INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES SECRETARIA

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES

SECRETARIA DA INDÚSTRIA. COMÉRCIO. CIÊNCIA E TECNOLOGIA AUTARQUIA ASSOCIADA A UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CARACTERIZAÇÃO DA LIGAÇÃO DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO HUMANO À MEMBRANA MICROSSOMAL DE FÍGADO

DE MULHER GRÁVIDA

Esther Piltcher Haber

Tese de Doutoramento como parte dos requisitos para otitençio do Titulo de

"Doutor na Área de Coneentraçio em Tecnologia Nuclear Básica".

Orientador Dr. Wllian Nicolau

São Paulo

1990

PiRRftTi^

D e v i d o falha t é c n i c a , o t e x t o da p á g i n a 44 s e g u e na p á g i n a 46

INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES Autarquía Associada a Universidade de São Paulo

CARACTERIZAÇÃO DA LIGAÇÃO DO HORMÔNIO DE CRESCIMENTO HUMANO Ã MEMBRANA MICROSSOMAL DE FÍGADO

DE MULHER GRÃVIDA

Esther Piltcher Haber

Tese de Doutoramento apresentada como parte dos requisitos para obtenção do titulo de Doutor na Área de Concentração em Tecnologia Nuclear Básica

Orientador: Dr. Wilian NicoIau

SÃO PAULO 1990

[X^mm NAÜbNí-L bt tMtHGlÁ NUCLtÀR/SP • IPtN

A G R A D E C I M E N T O S

Ao Dr. W i l i a n N i e o l a u , p e l a o r i e n t a ç ã o e p e l a o p o r t u n i d a d e que me c o n c e d e u de r e a l i z a r a p a r t e e x p e r i m e n t a l d e s t e t r a b a l h o no L a b o r a t ó r i o de P e s q u i s a s C l i n i c a s da ia. C l í n i c a M é d i c a da F a c u l d a d e de M e d i c i n a da U S P .

Ao D r . H o m e r o D' A b r o n z o , p o r sua i n e s t i m á v e l c o l a b o r a ç ã o na o r i e n t a ç ã o do p r e s e n t e t r a b a l h o , d u r a n t e o qual m u i t o me e n s i n o u .

D r a . B e r e n i c e B i l h a r i n h o de M e n d o n ç a , p o r seu c o n s t a n t e a p o i o e s u a s v a l i o s a s s u g e s t õ e s e o r i e n t a ç õ e s .

h D r a . y â n i a C a i r a B o r g h i , pela o r i e n t a ç ã o inicial e p o r seu e s t í m u l o para que eu e f e t i v a s s e o D o u t o r a m e n t o .

Ao Dr. J o s é R o b e r t o R o g e r o , por seu a p o i o na r e a l i z a ç ã o d e s t a t e s e .

Ao D r . R e n a t o M . E . S a b b a t i n i , por seu a p o i o e i n t e r e s s e em m i n h a f o r m a ç ã o .

Ao D r . M a r c e l o Z u g a i b e Dr. Wun N. K a n s , p e l a p a r t i c i p a ç ã o na c o l e t a d e a m o s t r a s s é r i c a s de m u l h e r e s g r á v i d a s no A m b u l a t ó r i o de O b s t e t r í c i a do H o s p i t a l d a s C l í n i c a s da U S P .

A o s c o l e g a s do L a b o r a t ó r i o de R a d i o i m u n o e n s a i o da ia.

C l í n i c a M é d i c a do H o s p i t a l d a s C l í n i c a s , L a b o r a t ó r i o de N u t r i ç ã o H u m a n a e D o e n ç a s M e t a b ó l i c a s e L a b o r a t ó r i o de C a r b o i d r a t o s da F a c u l d a d e de M e d i c i n a da USP e L a b o r a t ó r i o de P a t o l o g i a C l í n i c a do H o s p i t a l d a s C l í n i c a s da U N I C A M P , p o r sua c o l a b o r a ç ã o d i r e t a ou i n d i r e t a .

M a r i a do C a r m o C o s t a F a l c ã o , por sua c o l a b o r a ç ã o no p r o c e s s a m n e t o d o s d a d o s e x p e r i m e n t a i s j u n t o ao C e n t r o de P r o c e s s a m e n t o de D a d o s do I P E N / C N E N - S P .

^ R e n a t a M a i a , pela d i g i t a ç ã o e c o m p o s i ç ã o e s t é t i c a da

t e s e de D o u t o r a m e n t o .

m i n h a f a m í l i a , p e l o c o n s t a n t e a p o i o e c o m p r e e n s ã o

ÍNDICE

PAG.

RESUMO 5 A B S T R A C T 7

i. INTRODUCSü 9

S. MATERIAL E M É T O D O 1 5 2 . 1 . O b t e n ç ã o d e -fígado d e m u l h e r g r á v i d a 1 5

S.E. P r e p a r o d e r e c e p t o r e s d e h G H 1 5

H . 3 . H o r m ô n i o s u s a d o s 1 7 2 . 4 . R a d i o i o d a c a o d o s h o r m ô n i o s 1 8

2 . 5 . P u r i f i c a ç ã o do h o r m ô n i o i o d a d o 1 9

2 . 6 . P r o c e d i m e n t o da i n c u b a ç ã o S I 2 . 7 . D e t e r m i n a ç ã o d o s n í v e i s d e p r o l a c t i n a e h o r m ô n i o l a c t o g ê n i o

p l a c e n t a r i o S S 2 . 8 . P r o c e s s a m e n t o e a n á l i s e d o s d a d o s e x p e r i m e n t a i s o b t i d o s ....SS

3. R E S U L T A D O S S 5 3 . 1 . E f e i t o da c o n c e n t r a ç ã o d o r e c e p t o r na l i g a ç ã o e s p e c i f i c a d e

1 2 5 1 - h G H S 5 3 . 2 . E f e i t o d e t e m p o e t e m p e r a t u r a n a l i g a ç ã o e s p e c i f i c a d e

1 2 5 1 - h G H S 5 3 . 3 . E f e i t o d e c a t i o n s m o n o e d i v a l e n t e s n a l i g a ç ã o e s p e c í f i c a d e

1 2 5 1 - h G H 2 7 3 . 4 . E f e i t o d e p o l i a m i n a s n a l i g a ç ã o e s p e c i f i c a d e i 2 5 I - h G H 2 9

3 . 5 . E f e i t o d o s o r o sem h G H n a l i g a ç ã o e s p e c i f i c a d e 1 2 5 h G H S 9

3.6. A n á l i s e d o s p a r â m e t r o s d e l i g a ç ã o d e i 2 5 I - h 6 H 3 1 3 . 7 . C o m p a r a ç ã o do s o r o d e p a c i e n t e s a c r o m e g a l i c o s com h G H p a d r ã o

p a r a d e t e r m i n a ç ã o d o p a r a l e l i s m o 3 3 3 . 8 . C o r r e l a ç ã o e n t r e o s n í v e i s s é r i c o s d e h G H d o s a d o s por r a -

d i o r r e c e p t o r e n s a i o , e n s a i o i m u n o r r a d i o m é t r i c o e r a d i o i m u n o -

e n s a i o 3 6 3 . 9 . E s p e c i f i c i d a d e d o s s í t i o s d e l i g a ç ã o 3 8

3 . 1 0 . D o s a g e m d e h G H em a m o s t r a s s é r i c a s d e m u l h e r e s g r á v i d a s 4 0

4. Discussão E C O N C L U S Õ E S 4 2

5. R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S 5 1

C A R A C T E R I Z A C 2 0 DA L I G A C 2 0 DO H O R M Ô N I O DE C R E S C I M E N T O H U M A N O ô M E M B R A N A M I C R O S S O M A L DE F Í G A D O

DE M U L H E R GRtfíUIDA

E s t h e r P i l t c h e r H a b e r

R E S U M O

O p r e s e n t e t r a b a l h o d e s c r e v e a l g u m a s d a s c a r a c t e r í s t i c a s da l i g a ç ã o do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o em um s i s t e m a h o m ó l o g o , u s a n d o GH h u m a n o e m e m b r a n a m i c r o s s o m a l o b t i d a de f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a . C o m a a d i ç ã o de i 5 0 0 0 cpm de ^^^UGH a 2 0 uL de m e m b r a n a m i c r o s s o m a l (2.5 m g / m L ) , a l i g a ç ã o e s p e c í f i c a v a r i o u de E 0 a 4 0 % A l i g a ç ã o de ^ ^S J - I ^ Q H à f r a ç ã o m i c r o s s o m a l de f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a d e p e n d e da c o n c e n t r a ç ã o d e r e c e p t o r e s , t e m p o e t e m p e r a t u r a de i n c u b a ç ã o , d a p r e s e n ç a de c a t i o n s d i v a l e n t e s (Ca'''^ QQ Mg'*"^) e d o s o r o sem h G H .

A a n á l i s e de S c a t c h a r d , c o n s t a t o u - s e a e x i s t ê n c i a de

uma n o v a c l a s s e de r e c e p t o r e s p e c í f i c o p a r a h G H , s u g e r i n d o a p r e s e n ç a de Ó013 s í t i o s de l i g a ç ã o com a f i n i d a d e s d i f e r e n t e s no f í g a d o h u m a n o . Um dos s í t i o s de l i g a ç ã o tem u m a c o n s t a n t e de a f i n i d a d e (KA) da m e s m a o r d e m de m a g n i t u d e d o s p r e v i a m e n t e e n c o n t r a d o s em fígado h u m a n o

(0.9 X 109 M " i ) e l i n f ó c i t o s (1.3 x 1 0 ^ M ~ l ) e n q u a n t o que o o u t r o tem um v a l o r de KA 2 0 v e z e s m a i o r .

