UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU E PESQUISA MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E INOVAÇÃO EM SAÚDE
SÔNIA MARIZA LUIZ DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA Moringa oleifera LAM.
SÃO PAULO 2019
UNIVERSIDADE ANHANGUERA DE SÃO PAULO
DIRETORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU E PESQUISA MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA E INOVAÇÃO EM SAÚDE
SÔNIA MARIZA LUIZ DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA Moringa oleifera LAM.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Biotecnologia e Inovação em Saúde da Universidade Anhanguera de São Paulo - UNIAN, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia e Inovação em Saúde.
Orientador (a): Prof ͣ. Dr ͣ. Maria Cristina Marcucci Ribeiro
Coordenador (a): Profª. Drª. Alejandra Hortência Miranda González
SÃO PAULO 2019
Ficha Catalográfica
OLIVEIRA, Sônia Mariza Luiz de
Avaliação química e atividade antioxidante da Moringa oleifera Lam. / Sônia Mariza Luiz de Oliveira. – São Paulo, 2019.
140 f.: il., 30 cm
Dissertação (Programa de Pós-graduação em Biotecnologia e Inovação em Saúde) – Coordenadoria de Pós-graduação - Universidade Anhanguera de São Paulo, 2019.
Orientador: Profa. Dra. Maria Cristina Marcucci Ribeiro
1. Moringa oleífera lam.. 2. Composição química. 3. Fenóis. 4. Flavonoides. 5.Atividade antioxidante. I. Título. II. Universidade Anhanguera de São Paulo.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Curso de Biotecnologia e Inovação em Saúde da Universidade Anhanguera de São Paulo - UNIAN, para a obtenção do título de Mestre em Biotecnologia e Inovação em Saúde, em 12 de março de 2019.
AVALIAÇÃO QUÍMICA E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE DA Moringa oleifera LAM.
SÔNIA MARIZA LUIZ DE OLIVEIRA
_________________________________________
Drª Maria Cristina Marcucci Ribeiro Orientadora
Banca Examinadora:
________________________________________
Drª. Maria Cristina Marcucci Ribeiro Presidente
________________________________________
Dr. Niraldo Paulino
Universidade Anhanguera de São Paulo
________________________________________
Drª. Roberta Caroline Bruschi Alonso Universidade Metropolita de Santos Universidade de Mogi das Cruzes
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Drª. Simone dos Santos Grecco SUPLENTE
Universidade Anhanguera de São Paulo
________________________________________
Dr. Rogério da Silva Veiga SUPLENTE
Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de Misericórdia
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida, Aos meus pais, Sr. Joaquim D. de Oliveira e Srª. Matildes Luiz de Sousa,
Pelo que me ensinaram e transmitiram, Pelo amor e carinho,
Pelo apoio incondicional, Pelo que sou.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Universidade Anhanguera de São Paulo - UNIAN, pela oportunidade de alcançar o título de Mestre em Biotecnologia e Inovação em Saúde.
A minha orientadora, Profª. Drª. Maria Cristina Marcucci Ribeiro, por ter me aceito e recebido como orientanda, pelos seus valiosos ensinamentos profissionais que foram a base da minha formação científica e também pelos exemplos de conduta como pessoa.
A Profª. Drª. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya do programa de Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos e Biologia Vegetal do IB – UNICAMP pela valiosa contribuição na conclusão deste trabalho.
A Profa. Dra. Roberta Caroline Bruschi Alonso, da Universidade Metropolitana de Santos (UNIMES), Santos, SP e Núcleo de Pesquisas Tecnológicas (NPT), Universidade de Mogi das Cruzes (UMC), pela ajuda na análise estatística.
Ao Marciano Marques de Oliveira, da Faculdade de Engenharia de Alimentos da UNICAMP, pela ajuda com a análise quimiométrica.
Aos membros da minha banca de qualificação, Profª. Drª. Simone dos Santos Grecco e Prof. Dr. Niraldo Paulino por todas as valorosas contribuições a esse trabalho.
Aos professores do Mestrado em Biotecnologia e Inovação em Saúde da Universidade Anhanguera de São Paulo - UNIAN, especialmente à querida professora que tanto admiro: Profª. Drª. Alejandra Hortência Miranda González.
Agradeço por todo o aprendizado, apoio e pela convivência tão harmoniosa.
Ao Gabriel Antonio dos Santos, ao Lucas Zamariolli e a Valeria Ribeiro, do Laboratório de Produtos Naturais e Quimiometria da UNIAN-SP, pela valiosa ajuda.
Aos colegas que estão ou já passaram pelos programas de mestrado e doutorado em Biotecnologia e Inovação em Saúde da Universidade Anhanguera de São Paulo – UNIAN, com quem tive o prazer de conviver. Agradeço pela união, pelos momentos de descontração e pela ajuda nos trabalhos.
Ao meu esposo, Rodrigo Estevão dos Santos, obrigada por ser meu amigo, companheiro de todos os momentos. Obrigada pelo carinho, compreensão, amor e solidariedade inexprimíveis.
Aos meus pais, pela sólida formação dada durante toda a minha vida, que me proporcionou a continuidade nos estudos até à chegada a este mestrado, os meus eternos agradecimentos. Enfim, a toda minha família que, durante este tempo me apoiou incondicionalmente, que apostaram em mim mais do que ninguém e compreenderam a minha ausência e que seguramente são os que mais compartilham da minha alegria.
Sobretudo, agradeço a Deus, por ter me dado a vida e por tê-la mantido sempre com tantas alegrias e repleta de pessoas especiais.
“Da árvore da vida, fiz das folhas e caules a minha conquista”
Sônia Mariza Luiz de Oliveira [2019].
RESUMO
OLIVEIRA, S.M.L. 2019. 126f. Avaliação química e atividade antioxidante da Moringa oleifera Lam. Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Mestrado em Biotecnologia e Inovação em Saúde da Universidade Anhanguera de São Paulo, São Paulo, 2019.
A árvore Moringa oleifera lam, é uma planta utilizada na medicina tradicional com uso popular para o tratamento de várias enfermidades, tais como: doenças da pele, do sistema digestivo, doenças nas articulações, tratamento da malária e icterícia, entre outras. Em alguns países da África, quase todas as partes da planta (folhas, frutos e raízes) são usadas na alimentação humana pois possui alto valor nutritivo, contendo cálcio, ferro e vitamina C. Esta planta é utilizada no nordeste do Brasil para purificação de águas salobras. Mundialmente é conhecida como a “árvore da vida” devido a sua rica composição química. Tendo em vista este conhecimento popular, e sendo evidenciadas poucas pesquisas sobre a espécie moringa no Brasil, pretendeu-se neste trabalho realizar um controle de qualidade, além do estudo fitoquímico de duas partes da árvore, a saber, das folhas e do caule, a fim de verificar quais são os metabólitos secundários presentes nesta planta qualitativa e quantitativamente de acordo com o preconizado na Farmacopéia Brasileira, 5ª. edição. Foram preparados extratos aquosos, hidroetanólicos e etanólicos de diferentes partes da planta, a saber: folhas, pó de folha seca e caule da moringa Mais Vida e de Minas Gerais. Os parâmetros de atividade antioxidante (DPPH), sólidos solúveis, fenóis totais e flavonoides totais encontrados estão de acordo com a literatura. A haste da folha da Moringa Mais Vida foi a que apresentou o maior teor de umidade (12,25 ± 0,15%). O valor médio do teor de cinzas relatado por alguns autores é de 7,50%, sendo o encontrado no presente trabalho, bem próximo à média (7,25%). Com respeito ao teor de fenóis, observou-se que a amostra que apresentou o menor conteúdo foi a das folhas (Moringa Mais Vida) extraída com etanol (1,84%). A amostra com o maior conteúdo de fenóis totais foi a das folhas de MG (2,23%), extraídas com etanol, indicando que a grande variação pode ser atribuída às condições de plantio, solo, chuva, entre outras. Na análise do teor de flavonoides totais, observou-se que a amostra que apresentou o maior teor de flavonoides foi a das folhas (MG) extraídas com etanol:água (50:50) (1,88%) e a que apresentou o menor teor foi a das folhas (Moringa Mais Vida) (0,1415%) extraídas nas mesmas condições. A análise cromatográfica por HPLC mostrou picos que podem ser ácidos aromáticos e flavonoides cuja concentração varia, dependendo do tipo de extração. A análise está sendo repetida, com injeção dos padrões disponíveis para a quantificação. Realizou-se ensaios in vitro da atividade antioxidante dos extratos, onde as folhas (Moringa Mais vida) apresentaram melhor atividade supressora de radicais livres, com um valor de CE50% de 6,58 µg/mL para o extrato etanólico e 8,16 µg/mL para o extrato aquoso, esta atividade biológica pode ser atribuída a presença de compostos fenólicos e flavonoides relatadas acima em análise qualitativa e quantitativa. Realizou-se uma análise multivariada em dois grupos (Moringa Mais Vida e Moringa de MG), levando-se em consideração todas as condições de extração versus o teor de fenóis e flavonoides. O grupo de MG apresentou maior conteúdo de fenóis com correlação de 88%. Os resultados obtidos demonstraram que o extrato etanólico das folhas da moringa apresentaram um alto conteúdo de fenólicos totais e flavonoides totais.
