo carinho, amizade e companheirismo, Cláudia Tiemi Miyamoto Rosada, Claudinéia Conationi da Silva Franco, Juliana de Castro-Prado e Lúcia Jacovozzi Rosada.
Aos Professores Obdúlio Gomes Miguel, Carlos Itsuo Yamamoto, Miriam Machado Cunico e Lilian Cristina Côcco da Universidade Federal do Paraná, pela caracterização química do óleo de Achillea millefolium e Cirino Correa Júnior da Emater –PR pelo fornecimento do óleo essencial de A. millefolium.
Às Professoras Claudete Aparecida Mangolin e Isabel Cristina Martins dos Santos que contribuíram para a execução dos trabalhos experimentais.
Aos funcionários do Departamento de Biologia Celular e Genética, especialmente à Luzia Aparecida Regassi na preparação dos materiais, às colaboradoras, Maria José, Marli e Maroli e à Rosinete Gonçalves por sua assistência.
À Professora Josil Gebara pelo incentivo e confiança.
Ao meu Deus que faz todas as coisas segundo o seu propósito eterno.
Aos meus pais, sempre presentes.
Aos meus irmãos, Paula e Jeferson e cunhados, Edson e Cláudia pelo constante incentivo.
APRESENTAÇÃO
Esta Tese, intitulada Caracterização genética e molecular de isolados selvagens e mutantes de Colletotrichum truncatum, e da genotoxicidade do óleo de Achillea
millefolium através do ciclo parassexual em Aspergillus nidulans, é composta por dois
artigos científicos:
1. “Genetic Relatedness of Brazilian Colletotrichum truncatum isolates assessed by vegetative compatibility groups and RAPD analysis”, enviado para publicação no periódico Biological Research (Chile), Fator de Impacto 1.057 (JCR 2007).
2. “Genotoxicity of Achillea millefolium Essential oil in Diploid cells of
Aspergillus nidulans”, publicado no periódico Phytotherapy Research 23:
RESUMO GERAL
A parassexualidade, em fungos filamentosos, inicia-se com a heterocariose, a associação de núcleos haplóides geneticamente distintos num citoplasma comum. No interior da hifa heterocariótica, dois núcleos haplóides poderão sofrer fusão e originar núcleos diplóides heterozigotos, sujeitos a sucessivas divisões mitóticas. Dois processos cromossômicos poderão ocorrer durante as divisões mitóticas dos núcleos diplóides: a) não-disjunção cromossômica e b)
crossing-over. O primeiro processo, através da origem de núcleos aneuplóides, produzirá
núcleos haplóides. O crossing-over mitótico, por sua vez, produzirá núcleos diplóides recombinantes, os quais, sujeitos ao processo de haploidização, poderão originar haplóides recombinantes.
A heterocariose, entretanto, é limitada pelo sistema de compatibilidade vegetativa, governado pelos genes het (incompatibidade para heterocário) ou vic (incompatibilidade vegetativa), onde somente linhagens compatíveis e similares geneticamente para os loci het ou
vic podem produzir heterocários viáveis. Em fungos fitopatogênicos, isolados capazes de formar
heterocários viáveis entre si são caracterizados como membros de um mesmo grupo de compatibilidade vegetativa (VCG). A parassexualidade pode, portanto, atuar como um mecanismo de variabilidade genética, uma vez que isolados vegetativamente compatíveis podem trocar informações genéticas por meio da heterocariose.
A compatibilidade vegetativa entre isolados fitopatogênicos pode ser avaliada através da formação de heterocários entre isolados portadores de mutações auxotróficas geneticamente complementares. Mutantes deficientes na assimilação do nitrato (mutantes nit) são facilmente obtidos, através do cultivo do fitopatógeno em presença de clorato de potássio. Tais mutantes apresentam morfologia característica quando cultivados em presença de nitrato de sódio e são amplamente utilizados na caracterização de fungos fitopatogênicos em grupos de compatibilidade vegetativa.
pelos isolados G e H. O isolado A, entretanto, não foi incluído em nenhum dos VCGs pois mostrou-se deficiente para o processo de anastomose de hifas, sendo caracterizado como auto-incompatível.