C^omm mm

A pro 1 ac t X na h u m a n a n a o t e v e e ht-11 o no J es ! ocaÍIÍPn t c de --^•I-KGH em c o n c e n t r a ç õ e s até S 5 0 ng/inL. G h o r. T i Q n i u l a c t o g ê n i o c i . a c p n t á r i o em a l t a s c o n c e n t r a ç õ e s d e s l o c o u *25i_L,Qt-j ¡ -Q ^ ^ma p o t e n c i a r e l a t i v a de 0.3%. A c o m p e t i ç ã o de hPL com o hGH na l i g a ç ã o a seus r e c e p t o r e s h e p á t i c o s o c o r r e p e l o fato do hPL a p r e s e n t a r B5'Á de h o m o l o g í a em sua e s t r u t u r a p r i m á r i a em r e l a ç ã o ao h G H .

Q u a n d o a m o s t r a s com d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s de hGH foram t e s t a d a s p e l o p r e s e n t e e n s a i o , u m a boa c o r r e l a ç ã o Foi o b s e r v a d a e n t r e as e s t i m a t i v a s d a s c o n c e n t r a ç õ e s s é r i c a s o b t i d a s por r a d i o i m u n o e n s a i o e e n s a i o i m u n o r r a d i o m é t r i c o . A s s i m s e n d o , este r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o , com uma s e n s i b i l i d a d e de 0.6 u g / L GH n o s o r o , p o d e ser u s a d o para d o s a g e m d o s n í v e i s s é r i c o s de hGH fora da g r a v i d e z .

C H A R A C T E R I Z A T I O N OF H U M A N G R O W T H H O R M O N E B I N D I N G TO M I C R O S O M A L M E M B R A N E F R O M

P R E G N A N T W O M A N L I V E R

E s t h e r P i l t c h e r H a b e r

A B S T R A C T

The p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n d e s c r i b e s s o m e c h a r a c t e r i s t i c s of g r o w t h h o r m o n e b i n d i n g in an h o m o l o g o u s s y s t e m , u s i n g hGH and m i c r o s o m a l m e m b r a n e o b t a i n e d from liver of p r e g n a n t w o m a n . Whit t h e a d d i t i o n of 1 5 0 0 0 cpm I ^ S I - ^ Q H J-Q 2 0 uL of m i c r o s o m a l m e m b r a n e (E.5 m g / m L ) , the s p e c i f i c b i n d i n g r a n g e d from 2 0 to 4 0 % . The

125i

- h G H b i n d i n g to t h e m i c r o s o m a l f r a c t i o n of p r e g n a n t liver d e p e n d s on the r e c e p t o r c o n c e n t r a t i o n , t i m e and t e m p e r a t u r e of i n c u b a t i o n , p r e s e n c e of d i v a l e n t c a t i o n s (Ca'''^ or Mg'''^) and s e r u m w i t h o u t h G H .

S c a t c h a r d a n a l y s i s i n d i c a t e d the e x i s t e n c e of a new c l a s s of s p e c i f i c r e c e p t o r to h G H , s u g g e s t i n g the p r e s e n c e of two b i n d i n g s i t e s with d i f f e r e n t a f f i n i t i e s in the liver of p r e g n a n t w o m e n . One of these b i n d i n g s i t e s h a s o n e a f f i n i t y c o n s t a n t (KA> of the same o r d e r of m a g n i t u d e as p r e v i o u s l y r e p o r t e d to human liver

(0.9 X 109 M ~ l ) and l y m p h o c y t e s (1.3 x 1 0 ^ M " l ) , w h i l e the KA of the

o t h e r 1 5 2 0 t i m e s h i g h e r .

a

H u m a n p r o l a c t i n w a s i n e f f e c t i v e in d i s p l a c i n g ^"^^I-hGH in c o n c e n t r a t i o n up to ¿ 5 0 n g / m L . L a c t o g e n p l a c e n t a l h o r m o n e in h i g h e r serum l e v e l s d i s p l a c e d l 2 5 T - f, G H with a 0 . 3 % r e l a t i v e p o t e n c y The c o m p e t i t i o n of HPL with ^ ^S J - I ^ Q H in b i n d i n g to its h e p a t i c r e c e p t o r s o c c u r s d u e to t h e fact that h P L s h o w s 8 5 % h o m o l o g y with GH in p r i m a r y s t r u c t u r e .

W h e n s a m p l e s with d i f f e r e n t s e r u m l e v e l s of h G H w e r e tested by t h e p r e s e n r t a s s a y , a good c o r r e l a t i o n w a s o b s e r v e d with t h e e s t i m a t e s of s e r u m c o n c e n t r a t i o n s o b t a i n e d by r a d i o i m m u n o a s s a y and i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y . T h u s , t h i s r a d i o r r e c p t o r , whit a 0.6 u g / L GH s e r u m s e n s i t i v i t y , may p r o v i d e a useful assay for the d o s a g e of s e r i c l e v e l s of h G H out of p r e g n a n c y .

1. I N T R O D U Ç Ã O

1 INTRODUCao

O h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o ( h G H ) , p r o d u z i d o p e l a g l â n d u l a p i t u i t á r i a , e x i b e m ú l t i p l o s e f e i t o s b i o l ó g i c o s in v i v o s e n d o que a l g u m a s a ç õ e s m e t a b ó l i c a s são i n d u z i d a s d i r e t a m e n t e , em a s s o c i a ç ã o com c o r t i s o l , c o m o i n t o l e r â n c i a a g l i c o s e , e f e i t o a n t i - i n s u l i n a , a u m e n t o de l i p ó l i s e e c e t o g ê n e s e .

F s t e h o r m ô n i o a t u a t a m b é m i n d i r e t a m e n t e , i n t e r a g i n d o com os s í t i o s r e c e p t o r e s p r e s e n t e s no fígado com p r o d u ç ã o de s o m a t o m e d i n a ( I G F - i ) , q u e , na p r e s e n ç a de h o r m ô n i o s t i r e o i d e a n o s , e x e r c e i n f l u ê n c i a p r e p o n d e r a n t e no c r e s c i m e n t o e s t a t u r a l ( 7 3 ) . Além d i s s o , o hGH e s t i m u l a a s í n t e s e d e p r o t e í n a s e RNA p o l i m e r a s e no

f í g a d o (48) e a a t i v i d a d e de e n z i m a s c o m o o r n i t i n a d e s c a r b o x i 1 a s e (44) e g l u t a m a t o d e s i d r o g e n a s e ( 1 3 ) .

F m b o r a m u i t o s d e t a l h e s c o n c e r n e n t e s à forma de a t u a ç ã o d e s t e h o r m ô n i o p e p t í d i c o s e j a m a i n d a d e s c o n h e c i d o s , s a b e - s e que a p r i m e i r a e t a p a na a ç ã o b i o l ó g i c a do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o ( G H )

r e s i d e na l i g a ç ã o do h o r m ô n i o ao seu r e c e p t o r e s p e c í f i c o s i t u a d o na

s u p e r f í c i e da m e m b r a n a p l a s m á t i c a do t e c i d o alvo ( 7 0 ) . E s t a i n t e r a ç ã o

h o r m ó n l o - r e c e p t o r é p r e c e d i d a p o r u m a s é r i e de e v e n t o s c e l u l a r e s

í. V)

q u H p o s s i b i l i t a m a e x p r e s s ã o d e um o u m a i s e v e n t o s m e t a b ó l i c o s do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o < E 5 ) .

F n s a i o s com r a d i o r r e c e p t o r e s ( R R E ) têm s i d o d e s e n v o l v i d o p a r a v á r i o s h o r m ô n i o s p o l i p e p t í d icos e p r o t e í n a s , i n c l u i n d o GH 0 5 ) Na m a i o r i a d o s r a d i o r r e c e p t o r e s , f r a ç õ e s de m e m b r a n a p l a s m á t i c a o b t i d a s p o r h o m o g e n e i z a ç ã o e c e n t r i f u g a ç ã o d i f e r e n c i a l de t e c i d o s tem s i d o u t i l i z a d o c o m o f o n t e de r e c e p t o r e s h o r m o n a i s Lesniak <50) u s o u c u l t u r a de l i n f ó c i t o s h u m a n o s p a r a d e s e n v o l v e r um r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o p a r a ^^^l-UGH D e v i d o a c o n s i d e r á v e l e v i d ê n c i a que um d o s p r i n c i p a i s s í t i o s de a ç ã o do h G H é o

f í g a d o ( 6 4 ) , o u t r o s p e s q u i s a d o r e s e x a m i n a r a m a l i g a ç ã o d o ^ ^ ^ I - h G H a f r a ç õ e s de m e m b r a n a h e p á t i c a de r a t o s , c o e l h o s e o u t r a s e s p é c i e s (Tabela 1 )

Uma m a i o r d i f i c u l d a d e na i n t e r p r e t a ç ã o d o s d a d o s no m e c a n i s m o de a ç ã o do G H , a n í v e l c e l u l a r , tem s i d o o u s o f r e q u e n t e do hGH c o m o l i g a n t e m a r c a d o p a r a a a n á l i s e de l i g a ç ã o em s i s t e m a s h e t e r ó l o g o s A m a i o r i a d o s e s t u d o s tem s i d o r e a l i z a d o com r o d e n t e s ( r a t o s , c a m u n d o n g o s ) ou c o e l h o s u s a n d o GH h u m a n o c o m o l i g a n t e . é s u r p r e e n d e n t e , p o r t a n t o , que r e l a t i v a m e n t e p o u c o s e s t u d o s e x i s t e m com o u s o de s i s t e m a s l i g a n t e e r e c e p t o r h o m ó l o g o s , isto é, a l i g a ç ã o do

GH h u m a n o a t e c i d o s h u m a n o s ( 1 7 , 4 3 ) .