O extrato etanólico também apresentou uma atividade antioxidante in vitro considerável.
Palavras-chave: Moringa oleifera Lam., composição química, fenóis, flavonoides, atividade antioxidante. Quimiometria.
ABSTRACT
OLIVEIRA, S.M.L. 2019. 126f. Chemical and Evaluation of Moringa oleifera Lam Antioxidant Activity. Master Thesis presented to the Master Programme in Biotechnology and Health Innovation of University Anhanguera de São Paulo, São Paulo, 2019.
The tree Moringa oleifera Lam, is a plant used in traditional medicine with popular use for the treatment of various diseases, such as: skin diseases, digestive system, articulation diseases, treatment of malaria and jaundice, among others. In some countries in Africa, almost all parts of the plant (leaves, fruits and roots) are used in food because it has high nutritional value, containing calcium, iron and vitamin C, this plant is used in northeastern Brazil for water purification brackish water. Worldwide is known as the "tree of life" due to your rich chemical composition. In view of this popular knowledge, and because there are little research about the Moringa oleifera Lam species in Brazil, this work was intended to carry out a quality control, in addition to the phytochemical study of two parts of the tree, the leaves and the stem, in order to verify which are the secondary metabolites present in this qualitative and plant quantitatively according to the established in the Brazilian Pharmacopeia, 5th. Edition. Aqueous, hydroethanolic and ethanolic extracts were prepared from different parts of the plant, sheets, dry leaf and stem of the Moringa Mais Vida and from Minas Gerais. The parameters of antioxidant activity (DPPH), soluble solids, total phenols and flavonoids are in accordance with the literature. In the stem of Moringa Mais Vida is presented the highest content of humidity (12,25 ± 0,15%). The average ash content reported by some authors is 7.50%, being the one found in the present study, very close to the average (7.25%). With respect to the content of phenols, it was observed that the sample presented the lowest content was the leaf (Moringa Mais Vida) extracted with ethanol (1.84%). The sample with the greatest total phenols content was of MG (2.23%), extracted with ethanol, indicating that the large variation can be attributed to planting, soil conditions, rain, among others. Analysis of total flavonoids content, it was observed that the sample that presented the highest content of flavonoids was from the leaves (MG) extracted with ethanol: water (50:50) (1.88%) and presented the lowest was the content of the leaves (Moringa Mais Vida) (0.1415%) drawn in the same conditions. The chromatographic analysis by HPLC showed spikes that may be aromatic acids and flavonoids whose concentration varies, depending on the type of extraction. The analysis is being repeated, with injection of patterns available to quantify. Was held in vitro assays of the antioxidant activity of the extracts, where the leaf (Moringa Mais Vida) presented best suppressive activity of free radicals, with an EC50 value of 6.58% µg/mL for the ethanolic extract and 8.16 µ g/mL for the aqueous extract, this biological activity can be attributed to the presence of phenolic compounds and flavonoids reported above in qualitative and quantitative analysis. A multivariate analysis was conducted in two groups (Moringa Mais Vida and Moringa MG), taking into consideration all conditions of extraction versus the content of phenols and flavonoids. The MG group showed the highest content of phenols with 88% correlation. The obtained results demonstrated that ethanolic extract of the leaves of the moringa showed a high content of total phenolics and flavonoids. The ethanolic extract also showed an in vitro antioxidant activity.
Keywords: Moringa oleifera Lam., chemical composition, phenols, flavonoids, antioxidant activity. Chemometrics.
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1 Países onde são encontradas as árvores da moringa (em verde)...22
Figura 2 Aspectos morfológicos da Moringa oleifera Lam.: (A) caule, (B) folhas, (C) flores, (D) sementes e (E) raízes...26
Figura 3 Outros aspectos da Moringa oleifera Lam. (A) árvore e (B) mudas...27
Figura 4 Árvore da moringa em uso ornamental...29
Figura 5 Estrutura básica de um flavonoide...33
Figura 6 Estruturas básicas dos flavonoides...34
Figura 7 Algumas estruturas químicas de compostos identificados em moringa...35
Figura 8: Etapas do plantio das sementes de Moringa oleifera Lam. realizado pela autora: (A) sementes, (B) e (C) recipiente com papel toalha umedecido e sementes, (D) e (E) preparo do substrato, (F) e (G) deposito de sementes nas sementeiras, (H) mudas em desenvolvimento...43
Figura 8.1: Etapas do plantio das sementes de Moringa oleífera Lamarck realizado pela autora: (I) e (J) mudas com 30 cm prontas para o plantio em solo, (K) plantio realizado em solo, (L) e (M) adaptação em solo e desenvolvimento da planta...44
Figura 9 Reação de sequestro do radical livre (método do DPPH) pelo extrato da planta. Onde Agente H é o extrato de planta avaliado...52
Figura 10 Descoloração do radical livre DPPH. (violeta) pelo extrato da planta (até ficar amarelo)...52
Figura 11 Aspecto dos extratos de diferentes partes e solventes. (A) Alguns frascos antes da extração. (B) Cores diferentes após a extração...58
Figura 12 Teor de fenóis totais (%) nas amostras em diferentes condições de extração. Para os números, vide Tabela 8...60
Figura 13 Teor de flavonoides totais (%) nas amostras em diferentes condições de extração. Para os números, vide Tabela 8...62
Figura 14 Análise cromatográfica por HPLC das folhas da moringa (Moringa Mais Vida) em diferentes processos de extração. A área circulada em vermelho corresponde ao espectro UV de um flavonoide, ainda não identificado...63
Figura 15 Análise cromatográfica por HPLC da folha da moringa (Minas Gerais, MG) em diferentes processos de extração. A área circulada em vermelho corresponde ao espectro UV de um flavonoide, ainda não identificado...64
Figura 16 Análise cromatográfica por HPLC das folhas da moringa em pó (Moringa mais vida) em diferentes processos de extração. A área circulada em vermelho corresponde ao espectro UV de um flavonoide, ainda não identificado...65
Figura 17 Análise cromatográfica por HPLC das folhas da moringa em pó (MG) em diferentes processos de extração. A área circulada em vermelho corresponde ao espectro UV de um flavonoide, ainda não identificado...66 Figura 18 Análise cromatográfica por HPLC do caule da moringa (Moringa mais vida) em diferentes processos de extração. A área circulada em vermelho corresponde ao espectro UV de um flavonoide, ainda não identificado...67 Figura 19 Análise cromatográfica por HPLC do caule da moringa (MG) em diferentes processos de extração. A área circulada em vermelho corresponde ao espectro UV de um flavonoide, ainda não identificado...68 Figura 20 Análise por UHPLC-MS em modo negativo do extrato etanol:água (50:50) das folhas da moringa...69 Figura 21 Análise por UHPLC-MS em modo negativo do extrato etanol:água (50:50) do caule da moringa...69 Figura 22 Análise por espectrometria de massa em modo negativo do extrato etanol:água (50:50) das folhas da moringa...70 Figura 23 Análise por espectrometria de massa em modo negativo do extrato etanol:água (50:50) do caule da moringa moringa...70 Figura 24 Estruturas químicas de alguns marcadores encontrados na moringa partes da planta...70 Figura 25 Análise em PC-1 x PC-2 dos scores (processos de extração de diferentes partes da planta...77 Figura 26 Análise em PC-1 x PC-2 dos scores (processos de extração da folha) (A) e os loadings (B)...78 Figura 27 Análise em PC-1 x PC-2 dos scores (processos de extração do caule) (A) e os loadings (B)...79 Figura 28 Correlação entre o conteúdo de flavonoides (g/100g) e a atividade antioxidante (CE50) para o grupo de amostras da Moringa Mais Vida...80