As análises de RAPD, utilizando-se cinco primers distintos, permitiram identificar um total de 101 bandas, das quais 86 (85,15%) foram polimórficas. A análise do dendrograma mostrou um grau de similaridade genética entre os isolados de C. truncatum variando de 0,331 (isolado E) a 0,882 (isolados B e F) e permitiu identificar três grupos de RAPD: o grupo I, composto pelos isolados A e C, com grau de similaridade igual a 0,658; o grupo II, contendo os isolados B, D, F, G, H e I; e o grupo III formado apenas pelo isolado E. Polimorfismo genético foi também observado entre o isolado C e seus mutantes C.17 (nit1), C.16 (NitM), C.60 (NitM), e C.62 (NitM), demonstrando que linhagens fenotipicamente distintas podem também ser discriminadas molecularmente através dos marcadores de RAPD. Apesar da ausência de uma correlação entre as análises de RAPD e VCG, os resultados do presente estudo demonstram o potencial da análise de grupos de compatibilidade vegetativa na discriminação de isolados de C.
truncatum geneticamente similares quando comparados pela técnica do RAPD.
Além de atuar como um mecanismo que promove a diversidade genética entre fungos filamentosos, o ciclo parassexual pode ainda ser utilizado como ferramenta importante na caracterização do potencial genotóxico de substâncias químicas. O fungo filamentoso
Aspergillus nidulans é um excelente organismo para o estudo do crossing-over mitótico, pois
passa grande parte de seu ciclo celular em G2, fase esta em que os cromossomos encontram-se duplicados, facilitando a ocorrência da recombinação mitótica.
Em células diplóides heterozigotas, o crossing-over mitótico entre cromátides homólogas pode originar clones de células homozigotas para todos os genes distais ao ponto de permuta, se uma cromátide recombinante e uma paternal migrarem para o mesmo pólo mitótico. A perda da heterozigosidade, ocasionada pelo crossing-over mitótico, é considerada um evento importante na promoção de tumores hereditários, pela perda do alelo funcional do gene supressor de tumor.
(amarelos ou brancos) na colônia do diplóide, cujos conídios são verdes. Um aumento significativo no número de segregantes diplóides recombinantes, amarelos e brancos, foi observado nas colônias da linhagem diplóide, cultivadas em presença de 0,19 µ L/mL e 0,25 µ L/mL do óleo essencial de A. millefolium, em comparação com o controle (diplóide não tratado).
O óleo, na concentração de 0,25 µ L/mL, também induziu um aumento significativo no número de segregantes aneuplóides nas colônias da linhagem diplóide. Estes segregantes originam-se através do processo de não-disjunção cromossômica, e são facilmente identificados pelo crescimento micelial reduzido, em relação aos segregantes haplóides e diplóides, e pela grande instabilidade mitótica das colônias aneuplóides, quando comparadas com o controle.
Dois mecanismos podem explicar o efeito recombinagênico induzido pelo óleo essencial de A. millefolium: (a) o óleo induz uma desorganização do fuso mitótico, estimulando a ocorrência de eventos de não-disjunção, ou (b) o óleo induz quebras cromossômicas, resultando em crossing-over mitótico ou deleções cromossômicas. Estes resultados demonstram o potencial genotóxico do óleo essencial de A. millefolium.
GENERAL ABSTRACT
Parasexuality in filamentous fungi starts with heterokaryosis, or rather, the association of genetically distinct haploid nuclei in the common cytoplasm. Two haploid nuclei within the heterokaryotic hyphae may fuse and form heterozygous diploid nuclei which may undergo successive mitotic divisions. Two chromosome processes may occur during the diploid nuclei’s mitotic divisions: a) chromosome non-disjunction and b) crossing-over. Whereas haploid nuclei are caused by chromosome non-disjunction, mitotic crossing-over gives rise to recombinant diploid nuclei which, through a haploidization process, may produce recombinant haploids.
