Êpen
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
" AVALIAÇÃO //V VIVO EIN VITRO DO DOTA-LANREOTIDEO RADIOMARCADO COM GÁLIO-67 "
ELIANE BERNARDES ALDEGHERI
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações.
Orientador:
Dr. João Alberto Osso Junior
São Paulo
2005
Eliane Bernardes Aldegheri /
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear - Aplicações
Exemplar revisado pelo autor
Dr. João Alberto Osso Junior
São Paulo
2005
Ao meu pal ("ín memoríam") Pelo caminho escolhido...
A minha mãe pelo amor e incentivo em todas as etapas da minha vida...
Ao meu marido
e ao meu filho
Pelo amor, carinho e paciência
<f Ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, IPEN/CNEN/SP, nas pessoas do Superintendente Dr Cláudio Rodrigues e Dr Edson Roman Diretor de Projetos Especiais.
ü À Dra Constância Pagano Gonçalves da Silva, Assessora técnica do
Superintendente, quando gerente do Centro de Radiofarmácia, pela oportunidade concedida.
a Ao Msc. Jair Mengatti, gerente do Centro de Radiofámacia, pela oportunidade e
facilidades concedidas.
ü À farmacêutica Neuza Taeko Okasaki Fukumori, chefe da Divisão de Controle da
Qualidade, pelas facilidades oferecidas.
ü À Dra Elaine Bortoleti de Araújo, gerente adjimta para Garantia da Qualidade,
amizade, sugestões e colaboração fornecida.
st Ao Dr João Alberto Osso Jr., Chefe da Produção, pela orientação, pela amizade,
apoio, sugestões, compreensão e confiança a mim depositada.
a A Dra Bluma L Faintuch pela orientação e sugestões no início desta tese.
a À Dra Emiko Muramoto, pela amizade, apoio, sugestões e colaboração fornecida.
o Aos funcionários Ana Lucia Vilela Pinheiro Lima e Luis Alberto L Dias, da Divisão de Produção, pelo auxílio técnico prestado e colaboração no transcorrer deste trabalho.
a Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo
auxílio financeiro.
ü A Dra Nilda P S de Pereira, quando chefe da Divisão da Garantia, pela amizade e
facilidades oferecidas.
o Aos amigos do laboratório: Akinkumi Aranji, Áurea B. Geraldo, Dulcila Maria
Lessa Bemardes, Edson Vieira Alves, Guilherme L. Carvalho, José Caldeiras, Josefina
Santos, Laura Ueda, Kátia Susi Silveira, Marycel B.Figols, MTereza Coulturato,
Patrícia A Martins, Renata Martinussi, Tatiana Lavinas, Wagner Nieto.
Yoshie Okamoto, pela colaboração prestada na realização das imagens cintilográficas deste estudo.
o À técnica Neide Ferreira Mascarenhas, do Biotério do Centro de Biologia Molecular, pela colaboração realizada com o fornecimento dos animais de laboratório utilizados.
a À técnica Miriam Fussae Suzuki, do Centro de Biologia Molecular, pela colaboração realizada com a preparação das cultviras de células.
a Aos meus familiares e todos aqueles que contribuíram de alguma maneira pelo
carinho e confiança em mim depositada, tomando possível este trabalho.
Eliane B e r n a r d e s A l d e g h e r i
R E S U M O
U m d o s refinamentos e m medicina nuclear, d a atual g e r a ç ã o , consiste na
c a p a c i d a d e d e prover i m a g e n s d i n â m i c a s e cinéticas d o r a d i o f á n u a c o administrado,
retratando fielmente o s e u m e c a n i s m o d e transporte, sítios d e a ç ã o , ligação a
receptores, e a rota d e excreção. C o m o contínuo a v a n ç o tecnológico, novos
radiofármacos t ê m sido desenvolvidos d e f o r m a a e x p r e s s a r maior especificidade e,
portanto, c o m m a i o r e s caracteres d e afinidade receptores/complexo. U m
radiofármaco é f o r m a d o por reagente o u biomolécula q u e t e m a g r e g a d o à sua
estrutura u m radionuclídeo, cujo objetivo é direcioná-lo aos ó r g ã o s d e afinidade o u a
u m p r o c e s s o t u m o r a l b e n i g n o ou maligno. A somatostatina inibe o c r e s c i m e n t o e a
proliferação d e várias células tumorais. A n á l o g o s d a somatostatina se ligam a o s
receptores s o m a t o s t á t i c o s q u e s e e x p r e s s a m e m distintos tipos d e neoplasias. O
D O T A - L A N R E O T I D E O ( D O T A L A N ) é um o c t a p e p t i d e o cíclico a n á l o g o da
somatostatina. O interesse e m m a r c a r o bioconjugado c o m gálio-67 e m medicina
nuclear v e m d a s propriedades físicas, q u í m i c a s e biológicas d o radionuclídeo. A l é m
das radiações g a m a (y), d e g r a n d e valia n o diagnóstico de f o c o s d e inflamação e
infecção, p o s s u i e m i s s ã o de elétrons Auger (0,1-8keV) e elétrons d e c o n v e r s ã o
(80-90keV), t o r n a n d o - o u m isótopo atrativo para radioterapia interna, se os vetores
usados para conduzir o radionuclídeo a t é a célula tumoral são internalizados. O
objetivo d e s t e trabalho foi desenvolver u m a metodologia d e m a r c a ç ã o d o peptídeo
original e purificada. A purificação d o ^''Ga foi essencial para alcançar rendimentos maiores q u e 9 0 % . Os peptídeos b i o c o n j u g a d o s r a d i o m a r c a d o s d e v e m estar livres d e c o n t a m i n a n t e s metálicos, q u e p o s s a m competir no p r o c e s s o da m a r c a ç ã o . O seguinte p r o c e d i m e n t o foi estabelecido a p ó s os parâmetros d e m a r c a ç ã o estudados:
m a s s a d o peptídeo d e lO^ig (6nmol), p H 5, v o l u m e final d a r e a ç ã o d e ITOfxL d o
m a r c a d o e u m a atividade de ^^Ga d e 2 2 2 M B q (6mCi). O D O T A L A N - ^ ' ' G a p r e s e r v a d o
à t e m p e r a t u r a a m b i e n t e m a n t e v e - s e inalterado durante 144horas (94,95 ± 0,63%) e
u m a b o a estabiliade no plasma h u m a n o durante 24 horas (96,75 ± 1,06%), sustentou
sua integridade. A distribuição biológica apresentou a p r e d o m i n â n c i a d a e x c r e ç ã o d o
r a d i o f á m a c o pelo sistema renal e baixo a c ú m u l o da radioatividade nos órgãos, e m
animais sadios. O longo t e m p o d e residência d o radiofármaco DOTALAN-^^Ga e m
tecidos d e animais d e e x p e r i m e n t a ç ã o , ricos e m receptores d e s o m a t o s t a t i n a , está
relacionado à internalização d o s ligantes e c o n s e q ü e n t e m e n t e e n t r a d a na célula
t u m o r a l H T - 2 9 .
Eliane Bernardes A l d e g h e r i
A B S T R A C T
O n e of t h e refinements of m o d e r n Nuclear Medicine is the capacity of providing
d y n a m i c and kinetics images of the administered radiopharmaceutical, reproducing its
transport m e c h a n i s m , action sites, receptor binding and excretion route. W i t h t h e
c o n t i n u e s technological a d v a n c e s n e w radiopharmaceuticals have been d e v e l o p e d in
order to express higher specificity and with higher characters of affinity b e t w e e n
receptor/complex. O n e radiopharmaceutical is f o r m e d by a reagent or biomolecule that
has in its structure a radioisotope, that has the objectives of carrying it to the organs of
affinity or to benign or malign t u m o r a l process. S o m a t o s t a t i n e inhibits t h e growing and
proliferation of several t u m o r a l cells. S o m a t o s t a t i n e a n a l o g s bind to somatostatic receptors
that are e x p r e s s e d in different kind of neoplasies D O T A - L A N R E O T I D E ( D O T A L A N ) is an
octapeptide analog to s o m a t o s t a t i n e . T h e interest of labeling t h e bioconjugate with
gallium-67 in Nuclear Medicine c o m e s f r o m its physical, chemical a n d biological
properties. Besides its g a m m a radiation, useful in t h e diagnosis of inflamation and
infection focci, ^^Ga emits A u g e r electrons (0.1 - 8 keV) a n d conversion electrons (80 - 90
keV), m a k i n g it attractive to internal radiotherapy if t h e vectors used to lead the
with national a n d imported ^^Ga, in its original a n d purified f o r m s . T h e purification of ®^Ga
w a s essential t o reach yields higher t h a n 9 0 % . T h e radiolabelled bioconjugate peptides
m u s t be free of metallic c o n t a m i n a n t s t h a t could c o m p e t e in t h e labeling process. T h e
following p r o c e d u r e w a s established after studying t h e labeling p a r a m e t e r s : m a s s o f
peptide of 10 ^ig (6nmol), p H 5 , final reaction v o l u m e of 1 7 0 ^ L of t h e labelled a n d ^^Ga
activity of 2 2 2 M B q (6mCi). D O T A L A N - ^ ^ G a w a s stable for 144 hours (94,95 ± 0.63%) at
r o o m t e m p e r a t u r e , and w h e n incubated in h u m a n plasm t h e stability lasted for 2 4 hours
(96.75 ± 1.06%). T h e biological distribution s h o w e d a predominant excretion of t h e
radiopharmaceutical by t h e kidney s y s t e m a n d a c c u m u l a t i o n in t h e o r g a n s in healthy
animals. T h e long residence t i m e of D O T A L A N - ^ ^ G a in the tissues of animals, rich in
somatostatine receptors, is related t o t h e internalisation of t h e ligands a n d s u b s e q u e n t l y
entrance in t h e t u m o r a l cell H T - 2 9 .