E n t r e t a n t o , o b s e r v o u - s e que a q u a n t i d a d e de r e c e p t o r e s p a r a o hGH d e p e n d e do s e x o e e s t a d o f i s i o l ó g i c o do qual as

rOWlSSÀO NACtONH CE ENERGIA MUCLEAft/Sf' - IPEN

T A B E L A I

D i s t r i b u i ç ã o de r e c e p t o r e s d e GH em t e c i d o s

T e c i d o Espéc ie R e f e r e n c l a

Ad i p o s o R a t o Gorin et a l , 1 9 8 4

R o u p a s et a l , 1988 F a g i n et a l , 1 9 8 0 G r i c h t i n g et a l , 1 9 8 8 G a v i n et a l , 198S

O v e l h a Chan et a l , 1 9 7 8

C o r a ç ã o M a c a c o P o s n e r et a l , 1974

C o e l h o H e r i n g t o n et a l , 1986

Rim C o e l h o R o g u i n et a l , 1981

H e r i n g t o n et a l , 1986

R a t o R o g u i n et a l , 1981

F í g a d o C o b a i a P o s n e r et a l , 1 9 7 4 H u m a n o C a r r and F r i e s e n , 1 9 7 0

D ' A b r o n z o , 1 9 8 5 C a m u n d o n g o P o s n e r et a l , 1976

H e r i n g t o n et a l , 1 9 8 8 P o m b o P o s n e r et a l , 1 9 7 4 C o e l h o P o s n e r et a l , 1 9 7 4

C a r v a l h o et a l , 1979 U e b b , 1986

H u g h e s et a l , 1979

W a t e r s and F r i e s e n , 1979 R a t o P o s t e l - V i n a y , 1 9 7 7

M o o r e et a l , 1981 R a n k e et a l , 1976

T u r y n and D e l l a c h a , 1978

O v e l h a P o s n e r et a l , 1974

Chan et a l , 1 9 7 8 G l u c k m a n et a l , 1983 V a c a B a d i n g a et a l , 1 9 8 7

B r e i e r et a l , 1 9 8 8

P o r c o C h u n g and E t h e r t o n , 1986 F i b r o b l a s t o H u m a n o M u r p h a et a l , 1 9 8 3

C a m u n d o n g o M u r p h b et a l , 1983

Lin fóc it os H u m a n o L e s n i a k et a l , 1 9 7 3 , 1 9 7 4 , 1 9 7 7 A s a k a w a et a l , 1986

K i e s s and B u t e n e n d t , 1985

M ú s c u l o R a t o P o s n e r et a l , 1974

C o e l h o H e r i n g t o n , 1986

i 2

m e m b r a n a s h e p á t i c a s são o b t i d a s ( 3 3 , 3 4 , 4 2 , 4 5 , 6 7 ) A s s i m , por e n s a i o com r a d i o r r e c e p t o r e s , o b t e v e - s e m a i o r e s n í v e i s de l i g a ç ã o e s p e c í f i c a do ^ ^ ^ I - h G H a r e c e p t o r e s de m i c r o s s o m a h e p á t i c o de m u l h e r e s g r á v i d a s que em n ã ò - g r á v i d a s ( 1 7 )

E s t u d o s p r é v i o s ( 1 5 , 1 6 , 3 9 , 7 9 ) i n d i c a m que p e r f i s de f i l t r a ç ã o em gel e p a d r õ e s e1 e t r o f o r é t i c o s de ^ ^

pela a d i ç ã o de ou p r é - m c u b a ç ã o com s o r o h u m a n o , de c o e l h o s e de r a t o s n a s r e a ç õ e s de l i g a ç ã o do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o ao seu r e c e p t o r e s p e c í f i c o . E n t r e t a n t o , n e n h u m r e s u l t a d o q u a n t o a n a t u r e z a , c a r a c t e r i z a ç ã o ou e s p e c i f i c i d a d e d e s t a s a l t e r a ç õ e s foi r e v e l a d o .

Em a d i ç ã o , u m a p r o t e í n a e s p e c í f i c a c a r r e g a d o r a de GH ( P C - G H ) tem s i d o d e m o n s t r a d a p o r t é c n i c a de f i l t r a ç ã o em gel em s o r o de c o e l h o s (87) com c a r a c t e r í s t i c a s e s t r u t u r a i s s e m e l h a n t e s ao r e c e p t o r de GH em m e m b r a n a s p l a s m á t i c a s de c o e l h o s . Foi t a m b é m r e c o n h e c i d o em s o r o h u m a n o (5, 3 8 ) u m a p r o t e í n a com l i g a ç ã o e s p e c í f i c a ao h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o . E m n e n h u m d e s t e s c a s o s , a p r o t e í n a c a r r e g a d o r a foi d e t e c t a d a p r e v i a m e n t e por não p r e c i p i t a r no e n s a i o de l i g a ç ã o g e r a l m e n t e u s a d o p a r a m e d i r a l i g a ç ã o do GH ao r e c e p t o r (35, 3 6 , 3 8 , 7 6 , 8 7 ) .

P e s q u i s a s r e a l i z a d a s com a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s c o n t r a

o r e c e p t o r de f í g a d o d e c o e l h o s têm s u g e r i d o que a p r o t e í n a

c a r r e g a d o r a p l a s m á t i c a é b a s t a n t e r e l a c i o n a d a ao r e c e p t o r h e p á t i c o ( 4 ,

6, 8 7 ) t a n t o e s t r u t u r a l m e n t e q u a n t o f u n c i o n a l m e n t e .

1.3

A p u r i f i c a ç ã o do r e c e p t o r de GH em f í g a d o de c o e l h o s e da p r o t e í n a c a r r e g a d o r a de GH em s o r o de c o e l h o s tem s i d o r e c e n t e m e n t e i n v e s t i g a d a (53, 76). A s s e q u ê n c i a s de a m i n o á c i d o s da p o r ç ã o t e r m i n a l do r e c e p t o r de GH e da p r o t e í n a c a r r e g a d o r a s é r i c a são i d ê n t i c a s , c o m p r o v a n d o que a p r o t e í n a c a r r e g a d o r a é a p o r ç ã o e x t r a - c e l u l a r do r e c e p t o r e s p e c í f i c o do GH s i t u a d o na m e m b r a n a ( 5 3 , 7 2 )

O r e c o n h e c i m e n t o que f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a c o n t é m r e c e p t o r e s p a r a h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o (17) é de i n t e r e s s e d e s d e que o f í g a d o p o d e ser o p r i n c i p a l t e c i d o a l v o do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o e t a m b é m p o r q u e o f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a tem s i d o u s a d o com ê x i t o em r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o p a r a h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o . E n t r e t a n t o , c a r a c t e r í s t i c a s de i n t e r a ç ã o e n t r e o h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o e o s e u s í t i o de l i g a ç ã o no f í g a d o n ã o tem s i d o d e s c r i t o em d e t a l h e s .

Foi d e s c o b e r t o , r e c e n t e m e n t e , por e n s a i o com a n t i c o r p o s m o n o c l o n a i s , uma v a r i a n t e p l a c e n t a r i a do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o ( h P G H ) , d i s t i n t a do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o p i t u i t á r i o ( h G H )

( S ? , 3 1 , 3 2 ) . E s t a v a r i a n t e de GH a p a r e c e na s e g u n d a m e t a d e da

g r a v i d e z e s e u s n í v e i s s é r i c o s a u m e n t a m p r o g r e s s i v a m e n t e a t é o t e r m o ,

e n q u a n t o que a c o n c e n t r a ç ã o do hGH d e c l i n a a p ó s a s e g u n d a m e t a d e da

g r a v i d e z ( 3 1 ) . P e l a t é c n i c a d e DNA r e c o m b i n a n t e (40) foi d e m o n s t r a d o

que a v a r i a n t e p l a c e n t a r i a do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o d i f e r e do GH

p i t u i t á r i o em 14 a m i n o á c i d o s . A c a p a c i d a d e de l i g a ç ã o do GH

i 4

p i t u i t a r i o a o s r e c e p t o r e s de s u p e r f i c i e c e l u l a r e s foi t e s t a d a por e n s a i o com r a d i o r r e c e p t o r e s u s a n d o l i n f ó c i t o s h u m a n o s (33, 5 1 ) e m e m b r a n a de f í g a d o de c o e l h a g r á v i d a ( 4 7 , 8 0 , 8 1 ) c o m o s i t i o s de l i g a ç ã o O GH p l a c e n t a r i o a p r e s e n t o u 5 0 e 1 0 0 % de a t i v i d a d e em r e l a ç ã o ao GH p i t u i t a r i o , r e s p e c t i v a m e n t e , no e n s a i o com l i n f ó c i t o s e com r e c e p t o r e s h e p á t i c o s , a p r e s e n t a n d o c u r v a s d o s e - r e s p o s t a p a r a l e l a s em a m b o s s i s t e m a s (62)

C o m o uma ' p r i m e i r a e t a p a no e n t e n d i m e n t o do c o m p o r t a m e n t o d o s s i t i o s de l i g a ç ã o , a c a r a c t e r i z a ç ã o da r e a ç ã o de l i g a ç ã o é r e q u e r i d a . O p r e s e n t e t r a b a l h o d e s c r e v e , p o r t a n t o , a l g u m a s d a s c a r a c t e r í s t i c a s da l i g a ç ã o do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o em um s i s t e m a h o m ó l o g o , u s a n d o GH h u m a n o e m e m b r a n a m i c r o s s o m a l o b t i d a de

f í g a d o de m u l h e r e s g r á v i d a s n o r m a i s .

O u t r o p r o p ó s i t o d e s t a i n v e s t i g a ç ã o é o de e s t u d a r a v a l i d a d e do uso de r e c e p t o r e s de f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a na d e t e r m i n a ç ã o da c o n c e n t r a ç ã o s é r i c a do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o p i t u i t a r i o p a r a f i n s de d i a g n ó s t i c o de d e s o r d e n s de c r e s c i m e n t o .