LISTAS DE TABELAS
Tabela 1 Relação de reagentes e equipamentos utilizados nas análises...41
Tabela 2 Material vegetal empregado no estudo...45
Tabela 3 Tipos de extração das diferentes partes da moringa...47
Tabela 4 Gradiente utilizado na separação por HPLC...51
Tabela 5 Teor de umidade (%) das drogas vegetais de moringa...55
Tabela 6 Teor de cinzas (%) das drogas vegetais de moringa...56
Tabela 7 Teor de cinzas (%) da folha de moringa Mais Vida e de MG comparado com a de alguns autores...57
Tabela 8 Teor de sólidos solúveis nas partes da moringa em diferentes solventes...59
Tabela 9 Teor de fenóis totais nas partes da moringa em diferentes solventes...60
Tabela 10 Teor de flavonoides totais (%) nas partes da moringa em diferentes solventes...62
Tabela 11 Atividade antioxidante (CE50 em µg/mL) das partes da moringa em diferentes solventes...71
Tabela 12 Quantidade de fenóis (g/100g) em função da parte da planta e método de extração, independente da origem da planta...72
Tabela 13 Quantidade de fenóis (g/100g) extraídos por etanol em função da parte da planta e da origem da planta...73
Tabela 14 Quantidade de fenóis (g/100g) extraídos por solução etanol/água 50:50 em função da parte da planta e da origem da planta...74
Tabela 15 Quantidade de fenóis (g/100g) extraídos por ÁGUA em função da parte da planta e da origem da planta...74
Tabela 16 Quantidade de flavonoides (g/100g) em função da parte da planta e método de extração...75
Tabela 17 Quantidade de flavonoides (g/100g) extraídos por etanol em função da parte da planta e da origem da planta...75
Tabela 18 Quantidade de flavonoides (g/100g) extraídos por solução etanol/água 50:50 em função da parte da planta e da origem da planta...76
Tabela 19 Quantidade de flavonoides (g/100g) extraídos por ÁGUA em função da parte da planta e da origem da planta...76
LISTAS DE EQUAÇÕES
Equação 1 Cálculo do teor de cinzas...46 Equação 2 Cálculo do teor de sólidos solúveis...48
LISTAS DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS CE50 - Concentração que elimina 50% dos radicais livres
CL – Haste das folhas da Moringa Mais Vida
CLMG – Haste das folhas da moringa Minas Gerais CV (%) - Coeficiente de variação
DP - Desvio padrão de três determinações DPPH – Radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila ERNs - Espécies Reativas de Nitrogênio EROs - Espécies Reativas de Oxigênio EtOH - Extrato Etanólicos
FL - Folha Moringa Mais Vida FLMG – Folha Moringa Minas Gerais H2O - Extratos Aquosos
HEH - Extratos Hidroetanólicos 50:50
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HPLC-MS – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a Espectrometria de Massas
Inc - Incerteza simples
LDL - Lipoproteína Humana de Baixa Densidade M. oleifera Lam. - Moringa oleifera Lamark MS - Espectrometria de Massas
MMV - Moringa Mais Vida NR - Não Realizado O2 - Oxigênio
PFL – Pó da Folha Moringa Mais Vida PFLMG – Pó da Folha Moringa Minas Gerais S – Semente Moringa Mais Vida
SNC - Sistema Nervoso Central
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ... 17
2 OBJETIVOS ... 19
2.1 OBJETIVO GERAL ... 19
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19
3 REVISÃO DE LITERATURA ... 20
3.1 CLASSIFICAÇÃO DA Moringa sp. ... 20
3.1.1 Descrição botânica da Moringa oleifera Lamarck ... 21
3.1.2 Classificação taxonômica da moringa ... 22
3.1.3 Morfologia das partes da moringa ... 22
3.2 Utilização da moringa ... 26
3.2.1 A moringa como alimento ... 26
3.2.2 Utilização industrial da moringa ... 27
3.2.3 Utilização da moringa como biocombustível ... 27
3.2.4 Uso ornamental da moringa ... 28
3.2.5 Uso da moringa na purificação da água ... 28
3.2.6 Uso medicinal da moringa... 29
3.3 Composição química da moringa ... 30
3.3.1 Compostos fenólicos ... 31
3.3.2 Flavonoides ... 32
3.4 Atividade antioxidante ... 35
3.4.1 Antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos ... 36
3.4.2 Estresse oxidativo ... 37
3.5 Segurança de uso da moringa ... 39
4 MATERIAL E MÉTODOS ... 41
4.1 REAGENTES E EQUIPAMENTOS... 41
4.2 COLETA, IDENTIFICAÇÃO E PROCESSAMENTO DO MATERIAL VEGETAL . 41 4.2.1 ELABORAÇÃO DA EXSICATA ... 45
4.3 MÉTODOS DE ANÁLISE ... 45
4.3.1 Determinação da umidade... 45
4.3.2 Determinação de cinzas ... 46
4.3.3 Preparação dos extratos ... 46
4.3.3.1 Determinação do teor de sólidos solúveis ... 47
4.3.4 Determinação do teor de fenóis totais ... 48
4.3.5 Determinação do teor de flavonoides totais ... 49
4.3.6 Análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)... 50
4.3.6 Fingerprinting em espectrometria de massas ... 51
4.3.7 Avaliação da atividade supressora de radicais livres ... 51
4.3.8 Análise estatística ... 53
4.3.9 Análise quimiométrica ... 53
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 55
5.1 Teor de Umidade ... 55
5.2 Teor de Cinzas ... 56
5.3 Teor de Sólidos Soluveis ... 57
5.4 Teor de Fenóis ... 59
5.5 Teor de flavonoides totais ... 61
5.6 Análise Cromatográfica por HPLC ... 63
5.7 Análise por Espectrometria de Massas ... 68
5.8 Atividade Antioxidante – DPPH ... 71
5.9 Análise estatística – fenóis e flavonóides ... 72
6 CONCLUSÕES ... 81
REFERÊNCIAS ... 82
APÊNDICES ... 90
APÊNDICE A Laudo da confirmação botânica da Moringa oleifera Lam. ... 90
ANEXOS ... 92
ANEXO A Dados brutos do teor de umidade nas amostras de Moringa oleifera Lam. ... 92
ANEXO B Dados brutos do teor de cinzas na droga vegetal de Moringa oleifera Lam. ... 94
ANEXO B Dados brutos do teor de cinzas na droga vegetal de Moringa oleifera Lam. ... 95
ANEXO C Dados brutos do teor de sólidos solúveis nos extratos de Moringa oleifera Lam. ... 96
Anexo F: Dados brutos da atividade antioxidante das diferentes partes da Moringa oleifera Lam. ... 118
Anexo F: Dados brutos da atividade antioxidante das diferentes partes da Moringa oleifera Lam. (continuação)... ... 119
Anexo F: Dados brutos da atividade antioxidante das diferentes partes da Moringa oleifera Lam. (continuação)... ... 120
Anexo F: Dados brutos da atividade antioxidante das diferentes partes da Moringa oleifera Lam. (continuação)... ... 121
17 1 INTRODUÇÃO
Representante da família Moringaceae, o gênero moringa sp. é constituído por 16 espécies, sendo que a espécie Moringa oleifera Lamarck (moringa) é a mais notória (ANWAR et al., 2007), conhecida popularmente por
“moringa”, “quiabo-de-quina” ou “lírio”, é também chamada de "árvore milagrosa"
ou "árvore da vida". A cooptação do vocábulo oleífera no nome moringa vem do latim empregado para plantas que contém ou produzem óleos (FARIA, 1991).