1 . 1 . A g e n t e s q u e l a n t e s b i f u n c i o n a i s para o ^^Ga 19
2. R E V I S Ã O D A L I T E R A T U R A 2 5
2 . 1 . G á l i o 2 5 2 . 1 . 1 . P r o p r i e d a d e s n u c l e a r e s e q u í m i c a s d o ^'^Ga 2 5
2.1.2. Histórico 2 7 3. O B J E T I V O S 3 0 4. M A T E R I A I S E M É T O D O S 3 1
4 . 1 . M A T E R I A I S 3 1 4 . 1 . 1 . R e a g e n t e s 3 1 4.1.2. E q u i p a m e n t o s 3 2
4.1.3. O u t r o s 3 3 4.1.4. A n i m a i s 33 4.2. M é t o d o s 3 4 4 . 3 . 1 . A m o s t r a s d e ^^Ga 3 4
4.3.2. P u r i f i c a ç ã o d o ^^Ga para E l i m i n a ç ã o d e M e t a i s ( Z n , 3 5 Fe, C u e Ni)
4 . 3 . 3 . P r e p a r a ç ã o d o a c e t a t o d e ^^Ga 36
4.4. A n á l i s e d o s m e t a i s 36 4.5. P r e p a r a ç ã o d o p e p t í d e o D O T A L A N 3 7
4.6. M a r c a ç ã o do D O T A L A N c o m ^^Ga 3 7 4.7. A n á l i s e d a pureza r a d i o q u í m i c a 3 7 4.8. O t i m i z a ç ã o d o s p a r â m e t r o s d e m a r c a ç ã o 38
a . V a r i a ç ã o da m a s s a e d a atividade d o produto m a r c a d o 38
b. V a r i a ç ã o d o pH d o a c e t a t o d e ^^Ga 3 9 c. V a r i a ç ã o d o v o l u m e d o DOTALAN-^^Ga 3 9
d. V a r i a ç ã o d a atividade d o ^^Ga 3 9 4.9.a Estabilidade d o DOTALAN-^^Ga in vitro 3 9
4.9.b.Estabilidade do m a r c a d o no p l a s m a s a n g u í n e o 39
4 . 1 1 . Biodistribuição d o DOTALAN-^^Ga e m c a m u n d o n g o s 4 1
Swiss s a d i o s e c a m u n d o n g o s Swiss i n o c u l a d o s c o mcélulas d e a d e n o c a r c i n o m a d e cólon-retal h u m a n o (HT-29)
4.13. E n s a i o d e P e r f u s ã o 4 3 4.14. E s t u d o s Cintilográficos 4 3 5. R E S U L T A D O S E D I S C U S S Ã O 4 6
5 . 1 . A n á l i s e d e m e t a i s 4 6 5.8.1 a.Biodistribuição d o DOTALAN-^^Ga e m 57
c a m u n d o n g o s Swiss s a d i o s
5.2. Identificação e p u r e z a r a d i o q u í m i c a 5 0
5.3. M a s s a d o b i o c o n j u g a d o 5 1 5.4. V a r i a ç ã o d o pH d o acetato d e ^^Ga 53
5.5. V a r i a ç ã o d o v o l u m e do DOTALAN-^^Ga 5 4
5.6. V a r i a ç ã o d a atividade do ^^Ga 5 4 5.7. E s t a b i l i d a d e d o DOTALAN-^^Ga 5 5 5 . 7 . 1 . Estabilidade d a m a r c a ç ã o no p l a s m a s a n g u í n e o 5 6
5.8. E s t u d o s in vivo 5 6 5.1.1 . M a r c a ç ã o d o D O T A L A N c o m ^^Ga a n t e s e a p ó s a 4 8
e x t r a ç ã o por s o l v e n t e s
c a m u n d o n g o s Nudes i n o c u l a d o s c o m c é l u l a s H T - 2 9
5.9. E s t u d o s d e p e r f u s ã o 6 6 5.10. Biodistribuição do DOTALAN-^^Ga através d e 6 6
i m a g e n s cintilográficas e m c a m u n d o n g o s Swiss c o m células H T - 2 9
5 . 1 1 . Biodistribuição d o DOTALAN-^^Ga por m e i o d e gg i m a g e n s cintilográficas e m c a m u n d o n g o s Swiss
i n o c u l a d o s c o m células H T - 2 9
5.12. Biodistribuição d o DOTALAN-^^Ga por m e i o d e 7 0 i m a g e n s cintilográficas e m c a m u n d o n g o s Nudes
i n o c u l a d o s c o m células A R 4 - 2 J
5.13. E n s a i o d e internalização in vitro d o DOTALAN-^^Ga j2 n a s c é l u l a s d e a d e n o c a r c i n o m a d e cólon-retal h u m a n o
(HT-29)
6. C O N C L U S Ã O 7 4
7. R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S 7 5
F I G U R A 2 - Síntese d o D O T A - L A N R E O T I D E O 23 F I G U R A 3- Extração por s o l v e n t e s para purificação d o ^^Ga 3 6
F I G U R A 4- P r e s e n ç a d e m e t a i s e m a m o s t r a s d o ^'^GaCb a n t e s e a p ó s a 4 6 purificação
F I G U R A 5 (a - d ) - C u r v a s d e calibração d o zinco, ferro, c o b r e e níquel 4 7 obtidas no espectrofotômetro d e a b s o r ç ã o a t ô m i c o (EAA)
F I G U R A 6- M a r c a ç ã o d o D O T A L A N c o m ^^Ga (antes d a purificação e a p ó s 4 9 a extração c o m solventes)
F I G U R A 7- C o l u n a d e f a s e reversa Cía (RP-Cie) e m u m s i s t e m a ¡socrático, 5 2 c o m u m fluxo d e 1 ,OmU m i n a c o p l a d o a u m detector d e radiação: a) C L A E
d o DOTALAN-^^Ga ( t e m p o d e retenção d o EDTA-^^Ga = 2,0min e do DOTALAN-^^Ga =3,9 min) e b) C L A E d o EDTA-^^Ga
F I G U R A 8- m a r c a ç ã o d o D O T A L A N ( m a s s a d e 20ng e 5 0 ^ g ) e m acetato de 53 gálio-67, c o m variação d o p H (3 e 5)
F I G U R A 9- V a r i a ç ã o d o v o l u m e (100 ,150, 170 e 290nL) d o D O T A L A N 5 4 ( m a s s a d o peptídeo d e lOjig) c o m ^^Ga
F I G U R A 10 -Variação a atividade d e m a r c a ç ã o d e 185, 2 5 9 e 5 9 2 M B q 5 5 (5, 7 e 1 6 m C i )
F I G U R A 1 1 - I m a g e n s obtidas e m u m a mini - c â m a r a g a m a portátil colimada 6 7 para gálio-67: a ) a n i m a l c o m células HT-29 na pata direita (com u m a
blindagem na região a b d o m i n a l ) ; b) animal c o m células H T - 2 9 no d o r s o ; e c) animal sadio (normal) c o m u m a b l i n d a g e m na região a b d o m i n a l .
F I G U R A 1 2 - I m a g e n s cintilográficas d e c a m u n d o n g o s Swiss inoculados 69 c o m células HT-29, na região a b d o m i n a l . Imagens a p ó s a a d m i n i s t r a ç ã o do
produto: a) 3 horas; b) 4 horas e c) 24 horas
F I G U R A 1 3 - I m a g e n s cintilográficas d e c a m u n d o n g o s Nude inoculados c o m 7 1 células A R 4 2 J , na região a b d o m i n a l . I m a g e n s após a a d m i n i s t r a ç ã o d o
produto: a) 4 horas e b) 2 4 horas
T A B E L A 2 - Distância d e migração relativa (Rf) d o D O T A L A N - 50
^^Ga, o b s e r v a d a nas diferentes c o n d i ç õ e s solventes
T A B E L A 3 - P u r e z a radioquímica d a m a r c a ç ã o d o D O T A L A N - ^ ^ G a , 5 1 realizada e m c o l u n a s d e f a s e reversa de Sep Pak Ci8, variando a
m a s s a d o p e p t í d e o {10 a 50fig)
T A B E L A 4 a - Biodistribuição d o D O T A L A N - ^ ^ G a , e m c a m u n d o n g o s 5 8 Swiss s a d i o s . % A T I V I D A D E / Ó R G Ã O S
T A B E L A 4 b - Biodistribuição do D O T A L A N - ^ ^ G a , e m c a m u n d o n g o s gg Swiss s a d i o s . % A T I V I D A D E / G R A M A
T A B E L A 5 a - Biodistribuição d o D O T A L A N - ^^Ga, e m 61 c a m u n d o n g o s S w i s s inoculados c o m células H T - 2 9 .