Em a d i ç ã o , t e s t o u - s e a c a p a c i d a d e de l i g a ç ã o do GH

p l a c e n t a r i o , p r e s e n t e em a m o s t r a s s é r i c a s de m u l h e r e s g r á v i d a s , a o s

m i c r o s s o m a h e p á t i c o s de m u l h e r e s g r á v i d a s .

a. M A T E R I A L E M É T O D O

2 M A T E R I A L E M É T O D O

2 1 O b t e n ç ã o d e f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a

F o r a m o b t i d o s q u a t r o f í g a d o s de m u l h e r e s g r á v i d a s no S e r v i ç o de V e r i f i c a ç ã o de Ó b i t o s da C a p i t a l (São P a u l o ) d u r a n t e as s e s s õ e s de a u t ó p s i a s , a t é 12 h o r a s a p ó s o ó b i t o . F o r a m s e l e c i o n a d o s f í g a d o s com a s p e c t o m a c r o s c ó p i c o n o r m a l , p r e f e r i n d o - s e as m o r t e s d e c o r r e n t e s de d o e n ç a s c a r d i o v a s c u l a r e s .

2.2 P r e p a r o d e r e c e p t o r e s de h G H

As a m o s t r a s h e p á t i c a s o b t i d a s foram p i c a d a s em f r a ç õ e s de 5 0 g com u m a t e s o u r a de p o n t a fina e a r m a z e n a d a s em p l a c a s d e P e t r i a -r?0"C ou p r o c e s s a d a s i m e d i a t a m e n t e . C a d a a m o s t r a de 5 0 g foi h o m o g e n e i z a d a em um l i q ü i d i f i c a d o r W a l i t a R com 2 5 0 mL de s a c a r o s e 0.3 M, a A'^C, por d o i s m i n u t o s ( F I G . i ) . O h o m o g e n e i z a d o foi c e n t r i f u g a d o a 1 0 0 0 0 X g p o r 10 m i n u t o s em uma c e n t r í f u g a S o r v a l l e o s o b r e n a d a n t e foi r e c e n t r i f u g a d o a 1 0 0 0 0 0 x g p o r 2 h o r a s , a 4 ° C .

FÍGADO DE M U L H E R GRAVIDA

F R A Ç Õ E S DE 50g DE T E C I D O H E P Á T I C O P I C A D A S COM UMA T E S O U R A DE P O N T A F I N A

A R M A Z E N A M E N T O A - Z0°C OU P R O C E S S A M E N T O I M E D I A T O

H O M O G E N E I Z A Ç Ã O N O L I Q Ü I D I F I C A D O R COM 2 5 0 ML S A C A R O S E 0 . 3 M / 4 0 C / 2 MIN

C E N T R I F U G A Ç Ã O D O H O M O G E N E I Z A D O 1 0 . 0 0 0 G / 4 O C / I 0 M I N

C E N T R I F U G A Ç Ã O DO S O B R E N A D A N T E 1 0 0 . 0 0 0 G / 4 O C / 2 HS

O B T E N Ç Ã O DO P R E C I P I T A D O F R A C A O M I C R O S S O M A L

F I 6 1. E S Q U E M A R E S U M I D O DO P R O C E S S O DE P R E P A R A Ç Ã O M I C R O S S O M A L DO F Í G A D O DE M U L H E R G R A V I D A .

DA F R A C A O

Í7

O p r e c i p i t a d o , c o n t e n d o m e m b r a n a s c i t o p 1 a s m á t i c a s , p o l i r r i b o s s o m a s e a p a r e l h o de G o l g í , c o n s t i t u í a c h a m a d a f r a ç ã o m i c r o s s o m a l . N e s t a s m e m b r a n a s e n c o n t r a m - s e r e c e p t o r e s h o r m o n a i s , por e x e m p l o , do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o e i n s u l i n a O s m i c r o s s o m a s foram s u s p e n s o s em t a m p ã o T r i s (Tris r?5 mM, pH 7 4, a s i d a s ó d i c a <d.2%) e a l í q u o t a s de 2 mL foram a r m a z e n a d o s a - 2 0 ° C a t é seu u s o . A q u a n t i d a d e de m i c r o s s o m a s d a s s u s p e n s õ e s foi d e t e r m i n a d a p e l o t e o r de p r o t e í n a s (75)

2 3 H o r m ô n i o s u s a d o s

D u a s p r e p a r a ç õ e s de h G H foram u s a d a s : p r e p a r a ç ã o hGH A F P - 4 7 9 3 B , g e n e r o s a m e n t e f o r n e c i d a p e l o N I A D D K (National I n s t i t u t e of A r t h r i t i s , D i a b e t e s , D i g e s t i v e and K i d n e y D i s e a s e s - N I H ) e h G H - H C , p r e p a r a d o no L a b o r a t ó r i o de P e s q u i s a s C l í n i c a s da la. C l í n i c a M é d i c a da F a c u l d a d e de M e d i c i n a da USP ( 6 1 ) .

O u t r o s h o r m ô n i o s u s a d o s no t e s t e de e s p e c i f i c i d a d e da

l i g a ç ã o foram h o r m ô n i o l a c t o g e n i o p l a c e n t a r i o h u m a n o ( h P L ) e

p r o l a c t m a h u m a n a ( h P R L ) , f o r n e c i d o s p e l o N I A D D K .

18

5 4 R a d i o i o d a c a o d o s h o r m ô n i o s

O h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o foi m a r c a d o com 1 2 5 j de a c o r d o com o m é t o d o de G r e e n w o o d e H u n t e r (E8) com a l g u m a s m o d i f i c a ç õ e s ( 5 9 ) . A d i c i o n a r a m - s e , s e q u e n c i a l m e n t e , em um t u b o de v i d r o 18 K 6 0 mm, 5 ug de G H - H C d i l u í d o em 2 0 uL de t a m p ã o f o s f a t o 0 2 M, pH 7.4 e 1 mCi de l^Sj

sob a forma de l o d e t o de s ó d i o l i v r e de c a r r e a d o r A p ó s h o m o g e n e i z a ç ã o , foram p i p e t a d o s 2 0 ' u L de s o l u ç ã o de c l o r a m i n a T c o n t e n d o 1 4 m g / m L em t a m p ã o f o s f a t o 0.05 M, pH 7 4 A p ó s 10 s e g u n d o s de a g i t a ç ã o s u a v e , a d i c i o n o u - s e 2 0 uL de s o l u ç ã o de m e t a b i s s u l f i t o de s ó d i o c o n t e n d o 2.o m g / m L em t a m p ã o f o s f a t o 0,05 M, pH 7 4, s e g u i d o de 1 mL de T r i s - B S A (tampão T r i s 10 mM m a i s s o r o a l b u m i n a b o v i n a 0 1%, pH 7 . 4 ) .

O h o r m ô n i o l a c t o g ê n i o p l a c e n t a r i o h u m a n o e a p r o l a c t i n a

h u m a n a foram m a r c a d o s da m e s m a f o r m a .

i 9

2 5 P u r i f i c a ç ã o do h o r m ô n i o i o d a d o

Iodo livre e h o r m ô n i o d e g r a d a d o foram s e p a r a d o s do

^ ^ ^ T - h G H i n t a c t o p o r f i l t r a ç ã o em g e l . A m i s t u r a de l o d a c ã o foi a p l i c a d a em uma c o l u n a de v i d r o (10 K 5 5 0 m m ) , c o n t e n d o S e p h a d e x G-75 p r e v i a m e n t e e q u i l i b r a d a com t a m p ã o T r i s - H C l 10 mM, pH 7 . 4 , c o n t e n d o a l b u m i n a b o v i n a 0 . 1 % . C o l e t a r a m - s e a l í q u o t a s de 0.8 mL com um f l u x o de E 2 . 5 m L / h o r a , em um c o l e t o r de f r a ç õ e s 7 0 0 0 U l t r o r a c L K B , a 4 ° C , em 8 0 t u b o s de v i d r o (15 x 100 m m ) . P a r a d e t e r m i n a ç ã o do perfil de e l u i c ã o , c o n t a r a m - s e 10 uL de c a d a t u b o n o d e t e c t o r de r a d i a ç ã o g a m a (Gamma 4 0 0 0 , B e c k m a n )

A F I G . 2 a p r e s e n t a o perfil de f i l t r a ç ã o em S e p h a d e x G - 7 5 do hGH m a r c a d o . A p o s i ç ã o do p i c o no perfil de c r o m a t o g r a f i a p e r m i t e a i d e n t i f i c a ç ã o e r e n d i m e n t o da m a r c a ç ã o do h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o m a r c a d o com ^^Sj; A s s i m s e n d o , foram i d e n t i f i c a d o s 3 p i c o s n e s t e perfil o p r i m e i r o c o r r e s p o n d e n d o a o h G H a g r e g a d o e a a l b u m i n a i o d a d a , o s e g u n d o ao I ^ ^ J - ^ Q H í n t e g r o e o t e r c e i r o ao 125i l i v r e . Os c o n t e ú d o s d o s t u b o s que a p r e s e n t a r a m m a i o r e s n í v e i s de a t i v i d a d e no s e g u n d o p i c o foram m i s t u r a d o s de m o d o a se o b t e r , no f i n a l , 2.4 mL de 125i_^,QH í n t e g r o . A s e g u i r , e s t a m i s t u r a foi c o n g e l a d a a - 2 0 ° C p o r um p e r í o d o de 3 0 d i a s . C o n s i d e r o u - s e u m a b o a e f i c i ê n c i a de m a r c a ç ã o

q u a n d o 7 0 % ou m a i s da r a d i o a t i v i d a d e total c o r r e s p o n d i a ao p i c o do

^ 2 ^ 1 - h G H no perfil de c r o m a t o g r a f i a . A a t i v i d a d e e s p e c í f i c a d o 1 2 5 j _

h G H v a r i o u de 5 0 a 1 6 0 Ci/g

Cps

{Xl02)

100

5 0

' " l - h G H I N T E G R O

2 0 4 0 6 0

FIG. 2 - C R O M A T O G R A F Í A DA PURIFICAÇÃO E M S E P H A D E X G - 7 5 .