A moringa é uma árvore tropical multifuncional de origem indiana, pode ser encontrada em alguns países dos continentes asiático, africano e americano (PIO-CORRÊA, 1984; DUKE, 1987). Apresenta um bom desenvolvimento tanto em regiões de clima seco como em regiões úmidas (DUKE, 1987), já em terreno encharcado não apresenta um bom desenvolvimento ou não se desenvolve (CÁCERES et al., 1991).
A planta moringa tem muitos usos, devido ao seu valor alimentar, tratamento de água, uso ornamental, artesanato, uso industrial e medicinal, todas as suas partes como folhas, raízes, flores, vagem, podem servir para o consumo humano. A moringa pode ser empregada para produzir biomassa, fertilizantes, nutrientes foliares, clarificador de sucos e açúcar de cana, mel medicinal, plantas ornamentais, biopesticida, celulose, taninos para curtir couros, floculante/coagulante natural de resíduos em água utilização doméstica, entre outros (FUGLIE, 1999), sendo, portanto, importante nas áreas econômica, industrial e medicinal.
A grande maioria das partes da árvore da moringa pode servir de alimento como: folhas, frutos verdes, flores e sementes; todas as partes tem uso medicinal (PALADA, 1996; MAKKAR & BECKER, 1997). Suas folhas contêm vitaminas A, B e C, aminoácidos e minerais (Fe, K, Ca, P e Zn) (BECKER, 2001), além de apresentar betacaroteno, proteínas e as flores tem utilidade na produção de mel (ALVES et al., 2005). As sementes têm elevado teor de proteínas e lipídeos, alto teor de ácidos graxos insaturados (maior teor o oleico) e ácidos graxos saturados (MACHADO e CARNEIRO, 2000; LALAS et al., 2002).
A moringa difere na composição de nutrientes em locais diferentes (ASLAM, 2005). O interesse pelo seu cultivo tem se estendido em países onde
18 ela não é nativa (ODURO et al., 2008). No Brasil, há um esforço no sentido de difundir o cultivo e uso da moringa.
Outro tema que precisa ser mais bem avaliado diz respeito ao uso medicinal e nutricional da moringa em humanos. A maioria dos estudos sobre as qualidades benéficas da moringa foram realizados in vitro ou em animais, porém poucos trabalhos em humanos; e, desta forma, os efeitos benéficos sobre as doses humanas ainda não são totalmente conhecidos.
Considerando esse cenário, a pesquisa química e biológica a respeito de especies vegetais utilizadas tradicionalmente e sem devidos estudos químicos e farmacológicos, poderá contribuir significativamente no desenvolvimento do campo da saúde, sendo possível encontrar substâncias mais eficazes e menos tóxicas do que as já existentes, na prevenção e tratamento contra as diversas doenças existentes no mundo atual (TREVISAN, 2010).
Com este estudo, pretendeu-se realizar estudos fitoquímicos dos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico das folhas, folha em pó e caule da Moringa oleifera Lam, em cromatografia por HPLC, fingerprinting por espectrometria de massa, análise quantitativa de fenóis e flavonoides totais, e realizar ensaios experimentais in vitro, afim de determinar se a mesma possui atividade antioxidante.
19 2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Realizar estudos fitoquímicos dos extratos aquoso, etanólico e hidroetanólico das folhas, folha em pó e caule análise da planta moringa, bem como avaliar a sua atividade antioxidante, com a finalidade de uma bioprospecção da mesma.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Efetuar um controle de qualidade da droga vegetal;
Quantificar os marcadores nos extratos das diferentes partes da planta, através da análise de fenóis e flavonoides totais;
Analisar o perfil cromatográficos dos extratos da droga vegetal;
Analisar a atividade antioxidante nos extratos das partes da espécie vegetal;
Realizar a análise estatística e quimiometria dos resultados da análise quantitativa;
Comparar a droga vegetal adquirida da empresa Moringa Mais Vida versus a droga adquirida da plantação realizada pela própria autora.
20 3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 CLASSIFICAÇÃO DA Moringa sp.
De acordo Rangel (1999) apud Vieira (2017), a família Moringaceae contém um único gênero, Moringa sp., sendo constituída por 16 espécies conhecidas, descritas a seguir.
Moringa arborea Verdcourt – espécie não muito conhecida, pois só foi encontrada uma vez no Quênia, onde na qual, suas folhas nunca foram vistas, apenas flores e frutos; Moringa borziana Mattei – uma pequena árvore que sem as folhas e frutos se confundem com outras moringas, mas esta produz tubérculos; Moringa concanensis Nimmo - é um parente muito próximo da Moringa oleifera Lamarck, mas que não foi muito estudada; Moringa drouhardii Jumelle – produz um longo legume junto com uma grande porção de flores brancas ou cremes, caracterizado por sua constrição entre duas grandes sementes. Esta planta é considerada venenosa; Moringa hildebrandtii Engler – é a maior árvore dessa espécie mas que produz as menores flores; Moringa longituba Engler – é a mais abundante do noroeste africano, e tem a menor estatura e suas flores são vermelhas, bem diferente das outras; Moringa ovalifolia Dinter e Berger – possui flores pequenas, esbranquiçadas e com mais de dois planos de simetria, ocorre em populações quase puras formando uma paisagem estranha de troncos inchados e formas retorcidas; Moringa peregrina (forssk) Fiori – tem este nome devido sua grande abrangência e o seu óleo também foi muito usado na antiguidade; Moringa pygmaea Verdcourt – parece ser uma erva perene que cresce em um tubérculo e seu tamanho médio é cerca de cinco centímetros; Moringa rivae Mattei – esta espécie se divide em duas subespécies, a Moringa rivae sp. Rivae, com flores que vão do amarelo ao amarronzado, e a Moringa rivae sp. Longisiliqua, com flores amarelas brilhantes;
Moringa ruspoliana Mattei – se diferencia das outras por ter suas folhas pinatas com um grande folíolo e grandes folhas vermelhas; Moringa stenopetala (Baker F.) Cufodontis – esta espécie é uma das espécies mais importantes economicamente devido às suas folhas serem usadas na alimentação; Moringa sp. – uma espécie não identificada de moringa, as folhas não se parecem com nenhuma outra folha das outras espécies de moringa e crescem em rosetas ao
21 nível do solo, um hábito que não acontece em nenhuma outra espécie e a Moringa oleifera Lamarck (moringa) – de todas as espécies está é a espécie mais importante economicamente, possuindo propriedades nutricional, medicinal e industrial, sendo avaliada como uma das melhores plantas perenes devido ao seu rico conteúdo de proteínas, vitaminas e minerais, além da sua expressiva ação coagulante/floculante. A Figura 1 descreve os países onde são encontradas as árvores de moringa.
Figura 1 Países onde são encontradas as árvores da moringa (em verde).