% A T I V I D A D E / Ó R G Ã O S
T A B E L A 5 b - Biodistribuição d o D O T A U \ N - ^^Ga, e m c a m u n d o n g o s S w i s s inoculados c o m células H T - 2 9 .
% A T I V I D A D E / G R A M A
T A B E L A 6 a - Biodistribuição d o D O T A L A N -^^Ga, e m 63 c a m u n d o n g o s NUDE c o m células H T - 2 9 . % A T I V I D A D E / Ó r g ã o
T A B E L A 6 b - Biodistribuição d o D O T A L A N -^^Ga, e m NUDE 6 4 inoculados c o m células H T - 2 9 . % A T I V I D A D E / G r a m a
T A B E L A 7- Biodistribuição do D O T A L A N - ^ ^ G a e m c a m u n d o n g o s , 70 visto s o b o prisma d a s imagens cintilográficas
T A B E L A 8- % d e D O T A L A N - ^ ^ G a ligada e internalizada à s ^2
células d e a d e n o c a r c i n o m a d e colon h u m a n o (HT-29)
1 . I N T R O D U Ç Ã O
U m d o s r e f i n a m e n t o s e m m e d i c i n a nuclear, d a atual g e r a ç ã o , consiste na c a p a c i d a d e d e prover i m a g e n s d i n â m i c a s e cinéticas d o r a d i o f á r m a c o a d m i n i s t r a d o , retratando f i e l m e n t e o s e u m e c a n i s m o d e transporte, sítios d e a ç ã o , ligação a receptores, e a rota d e e x c r e ç ã o .
U m r a d i o f á r m a c o é f o r m a d o por c o m p l e x o d e r e a g e n t e o u biomolécula q u e t e m a g r e g a d o a s u a estrutura um radionuclídeo, cujo objetivo é direcioná-lo a ó r g ã o s d e afinidade ou a u m p r o c e s s o t u m o r a l b e n i g n o o u maligno.
O s r a d i o f á r m a c o s c o m finalidades diagnósticas, utilizados na o b t e n ç ã o d e i m a g e n s , c o m auxílio d e t o m o g r a f i a c o m p u t a d o r i z a d a por e m i s s ã o d e fóton único - S P E C T {Single Plioton Emission Computed Tomograph"), d e v e m ser, p r e f e r e n c i a l m e n t e e m i s s o r e s d e radiação g a m a , d e e n e r g i a entre 100-300 k e V e c o m t e m p o d e meia vida (T1/2) relativamente curto (horas a p o u c o s dias). S ã o e x e m p l o s d e radioisótopos utilizados e m r a d i o f á r m a c o s para diagnóstico o T e c n é c i o - 9 9 m (^^"'Tc), l o d o - 1 2 3 (^^^1), Gálio-67 (^^Ga), Tálio-201 (^°^TI), índio-111 (^^^In), entre outros \
J á os r a d i o f á r m a c o s d e s t i n a d o s à terapia d e t u m o r e s m a l i g n o s , d e v e m
possuir radiação p' a s s o c i a d o a u m a e n e r g i a relativamente alta e c o m t e m p o d e
meia vida (T1/2) maior, utilizando-se radionuclídeos tais c o m o : l o d o - 1 3 1 (^^^1),
S a m á r i o - 1 5 3 (^^^Sm), R ê n i o - 1 6 6 (^^^Re), entre outros ^. O ^^Ga t a m b é m p o d e
ser aplicado à terapia d e t u m o r e s a p r e s e n t a n d o e m i s s ã o d e elétrons A u g e r (0,1-8
k e V ) e elétrons de conversão ( 8 0 - 9 0 k e V ) d e baixa e n e r g i a .
18 C^F), C a r b o n o - 1 1 (11C), Nitrogênio-13 (^^N), O x i g ê n i o - 1 5 (^^O), Gálio-68 (^^Ga), entre outros, p r o m o v e m i m a g e n s por meio d e t o m o g r a f i a d e e m i s s ã o d e pósitrons - P E T {Pósitrons Emission Tomograptiy) ^.
E m 1975, Kohler e Milstein^ d e s e n v o l v e r a m a técnica d o h i b r i d o m a (fusão celular) para a p r o d u ç ã o d e anticorpos m o n o c l o n a i s c o m u m alto g r a u d e pureza, e s p e c i f i c i d a d e a l é m d e m a i s reativos. C o m o p r o v ê m d e u m único c o n g l o m e r a d o celular, s ã o q u i m i c a m e n t e h o m o g ê n e o s e d e a p r o x i m a d a m e n t e 150000 daltons (ou 1 5 0 0 0 0 u.m.a). Por a ç ã o enzimática p o d e m ser f r a g m e n t a d o s e m unidades m e n o r e s , p o r é m , p r e s e r v a n d o a sua p r o p r i e d a d e biológica ativa.
O s r a d i o f á r m a c o s p r e p a r a d o s a partir d e anticorpos m o n o c l o n a i s surgiram, c o m o s u c e s s o d o a d v e n t o d o r a d i o i m u n o e n s a i o , no qual u m d o s c o m p o n e n t e s , a n t í g e n o o u anticorpo m a r c a d o serve c o m o radiotraçador.
N a M e d i c i n a Nuclear diagnóstica, e s s a s b i o m o l é c u l a s m a r c a d a s c o m r a d i o e l e m e n t o s c o m p a t í v e i s c o m a sua estrutura, f o r n e c e m subsídios i m p o r t a n t e s nas investigações d e d i v e r s a s d o e n ç a s e na terapia por irradiação.
E m vista d a s u a especificidade e d i v e r s i d a d e , e s s e s r a d i o f á r m a c o s d e m o n s t r a r a m ser a g e n t e s p r o m i s s o r e s p a r a u m a v a r i e d a d e de d e s o r d e n s s e j a m elas, b e n i g n a s ou m a l i g n a s s e n d o a imunocintilografia classificada c o m o provável i n s t r u m e n t o d e diagnóstico na oncologia clínica.
E m 1993, a F D A {Food and Drug Administration - USA) a p r o v o u o
primeiro anticorpo m o n o c l o n a l m u r i n o (rato) para diagnóstico d o c â n c e r
reincidente d e ovário e coloretal (OncoScint, 1992). S u b s e q ü e n t e m e n t e , m a i s três
produtos f o r a m liberados e utilizados para diagnósticos. Entretanto, a n o s d e
pesquisa t ê m d e m o n s t r a d o a ocorrência d e efeitos a d v e r s o s à s a ú d e pelo uso
sucessivo d e s s e s r a d i o f á r m a c o s , c o m o r e a ç õ e s d e c o r r e n t e s da i m u n o g e n i c i d a d e .
A l é m de a p r e s e n t a r lenta d e p u r a ç ã o s a n g ü í n e a , o q u e requer a o s p a c i e n t e s
e s p e r a e m dias para a o b t e n ç ã o d a s i m a g e n s cintilográficas ^' ^.
d e p e p t í d e o s r a d i o m a r c a d o s ; entretanto, o interesse para o e m p r e g o diagnóstico e terapia foi s o m e n t e há u m a d é c a d a atrás ^ ''.
O t e r m o p e p t í d e o é c o n v e n c i o n a l m e n t e u s a d o para s e referir a moléculas c o m m e n o s d e 50 a m i n o á c i d o s , o u cerca d e 5 5 0 0 daltons e m p e s o molecular, e n q u a n t o q u e as proteínas s ã o constituídas por m a i s d e 100 a m i n o á c i d o s ^' ^. O s peptídeos p e q u e n o s se referem a m e n o s d e 30 a m i n o á c i d o s ou cerca d e 3 5 0 0 daltons e m p e s o molecular ^.
E s s e s p e q u e n o s p e p t í d e o s p o d e m ser classificados c o m o s e n d o altamente lipofílicos ou hidrofílicos e o efeito f a r m a c o c i n é t i c o d e v e c o r r e s p o n d e r a sua característica física.
O s f r a g m e n t o s d e p e p t í d e o s e de anticorpos a p r e s e n t a m certas v a n t a g e n s e m c o m p a r a ç ã o a f o r m a íntegra, tais c o m o , d e p u r a ç ã o s a n g ü í n e a m a i s rápida p e r m i t i n d o melhor definição e m relação a o órgão d e interesse^. Os peptídeos solicitam técnicas m e n o s sofisticadas d e preparo e u m custo mais acessível q u a n d o e q u i p a r a d o aos anticorpos
R e c e n t e m e n t e , o p e p t í d e o t e m sido identificado pela alta a f i n i d a d e às células t u m o r a i s q u e e x p r e s s a m nas s u a s m e m b r a n a s p l a s m á t i c a s u m a g r a n d e q u a n t i d a d e d e receptores d e proteínas. E m adição, há m a i s d e 8 5 0 p e p t í d e o s e n d ó g e n o s b e m caracterizados , d o s quais u m peptídeo efetivo o u s e u a n á l o g o p o d e ser e s c o l h i d o para u m a futura aplicação^^. O s u c e s s o d e p e n d e r á d a relação d e c a p t a ç ã o t u m o r / n ã o tumor, d a d e p u r a ç ã o , da biodistribuição, a s s i m c o m o d a radiotoxicidade relacionada c o m os a g e n t e s terapêuticos.