8 0

T U B O (N2) DO ' 2 5 l - h G H

COMISSÃO NACIONÍL OE ENERGlÀ N U C U A R / S P ^ (PEN

P. 6 P r o c e d i m e n t o da i n c u b a c ã o

Em um v o l u m e final de 0 E mL com t a m p ã o T r i s - B S A os t u b o s c o n t i n h a m 1 0 0 0 0 a 2 0 0 0 0 c o n t a g e n s p o r m i n u t o de ^ ^ ^ I - h G H , 1 a 5 m g / m L de p r o t e í n a m i c r o s s o m a l e M g C l 2 1 e x c e t o n o s e x p e r i m e n t o s o n d e os e f e i t o s de N a C l , K C l , M g C l g , C a C l g , e s p e r m i n a e e s p e r m i d i n a

foram e s t u d a d o s hGH não m a r c a d o foi a d i c i o n a d o em um v o l u m e de 0.1 mL em c o n c e n t r a ç õ e s c r e s c e n t e s p a r a o e s t u d o do d e s l o c a m e n t o c o m p e t i t i v o da l i g a ç ã o do ^ ^ ^ I - h G H Q u a n d o c o n c e n t r a ç õ e s s é r i c a s do h G H

s ã o m e d i d a s p e l o p r e s e n t e m é t o d o , a m e s m a q u a n t i d a d e de s o r o de n a n i c o s foi a d i c i o n a d a à c u r v a p a d r ã o d e v i d o às p r o t e í n a s s é r i c a s p r e s e n t e s n a s a m o s t r a s a n a l i s a d a s . As i n c u b a ç õ e s foram f e i t a s em d u p l i c a t a por 2 4 h o r a s , a 2 4 ° C , e x c e t o n o s e x p e r i m e n t o s r e f e r e n t e s ao e f e i t o de t e m p o e t e m p e r a t u r a de i n c u b a c ã o na l i g a ç ã o e s p e c í f i c a do

^ 2 ^ 1 - h G H a o s r e c e p t o r e s h e p á t i c o s . Ao final do p e r í o d o de i n c u b a c ã o a r e a ç ã o foi b l o q u e a d a p e l a a d i ç ã o de 2 mL de t a m p ã o T r i s - B S A a 4 ° C , s e g u i d a por c e n t r i f u g a ç ã o a 1 0 0 0 0 g r a v i d a d e s por 2 0 m i n u t o s . A s p i r o u - se o s o b r e n a d a n t e e o p r e c i p i t a d o , c o n t e n d o o c o m p l e x o h o r m ô n i o - r e c e p t o r , foi c o n t a d o n o d e t e c t o r g a m a . A l i g a ç ã o i n e s p e c í f i c a de

^f^^I-hCH foi d e t e r m i n a d a p e l a q u a n t i d a d e r e s i d u a l de r a d i a ç ã o na

p r e s e n ç a de 1 ug de hGH n ã o m a r c a d o por t u b o e, e n t ã o , s u b t r a í d a d o s

o u t r o s t u b o s p a r a d e t e r m i n a ç ã o da l i g a ç ã o e s p e c i f i c a , e x p r e s s a em

p o r c e n t a g e m d a s c o n t a g e n s t o t a i s .

22

?. .7. D e t e r m i n a ç ã o d o s n í v e i s s é r i c o s de p r o l a c t i n a e h o r m ô n i o l a c t o -

g e n i o p l a c e n t a r i o

Os n í v e i s s é r i c o s de p r o l a c t i n a -Foram d e t e r m i n a d o s em d u p l i c a t a p e l o " k i t " c o m e r c i a l de r a d i o i m u n o e n s a i o " D o u b l e A n t i b o d y P r o l a c t i n e " ( D i a g n o s t i c P r o d u c t s C o r p o r a t i o n , CA, U S A ) , s e g u n d o o m é t o d o de s e p a r a ç ã o p o r s e g u n d o a n t i c o r p o .

O h o r m ô n i o l a c t o g ê n i o p l a c e n t a r i o -foi d o s a d o em d u p l i c a t a no s o r o em um " k i t " c o m e r c i a l de r a d i o i m u n o e n s a i o , " C o a t - A - C o u n t R P l a c e n t a l L a c t o g e n " ( D i a g n o s t i c P r o d u c t s C o r p o r a t i o n , C A , U S A ) , p e l a t é c n i c a de fase s ó l i d a ( a n t i c o r p o l i g a d o à p a r e d e do t u b o )

P 8 P r o c e s s a m e n t o e a n á l i s e d o s d a d o s e x p e r i m e n t a i s o b t i d o s

O s c á l c u l o s da c u r v a d o s e - r e s p o s t a e da c o n c e n t r a ç ã o

d a s a m o s t r a s d e s c o n h e c i d a s foram r e a l i z a d o s por um p r o g r a m a de

c o m p u t a ç ã o d e n o m i n a d o G A R L A ( S 7 ) , d i s p o n í v e l no C e n t r o de

P r o c e s s a m e n t o de D a d o s do I n s t i t u t o de P e s q u i s a s E n e r g é t i c a s e

N u c l e a r e s - I P E N - C N E N / S P . E s t e p r o g r a m a , r e d i g i d o em F o r t r a n IV,

p o s s i b i l i t a a a u t o m a t i z a ç ã o do t r a ç a d o da c u r v a d o s e - r e s p o s t a n a s

e s c a l a s " 1 i n e a r - 1 i n e a r " , " 1 i n e a r - 1 o g a r í t m i c a " e " 1 o g i t o - l o g a r í t m i c a " ,

s e g u n d o os c r i t é r i o s p r o p o s t o s p o r R o d b a r d e c o l . (68)

D perfil de p r e c i s ã o da c u r v a de d e s l o c a m e n t o c o m p e t i t i v o na p r e s e n ç a de s o r o sem hGH a p a r e c e na F I G . 3 . O r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o de hGH a p r e s e n t o u m a i o r p r e c i s ã o na faina de c o n c e n t r a ç ã o e n t r e a p r o x i m a d a m e n t e 5.5 e 150 n g / m L com e r r o da o r d e m de 5 a 1 5 % , num nível de s i g n i f i c â n c i a de 0.05.

A d o s e m í n i m a d e t e c t á v e l ( D M D ) , c a l c u l a d a em 7 e n s a i o s ,

u s a n d o d i f e r e n t e s p r e p a r a ç õ e s de r e c e p t o r e s de h G H , foi de 0.6 ng

GH/tiibo, e q u i v a l e n t e a 0.6 ug/l GH n o s o r o .

õ

L<

O

<

E 28 5

uj 20 o

UJ ^-

z

UJ

ü

UJ

o ü 12

X

X

*«„X

««5

15 62.5 107.5

h G H - í n g / m L )

150

F I 6 . 3 - P E R F I L DE P R E C I S Ã O DA CURVA D O S E -

- R E S P O S T A DE hGH NO R A D I O R R E C E P -

TORENSAIO DE ' ^ ^ I - h G H COM MICROSSOMA

DE FÍGADO DE M U L H E R GRAVIDA NA

P R E S E N Ç A DE 50 DE SORO S E M hGH.

3 . R E S U L T A D O S

3 R E S U L T A D O S

3.3 E f e i t o da c o n c e n t r a ç ã o do r e c e p t o r na l i g a ç ã o e s p e c í f i c a de

A l i g a ç ã o do ^ ^ ^ I - h G H foi m o s t r a d a s e r d i r e t a m e n t e p r o p o r c i o n a l à c o n c e n t r a ç ã o m i c r o s s o m a l na m i s t u r a de i n c u b a c ã o , na faixa de 1.0 a 5 0 m g / m L ( F I G . 4 ) . A l i g a ç ã o e s p e c í f i c a m á x i m a v a r i o u de 3 0 a 5 0 % em d i f e r e n t e s e x p e r i m e n t o s d e v i d o v a r i a ç õ e s na p r e p a r a ç ã o do r e c e p t o r e h o r m ô n i o m a r c a d o . A a d i ç ã o de s o r o h u m a n o à m i s t u r a de i n c u b a ç ã o r e s u l t o u em uma d i m i n u i ç ã o da l i g a ç ã o d o ^ ^ S j - ^ G H ao r e c e p t o r h e p á t i c o .

3 2 . E f e i t o d e t e m p o e t e m p e r a t u r a na l i g a ç ã o e s p e c í f i c a de ^ ^ S j - h O M

A l i g a ç ã o e s p e c í f i c a do ^ ^ ^ I - h G H ao m i c r o s s o m a de f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a foi m e d i d a a p ó s d i f e r e n t e s p e r í o d o s de i n c u b a c ã o a A°C, 2 4 ° C e 3 7 0 C ( F I G . 5 ) . E m b o r a d i f e r e n t e s n í v e i s de l i g a ç ã o m á x i m a t e n h a m s i d o o b t i d o s , o t e m p o p a r a a t i n g i r o m á x i m o foi s e m e l h a n t e em c a d a c a s o . A l i g a ç ã o i n e s p e c í f i c a foi i n a c e i t a v e 1 m e n t e

COMISSÃO NACIONAL DE ENERGIA NUGLEAR/SP - IPEN

ce.

1,0 2,5 5,0 MICROSSOMA ( m g / m Ü

FIG. 4 - LIGAÇÃO ESPECÍFICA DE '"l - hGH EM FUNÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE MICROSSOMA DE FÍGADO DE M U L H E R GRÁVIDA SEM SORO ( X — K ) E COM 50>jL DE SORO SEM hGH ( — . ) .