Fonte: www.fmmh.com.br
3.1.1 Descrição botânica da Moringa oleifera Lamarck
A Moringa oleifera Lam. (moringa) é uma árvore de porte grande, sempre verde, decídua que pode atingir uma altura entre 10 a 12 metros, resistente a climas secos. Sua madeira é macia e sua casca de cor clara. Tem uma coroa aberta espalhada, tipicamente em forma de guarda-chuva. As raízes são profundas. Os ramos são frágeis e caídos (Figuras 2 e 3). Os galhos jovens e os brotos são cobertos por uma penugem de cor esbranquiçada. As folhas da moringa são alternadas, de 7 a 60 cm de comprimento e as inflorescências são de 10-20 cm de comprimento. As flores de moringa são pentárgicas, zigomórficas, de 7-14 mm de comprimento e de cor branca a creme. O fruto é uma cápsula tipicamente de 3 ápices, de 10 a 60 cm de comprimento, muitas vezes referido como uma "vagem". A fruta é verde quando jovem e fica marrom quando madura. A fruta madura se separa ao longo de cada ângulo para expor
22 as sementes. A cápsula contém 15-20 sementes oleosas arredondadas, 1-1,5 cm de diâmetro. As sementes de moringa contêm uma grande quantidade de óleo (RANGEL, 1999; FOIDL et al., 2001; RADOVICH, 2009; FAO, 2014). A árvore da moringa produz suas sementes no seu primeiro ano em condições ideais para seu desenvolvimento, sendo que na estação mais úmida ocorre a floração, perdendo as suas folhas no começo da estação seca. Às vezes estes fenômenos podem acontecer de forma simultânea, ou seja, florescer e cairem as folhas ao mesmo tempo, ou florar e produzir seu fruto (CORRÊA, 1984;
MORTON, 1991; TRIER, 1995; PALADA, 1996).
3.1.2 Classificação taxonômica da moringa
A moringa é classificada taxonomicamente conforme descrito a seguir (PEREIRA, 2015, Apud Sousa, 2001):
Reino: Plantae;
Divisão: Magnoliophyta;
Classe: Magnoliopsida;
Ordem: Brassicales;
Família: Moringaceae;
Gênero: Moringa;
Espécie: oleifera;
Nome filotaxonômico: Moringa oleifera Lamarck.
3.1.3 Morfologia das partes da moringa
A moringa tem madeira macia, porosa, de cor amarela e de baixa densidade, sendo utilizada na produção de papel (ARAÚJO, 2010). Na parte
23 externa é encontrado o látex e na parte interna do centro, uma secreção rica em polissacarídeos (mucilagem) (LORENZI e MATOS, 2002).
O eixo central da folha da moringa tem duas ou três folhas pinadas e cada folha tem em média sete folíolos que são as divisões da folha ao longo da raque (SOUZA e LORENZI, 2008). Suas folhas são ricas em ácido ascórbico, caroteno, ferro, vitaminas, minerais e, são uma boa fonte de proteínas e, por isso, podem ser adicionadas em alguns alimentos, como massas e cereais, para aumentar sua quantidade de proteína (MAKKAR e BECKER, 1996; BEZERRA et al., 2004;
MOURA et al., 2009).
Suas flores têm pétalas de coloração branca ou creme com estames amarelo (órgão masculino da planta) (PALADA, 1996; ORWA et al., 2009;
RADOVICH, 2011). Tem elevados teores de aminoácidos, glicose, sacarose, cálcio, potássio e antioxidantes (RAMACHANDRAN et al., 1980; FAIZI et al., 1994; MAKKAR e BECKER, 1996; RUCKMANI et al., 1998; GUEVARA et al., 1999; SIDDHURAJU e BECKER, 2003; SÁNCHEZ-MACHADO et al., 2006).
Possuem compostos com certa eficiência contra fungos e bactérias (LIZZY et al., 1968; ONG, 2008) e substâncias como a lectina que combatem a larva do Aedes aegypti (PONTUAL et al., 2012), além de ser usado como agente secretor biliar, diurético, hipoglicêmico e tônico (PARROTTA, 2009; KHARE, 2007). A moringa é muito visitada por alguns insetos e beija-flores, destacando-se as abelhas, devido a suas flores serem uma boa fonte de néctar, especialmente na caatinga e por isso é considerada uma espécime com capacidade para criação de abelhas (KIILL et al., 2012). Por atrair abelhas é usada na produção de mel (JAHN et al, 1986).
A moringa possui uma vagem/casca que se divide em endocarpo (parede interna do fruto) e exocarpo (parede externa do fruto) (BECKER, 2001). O fruto da moringa, de coloração castanho quando atinge a maturação, é simples, seco, do tipo cápsula loculicida, com três valvas (aberturas das cascas), as quais foram descritas por Foidl et al. (2003) como cápsula trilobulada e deiscente (frutos secos que se abrem por um mecanismo natural). No fruto encontram-se as sementes presas às placentas parietais ao longo do seu comprimento, as sementes são aladas, ou seja, é provido de ala ou com uma expansão em forma de asa (GONÇALVES, 2011; BARROSO et al. 1999). Sua deiscência faz com que os lados do fruto se fendam longitudinalmente, expondo as sementes. Os
24 frutos possuem, em seu interior, uma média de 12 sementes. A massa varia com o grau de maturação, sendo mais leve quanto mais próximo desta, apresentando, em média, 9,91 g. O comprimento médio é de 28,50 cm e a largura média é de 2,21 cm. As vagens verdes servem de alimento, se forem cozidas, para se comer como verdura (CHAWLA et al., 1988; HERDES,1994).
Já suas sementes contém uma grande quantidade tanto de proteínas como de lipídeos. Essas sementes contém um óleo rico em ácidos graxos insaturados e devido a isso, tem uma elevada resistência à oxidação (MACHADO e CARNEIRO, 2000; LALAS et al., 2002). As proteínas contidas nas sementes lhes conferem um alto poder coagulante, sendo assim, são muito utilizadas na clarificação e purificação da água (GASSENSCHMIDT et al., 1995). Os óleos extraídos das sementes apresentam um elevado poder nutricional, além de poder ser usado também na produção de biodiesel (ELIERT et al., 1981).
As raízes têm aparência de tubérculos onde acumulam água, que ajuda em seu desenvolvimento, durante as estações de seca (ARAÚJO, 2010). São mal cheirosas e parecem com o rabanete (CÁCERES et al., 1991). Alguns médicos as recomendam para o tratamento de algumas doenças como:
epilepsia, histeria, paralisia, reumatismo, febres intermitentes, fígado e baço hipertrofiado (MIRANDA et al., 2009).
A Figura 2 e a Figura 3, mostram os aspectos morfológicos da moringa, a árvore e as mudas da moringa, respectivamente.
25 Figura 2 Aspectos morfológicos da Moringa oleifera Lam.: (A) caule, (B) folhas, (C) flores, (D) sementes e (E) raízes.
Fonte: (A) http://www.sempresustentavel.com.br/terrena/moringa-oleifera/moringa-oleifera.htm, (B) https://vivagreen.com.br/organicos/moringa-oleifera-um-milagre-da-natureza/, (C) http://bibocaambiental.blogspot.com/2014/02/moringa-oleifera-arvore-milagrosa.html (D) http://ciprest.blogspot.com/2017/08/moringa-moringa-oleifera.html (E) https://www.moringa.blog.br/raiz-da-moringa/.
(A) (B)
(C) (D)
(E)
26 Figura 3 Outros aspectos da Moringa oleifera Lam. (A) árvore e (B) mudas.
Fonte: (A) e (B) Arquivo pessoal.
3.2 Utilização da moringa
A moringa é uma planta que serve para muitos propósitos, sendo referida como “árvore milagrosa” (FUGLIE, 1999).
3.2.1 A moringa como alimento
Todas as partes de moringa são consumidas como alimento. A planta produz folhas durante a estação seca e durante períodos de seca, é uma excelente fonte de vegetais verdes quando há pouco outro alimento disponível (FAO, 2014; LEONE et al., 2015b). A moringa é cultivada principalmente por suas folhas na África, e muito apreciada por suas vagens na Ásia (BOSCH, 2004). As folhas possuem sete vezes mais vitamina C que as laranjas, quatro vezes mais cálcio que o leite, quatro vezes mais vitamina A que as cenouras, duas vezes mais proteínas que o leite e, três vezes mais potássio que as bananas (HSU et al., 2006). Já no Brasil, busca-se aumentar a plantação e utilização da moringa como hortaliça, pois suas folhas são muito nutritivas e ricas em proteínas, vitaminas A, B e C e minerais, além de sua produção ser barata,
(A)
(B)
27 é absolutamente comestível (FAO, 2014; TEIXEIRA et al., 2014). O pó da folha da moringa é usado para auxiliar na recuperação de crianças que sofrem de desnutrição, e de quem as está amamentando (RADOVICH, 2009; FAO, 2014).