Para e s t u d o s d e receptores, a relação q u e l a n t e / m e t a l , Luy e K a t z e n e l l e n b o g e m (2002)^^ d e s e n v o l v e r a m m é t o d o s para m a r c a r ç ã o de biomoléculas (peptídeos e proteínas) c o m metais, cujos perfis d o s isótopos o b e d e c e m às s e g u i n t e s características: a) ligação c o m alta e s t a b i l i d a d e cinética;
b) ter sítio d e q u e l a ç ã o identificável por e s p e c t r o s c o p i a ; e c) possuir p r o p r i e d a d e
bifuncional q u e permita o s e u a c o p l a m e n t o a u m a v a r i e d a d e d e b i o m o l é c u l a s .
Muitos p e p t í d e o s e n d ó g e n o s t ê m u m a m e i a vida biológica muito curta, inviabilizando o s e u e m p r e g o c o m o r a d i o f á r m a c o s t e r a p ê u t i c o s e diagnósticos.
Isto é u s u a l m e n t e d e v i d o à rápida proteólise na circulação, o qual t e m u m c a m i n h o para ajustar a influência in vivo destes a g e n t e s , por e x e m p l o a somatostatina^'* •
A s o m a t o s t a t i n a natural foi d e s c o b e r t a no final d a d é c a d a d e 1960. É u m peptídeo cíclico c o m 14 a m i n o á c i d o s q u e a g e c o m o n e u r o t r a n s m i s s o r o u c o m o h o r m ô n i o d e p e n d e n d o d o sítio d e a ç ã o e do tipo d e célula alvo. P o s s u i u m p a p e l regulatóho no trato gastrointestinal e sistema pancreático. Inibe a s e c r e ç ã o glandular, a contratilidade d o m ú s c u l o liso e a f u n ç ã o d e células i m u n e s ativadas.
A s o m a t o s t a t i n a inibe o c r e s c i m e n t o e a proliferação d e várias células t u m o r a i s . P e l a razão d a s células t u m o r a i s e x p r e s s a r e m u m g r a n d e n ú m e r o d e receptores s o m a t o s t á t i c o s t o r n o u - s e u m instrumento básico para o uso d o b i o c o n j u g a d o r a d i o m a r c a d o na localização in vivo d e t u m o r e s e n d ó c r i n o s
A s o m a t o s t a t i n a natural é susceptível a d e g r a d a ç ã o e n z i m á t i c a rápida (a m e i a vida biológica no s a n g u e é 2 a 4 minutos), por isto, inapropriada para aplicação in vivo. F o r a m d e s e n v o l v i d o s a n á l o g o s sintéticos d a s o m a t o s t a t i n a estáveis: octreotideo [(D)Phe-Cys-Phe-(D)Trp-Lys-Thr-Cys-Thr(ol)]; v a p r e o t i d e o - ^ [(D)Phe-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-Trp
-NH2], lanreotideo - > (D)pNal-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 e outros ^ \
O s a n á l o g o s d a s o m a t o s t a t i n a se ligam a o s receptores s o m a t o s t á t i c o s
q u e s e e x p r e s s a m e m distintos tipos d e neoplasias. A p ó s e s t a e t a p a u m a f r a ç ã o
d e s t e s c o m p l e x o s se internaliza. O s receptores d e s o m a t o s t a t i n a h u m a n o s s ã o
e x p r e s s o s e m 5 subtipos ( S S T i , SST2, SST3, SST4 e
S S T 5 ) ,p a r c i a l m e n t e
caracterizados A recente c l o n a g e m de vários g e n e s receptores d e
s o m a t o s t a t i n a t e m a m p l i a d o o c o n h e c i m e n t o d a estrutura e a f u n ç ã o d e s t e s
receptores
t u m o r e s n e u r o e n d ó c r i n o s e e m n e u r o b l a s t o m a s , c a r c i n o m a m e d u l a r d e tireóide, próstata, f e o c r o m o c i t o m a s e p e q u e n a s células d e p u l m ã o , peptídeos intestinais entre vários o u t r o s , c o m o a d e n o c a r c i n o m a s , linfomas, a s t r o c i t o m a s , glioblastos e m e n i n g i o m a s T u m o r e s d e m a m a e x p r e s s a m receptores d e calcitonina ^ \
O ^^^In-DTPA-Octreotideo c o n h e c i d o c o m e r c i a l m e n t e c o m o
O c t r e o S c a n ® , e lanreotideo s a o o c t a p e p t í d e o s cíclicos a n á l o g o s da somatostatina. N o octreotideo a substituição d a fenilalanina na posição 3 (Phe^) pela posição tirosina (Tyr) p e r m i t e m a u m e n t o na hidrofilicidade, c o n h e c i d o na f o r m a abreviada d e T O O [(Tyr) octreotideo D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Cys-Thr(ol)]
22
O O c t r e o S c a n ® foi o primeiro peptídeo u s a d o para i m a g e n s d e pacientes c o m t u m o r e s q u e a p r e s e n t a m receptores d e s o m a t o s t a t i n a ( S S T R ) , a p ó s s e r e m r a d i o m a r c a d o s c o m o ^^^In
P e q u e n a s m o d i f i c a ç õ e s estruturais d o s a n á l o g o s d a s o m a t o s t a t i n a , incluindo a i n t r o d u ç ã o d e u m metal na estrutura q u e l a n t e , p o d e m afetar as propriedades d e ligação d o s a n á l o g o s a o s vários s u b t i p o s S S T d e receptores.
1.1. A g e n t e s q u e l a n t e s b i f u n c i o n a i s para o ^^Ga
Muitas b i o m o l é c u l a s n ã o p o d e m se ligar d i r e t a m e n t e a o s radioisótopos, s e n d o necessária a utilização d e a g e n t e s quelantes q u e sirvam d e ligação entre a molécula e o radioisótopo. P r i m e i r a m e n t e , eles s ã o c o n j u g a d o s c o m a m o l é c u l a , e a m b o s d e v e m estar protegidos para q u e a c o n j u g a ç ã o ocorra no local a d e q u a d o da molécula e q u e , outros sítios e s t e j a m disponíveis para a ligação c o m o radioisótopo.
O s três sítios principais são os g r u p o s a m i n o d a lisina, tiol d a cisteína e
a carboxila d a c a d e i a lateral. A p ó s a c o n j u g a ç ã o é n e c e s s á r i o passar por u m a
e t a p a d e purificação para r e m o v e r o q u e l a n t e livre a n t e s d a a d i ç ã o d o
radioisótopo '«^a.so
A l g u n s radioisótopos c o m o ^ " i n , ^°Y, ^^Ga s ó c o n s e g u e m c o m p l e x a r c o m as p r o t e í n a s por m e i o d e a g e n t e s bifuncionais
V á r i o s quelantes para o ^''Ga t ê m sido d e s e n v o l v i d o s . S u a s p r o p r i e d a d e s biológicas d e p e n d e m d a estrutura, c a r g a e lipofilicidade d o s c o m p l e x o s f o r m a d o s . Q u e l a n t e s bifuncionais d o gálio t ê m tido uso limitado na m a r c a ç ã o d e anticorpos^'^.
O primeiro a g e n t e bifuncional foi o á c i d o poliaminocarboxílico introduzido por S u n d b e r g e M e a r e s O s ácidos poliaminocarboxílicos s ã o ácido dietilenotriamino pentacético ( D T P A ) e o á c i d o etilenodiamino tetracético ( E D T A ) . Estes c o m p o s t o s d e ácidos policarboxílicos t e m sido muito u s a d o s e m radiofarmácia e f o r m a m q u e l a n t e s estáveis c o m ^^^In e outros m e t a i s trivalentes c o m o ^^Ga e ^^Y.
P o r é m , e m a l g u n s e s t u d o s realizados por H n a t o w i c h c o m e anticorpos m o n o c l o n a i s c o n j u g a d o s c o m D T P A pelo m é t o d o d a anidrina, a q u e l a ç ã o resultou e m toxicidade h e m a t o p o i é t i c a in vivo e o ^°Y se desligou d o c o m p l e x o e foi absorvido pelo e s q u e l e t o .