FIG. 5 - LIGAÇÃO ESPECÍFICA DE '^^I - hGH COM MICROSSOMA DE FÍGADO DE MU LHER GRÁVIDA EM FUNÇÃO DO TEM- PO E DA TEMPERATURA DE INCUBA- ÇÃO NA PRESENÇA DE 50>íL DE SO RO SEM hGH . 37 S C ( x x ) .

>t o.v / _

a l t a a 3 7 " G , de m o d o que 5 4 ° C foi e s c o l h i d a c o m o t e m p e r a t u r a de i n c u b a c ã o p o r 2 4 h o r a s n o s e s t u d o s s u b s e q u e n t e s . N e s t e s e n s a i o s , a c o n c e n t r a ç ã o m i c r o s s o m a l foi de E . 0 m g / m L .

3.3. E f e i t o de c a t i o n s m o n o e d i v a l e n t e s na l i g a ç ã o e s p e c í f i c a de

U s a n d o fração m i c r o s s o m a l de f í g a d o de m u l h e r e s g r á v i d a s e h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o (hGH) m a r c a d o com ^^^1, na p r e s e n ç a de 5 0 uL de s o r o sem h G H , d e t e r m i n o u - s e o nível de l i g a ç ã o e s p e c í f i c a p a r a N a C l , K C l , M g C l g e C a C l g ( F I G . 6 ) . O s c a t i o n s Na+

e K"*" a u m e n t a m s i g n i f i c a t i v a m e n t e a l i g a ç ã o e s p e c í f i c a . C o n t u d o ,

m a i o r e s n í v e i s de l i g a ç ã o e s p e c í f i c a foram o b t i d o s com a a d i ç ã o de

M g C l g ou C a C l g à m i s t u r a de i n c u b a ç ã o . Assim s e n d o , n o s e n s a i o s

s u b s e q u e n t e s , u s o u - s e M g C l g P o r a p r e s e n t a r m e n o r e s n í v e i s de l i g a ç ã o

i n e s p e c í f i c a que o C a C l g n a s m e s m a s c o n d i ç õ e s do e n s a i o .

B / r %

40 •

20 •

NaCl 200 mM

i

KCl 200mM

MgCle 20 mM

CaClg 20 mM

F i G . 6 - E F E I T O DE CATIONS MONO E D I V A L E N T E S NA LIGAÇÃO TOTAL ( HHD ) E E S P E C Í F I C A ( ^ ) DE 125 I - hGH COM MICROSSOMA DE FÍGADO DE MU- L H E R GRÁVIDA NA P R E S E N Ç A DE 50>iL DE SORO S E M HGH .

B / T %

40

2 0

i

i

E S P E R M I D I N A 10 mM

E S P E R M I N A l O m M

F I G . 7 . - E F E I T O DE P O L I A M I N A S NA LIGAÇÃO TOTAL { IHII ) E E S P E

C I ' F I C A ( ^ ) DE 125 I - hGH ~

COM MICROSSOMA DE FÍGADO DE M U L H E R GRÁVIDA NA P R E S E N Ç A DE 50>JL DE SORO S E M h G H .

COMISSÃO

NACiCNít.

3.4 E f e i t o d e p o l i a m i n a s na l i g a ç ã o e s p e c í f i c a d e ^ ^ ^ I - h G H

A ligação do a o s r e c e p t o r e s h e p á t i c o s , em p r e s e n ç a de 5 0 uL de s o r o sem hGH ( F I G . 7 ) , a u m e n t a com a a d i ç ã o de e s p e r m i n a 10 mM a t i n g i n d o 37 5% de l i g a ç ã o e s p e c í f i a A e s p e r m i d m a 10 mM t a m b é m e s t i m u l a a l i g a ç ã o d o '^^^l-hCH ao r e c e p t o r , s e n d o a e s p e r m i n a m a i s p o t e n t e que a e s p e r m i d i n a .

3 5 E f e i t o d o s o r o sem h G H na l i g a ç ã o e s p e c í f i c a d e ^ ^ ^ I - h G H

A i n f l u ê n c i a do s o r o s o b r e o g r a u de p r e c i p i t a ç ã o do

c o m p l e x o ^-^Si-^QH-receptor h e p á t i c o n a s r e a ç õ e s de l i g a ç ã o foi

p r e v i a m e n t e t e s t a d a . S o r o h u m a n o ("pool" de s o r o de n a n i c o s e

i n d i v í d u o s n o r m a i s p r e v i a m e n t e s u b m e t i d o s ao t e s t e de i n t o l e r â n c i a

a g l i c o s e o r a l ) com n í v e i s a u s e n t e s de hGH foi a c r e s c e n t a d o à m i s t u r a

de i n c u b a c ã o em um v o l u m e de 5 0 uL p a r a a c o m p a r a ç ã o da c u r v a de

d e s l o c a m e n t o c o m p e t i t i v o da l i g a ç ã o d o 125j_f,3H p o r q u a n t i d a d e s

c r e s c e n t e s de h G H frio no r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o i n c u b a d o sem s o r o . Na

c u r v a d o s e - r e s p o s t a do ^ ^ ^ I - h G H ( F I G . 8 ) , em p r e s e n ç a de 5 0 uL de s o r o

sem h G H , o b s e r v o u - s e u m a d i m i n u i ç ã o s i s t e m á t i c a p a r a t o d o s os n í v e i s

de c o n c e n t r a ç ã o de hGH frio em r e l a ç ã o à c u r v a de d e s l o c a m e n t o

i n c u b a d a sem s o r o . E s t e s d a d o s d e m o n s t r a m a n e c e s s i d a d e da a d i ç ã o do

3 0

B / T %

6 0 •

4 0 •

2 0 •

0.3 1.2 4.8 19.4 77.5 155

h G H

FIG. 8 - C U R V A S DE D E S L O C A M E N T O C O M P E T I T I V O POR

s o r o sem h G H à t u r v a p a d r ã o p a r a d e t e r m i n a ç ã o d o s n í v e i s s é r i c o s de h G H n a s a m o s t r a s a n a l i s a d a s , com a f i n a l i d a d e de se igualar à c o n c e n t r a ç ã o de p r o t e í n a s s é r i c a s em t o d o s os t u b o s de um d e t e r m i n a d o e n s a i o

3.6 A n á l i s e d o s p a r â m e t r o s de l i g a ç ã o d e

A c o n s t a n t e de a f i n i d a d e e c o n c e n t r a ç ã o d o s s í t i o s r e c e p t o r e s de ^ ^ ^ I - h G H em f í g a d o de m u l h e r e s g r á v i d a s na p r e s e n ç a de q u a n t i d a d e s c r e s c e n t e s de hGH frio e q u a n t i d a d e s f i x a s de ^ ^ ^ T - h G H e m i c r o s s o m a s foram c a l c u l a d o s p e l a a n á l i s e de S c a t c h a r d ( 7 3 ) , u s a n d o o p r o g r a m a de R o d b a r d ( 6 8 ) .

D u a s c l a s s e s de s í t i o s de l i g a ç ã o foram r e v e l a d a s p e l a d e c o m p o s i ç ã o de c u r v a d o s e - r e s p o s t a em d u a s r e t a s (FIG.9) A c o n s t a n t e de a f i n i d a d e de um d o s s í t i o s de l i g a ç ã o foi a p r o x i m a d a m e n t e E 0 v e z e s m a i o r que o s e g u n d o s í t i o de l i g a ç ã o , i n d e p e n d e n t e da p r e s e n ç a ou não d o s o r o sem h G H no e n s a i o , e é i n t e i r a m e n t e c o m p a t í v e l com as c o n c e n t r a ç õ e s s é r i c a s do h o r m ô n i o , 1 0 " ' a í(d~^^ M.

O s p a r â m e t r o s de l i g a ç ã o o b t i d o s d a s c u r v a s d o s e -

r e s p o s t a e l a b o r a d a s sem s o r o e c o m 5 0 u L s o r o sem h G H foram c o m p a r a d a s

B / F %

0.5 •

KA= 2.6 X I0 ' °M ' '

K A =

1.2

10^

5.0 10.0 15.0 20.0 h G H B O U N D X 10"'2 M

FIG. 9 - D E T E R M I N A Ç Ã O DAS C O N S T A N T E S DE ASSOCIAÇÃO

( K A ) DA LIGAÇÃO DE hGH E C O N C E N T R A Ç Ã O (^)

DOS SÍTIOS R E C E P T O R E S H E P Á T I C O S P A R A hGH

E M FÍGADO DE M U L H E R GRÁVIDA C A L C U L A D O

POR ANÁLISE DE S C A T C H A R D .

p e l o s s e u s r e s p e c t i v o s v a l o r e s de c o n s t a n t e de a f i n i d a d e e c o n c e n t r a ç ã o d o s r e c e p t o r e s (Tabela 2 ) . A a d i ç ã o de 5 0 uL sem hGH ao e n s a i o levou a uma r e d u ç ã o de a p r o x i m a d a m e n t e 4 0 % d a s c o n s t a n t e s de a f i n i d a d e d o s d o i s s í t i o s l i g a n t e s , sem a l t e r a ç ã o s i g n i f i c a t i v a d a s c o n c e n t r a ç õ e s d o s r e s p e c t i v o s r e c e p t o r e s h e p á t i c o s .