Além das folhas, também podem servir de alimento tanto as vagens verdes, que podem ser consumidas cozidas, como as sementes maduras, que podem ser torradas. As sementes de moringa contêm cerca de 30-40% de óleo comestível (ben oil), que é resistente à rancidez e fornece quantidades substanciais de ácido oleico, esteróis e tocoferóis (YU et al., 2005; FAO, 2014).
3.2.2 Utilização industrial da moringa
O óleo moringa possui várias aplicações industriais. É empregado na indústria de perfumes, pois mantém sua fragrância e não tende a rancificar-se, por isso também é utilizado na fabricação de tintas e lubrificantes (FOIDL et al., 2001). O óleo de moringa é empregado na fabricação do biodiesel (RASHID et al., 2008; DA SILVA et al., 2010; AZAD et al., 2015). O “bolo” de óleo resultante da extração de óleo de sementes contém cerca de 1% de proteínas floculantes que se ligam a partículas minerais e materiais orgânicos. Essas proteínas também são usadas para auxiliar na sedimentação de fibras nas indústrias de suco e cerveja. A madeira da moringa é macia e só pode ser utilizada para construções leves, mas pode produzir fibra para cordas e tapetes, bem como polpa para a indústria de papel. A casca moringa é uma fonte de corante (FOIDL et al., 2001).
3.2.3 Utilização da moringa como biocombustível
Por ser uma das árvores que produz maior quantidade de óleo, o biodiesel pode ser obtido da moringa (VIEIRA, 2017). O óleo tem ótimo fator de conversão de biodiesel (FOIDL e MAYORGA, 2000). As características consideráveis de combustível adquiridas do biodiesel conseguido do óleo das sementes de moringa, são: a estabilidade oxidativa, viscosidade, e grande quantidade de cetano, que torna o biodiesel com grande possibilidade de substituição por outros
28 biodieseis com menos cetano, devido à quantidade de cetano ter a ver com a qualidade de ignição, uma das propriedades que indica uma boa capacidade de substituição do petrodiesel (RASHID et al., 2008 apud VIEIRA, 2017).
3.2.4 Uso ornamental da moringa
Esta planta também pode ser utilizada para embelezamento dos ambientes (Figura 4) e serve também como um cercado vivo ou como quebra- vento (JAHN et al., 1986).
Figura 4 Árvore da moringa em uso ornamental.
Fonte: http://cbermvm.blogspot.com/2013/07/moringa-oleifera-arvore-humilde-moringa.html
3.2.5 Uso da moringa na purificação da água
As sementes de moringa são utilizadas como um substituinte para coagulantes químicos, como os usados a base de alumínio, nas estações de tratamento de água, pois apresentam um bom resultado na coagulação e na remoção de micro-organismos (MUYIBI e EVISION, 1995). Os coagulantes naturais vêm sendo mais usados nos países em desenvolvimento, devido a serem mais baratos (PATERNIANI et al., 2009) e o coagulante natural feito da
29 semente da moringa é mais viável que o químico (sulfato de alumínio), já que pode ser preparado no mesmo local de uso (AMAGLOH e BENANG, 2009).
Nas sementes da moringa existe uma grande quantidade de proteínas solúveis de carga positiva (SCHWARZ, 1996). Geralmente as impurezas da água são o barro, argila, bactérias e algumas partículas tóxicas e elas contêm cargas negativas, quando se adiciona o pó da semente da moringa à agua, esta atrai todas estas impurezas pra si, devido a suas proteínas liberarem suas cargas positivas (KALOGO et al., 2001; AMAGLOH e BENANG, 2009; SILVA et al., 2011), sem alterar o pH da água (GALLÃO, 2006) e sem modificar o seu sabor (AMARAL et al., 2006). Com isso, as sementes de moringa são usadas para retirar a coloração e turbidez da água, tornando-a própria para consumo (ARANTES et al., 2012).
O pó da semente de moringa tem propriedades antibacterianas que o tornam útil como clarificador natural para sistemas de purificação de água e lagoas de peixes (ARUNA et al., 2012). É considerada uma alternativa natural e barata ao alume tóxico, mas é necessária uma investigação adicional, uma vez que o pó de sementes de moringa pode ter efeitos negativos quando combinado com o tratamento com cloro (PRESTON et al., 2010).
3.2.6 Uso medicinal da moringa
Quase todas as partes da árvore da moringa têm uso medicinal como antídoto contra veneno de centopeias, escorpiões e aranhas; combate também bactérias, é diurético, estrogênica, expectorante, purgativo, estimulante, tônico e vermífugo (DUKE, 1987 apud VIEIRA, 2017).
O extrato das folhas de moringa tem aplicação como medicamento alternativo principalmente por fatores econômicos e sociais, como: anti- inflamatório, analgésico, antiasmático, antianêmico, ativador do metabolismo, protetor do fígado, hipotensivo, antiespamolítico, produtor de hormônios, hidratante, mobilizador de líquidos do corpo (homeostático), desintoxicante, fortalecedor de músculos e ossos, ativador do alerta mental, da memória e da
30 capacidade de aprendizagem (SILAMBARASAN, AYYANARN, 2015), inibidor do edema e da atividade diurética (CACERES et al., 1992; MAKITA et al., 2016), também possui atividade antioxidante (REDDY et al., 2005; IQBAL, BHANGER, 2006; LAKO et al., 2007) e ainda como agente hipocolesterolêmico em pacientes obesos (GHASI, 2000). Possui efeito terapêutico na fase aguda da doença de Chagas em camundongos, por reduzir a parasitemia e em ratos adultos regula o hipertireoidismo (TAHILIANI, KAR, 1999). Devido ao uso na medicina popular, estudos fitoquímicos têm sido feitos visando a ação biológica dos metabólitos secundários nesta planta. Algumas atividades biológicas foram descritas na literatura, dentre estas, destacam-se: antimicrobiana (FAIZI et al., 1994;
FERREIRA et al., 2011; ONSARE et al., 2013; SINGH et al., 2013; BRILHANTE et al., 2015), antitumoral (GUEVARA et al., 1999; JUNG, 2014; AL-ASMARI et al., 2017), hepatoprotetora (BENNETT et al., 2003), antiespasmódica, diurética (CÁCERES et al., 1992) antifúngica (CHUANG et al., 2007) e cicatrizante (RUBIO-ELIZALDE et al., 2019).
De acordo com Anwar et al. (2007) a combinação generalizada de diuréticos juntamente com lipídios e a redução da pressão arterial faz com que essa planta seja altamente útil em distúrbios cardiovasculares. Mediada, possivelmente, por antagonismo dos canais de cálcio, compostos ativos isolados do extrato etanólico das folhas (niazinina A, niazinina B, niazimicina e niazinina) foram capazes de diminuir a pressão sanguínea em ratos (GILANI et al., 1994).
Outros estudos mostram que raízes, flores, folhas, látex e infusão aquosa são usadas como auxiliar para o tratamento da hipertensão, pois possuem atividade diurética (PEREIRA (2014) apud MORTON (1991); PEREIRA (2014) apud CÁCERES et al. (1992).
3.3 Composição química da moringa
O estudo das propriedades terapêuticas das plantas utilizadas na medicina tradicional, baseia-se inicialmente nas informações etnofarmacológicas e no conhecimento popular a respeito delas, vindo orientar muitos dos ensaios clínicos, farmacológicos e mesmo o isolamento e
31 identificação de moléculas, e são estas as substâncias responsáveis pela eficácia terapêutica (ALBUQUERQUE e ANDRADE, 2002; GBOLADE, 2009).