O u t r o s a g e n t e s q u e l a n t e s s u r g i r a m no final d a d é c a d a d e 90 q u e s ã o o s c o m p o s t o s macrocíclicos c o n h e c i d o s c o m o N O T A , D O T A e TETA^°' ^ \
O c o m p o s t o macrocíclico D O T A ( á c i d o l ,4,7,10- t e t r a a z a c i c l o d o d e c a n o -
1,4,7,10-tetracético) é um a g e n t e q u e l a n t e bifuncional, utilizado c o m o intermediário n a ligação d e m o l é c u l a s , c o m o radioisótopos e m i s s o r e s d e fótons, e x e m p l o , ^^^In e ^'^Ga, radioisótopos e m i s s o r e s d e pósitrons, e x e m p l o s : ^^Ga, ^®Y e ^'^Cu o u o ^°Y e m i s s o r d e partícula beta
O D O T A t e m sido c o n j u g a d o c o m vários peptídeos^^: Phe^-octreotideo
( D O T A O G ) , Phe^-Tyr^-octreotideo ( D O T A T O C ) , ( D ) p N a P - l a n r e o t i d e o ( D O T A L A N ) ,
(D) Phe^-vapreotideo ( D O T A V A P ) , c o m o a p r e s e n t a d o na FIG 1.
" 1 1
T n s - ^ j — C p « f « 0 0 « C C O D M
DOTA^-flD)Pt39'''Oc:tracvtlf29 í D O T A O c J
{ L - J ^ j T n n ^ e — í i * T r j - ;.pa N Q O C <CX>04<i
DOTA*-(D)Pltie''-Tyir*-octreotití« <DOTATOC)
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H J - n i — Cp B V » L^m
D O T A ° - ( 0 ) K f l a l ^ - o c t r a o t f d a f D O T A L a n )
c : " I I
^ 1^ I >j • " • ' j T wp C > • Vb õ t-Y •
DOTA '>-p>Phe'-vap<re<)rtl <le (DOTAVap)
M O O M > — O M f í W l í W - - C p * — T > » — * . r *
F I G U R A 1 - estrutura d o s a n á l o g o s d a s o m a t o t a t i n a
c o n j u g a d o s c o m o a g e n t e quelante bifuncional D O T A
O lanreotideo é u m o c t a p e p t i d e o cíclico a n á l o g o d a s o m a t o s t a t i n a , q u e se liga a o s receptores s o m a t o s t á t i c o s c o m alta afinidade. O D O T A c o n j u g a d o a o lanreotideo ( D O T A - L A N R E O T I D E O ) n ã o interfere c o m a ligação a o receptor, assim a afinidade d e ligação a o s receptores d e s o m a t o s t a t i n a p e r m a n e c e ^. O D O T A L A N r e c o n h e c e o s receptores s o m a t o s t á t i c o s e s e liga a u m a v a r i e d a d e d e t u m o r e s h u m a n o s in vitro
O D O T A L A N liga-se a t o d o s os receptores d e s o m a t o s t a t i n a (hsst):
alta a f i n i d a d e a o s r e c e p t o r e s d o subtipo 2, 3, 4 e 5 (hsst2.5) e baixa afinidade a o s u b t i p o l (hssti) ligando-se a u m a m p l o range d e células tumorais.
O b i o c o n j u g a d o a p r e s e n t a longo t e m p o d e residência biológica, permitindo s u a internalização nas células q u e e x p r e s s a m receptores d e somatostatina. O p e p t í d e o a p r e s e n t a u m c l a r e a m e n t o s a n g u í n e o rápido, baixa retenção renal e a u m e n t o n o f í g a d o q u a n d o c o m p a r a d o a outros ligantes octapetídeos, c o m o o 1 1 1 l n - D T P A - D - P h e 1 - 0 C T , refletindo a natureza mais lipofílica d o D O T A L A N .
O D O T A L A N c o n h e c i d o c o m o M A U R I T I U S (Multicenter A n a l y s i s of Universal Receptor a n d i m a g i n g a n d T r e a t m e n t Initiative: a E u r o p e a n Study) é u m ligante receptor d e somatostatina. S u a f ó r m u l a molecular é descrita c o m o CyoHgsNíõOirSae s e u p e s o é d e 1 4 8 2 , 7 3 g .
O D O T A L A N foi sintetizado e m três e t a p a s , s e g u n d o S m i t h - J o n e s e col, 1999 2 ^ :
1. P r o t e ç ã o d o g r u p o a m i n o- s d o Lanreotideo c o m o uso d o reagente (B0C2O) para produzir o s - B o c Lanreotide;
2. C o n j u g a ç ã o d o D O T A e e-Boc Lanreotideo, u s a n d o c a r v ã o ativado c o m d e x t r a n / soro h u m a n o ( D C C / N H S ) ;
3. D e s p r o t e ç ã o d o B o c c o m o ácido trifluoracético (TFA) para f o r m a r o peptídeo
c o n j u g a d o D O T A L A N .
H-{D)pNd-Cy5-Tyr-(D)Trp -Thr-Cbí^Val-Lys
H.(D)pNal-C>Tyr-(D)Tip
NHj -'nir-Cys.Val-U's(Bot>
2>iK:c/Nns
^. '(D)pNal-YT>T^)'
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F I G U R A 2 - Síntese d o D O T A L A N R E O T I D E O
IVloíéculas b a s e a d a s e m leves modificações d o octreotideo, tais c o m o a
substituição d e T h r (ol) p o r a p e n a s T h r d e r a m origem a o octreotate, q u e t e m sido
e s t u d a d o c o n j u g a d o t a n t o a o a g e n t e bifuncional D T P A c o m o a o D O T A para
m a r c a ç ã o c o m e ^''Ga, m o s t r a n d o - s e mais efetivo na visualização d e t u m o r e s
d o q u e o OctreoScan^^.
u m a alternativa a o Octreoscan^^. O D O T A T O C m o d i f i c a d o c o m o a g e n t e q u e l a n t e foi c o m p l e x a d o c o m o s radiometais ^^Ga^", ^^^In^* e ^"Y^"^ c o m alta atividade específica. Estes três r a d i o p e p t í d e o s a p r e s e n t a r a m alta e s t a b i l i d a d e no s o r o h u m a n o , e alta a f i n i d a d e a o s receptores d e s o m a t o s t a t i n a
O D O T A T O C r a d i o m a r c a d o c o m o ^^Ga a p r e s e n t o u m a i o r c a p t a ç ã o n o t u m o r e baixa c a p t a ç ã o n o s rins e m m o d e l o s a n i m a i s , q u a n d o c o m p a r a d o s c o m o u t r o s b i o c o n j u g a d o s r a d i o m a r c a d o s , a s s i m c o m o ^^^In-DTPA-Octreotide,
^ " I n - D O T A T O C e ^ ° Y - D O T A T O C 2 6 2 7 , 3 9
A e s c o l h a d o D O T A L A N para m a r c a ç ã o c o m ^''Ga a p a r e n t o u ser u m a proposição interessante p a r a suprir a s deficiências citadas e m razão d a s p r o p r i e d a d e s físicas, q u í m i c a s e biológicas. A l é m d a s radiações g a m a (y), d e g r a n d e valia no d i a g n ó s t i c o d e f o c o s d e i n f l a m a ç ã o e infecção, p o s s u i e m i s s ã o d e elétrons Auger (0,1-8 k e V ) e elétrons d e c o n v e r s ã o ( 8 0 - 9 0 k e V ) , t o r n a n d o - o u m isótopo atrativo para radioterapia interna, s e os v e t o r e s u s a d o s para c o n d u z i r o radionuclídeo a t é a célula t u m o r a l s ã o internalizados .
O objetivo d e s t e trabalho foi d e s e n v o l v e r u m a m e t o d o l o g i a d e m a r c a ç ã o d o p e p t í d e o D O T A L A N c o m ^^Ga, o t i m i z a n d o o s p a r â m e t r o s d e m a r c a ç ã o e d e t e r m i n a n d o a m e t o d o l o g i a d o controle d e q u a l i d a d e .
2. R E V I S Ã O DA L I T E R A T U R A 2 . 1 . G Á L I O
2 . 1 . 1 . P R O P R I E D A D E S N U C L E A R E S E Q U Í M I C A S
O gálio é u m metal d o g r u p o IIIA d a tabela periódica e a p r e s e n t a três elétrons na última c a m a d a . O gálio e l e m e n t a r é u m sólido c o m p o n t o d e f u s ã o baixo (30°C)*°. E m m e i o a q u o s o , p o d e existir nos diferentes e s t a d o s d e o x i d a ç ã o c o m o + 1 , +2 e + 3 , s e n d o e s t e último o m a i s estável. E m p H neutro, s e u s sais mais c o m u n s s ã o insolúveis e se e s t i v e r e m na f o r m a iónica (Ga""^) q u a n d o a d i c i o n a d o s à á g u a , hidrolisam-se f a c i l m e n t e . Para q u e s e j a m estabilizados, s ã o c o m p l e x a d o s a ligantes c o m o citrato.