3.7 C o m p a r a ç ã o do s o r o d e p a c i e n t e s a c r o m e g a l i c o s c o m h G H p a d r ã o p a r a d e t e r m i n a ç ã o de p a r a l e l i s m o

Com o s i s t e m a de r e c e p t o r em c o n d i ç õ e s ó t i m a s (pH 7 . 4 ,

M g C l p 20 mM e 2.0 mg de p r o t e í n a m i c r o s s o m a l / m L ) , p r o c e d e u - s e à

r e a l i z a ç ã o d a s c u r v a s d o s e - r e s p o s t a com d i l u i ç õ e s s e r i a d a s (i/2 a

1/32 em t a m p ã o de e n s a i o ) de pool de s o r o s de p a c i e n t e s a c r o m e g á 1 i c o s ,

c o n t e n d o n í v e i s a l t o s de G H , e com G H - N I H . As c u r v a s de d e s l o c a m e n t o

o b t i d a s foram c o m p a r a d a s e n t r e si p a r a d e t e r m i n a ç ã o do p a r a l e l i s m o

( i n c l i n a ç ã o d a s c u r v a s e s t a t i s t i c a m e n t e n ã o d i f e r e n t e s e n t r e s i )

i n d i c a n d o que o s o r o de p a c i e n t e s a c r o m e g a l i c o s tem c o m p o r t a m e n t o

b i o l ó g i c o s e m e l h a n t e ao GH p a d r ã o n o r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o de f í g a d o de

m u l h e r g r á v i d a ( F I G . 1 0 ) .

3 4

T A B E L A E. P a r â m e t r o s da l i g a ç ã o de ^ ^ ^ I - h G H a o s r e c e p t o r e s h e p á t i c o de m u l h e r e s de m u l h e r e s g r á v i d a s c a l c u l a d o s p e l a a n á l i s e de S c a t c h a r d d a s c u r v a s d o s e - r e s p o s t a sem s o r o e com 5 0 uL s o r o sem h G H .

S i t i o de l i g a ç ã o C t e . A f i n i d a d e C o n c e n t r a ç ã o d o s r e c e p t o r e s ( f m o l / m g ) sem s o r o

C l a s s e I C l a s s e II

2.6 X 10l®

1.2 X 109

2 6 2 0 8 com 5 0 uL s o r o

C l a s s e I C l a s s e II

1.2 X 10l®

0.8 X 1 0 9

2 4

1 9 8

3 5

B / B o % 100

8 0 •

6 0 •

4 0 •

2 0 •

-i l—L. -I—L.

3.9 7.5 15 3 0 6 0 120 h G H - ( n g / m L ) 1/32 1/16 1/8 1/4 1/2 (DILUIÇÃO DO S O R O ) FIG. 1 0 - D E M O N S T R A Ç Ã O DE PARALELISMO DE S O R O DE

ACROMEGALIA E M VARIAS DILUIÇÕES COM h G H

PADRÃO NO R A D I O R R E C E P T O R E N S A I O C O M FÍ-

G A D O DE M U L H E R GRÁVIDA. h G H PADRÃO

(• • ) ; S O R O DE A C R O M E G A L I A (x K ) .

3 6

3 8 C o r r e l a ç ã o e n t r e o s n í v e i s s é r i c o s d e h G H d o s a d o s p o r r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o , e n s a i o i m u n o r r a d i o m é t r i c o e r a d i o i m u n o e n s a i o

A m o s t r a s s é r i c a s de d i f e r e n t e s c o n c e n t r a ç õ e s de h G H p r e v i a m e n t e e s t i m a d a s p e l o r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o (RRF!) de f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a foram m e d i d a s p o r r a d i o i m u n o e n s a i o ( R I E ) u s a n d o r e a g e n t e s f o r n e c i d o s p e l o N a t i o n a l I n s t i t u t e of H e a l t h ( N I H ) e p o r um

" k i t " c o m e r c i a l da P h a r m a c i a que q u a n t i f i c a hGH p o r e n s a i o i m u n o r r a d i o m é t r i c o ( I R M A ) , u s a d o r o t i n e i r a m e n t e no L a b o r a t ó r i o de P e s q u i s a s C l í n i c a s da C l í n i c a M é d i c a da F a c u l d a d e de M e d i c i n a da U S P . O e s t u d o da c o r r e l a ç ã o foi r e a l i z a d o p e l a a n á l i s e de r e g r e s s ã o l i n e a r e o s v a l o r e s o b t i d o s p e l o s d o i s m é t o d o s r e f e r e n c i a i s foram b a s t a n t e p r ó x i m o s a o s d e t e r m i n a d o s p e l o R R E (FIG.11 e 1 2 ) . A s s i m s e n d o , u m a b o a c o r r e l a ç ã o foi o b s e r v a d a e n t r e as e s t i m a t i v a s d a s c o n c e n t r a ç õ e s s é r i c a s i n d i v i d u a i s o b t i d a s p a r a c a d a um d o s m é t o d o s (r

> 0 . 9 5 )

25 5 0 IRMA ( n g / m Ü

FIG. 11 - C O R R E L A Ç Ã O DE NÍVEIS DE hGH D O S A D O S POR R A D I O R R E C E P T O R E N - SAIO DE FÍGADO DE M U L H E R GRÁ VIDA E POR ENSAIO I M U N O R R A - D I O M É T R I C O (IRMA ) .

2 5 5 0

FIG. I 2 - C 0 R R E L A Ç Ã 0 DE NÍVEIS DE hGH

D O S A D O S POR R A D I O R R E C E P T O R E N

SAIO ( R R E ) DE FÍGADO DE M U -

L H E R G R Á V I D A E POR RADIOIMU

N O E N S A I O (RÍE ) .

38

3 9 E s p e c i f i c i d a d e d o s s í t i o s d e l i g a ç ã o

A e s p e c i f i c i d a d e d o s s í t i o s de l i g a ç ã o ao ^ ^

m i c r o s s o m a s h e p á t i c o s de m u l h e r e s g r á v i d a s foi t e s t a d a c o n t r a p r o l a c t i n a h u m a n a ( h P R L ) e h o r m ô n i o l a c t o g ê n i o p l a c e n t a r i o h u m a n o

( h P L ) , d e v i d o a p r o x i m i d a d e d e s t e s h o r m ô n i o s q u a n t o a e s t r u t u r a m o l e c u l a r e a ç ã o f i s i o l ó g i c a ( 5 6 , 6 0 ) ( F I G , 1 3 ) . A p r o l a c t i n a h u m a n a t a m b é m c o m p e t e na l i g a ç ã o do ^ ^ ^ I - h G H m a s com uma p o t ê n c i a r e l a t i v a r e d u z i d a ( 0 . 6 % ) c o m p a r a d o com o h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o . E n t r e t a n t o , n í v e i s s é r i c o s m á x i m o s d e h P R L o c o r r e m d u r a n t e a g r a v i d e z com v a l o r e s e n t r e 2 0 0 e 2 5 0 n g / m L (11) e e s t a s c o n c e n t r a ç õ e s têm c a p a c i d a d e m í n i m a p a r a c o m p e t i r na l i g a ç ã o aos s í t i o s r e c e p t o r e s de

^'^•^I-hGH. A s s i m , n e n h u m a i n t e r a ç ã o d e h P R L com e s t e s s í t i o s de l i g a ç ã o é e s p e r a d o o c o r r e r "in v i v o " .

A s c u r v a s de i n i b i ç ã o c o m p e t i t i v a de l i g a ç ã o do

125i„h(3}^ a o s m i c r o s s o m a s h e p á t i c o s p o r hGH e hPL foram d i v e r g e n t e s

(slope = 0.3) e a p o t ê n c i a r e l a t i v a d o h P L foi de 0 . 3 % n o p o n t o de 5 0 %

da c u r v a d o s e - r e s p o s t a ( F I G . 1 3 ) . P o r o u t r o l a d o , d u r a n t e a g r a v i d e z

hPI. a t i n g e n í v e i s s é r i c o s e n t r e 4 0 0 0 e 1 2 0 0 0 n g / m L (11) e e s t a s

c o n c e n t r a ç õ e s , n o s e x p e r i m e n t o s r e a l i z a d o s com a m o s t r a s s é r i c a s de

m u l h e r e s g r á v i d a s ( F I G . 1 4 ) , foram c a p a z e s de d e s l o c a r m a i s de 5 0 % de

55

X

o

LU

O

3 0

<

ü 2 0 o.

(/) tu

o <

10 •

\

4 ^

I 10 100 1 0 0 0 In C O N C E N T R A Ç Ã O h G H ( n g / m L )

1 0 0 0 0

FIG. 1 3 - D E S L O C A M E N T O C O M P E T I T I V O DA L I G A Ç Ã O D E ' 2 5 i - h G H A O S M I C R O S S O M A S H E P Á T I C O S P O R h G H ( - — - ) , h P R L ( x — — X ) E H P L (A- -L) .

CMI3^Â0 NACIONAL DE EÍ^E>R(3IÁ NÜCLEÁR/SP - IPEN

40

3 10 D o s a g e m de h G H em a m o s t r a s s é r i c a s de m u l h e r e s g r á v i d a s

F o r a m r e a l i z a d a s c u r v a s d o s e - r e s p o s t a com d i l u i ç õ e s

s e r i a d a s de pool d e s o r o de p r i m e i r o e t e r c e i r o t r i m e s t r e s de g r a v i d e z

e q u a n t i d a d e s c r e s c e n t e s de G H - N I H e h P L - N I H ( F I G . 1 4 ) As c u r v a s de

d e s l o c a m e n t o o b t i d a s com os d o i s p o o l s s é r i c o s n ã o a p r e s e n t a r a m

i n c l i n a ç ã o p a r a l e l a à c u r v a de h G H - N I H e nem à c u r v a do h P L - N I H .

E n t r e t a n t o , a m b a s as c u r v a s de d e s l o c a m e n t o a p r e s e n t a r a m u m a i n c l i n a ç ã o

e s t a t i s t i c a m e n t e m a i s p r ó x i m a à da c u r v a do h P L - N I H n o

r a d i o r r e c e p t o r e n s a i o de f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a .