As plantas vêm despertando o interesse de pesquisadores de vários campos da ciência, visando nelas uma promissora fonte de moléculas potencialmente úteis a humanidade (SANTOS, 2002). Estas moléculas são produzidas pelas plantas em pequenas quantidades, para sua defesa contra vírus, bactérias, fungos ou animais predadores (LAPA et al., 2003; MONTANARI Jr., 2002), ou ainda, atuando na competição entre plantas e atração de organismos benéficos como polinizadores, dispersores de sementes, micro- organismos simbiontes (PERES, 2008), também em alelopatias (SANTOS, 2002). Estas moléculas são chamadas de metabolitos secundários, e a presença destes caracteriza a planta quanto ao seu uso medicinal (VIEGAS et al., 2006).
Vários compostos bioativos foram identificados na moringa. São eles:
vitaminas (A, B1, B2, B3, C e E), carotenoides (ex.: luteína), flavonoides, ácidos fenólicos, alcaloides, glicosinolatos, isotiocianatos, taninos, saponinas, oxalatos, fitatos e minerais, especialmente o cálcio (SANCHEZ-MACHADO et al., 2006;
SHIH et al., 2011; ZHANG et al., 2011; COPPIN et al., 2013; LEONE et al., 2015A; VALDEZ-SOLANA et al., 2015).
A triagem fitoquímica quantitativa, quando evidenciada a presença de grupos fitoquímicos, quantifica flavonoides, fenóis, taninos e saponinas totais, através de técnicas colorimétricas validadas, comumente empregadas (FARM.BRAS., 2010).
3.3.1 Compostos fenólicos
Os compostos fenólicos formam um grupo de substâncias que assumem papel de destaque entre os fitocompostos, exercendo funções biológicas em plantas e despertam interesse por suas diversas propriedades farmacológicas.
Os compostos fenólicos são produtos do metabolismo secundário das plantas, e apresentam características especificas para cada vegetal, tal como sabor, odor e coloração, que incluem grande diversidade de substâncias, algumas com estrutura relativamente simples até outras com alto grau de polimerização (BRAVO, 1998).
32 Estas substâncias se encontram presentes em vários alimentos e espécies de origem vegetal, apresentando pelo menos um anel aromático no qual um ou mais hidrogênios são substituídos por um grupamento hidroxila (SIMÕES et al., 2003).
A classe dos compostos fenólicos é importante devido suas propriedades anti-inflamatórias, antimicrobiana, antioxidantes e os compostos fenólicos distribuídos no reino vegetal que mais se destacam são os ácidos fenólicos, ácidos didroxicinâmicos, flavonoides e compostos altamente polimerizados (ligninas, melaninas e taninos) (SIMÔES et al., 2003).
3.3.2 Flavonoides
Os flavonoides, pertencem ao grupo dos compostos fenólicos e se constituem substâncias aromáticas contendo quinze átomos de carbono (C15) em seus núcleos básicos. Este grupo de compostos polifenólicos apresenta uma estrutura comum caracterizada por dois anéis aromáticos e um heterociclo oxigenado, formando um sistema C6- C3-C6, onde cada C6 representa um anel aromático (Figura 5) (COSTA, 2002).
Figura 5 Estrutura básica de um flavonoide.
Fonte: BRAVO, 1998.
33 Vários subgrupos de flavonoides são classificados de acordo com o perfil de substituições no anel C, tão bem quanto pelo seu estado de oxidação, podendo ser chamados de flavanonas, flavonas, flavonóis, neoflavonoides, flavan-3-ol, flavan-4-ol, flavan-3,4-diol e isoflavonoides de acordo com a Figura 6.
Figura 6 Estruturas básicas dos flavonoides.
Fonte: SIMÕES et al., 2003.
O termo flavonoide deriva do latim flavus, que significa amarelo, em virtude da cor que confere as flores, estes são encontrados principalmente em frutos, sementes, caules, flores, cascas de árvore e raízes, sendo constituintes essenciais da dieta humana (SIMÕES et al., 2003). Plantas medicinais que contém flavonoides são usadas há milhares de anos na medicina popular, por apresentarem atividade antioxidante.
A Figura 7 mostra estruturas químicas identificadas em amostras de moringa (ANWAR et al., 2007).
34 Figura 7 Algumas estruturas químicas de compostos identificados em moringa.
Legenda – Niazinina A (1), 4-(4′O -acetil-α -L-ramnopiranosiloxi)benzil isothiocianato (2), 4-(-L- ramnopiranosiloxi)benzil isothiocianato (3), niazimicina (4), 4-( α -L-ramnopiranosiloxi)benzil glicosinolato (5), isothiocianato de benzila (6), aglicona de deoxi-niazimicina (N-benzil, S- etiltioformato) (7), pterigospermina (8), niaziminina (9 + 10), O -etil-4-( α -L-ramnosiloxi)benzil carbamato (11), niazirina (12), glicerol-1-(9-octadecanoate) (13), β -sitosterol (14), 3O -(6′O - oleoil-β -D-glicopiranosil)-β -sitosterol.
Fonte: ANWAR et al., 2007.
35 3.4 Atividade antioxidante
O sistema antioxidante é uma complexa rede de reações enzimáticas e não enzimáticas, que atua capturando ou bloqueando substâncias potencialmente danosas, tais como as espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (EROs/ERNs) radicais carbonos-centrais, metais de transição e diversos fragmentos derivados de lipídios e proteínas (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007). O oxigênio e nitrogênio são moléculas altamente reativas e podem ser parcialmente reduzidas para formar um número de agentes quimicamente reativos. O processo de transferência de elétrons, ou a absorção de energia pode levar o oxigênio ou o nitrogênio a gerar espécies reativas, conhecida como EROs (Espécies Reativas de Oxigênio) ou ERNs (Espécies Reativas de Nitrogênio), também são chamadas de radicais livres (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
O termo radical livre é frequentemente usado para designar qualquer átomo ou molécula com existência independente, contendo um ou mais elétrons desemparelhados na sua órbita externa, sendo um conjunto de moléculas orgânicas e inorgânicas altamente reativas, que contêm número ímpar de elétrons em sua camada eletrônica e este não emparelhamento de elétrons da última camada confere alta reatividade a esses átomos ou moléculas (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
As principais EROs, distribuem-se em dois grupos, as radicalares: que são as hidroxilas, superóxidos, peroxilas e alcoxilas; e as não radicalares:
oxigênio, peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Já as principais ERNs são:
o cátion nitrosonium, o ânion nitroxila e o peroxinitrito (DROGE, 2002;
BARREIROS, et al., 2006).
O processo de oxidação envolvendo o oxigênio (O2) é parte fundamental da vida aeróbia e do metabolismo e, assim, a geração destes radicais livres, nas células, ocorre tanto no meio citoplasmático, como nas mitocôndrias e estão envolvidos em funções fisiológicas básicas, como na produção de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
Os radicais livres produzidos pelos macrófagos e neutrófilos são empregados contra bactérias e fungos invasores do organismo, produzindo ação lesiva a estes micro-organismos. Por outro lado, o excesso de radicais livres leva
36 a alterações em nível molecular que estão associadas a danos às macromoléculas biológicas como lipídeos, proteínas e DNA, gerando alterações teciduais que estão implicadas em inúmeros processos patológicos, como por exemplo: câncer, aterosclerose, doenças neurodegenerativas, diabetes, cirrose, artrite reumatoide, entre outras (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007).
A produção de radicais livres também ocorre nos fagócitos quando infectados por bactérias ou vírus, produzindo agentes oxidantes como o óxido nítrico, ânion superóxido, peróxido de hidrogênio, entre outros, fazendo com que os radicais livres façam parte da defesa imune do organismo (VALKO et al.,2006).
Os radicais livres também são produzidos por causas exógenas, como radiações gama, poluentes, praguicidas, entre outros. O fumo é uma importante fonte exógena desses radicais, pois a combustão do cigarro produz óxidos de nitrogênio levando à oxidação das moléculas biológicas (ELSAYED, 2001).