A m e i a vida física d o ®^Ga é 3,26 dias e radiação g a m a s e g u i d a d e reações d e c a p t u r a eletrônica t o r n a n d o - s e favorável c o m o traçador. O e s t a d o d e o x i d a ç ã o é G a (III), a química d e c o o r d e n a ç ã o s e m e l h a n t e a o Fe (III), alta c a r g a e p e q u e n o raio iónico (0,62A), classificando-o c o m o ácido forte de Lewis '*^' '*^' portanto, c o m p r e d o m i n a n c i a s pelas b a s e s fortes, tais c o m o , oxigênio e nitrogênio para c o o r d e n a ç ã o . E m s o l u ç ã o a q u o s a , o íon G a (III) hidratado é e s t á v e l s o m e n t e e m c o n d i ç õ e s ácidas. O ^^Ga livre d e c a r r e g a d o r p o d e existir e m s o l u ç ã o e m p H fisiológico s e m precipitação d e G a ( 0 H
) 3 .E x i s t e m três radionuclídeos d e gálio c o m características d e
d e c a i m e n t o a d e q u a d o s para o b t e n ç ã o d e i m a g e n s cintilográficas: e m i s s o r e s
g a m a e d e pósitrons, a p r o p r i a d o s para radiodiagnóstico e para t e r a p i a m e d i a d a
por receptores.
O ^^Ga é u m e m i s s o r d e pósitrons c o m meia vida d e 67,6 m i n u t o s ( d e c a i m e n t o 8 9 % p*) q u e p o d e ser obtido d o g e r a d o r d e g e r m â n i o - 6 8 (^^Ge) ou d i r e t a m e n t e por ciclotrón
O ^^Ga é t a m b é m u m e m i s s o r d e pósitrons d e m e i a vida d e 9,5 horas, j á foi utilizado na rotina m é d i c a , e m f u n ç ã o da s u a meia vida intermediária. É
p r o c e s s a d o no ciclotrón e e m i t e positrón c o m u m a a b u n d â n c i a d e 5 6 % e energia d e 1,7 M e V ^ ^ ' ^ ^
O ^''Ga é o p r o d u t o d a reação ^®Zn (p, 2n), d e s e n v o l v i d o e m ciclotrón, e e s t á disponível c o m e r c i a l m e n t e na f o r m a d e cloreto o u d e citrato. T e m u m a meia vida d e 7 8 , 3 horas e d e c a i por captura eletrônica e m i t i n d o três raios g a m a principais d e 9 3 k e V ( 3 8 % ) , 1 8 5 k e V (24%) e 3 0 0 k e V (16%) e t e n d o c o m o produto final d e d e c a i m e n t o o ^''Zn. É u s a d o e m cintilografia planar e t o m o g r a f i a por e m i s s ã o d e fóton único ( S P E C T ) '*^.
Na f o r m a d e citrato d e ^^Ga, é um i m p o r t a n t e r a d i o f á r m a c o e m m e d i c i n a nuclear para a d e t e c ç ã o e localização d e t u m o r e s e p r o c e s s o s inflamatorios Q u a n d o a d m i n i s t r a d o i n t r a v e n o s a m e n t e liga-se a transferrina d o s a n g u e e s u b s e q ü e n t e m e n t e é t r a n s p o r t a d o para o t e c i d o t u m o r a l o u f o c o s inflamatorios, e m razão d o a u m e n t o da p e r m e a b i l i d a d e vascular"*^'
A c r e d i t a - s e q u e o isótopo d o G a a p r e s e n t a u m t r a n s p o r t e m e d i a d o por
transferrina, lactoferrina (LF), ferritina e proteínas sideróforas e o m e c a n i s m o
envolvido seja, p r o v a v e l m e n t e o d e deslocar a transferrina. Esta proteína está
p r e s e n t e nos g r a n u l o s s e c u n d á r i o s d o s leucocitos p o l i m o r f o n u c l e a d o s e é e x p u l s a
q u a n d o ocorre u m a t a q u e b a c t e r i a n o . A lactoferrina p r e s e n t e no f o c o p o d e se ligar
a receptores LF nos m o n ó c i t o s o u m a c r ó f a g o s e seguir a t é a ferritina intracelular,
a qual t e m g r a n d e afinidade pelo G a . O s m i c r o r g a n i s m o s p a t o g ê n i c o s p r e s e n t e s
n u m a b s c e s s o purulento são p r o v a v e l m e n t e o fator m a i s importante para o
a c ú m u l o d o G a , d e v i d o a s u a a v i d e z pelo metal. A c r e d i t a - s e q u e as proteínas
sideróforas e s t e j a m e n v o l v i d a s nesta c a p t u r a , u m a v e z q u e s ã o sintetizadas e s e c r e t a d a s por bactérias q u e s e q ü e s t r a m o ferro (Fe""^). A s proteínas sideróforas s ã o m o l é c u l a s p e q u e n a s ( 5 0 0 - 1 0 0 0 Da) q u e a p r e s e n t a m e x t r e m a afinidade pelo íon Fe""^, c o n s e q ü e n t e m e n t e pelo ^^Ga. E m f u n ç ã o d a similaridade, o gálio é c a p t u r a d o para o interior d o s m i c r o r g a n i s m o s por m e i o d e u m m e c a n i s m o d e saturação e energía dependente"*^.
S a b e - s e q u e a q u í m i c a d o gálio é s e m e l h a n t e a d o Fe (III), s e n d o q u e a maior d i f e r e n ç a entre o G a e o F e (III) é a inabilidade d a r e d u ç ã o d o gálio "in
vivo", e n q u a n t o o Fe (III) p o d e f a c i l m e n t e ser r e d u z i d o e interagir. O gálio ficaligado às proteínas, q u e t r a n s p o r t a m o ferro (Fe III). Esta diferença explica e m g r a n d e parte p o r q u e a despeito d e o u t r a s s e m e l h a n ç a s físicas o c o m p o r t a m e n t o biológico d o gálio e d o Fe (III) diferem
No e s q u e m a da distribuição biológica, o citrato d e ^^Ga, e m c o n d i ç ã o fisiológica, m o s t r a afinidade pelo s i s t e m a hepato-intestinal e estrutura ó s s e a e s e n d o e x c r e t a d o p a r c i a l m e n t e , pelas vías renais e trato-gastrointestinal nas primeiras 2 4 horas a p ó s a injeção d a d o s e . Esse m e c a n i s m o cinético d o t r a ç a d o r c o m p r o m e t e a sua especificidade, a p e s a r d a s u a c o n c e n t r a ç ã o e m f o c o s infecciosos, inflamatorios e e m t u m o r e s b e n i g n o s o u malignos'*®.
E s s e p a d r ã o q u e limita o e m p r e g o do citrato d e ^'^Ga t ê m incentivado vários p e s q u i s a d o r e s a projetar novos r a d i o f á r m a c o s , cuja especificidade permita classificá-los d e p e n d e n d o d o q u a d r o d e p a t o g e n i c i d a d e .
2.1.2. H I S T Ó R I C O
D u d i e y e M a d d o x a p ó s a o b t e n ç ã o d e lactato d e " G a d e baixa
atividade específica injetaram e m s e r e s h u m a n o s c o m t u m o r e s ó s s e o s a v a n ç a d o s
e concluíram q u e o p o d e r d e c o n c e n t r a ç ã o nas lesões era 2 0 v e z e s maior q u a n d o
c o m p a r a d o s c o m t e c i d o s normais.
B r u n e r e c o l a b o r a d o r e s (1953)'*^, d e m o n s t r a r a m q u e o u s o d o isótopo d e ^''Ga poderia ser melhor q u e o isótopo d e " G a , e m f u n ç ã o curta d a meia vida d e 14 horas e a disponibilidade c o m baixa atividade específica. O s a u t o r e s utilizaram ^^Ga, q u e a p r e s e n t a v a U/2 d e 78,3 horas, livre d e c a r r e g a d o r e s . C o n t u d o , e q u i p a m e n t o s d e s s a é p o c a n ã o p o s s u í a m s u p o r t e s s u f i c i e n t e m e n t e qualificados para obter i m a g e n s d e b o a resolução para e s t u d o s clínicos c o m este radioisótopo.
E m 1955, a C o m i s s ã o d e Energia Nuclear d o s Estados U n i d o s a p r o v o u a c o m e r c i a l i z a ç ã o d o radionuclídeo e d o s reagentes d e r i v a d o s d a m a r c a ç ã o pelos laboratórios especializados e m â m b i t o m u n d i a l . Q u a n d o , s e g u i n d o a e v o l u ç ã o , G r u v e r m a n e Kruger ^° d e s e n v o l v e r a m m é t o d o s para p r o c e s s a m e n t o d e vários radioisótopos e m ciclotrón, d e n t r e eles o ®^Ga.
H a r t m a n e Hayes^^ d e f e n d e r a m a teoria d e q u e o citrato d e gálio-67 era u m a g e n t e d e i m a g e m ó s s e a . Para c o m p r o v a r e s t e fato o s p e s q u i s a d o r e s e s t u d a r a m a influência d o c a r r e g a d o r d e gálio, e c o n c l u í r a m q u e o depósito d o radionuclídeo na estrutura e s t a v a d i r e t a m e n t e relacionado à s a t u r a ç ã o no p l a s m a .
A c o m p r o v a ç ã o f o i e l a b o r a d a c o m o citrato d e ^^Ga livre d e carregador.