B / B o %

9 5

9 0

I-

5 0 -

1 0 •

0.1 10.0 1 / 1024

1.0 1 0 0 . 0 1 / 1 2 8

10.0 1000.0 1/16

1 0 0 0 . 0 hGH (ng/mL 1 1 0 0 0 0 . 0 hPL (ng/mL)

1/1 ( DILUIÇÃO DO SORO )

F I G . 1 4 - C U R V A S D E D E S L O C A M E N T O D O 1 2 5 I - hGH D O S M I C R O S S O M A S H E P Á T I C O S P O R h G H- N I H ( — • ) , hPL - NIH

[n—k),

|2

4 . D i s c u s s ã o E C O N C L U S S E S

à2

A. O I S C U S S S O E C O N C L U S Õ E S

A l i g a ç ã o de hGH a d i f e r e n t e s t e c i d o s em uma v a r i e d a d e de e s p é c i e s tem s i d o d e s c r i t a ( 8 , 5 6 , 6 7 , 7 7 ) , m a s p o u c o se s a b e s o b r e as c a r a c t e r í s t i c a s f u n d a m e n t a i s da l i g a ç ã o do f í g a d o de m u l h e r g r á v i d a em p a r t i c u l a r . Os e s t u d o s r e a l i z a d o s aqui d e s c r e v e m a l g u n s d o s d e t a l h e s b á s i c o s da l i g a ç ã o do hGH a m e m b r a n a m i c r o s s o m a l do f í g a d o de m u i h e r g r á v i d a .

R e c e n t e s p e s q u i s a s ( 8 , 1 7 , 4 3 , 4 5 , 6 3 , 6 7 ) têm

i d e n t i f i c a d o a v a r i a ç ã o da c a p a c i d a d e de l i g a ç ã o e s p e c í f i c a do

h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o em m i c r o s s o m a s h e p á t i c o s de a n i m a i s da m e s m a

e s p é c i e , m a s em d i f e r e n t e s e s t a d o s f i s i o l ó g i c o s . R a t a s a d u l t a s

a p r e s e n t a m m a i o r l i g a ç ã o que r a t o s a d u l t o s e r a t a s ou r a t o s em fase de

p r é - p u b e r d a d e ou h i p o f i s e c t o m i z a d o s . O u s o de m e m b r a n a m i c r o s s o m a l de

f í g a d o de r a t a s g r á v i d a s r e s u l t o u em um a u m e n t o da l i g a ç ã o de d u a s a

t r e s v e z e s a s s i m c o m o m a i o r e s n í v e i s d e l i g a ç ã o p u d e r a m s e r i n d u z i d o s

em a n i m a i s p r e v i a m e n t e t r a t a d o s com e s t r ó g e n o s ( 3 4 , 6 7 ) . A s s i m s e n d o ,

a l i g a ç ã o de ^ ^

m e m b r a n a m i c r o s s o m a l o b t i d a de f í g a d o de m u l h e r e s g r á v i d a s , d e s d e que

e s t u d o a n t e r i o r (17) m o s t r o u m a i o r c a p a c i d a d e de l i g a ç ã o d e s t e

h o r m ô n i o em r e c e p t o r e s d e m i c r o s s o m a h e p á t i c o de m u l h e r e s g r á v i d a s que

em n ã o - g r á v i d a s . C a d a uma d e s t a s s i t u a ç õ e s r e f l e t e os d i f e r e n t e s

e s t a d o s e s t r o g ê n i c o s s u g e r i n d o a p a r t i c i p a ç ã o d o s e s t r ó g e n o s na

i n d u ç ã o e m a n u t e n ç ã o d o s s í t i o s d e l i g a ç ã o em m i c r o s s o m a s h e p á t i c o s .

4 3

A l g u n s a u t o r e s têm e n f a t i z a d o , r e c e n t e m e n t e , a i m p o r t â n c i a do uso de s i s t e m a s h o m ó l o g o s p a r a p e s q u i s a s de l i g a ç ã o de r e c e p t o r e s p o r hGH (43, 5 5 , 7 8 , 7 7 ) . GH de p r i m a t a s d e s l o c a m o ^ ^

de s e u s s í t i o s l i g a n t e s no f í g a d o h u m a n o , m a s GH de n ã o - p r i m a t a s não s ã o c a p a z e s de d e s l o c a r . I s t o c o r r e l a c i o n a com a c o n h e c i d a i n c a p a c i d a d e de GH de n ã o - p r i m a t a s i n d u z i r c r e s c i m e n t o em h u m a n o s . A l t e r n a t i v a m e n t e , o u s o de um s i s t e m a h e t e r ó l o g o em que ^ ^ S x - h G H é u s a d o p a r a l i g a ç ã o a r e c e p t o r e s de f í g a d o de n ã o - p r i m a t a s t a m b é m t o r n a d i f í c i l a i n t e r p r e t a ç ã o do s i g n i f i c a d o b i o l ó g i c o d o s r e s u l t a d o s o b t i d o s . No p r e s e n t e e s t u d o , d e s c r e v e m o s , p o r t a n t o , a i n t e r a ç ã o do GH em um s i s t e m a h o m ó l o g o u s a n d o G H h u m a n o e f r a ç ã o m i c r o s s o m a l de f í g a d o de m u l h e r e s g r á v i d a s n o r m a i s .

A i n t e r a ç ã o d o h o r m ô n i o de c r e s c i m e n t o h u m a n o com r e c e p t o r e s h e p á t i c o s d e p e n d e d e v á r i o s p a r â m e t r o s i n c l u i n d o t e m p o de i n c u b a c ã o , t e m p e r a t u r a , c o n c e n t r a ç ã o da m e m b r a n a m i c r o s s o m a l e

t r a ç a d o r (85) S a b e - s e que a l i g a ç ã o de ^ 2 5

p r e s e n ç a de c á t i o n s d i v a l e n t e s ( 4 , 1 8 ) ; no n o s s o e x p e r i m e n t o Mg'*"^ foi a l g o m a i s e f e t i v o que Ca'^^^ s e n d o a d i c i o n a d o , p o r t a n t o , em t o d o s os e n s a i o s d e s c r i t o s n e s t e t r a b a l h o . A s p o l i a m i n a s e s p e r m i n a e e s p e r m i d i n a são c a p a z e s de p r o m o v e r a l i g a ç ã o de hGH a r e c e p t o r e s h e p á t i c o s , q u a n d o p r e s e n t e s na m i s t u r a de i n c u b a c ã o , em c o n c e n t r a ç õ e s

i n f e r i o r e s às d o s c á t i o n s d i v a l e n t e s Ca''"^ e Mg''"^ ( 1 9 ^ 8 1 ) . E n t r e t a n t o ,

o b s e r v a m o s no p r e s e n t e t r a b a l h o que o u s o de c á t i o n s d i v a l e n t e s

o f e r e c e v a n t a g e n s , p o i s sua c o n t r i b u i ç ã o em t e r m o s de c u s t o é

44

i r r i s ó r i a , a l é m de uma m a i o r f a c i l i d a d e de o b t e n ç ã o em um l a b o r a t ó r i o c l í n i c o ou e x p e r i m e n t a l .

A d i m i n u i ç ã o da l i g a ç ã o e s p e c í f i c a n a s c u r v a s de d e s l o c a m e n t o c o m p e t i t i v o de ^ ^ ^ I - h G H por hGH foi o b s e r v a d a na c u r v a i n c u b a d a com s o r o sem h G H em r e l a ç ã o a i n c u b a d a sem s o r o . A d i m i n u i ç ã o r e l a t i v a da l i g a ç ã o e s p e c í f i c a em p r e s e n ç a do s o r o sem hGH foi o b s e r v a d a t a m b é m com c o n c e n t r a ç õ e s d i f e r e n t e s de m i c r o s s o m a Ao c o m p a r a r m o s o s p a r â m e t r o s de l i g a ç ã o o b t i d o s d a s c u r v a s d o s e - r e s p o s t a e l a b o r a d a s sem s o r o e com s o r o sem h G H p e l o s s e u s r e s p e c t i v o s v a l o r e s de c o n s t a n t e de a f i n i d a d e e c o n c e n t r a ç ã o d o s r e c e p t o r e s , n o t a m o s que a a d i ç ã o de s o r o sem hGH ao e n s a i o levou a uma r e d u ç ã o de a p r o x i m a d a m e n t e 4 0 % d a s c o n s t a n t e s de a f i n i d a d e d o s d o i s s í t i o s l i g a n t e s , sem a l t e r a ç ã o s i g n i f i c a t i v a d a s c o n c e n t r a ç õ e s d o s r e s p e c t i v o s r e c e p t o r e s h e p á t i c o s . E s t e s d a d o s c o m p r o v a m a p r e s e n ç a de u m a s u b s t â n c i a e s t r a n h a no s o r o que p o d e i n t e r f e r i r na r e a ç ã o de c o m p e t i ç ã o com o ^^^l-hGH na l i g a ç ã o a o s r e c e p t o r e s h e p á t i c o s .

A s s i m s e n d o , a d i m i n u i ç ã o da l i g a ç ã o e s p e c í f i c a do ^ ^

m i c r o s s o m a s h e p á t i c o s de m u l h e r e s g r á v i d a s p o d e r i a a d v i r da p r e s e n ç a da p r o t e í n a c a r r e g a d o r a de hGH n o s o r o (5, 6, 3 8 , 3 9 , 5 3 , 8 7 ) que e s t a r i a c o m p e t i n d o p e l a l i g a ç ã o do h G H .

As a n á l i s e s d e S c a t c h a r d d o s r e c e p t o r e s h u m a n o s de hGH

em l i n f ó c i t o s (51) e f í g a d o h u m a n o (9) r e v e l a r a m a p e n a s um r e c e p t o r .

N o e s t u d o com r a d i o r r e c e p t o r em f í g a d o de m u l h e r e s g r á v i d a s ,

c o n s t a t o u - s e a e x i s t ê n c i a d e uma n o v a c l a s s e de r e c e p t o r e s p e c í f i c o

p a r a h G H , s u g e r i n d o a p r e s e n ç a de d o i s s í t i o s de l i g a ç ã o com

4 5