However, heterokaryosis is limited by the vegetative compatibility system, affected by genes het (heterokaryon incompatibility) or vic (vegetative incompatibility) in which only genetically compatible and similar strains for het or vic loci may produce viable heterokaryons. In the case of phytopathogenic fungi, isolates that form viable heterokaryons among themselves are members of the same vegetative compatible group (VCG). Parasexuality may be a mechanism for genetic variability since vegetative compatible isolates may exchange genetic information through heterokaryosis.
Vegetative compatibility among phytopathogenic isolates may be evaluated by the formation of heterokaryons among isolates which are genetically complementary for auxotrophic mutations. Deficient mutants in nitrate assimilation (nit mutants) may be easily obtained through the phytopathogenic cultivation in potassium chlorate. These mutants have a special morphology when cultivated in presence of sodium nitrate and are widely used in the characterization of phytopathogenic fungi in vegetative compatible groups.
RAPD analyses with five distinct primers identified 101 bands, of which 86 (85.15%) were polymorphic. Whereas dendrogram analysis revealed genetic similarity among isolates of
C. truncatum, ranging between 0.331 (isolate E) and 0.882 (isolates B and F), it identified three
RAPD groups. Group I comprised isolates A and C, with similarity equal to 0.658; Group II, comprised isolates B, D, F, G, H and I; Group III comprised only isolate E. Genetic polymorphism was also reported between isolate C and its mutants C.17 (nit 1), C.16 (NitM), C.60 (NitM), and C.62 (NitM). This fact shows that phenotypically distinct strains may be molecularly discriminated by RAPD markers. In spite of the lack of co-relationship between RAPD and VCG analyses, current results reveal the potential of vegetative compatibility group analysis in the discrimination of genetically similar C. truncatum isolates when compared by RAPD.
The parasexual cycle functions not only as a mechanism that causes the genetic diversity among filamentous fungi but may be used as an important tool for the characterization of chemical compounds’ genotoxic potential. The filamentous fungus Aspergillus nidulans is an excellent organism to study mitotic crossing-over since most of its cell cycle is passed in G2 in which chromosomes are duplicated. The occurrence of mitotic recombination is thus facilitated.
In the case of heterozygous diploid cells, mitotic crossing-over between homologous chromatids may produce homozygous cells for all distal genes till exchange if a recombinant and a parental chromatid migrate to the same mitotic pole. Mitotic crossing-over-caused loss of heterozygosity is an important event in producing hereditary tumors. This fact is due to the loss of the functional tumor-suppressor allele.
Essential oil extracted from the Achillea millefolium flowers is commonly used in popular medicine for the treatment of respiratory infections, fever and rheumatic pains. Taking into account the therapeutic use of A. millefolium oil, current investigation evaluate the genotoxicity of A. millefolium essential oil by the Mitotic Segregation Index (MSI) using a diploid strain of the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Strain A757//UT448, which is heterozygous for the two conidia color genes, yA2 (yellow) and wA2 (white), gives rise to haploid mitotic segregants and/or recombinant diploids during its growth in CM. They may be identified by the visual inspection of the colored sectors (yellow or white) in the diploid colony with green conidia. When compared to control (non-treated diploids), a significant increase in the number of recombinant diploid yellow and white segregants, was reported in diploid strain colonies cultivated in 0.19 µL/mL and 0.25 µL/mL of A. millefolium essential oil.
non-disjunction process and may be easily identified by their reduced mycelial growth, when compared to haploid or diploid segregants, and by the aneuploids colonies’ great mitotic unstableness when compared to that of control.
Two mechanisms may explain the recombinogenic effect induced by the essential oil of A.
millefolium: a) the oil causes a disorganization of the mitotic spin and stimulates the occurrence
of non-disjunction events; or b) the oil causes chromosome breaks with mitotic crossing-over or chromosome deletions. Results show the genotoxic potential of the A. millefolium essential oil.