D u r a n t e a s investigações, o s autores d e s c o b r i r a m a c i d e n t a l m e n t e a afinidade d o radionuclídeo pelos t u m o r e s d e t e c i d o s m o l e s . Esta d e s c o b e r t a acidental e m 1969, possibilitou criar u m a nova era na história d o ^'^Ga, t o r n a n d o - a u m a das principais f e r r a m e n t a s d e investigação na Medicina Nuclear, g a n h a n d o r e p u t a ç ã o c o m o a g e n t e d e localização d a d e s o r d e m e m tecidos m o l e s .
O d e s e n v o l v i m e n t o d e u m g e r a d o r ^^Ge/^^Ga, no final d a d é c a d a d e 6 0 ,
r e a c e n d e u o interesse no G a para a localização d e t u m o r ó s s e o . P o r é m , logo foi
d e s c a r t a d o , e m f u n ç ã o d a toxicidade na q u a n t i d a d e d e c a r r e g a d o r d e gálio q u e na
é p o c a era a d i c i o n a d o para a s e p a r a ç ã o d o ^^Ge '*°.
No início d o s a n o s 7 0 , ressurge o ^''Ga c o m s u a s características a j u s t a d a s para o b t e n ç ã o i m a g e n s d e t u m o r e s ó s s e o s F i n a l m e n t e , p o u c o s a n o s d e p o i s , e m p r o c e s s o s inflamatórios^^.
E m 1 9 7 1 , B r o w n d e s e n v o l v e u e t e s t o u u m m é t o d o d e s e p a r a ç ã o química por t é c n i c a d e e x t r a ç ã o por solventes para a o b t e n ç ã o d e ^''Ga d e alta pureza q u í m i c a , e reduzindo o t e m p o d e p r o c e s s a m e n t o .
O u t r a s f o r m a s d e c o m p l e x o s m a r c a d o s c o m ^^Ga f o r a m utilizadas c o m o o cloreto d e ^^Ga, etilenodiaminotetracetato d e gálio ( E D T A - G a ) , e t i l e n o d i a m i n o t e t r a m e t i l e n o f o s f a f a t o d e gálio ( E D T M P - G a ) , e m b o r a n ã o t ã o c o m u m c o m o o citrato d e ^''Ga.
A n t e r i o r m e n t e a o período d e 2 0 0 2 o ®^Ga era disponibilizado por i m p o r t a ç ã o ( N o r d i o n - C a n a d a ) e a s u a distribuição feita pelo C e n t r o d e R a d i o f a r m á c i a d o I P E N / C N E N - S P a f i m d e atender a d e m a n d a s e m a n a l d e 8 0 0 m C i e c o m c r e s c i m e n t o m é d i o d e 6 % a o a n o .
A t u a l m e n t e , d e v i d o a o p r o g r a m a de n a c i o n a l i z a ç ã o d a p r o d u ç ã o d e
r a d i o f á r m a c o s i m p l a n t a d o n o Instituto c o m a finalidade d e afirmar a c a p a c i d a d e
tecnológica d o Brasil na á r e a nuclear e a t e n d e r a d e m a n d a d o m e r c a d o nacional
e m r a d i o f á r m a c o s , foi a d q u i r i d o u m novo ciclotrón d e 30 M e V d e p r ó t o n s
d e s t i n a d o à p r o d u ç ã o d e '^f, ^^Ga, ^^^1 e ^^^Tl.
3. O B J E T I V O S
O objetivo d e s t e t r a b a l h o foi d e s e n v o l v e r u m a m e t o d o l o g i a d e m a r c a ç ã o d o p e p t í d e o D O T A - L A N R E O T I D E O c o m ^^Ga, o t i m i z a n d o os p a r â m e t r o s d e m a r c a ç ã o e d e t e r m i n a n d o a m e t o d o l o g i a d o controle d e q u a l i d a d e .
O a s p e c t o inédito foi a m a r c a ç ã o c o m o ^^Ga na sua f o r m a original e purificada a v e r i g u a n d o o efeito deletério q u e p o d e ser c a u s a d o pelos c o n t a m i n a n t e s metálicos p r e s e n t e s n a s o l u ç ã o d e gálio no d e s e n v o l v i m e n t o d e m a r c a ç ã o d o D O T A L A N .
Foi ainda importante e s t u d a r a biodistribuição e a interação d o
radiofármaco DOTALAN-^'^Ga c o m receptores t u m o r a i s .
4. M A T E R I A I S E M É T O D O S 4 . 1 . M A T E R I A I S
4 . 1 . 1 . R E A G E N T E S
- A c e t a t o d e a m ó n i o , p.a., Merck, EUA;
- A c e t a t o d e sódio, p.a.. S i g m a , EUA;
^ Acetonitrila, g r a u d e p u r e z a d e 99,9 %, Carlo Erba e Mallinckrodt;
- Á c i d o acético glacial, g r a u d e pureza p.a., Merck;, E U A ;
- Á c i d o clorídrico f u m e g a n t e 3 7 % (HCI), g r a u d e p u r e z a p.a., Merck, EUA;
- Á c i d o e t i l e n o d i a m i n o tetra acético ( E D T A ) sal d i s s ó d i c o , g r a u d e p u r e z a p.a., M i c r o - B i o q u i m i c a ;
^ Á c i d o gentísico. S i g m a , E U A ;
- Á c i d o trifluoracético, g r a u d e pureza p.a., Merck, E U A ; - Cloreto d e sódio, M e r c k , EUA;
- Éter diisopropílico, g r a u d e pureza p.a., Merck; E U A ;
Fosfato di-sódico a n i d r o , g r a u d e pureza p.a., Carlo E r b a , E U A ; - Fosfato m o n o h i d r a t a d o , g r a u d e pureza p.a.. Nuclear, Brasil;
- Glicina, S i g m a , EUA;
- Heparina sódica (Liquemine) 5 0 0 0 0 U I / 5 m L , R o c h e , Brasil;
- Hidróxido d e s ó d i o , g r a u d e pureza p.a., Merck, E U A ; - Meio F12K, Gibco, E U A ;
Meio R P M I 1640, Cultilab, C a m p i n a s / S P ;
- M e t a n o l ( M e O H ) , g r a u d e p u r e z a p.a., Merck, E U A ; - Nitrogênio g a s o s o . W h i t e Martins, Brasil;
- P a d r õ e s d e Z i n c o (Zn), Ferro (Fe), C o b r e (Cu) e Níquel (Ni)- A S S U R A N C E - calibrados a partir d e 1 0 0 0 m g / L o u lOOOppm.
- Peptídeo D O T A - L A N R E O T I D E ( D O T A L A N ) - D O T A ( D ) p N a l - C y s -
Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH2 [ P I C H E M - Austria ];
- S o l u ç ã o d e cloreto d e gálio-67 (^^GaCb) - p r o d u z i d a no C e n t r o d e A c e l e r a d o r e s ( C A C ) d o I P E N - C N E N , Brasil;
- S o l u ç ã o d e cloreto d e gálio-67 (^^GaCIs) - M D S N o r d i a n , C a n a d á , p r o c e s s a d a no C e n t r o d e R a d i o f a r m á c i a ;
- Soro a l b ú m i n a bovina ( S A B ) , S i g m a , E U A ; - Soro fetal b o v i n o , Cultilab, Brasil;
- U r e t a n a , g r a u d e pureza p.a., Merck, Brasil.
4.1.2. E Q U I P A M E N T O S
- A g i t a d o r d e t u b o s Vortex, V W R - Scientific, Brasil;
- C r o m a t ó g r a f o líquido d e alta eficiência ( C L A E ) , c o m p o s t o p e l o s seguintes m ó d u l o s :
o Detector UV/visível ( l â m p a d a D2), m o d e l o C G - 4 3 5 - B
I n s t r u m e n t o s Científicos C G Ltda - Brasil
o Injetor m a n u a l e b o m b a d e s o l v e n t e s , m o d e l o C G - 4 8 0 - C ,
I n s t r u m e n t o s Científicos C G Ltda - Brasil
o Integrador m o d e l o C - R 4 A C h r o m a t o p a c , S h i m a d z u , E U A e o
detetor d e radiação tipo poço, m o d e l o Nuclear S p e c t r o m e t e r LB 2 0 4 0 , Berthold - A l e m a n h a
o Estabilizador d e v o l t a g e m . I n s t r u m e n t o s Científicos C G Ltda - Brasil; A p a r e l h o e s p e c t r o f o t ô m e t r o na região d o ultravioleta (UV) visível, m o d e l o D M S - 8 0 , Perkin Elmer, A l e m a n h a ;
- Balança analítica, m o d e l o M-220, Denver Instruments, E U A ;
- Calibrador d e d o s e s m o d e l o C R M ™ - 3 5 R , c o m c â m a r a d e ionização m o d e l o CRC®, Carpintee, EUA;
- Centrífuga, Hitachi, m o d e l o H i m a c C F 7 D 2 , J a p ã o ;
- C o n t a d o r a u t o m á t i c o tipo p o ç o , c o m cristal N a l (TI), m o d e l o E 5 0 0 2 , c o b r a II, a u t o - g a m m a , A . P a c k a r d , G a m b e r r a , E U A ;
- C a p e l a c o m s i s t e m a d e e x a u s t ã o , E q u i p a m e n t o s para Laboratório Ltda, B R A S L A B , Brasil;
- E s p e c t r o f o t ô m e t r o d e a b s o r ç ã o a t ô m i c a , m o d e l o Z - 5 3 0 0 - H I T A C H I -
J a p ã o ;
100,0 - 1000,0 [iL, B r a n d , Brasil;
S i s t e m a purificador d e á g u a Ellix, a c o p l a d o a u m s i s t e m a d e purificação Milli-Q, Millipore, E U A ;
- Ultrafreezer ( t e m p e r a t u r a d e - 7 0 °G), m o d e l o A 8 5 1 3 U S A , Revoo Scientific Inc. ( W W R Scientific), A s h e v i l l e , N.C., E U A .