3.4.1 Antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos
Os radicais livres formam-se em condições fisiológicas em proporções controladas pelos mecanismos defensivos celulares. Estes mecanismos de defesa são comumente chamados de antioxidantes que podem ser definidos como substâncias capazes de retardar ou inibir a oxidação de substratos oxidáveis, podendo estes serem enzimáticos ou não enzimáticos (HALIWELL, 2001; SOUSA et al., 2007).
O sistema enzimático constitui a primeira defesa endógena a agir aos ataques das EROs ou ERNs, impedindo sua formação ou sequestram-na de forma a impedir sua interação com os alvos celulares, ou seja, bloqueiam a etapa de iniciação da cadeia radicular (ROVER JR. et al., 2001). Os antioxidantes enzimáticos que atuam como mecanismo de defesa antioxidante são a superóxido dismutase, a catalase, a glutationa peroxidase, a glutationa redutase e a glutationa S-transferase, que neutralizam ou reduzem a ação das EROs (YU, 1994).
O sistema de defesa não enzimático, em sua grande maioria, necessita ser adquirido pela alimentação. As frutas e vegetais são as principais fontes
37 destes antioxidantes. Entre os antioxidantes não enzimáticos tem-se a vitamina C, a vitamina E, os carotenoides e os flavonoides. Juntos, estes compostos produzem um arranjo de antioxidantes que pode agir por diferentes mecanismos para conferir um sistema de defesa efetivo contra o ataque dos radicais livres (SHAHIDI, 1997).
Das classes de compostos químicos que são responsáveis pela inibição da peroxidação lipídica, presentes na maioria dos produtos naturais, estão os polifenóis, flavonoides e taninos. Os flavonoides são também responsáveis pela inibição de oxidação do ácido linoleico, oxidação de LDL (lipoproteína humana de baixa densidade), peroxidação de fosfolipídeos da membrana, peroxidação lipídica microssomal e mitocondrial, peroxidação de eritrócitos e fotoxidação e peroxidação de cloroplastos (ANILA e VIJAYALAKSHMI, 2003; SANTANAM et al., 2004).
Os polifenóis, flavonoides e taninos, conhecidos como antioxidantes naturais estão presentes em frutos, sementes, folhas e raízes de plantas, inibindo a formação dos radicais livres (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 2007;
SOUSA et al., 2007). O consumo destes antioxidantes naturais tem sido associado a uma menor incidência de doenças relacionadas com o estresse oxidativo (DROGE, 2002).
O sistema de defesa humano contra os radicais livres não seria completo sem os antioxidantes provenientes da dieta natural, o que confirma a importância da ingestão diária desses compostos, proporcionando vários benefícios como melhoria na qualidade de vida da população (RATMAN et al., 2006).
3.4.2 Estresse oxidativo
A formação de radicais livres ocorre pela ação catalítica de enzimas in vivo, durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem no metabolismo celular e pela exposição a fatores exógenos. A concentração desses radicais EROs/ERNs, pode se elevar devido à maior geração intracelular ou pela deficiência dos mecanismos antioxidantes, esse desequilíbrio desfavorável que ocorre entre as moléculas oxidantes e antioxidantes, caracteriza o estresse oxidativo, que pode causar danos moleculares às
38 estruturas celulares tendo como consequência alteração funcional e prejuízo das funções vitais em diversos tecidos e órgãos (DROGE, 2002).
A ocorrência de um estresse oxidativo moderado é frequentemente acompanhada de um aumento nas defesas antioxidantes enzimática, porém, a produção de uma quantidade elevada de radicais livres pode causar danos e morte celular (ANDERSON, 1996)
O estresse oxidativo ocorre como um desequilíbrio entre o balanço pró- oxidante/antioxidante, em favor da situação pró-oxidante, promovendo um dano potencial. A neutralização destes radicais pelo sistema antioxidante torna-se ineficiente ocasionando alterações nas sinalizações celulares, acúmulos de radicais tóxicos e vários danos nas biomoléculas e organelas celulares, relacionado com as patologias de um grande número de doenças crônicas (KIM et al., 2003; MENDEL e YOUDIM, 2004; CHAKRABARTI et al., 2013).
Estudos epidemiológicos mostram que uma dieta saudável, na qual a maior parte da ingestão de calorias provém de vegetais, pode reduzir o risco destas doenças (HALLIWELL, 2001). Este efeito protetor advém não somente dos macronutrientes presentes nas plantas, como as proteínas, carboidratos e lipídeos, mas também de compostos originários do seu metabolismo secundário, tal como, os polifenóis (entre eles os flavonoides) e taninos (VISIOLI et al., 2000;
HALLIWELL, 2001). Estas substâncias são capazes de agir como protetoras frente ao estresse oxidativo, atuando como “varredores” de radicais livres e/ou moduladores dos mecanismos de defesa antioxidante e do sistema de reparo do DNA (THOMPSON et al., 2005; MOLLER e LOFT, 2006).
A definição de um bom antioxidante se dá pelas suas características químicas, como a presença de doadores de elétrons ou de hidrogênio, capacidade de deslocamento do radical formado em sua estrutura, potencial de quelar metais de transição envolvidos no processo oxidativo e facilitador de acesso ao local de ação (MANACH e DONOVAN, 2004).
Danos oxidativos tem sido associado a diversas doenças crônicas e agudas, patológicas com a isquemia, hipoglicemia, inflamação, doenças neurodegenerativas e envelhecimento estão relacionadas com o estresse oxidativo causado pela ação enzimática devida a presença em excesso de radicais livres (THAKURTA et al., 2012), inclusive as ocorrentes no cérebro e sistema nervoso central (SNC). O cérebro é notoriamente vulnerável ao estresse
39 oxidativo devido ao seu alto consumo de oxigênio (FRIEDMAN, 2011; OTAEGUI- ARRAZOLA et al., 2014).
Ao mesmo tempo o cérebro e o SNC são responsáveis pela geração de radicais livres, onde que o próprio órgão para manter a homeostase iônica intracelular utiliza cerca de 20% de todo o oxigênio consumido pelo corpo para a produção de ATP e aproximadamente 0,2% deste oxigênio é transformado em EROS por diferentes cadeias respiratórias. O SNC tem alta atividade da NADPH oxidase a qual também é uma importante fonte intracelular de EROS (INFANGER et al., 2006).
Estudos relatam que a presença de flavonoides, principal agente anti- oxidante natural, impede a inativação de receptores de acetilcolina muscarínicos pelo dano oxidativo catalizado pelo inibidor endógeno de baixo peso molecular presente três vezes mais em cérebros de pacientes com Alzheimer. O dano a estes receptores causa uma diminuição da transmissão colinérgica, envolvida na memória e na aprendizagem e o uso desses flavonoides pode aumentar a eficácia dos inibidores da acetilcolinesterase (FAWCETT et al., 2002).
De acordo com Leone et al (2015) as folhas da moringa oleifera são uma fonte rica de compostos antioxidantes. Siddhuraju e Becker (2003) examinaram as capacidades de eliminação de radicais livres e atividades antioxidantes dos extratos aquosos, aquosos de metanol e etanol aquoso de folhas liofilizadas de Moringa oleifera lam. de diferentes regiões agro-climáticas. Os autores descobriram que extratos de folhas diferentes inibiram 89,7% - 92,0% de peroxidação de ácido linoléico e tiveram uma atividade de eliminação em radicais superóxido de uma maneira dose. Todos os extratos solventes de amostras de folhas tiveram uma atividade de eliminação de radicais muito alta, no entanto melhores resultados foram obtidos em metanol e etanol.
3.5 Segurança de uso da moringa
Nenhum efeito adverso foi relatado nos estudos em humanos, numa revisão por Stohs e Hartman (2015). Várias preparações relatadas na literatura como alimentos e medicamentos contendo a moringa (M.oleifera), descrevem a sua segurança de uso. Muitos estudos em animais foram realizados para a avaliação do potencial citotóxico da planta. A segurança do uso de um extrato