- G a m a C â m a r a s (y): a) G a m m a Nuclear Hungria, portátil c o m cristal d e Nal(TI), a c o p l a d o a u m s i s t e m a informatizado tipo C o m m a d o r a ( 4 0 0 0 / 0 3 0 ) c o m p r o g r a m a m i c r o s e g a n s - C e n t r o d e R a d i o f a r m á c i a (CR) d o I P E N - C N E N / S P ; b) S i e m e n s L E M , portátil c o m cristal d e Nal(TI), c o l i m a d o r pinhole, c o m p u t a d o r d e a q u i s i ç ã o d e i m a g e n s c o m p a t í v e l I B M / P C Intel P e n t i u m 133, s o f t w a r e d e a q u i s i ç ã o d e i m a g e n s PIP - C e n t r o d e M e d i c i n a N u c l e a r ( C M N ) d a F a c u l d a d e d e M e d i c i n a d a U S P
4 . 1 . 3 . O u t r o s
- C é l u l a s d e a d e n o c a r c i n o m a d e cólon retal h u m a n o ( H T - 2 9 ) , B a n c o d e Células d o Rio d e J a n e i r o ( R J C B ) , Brasil;
- Células d e a d e n o c a r c i n o m a p a n c r e á t i c o ( A R 2 - 4 J ) , A T C C , E U A ;
- C o l u n a para c r o m a t o g r a f í a liqüida d e alta eficiência ( C L A E ) , S y m m e t r y® C i 8 (RP-Cia) 4 , 6 x 2 5 0 m m , 5 jam. W a t e r s , E U A ;
- C o l u n a s c o m p a c t a d a s S e p P a k light Cis, W a t e r s , E U A ;
- Filtros d e s c a r t á v e i s d e 0,22 \im e 0,45 \im d e poro, Millipore, E U A ; - Fitas d e c r o m a t o g r a f i a d e c a m a d a d e l g a d a revestidas d e sílica gel
( I T L C - S G / 1 3 x 1 , 5 c m ) ; fitas d e alumínio i m p r e g n a d a s c o m sílica gel ( T L C - S G / 1 3 x 1 , 5 c m ) ; p a p e l W h a t m a n n°1 e W h a t m a n 3 M M ;
- Caixa d e luvas. G l o v e box, I P E N / C N E N , Brasil
- Material plástico d e s c a r t á v e l e m geral seringas, ponteiras, t u b o s , e t c ; - Vidraria e m g e r a l .
4 . 1 . 4 . A n i m a i s
• C a m u n d o n g o s a d u l t o s d a l i n h a g e m Nude, Biotério d o I P E N / C N E N ;
• C a m u n d o n g o s a d u l t o s d a l i n h a g e m Swiss, Biotério d o I P E N / C N E N ;
4 . 2 . M É T O D O S
A s atividades e x p e r i m e n t a i s f o r a m realizadas no Centro d e R a d i o f a r m á c i a (CR) d o I P E N / C N E N q u e possui instalações a p r o p r i a d a s para m a n i p u l a ç ã o d e a m o s t r a s radioativas n ã o seladas.
A á g u a utilizada e m t o d o s o s p r o c e d i m e n t o s foi p r o v e n i e n t e d e u m sistema Milli-Q/ Ellix. Para e l i m i n a ç ã o d e m e t a i s ela foi s u b m e t i d a a u m a purificação e m resina d e C h e l e x 100.
N o início d o t r a b a l h o f o r a m utilizadas a m o s t r a s d e cloreto d e ^^Ga (^^GaCIs), p r o c e d e n t e d a N o r d i o n ( C a n a d á ) . A partir d o s e g u n d o s e m e s t r e d e 2 0 0 2 p a s s o u - s e a usar o ^''Ga proveniente d a p r o d u ç ã o nacional d o I P E N - C N E N / S P .
4 . 3 . 1 . A m o s t r a s d e ^^Ga
a) O ^''Ga p r o d u z i d o pela Nordion foi obtido na f o r m a d e cloreto d e gálio (diluído e m ácido clorídrico 0,1M), c o m a c o n c e n t r a ç ã o radioativa d e 3 3 5 , 9 6 M B q / m L ( 9 , 0 8 m C i / m L ) . Este produto a p r e s e n t a v a teores d e m e t a i s d e zinco, c o b r e e ferro (Zn^", Cu^"^, Fe^* < I x I O ' ^ n g / 3 7 M B q ) d e a c o r d o c o m o certificado d e análise d o radionuclídeo. A q u a n t i d a d e d e metais permitida pela f a r m a c o p é i a a m e r i c a n a
^® é m e n o r q u e 5(a,g/ m L .
b) O ^^Ga produzido no centro d e a c e l e r a d o r e s d o I P E N / C N E N - S P , é
obtido no ciclotrón, m o d e l o C i c l o n e 3 0 , adquirido d a e m p r e s a IBA (Ion B e a m
A p p i i c a t i o n - B é l g i c a ) , c o m corrente m é d i a d e 200 |J A , por u m período d e 8 horas,
pelo b o m b a r d e a m e n t o d o alvo e n r i q u e c i d o d e ®®Zn e l e t r o d e p o s i t a d o s o b r e u m a
placa d e c o b r e revestida c o m níquel (a m a s s a d o alvo e l e t r o d e p o s i t a d o variou d e
6 0 0 a 7 5 0 mg) c o m prótons d e 2 6 M e V , pela reação ^®Zn (p,2n) ^''Ga
dissolução d o alvo e m s o l u ç ã o d e HCI c o n c e n t r a d o e p e r c o l a d o através d e u m a coluna d e resina t r o c a d o r a d e íons, d o tipo D O W E X 5 0 W X 8 equilibrada c o m u m a s o l u ç ã o de HCI 10 m o l / L e, eluído c o m u m a solução d e HCI 3,5 m o l / L^^
A c o n c e n t r a ç ã o radioativa d o radionuclídeo foi e m m é d i a d e 503,2 M B q / m L ( 1 3 , 6 m C i / m L ) . A s q u a n t i d a d e s permissíveis d e m e t a i s na s o l u ç ã o de citrato gálio-67 e s t a v a m c o n c o r d a n t e s , c o m a r e c o m e n d a ç ã o d a f a r m a c o p é i a americana^®.
A p ó s a t r a n s f o r m a ç ã o na f o r m a d e cloreto d e ^^Ga (^^GaCb) h o u v e a n e c e s s i d a d e d e r e m o v e r os metais utilizando-se a t é c n i c a d e extração c o m solventes p a r a d e s c a r t a r os interferentes na m a r c a ç ã o d o s p e p t í d e o s bioconjugados.
4.3.2. P u r i f i c a ç ã o d o ^^Ga para E l i m i n a ç ã o d e M e t a i s ( Z n , F e , C u e Ni) A purificação d o cloreto d e ^^Ga foi realizada por m e i o d a e x t r a ç ã o por solventes (HCI 7 m o l / L , é t e r diisopropílico e água) o b e d e c e n d o a s e g u i n t e técnica:
1. F a s e (eliminação d o s metais) - a s o l u ç ã o d e ^^GaCIs obtida d a p r o d u ç ã o foi e v a p o r a d a e a o resíduo f o r a m a d i c i o n a d o s 3,5 m L d e HCI 7 m o l / L . A p ó s a t r a n s f e r ê n c i a para u m balão d e d e c a n t a ç ã o e a c r é s c i m o d e 3,5 m L d e é t e r diisopropílico, m e d i a n t e a g i t a ç ã o e r e p o u s o , p r o c e d e u - s e à s e p a r a ç ã o d a f a s e a q u o s a (HCI) d a o r g â n i c a e repetiu-se a o p e r a ç ã o por m a i s d u a s v e z e s . E m s e q ü ê n c i a , d e t e r m i n o u - s e a atividade d o ^^Ga d e a m b a s a s f a s e s e m u m curiômetro.
2. F a s e ( o b t e n ç ã o d a atividade) - a o v o l u m e d o éter obtido da primeira
e x t r a ç ã o f o r a m a d i c i o n a d o s l O m L d e á g u a e levados a o funil d e
s e p a r a ç ã o . A c o n d u t a s u b s e q ü e n t e foi similar a o descrito no p a r á g r a f o
anterior (Fig.3).
""BaClj+lpSmLHCITM+a.SniL É t e r diisaprâ|i(|ico ED
HCI
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2-Etapa
ED<11-2*3)
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